Summary
在这里，我们提出了一种从短寿命脊椎动物模型 Nothobranchius furzeri 的大脑中分离细胞核的方案，用于下游应用，例如单核RNA测序或转座酶可接近染色质测序（ATAC-seq）的单核测定。
Abstract
由于成本、时间和技术限制，研究脊椎动物系统中单细胞分辨率的大脑衰老仍然具有挑战性。在这里，我们展示了一种从自然短命脊椎动物非洲绿松石鳉鱼 Nothobranchius furzeri的大脑中生成单核RNA测序（snRNA-seq）文库的方案。非洲绿松石鳉鱼的寿命为4-6个月，可以以具有成本效益的方式饲养，从而减少了研究脊椎动物大脑衰老的成本和时间障碍。然而，需要量身定制的方案来从年轻和老年鱼的大脑中分离出足够质量的细胞核，用于下游单细胞实验。在这里，我们展示了一种经验优化的方案，用于从成年非洲绿松石鳉鱼的大脑中分离高质量细胞核，这是生成高质量单核组学库的关键步骤。此外，我们表明，减少污染背景RNA的步骤对于清楚地区分细胞类型很重要。总之，该协议证明了研究非传统脊椎动物模式生物大脑衰老的可行性。
Introduction
了解脊椎动物大脑衰老的机制对于解决与年龄相关的神经退行性疾病（如阿尔茨海默氏症和痴呆）至关重要1。非洲绿松石鳉鱼（Nothobranchus furzeri）是可以在圈养中繁殖的寿命最短的脊椎动物，由于其寿命短和与年龄相关的认知障碍，它是一种优秀的大脑衰老模型2，3，4，5。最近，单细胞“组学”技术的出现，如单核RNA-seq（snRNA-seq）和转座酶可接近染色质测序的单核测定（snATAC-seq），使研究人员能够以前所未有的分辨率询问衰老的大脑6，7，8。这些方法依赖于细胞核分离，因为脑细胞（如神经元）的恢复通常太难分离6，7，8，9，10。然而，大多数已发表的细胞核分离方案都针对哺乳动物模式生物11，12，13，14，15进行了优化。因此，由于目前在衰老研究领域分离脑细胞核的需求尚未得到满足2领域新兴的新模式生物，因此该协议的目标是建立一种从冷冻脑鳉鱼组织中分离高质量细胞核的方法。
在这里，建立了一个简化而强大的工作流程，使用常用的材料从鳉鱼大脑中分离出高质量的细胞核。该协议是从小鼠大脑的 10x 基因组学协议修改而来的，以适应非洲绿松石鳉鱼的髓鞘含量较低的大脑、冷冻组织的脆弱性以及减少测序相关应用的环境碎片含量的需要16.事实上，先前针对哺乳动物脑组织17，18 优化的方案在用于冷冻鳉鱼脑时会导致细胞核质量差（即过度裂解）和/或碎片含量高，根据使用微流体的单核 RNA-seq 的建议，它们不适合与 snRNA-seq 一起使用（补充图 1）。
除了细胞核分离外，我们还演示了如何通过显微镜和流式细胞术评估细胞核质量和产量。本文提供了最佳和次优结果的示例，并讨论了故障排除。该协议是为冷冻鳉鱼大脑设计和优化的，但也无需对新鲜解剖的鳉鱼样品进行重大修改即可使用。使用这种方法分离的鳉鱼脑细胞核已经过优化，可作为下游应用用于单核RNA-seq（snRNA-seq），但也应适用于snATAC-seq和批量ATAC-seq。
Protocol
动物护理和动物实验是根据南加州大学IACUC根据批准的协议#21215进行的。对于使用此协议的任何工作，在开始任何脊椎动物研究工作之前，必须获得该机构IACUC的批准。
注意：从快速冷冻的脑组织（从步骤3开始）开始的完整协议运行需要~2.5小时，对于六个样品（图1）。
1. 解剖鳉鱼大脑
- 在系统水中使用 1.5 g/L 甲磺酸盐/三卡因 （MS-222） 溶液人道地对鳉鱼实施安乐死。
- 在所有身体和鳃运动停止后，使用锋利的剪刀迅速斩首鳉鱼。
- 如前所述，在干净的培养皿上解剖斩首的头19。
- 将培养皿放在解剖显微镜下（使用8x-35x放大范围）。转动头部，使分支隐形射线聚焦
- 用剪刀剪开牙齿，露出分支鳐鱼和颅骨。
- 使用镊子按住颅骨两侧的分支鳐鱼。使用另一对镊子从颅骨中取出任何残留的组织碎片。连接大脑和眼睛的V形光学交叉应该变得可见。
- 用剪刀剪开视交叉，将双眼与大脑分离。用镊子轻轻地释放颅骨。
- 将颅骨倒置，用镊子从颅骨背侧刮下肌肉。
- 用一对镊子将颅骨固定到位，用另一对镊子轻轻取出颅骨，露出大脑。
- 大脑看起来又白又软。一旦可见，就不需要去除所有颅骨。用干净的镊子轻轻提起和刮擦去除大脑。
- 通过将大脑放入储存在干冰上的微量离心管中来快速冷冻大脑。
注意：冷冻的脑组织可以储存在-80°C，直到收集所有要一起处理的样品，以限制处理文库生成时的批次效应。虽然储存在-80°C的样品不能无限期储存，但该方案已在储存长达12个月的鳉鱼大脑上成功执行，质量没有明显下降。
2. 准备新鲜的缓冲液
- 制备细胞核洗涤缓冲液（1x PBS 中的 2% 牛血清白蛋白 [BSA]、磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 和 0.2 U/μL RNase 抑制剂）并储存在冰上。为多达 8 个样品准备 250 mL 细胞核洗涤缓冲液。对于 250 mL，使用 50 mL 的 10% BSA 储备溶液、25 mL 的 10x PBS 储备溶液、1.25 mL 的 40 U/μL RNase 抑制剂储备液，然后使用不含 RNA 酶的 ddH2O 使体积达到 250 mL。
- 制备细胞核裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl 2、0.01875% v/v NP-40 和0.2 U/μL RNase 抑制剂）并储存在冰上。为多达 8 个样品准备 10 mL 细胞核裂解缓冲液。对于 10 mL，使用 100 μL 1 M Tris-HCl pH 7.4 储备溶液、20 μL 5 M NaCl 储备溶液、30 μL 1 M MgCl 2 储备溶液、18.75 μL 10% NP-40 储备溶液、50 μL 40 U/μL RNase 抑制剂储备液，然后用不含 RNA 酶的 ddH2O 使体积达到 10 mL。
3. 分离细胞核
- 如果使用冷冻样品，请在冰上解冻10分钟。如果使用新鲜解剖的大脑，请直接进入步骤3.2
注意：虽然该协议可以适用于单个大脑，但来自幼鱼（5-6周龄）的较小样本的产量较差。无论鱼的年龄和性别如何，通过将两个大脑作为一个样本处理总是可以获得足够的产量（表1）。该方案已成功从5-26周龄的鱼类中分离出高质量的细胞核，包括来自GRZ和ZMZ1001菌株的动物。将此协议应用于其他菌株预计不会出现任何问题。 - 在 2 mL Dounce 匀浆器中的 1 mL 冰冷细胞核裂解缓冲液中弹跳大脑。将均质器保持在冰上，避免在裂解样品时产生气泡。以大约 0.5 秒/下冲程和 0.5 秒/上冲程的速度弹跳，每个周期扭转 180°。使用松散的杵弹跳15次，如果需要额外的笔划，则直到组织/裂解缓冲液混合物看起来均匀。
注意：Dounce均质机应清洗，用蒸馏水冲洗，并在两次使用之间用标准干式高压灭菌器灭菌循环灭菌。- 用紧杵弹跳30次，每10次小休息30秒至1分钟。以大约 0.5 秒/下冲程和 0.5 秒/上冲程的速度弹跳，每个周期扭转 180°。让样品在Dounce均质机中的冰上休息2分钟。
注意：此孵育时间可确保充分裂解，但如果观察到核过度裂解，则应缩短。
- 用紧杵弹跳30次，每10次小休息30秒至1分钟。以大约 0.5 秒/下冲程和 0.5 秒/上冲程的速度弹跳，每个周期扭转 180°。让样品在Dounce均质机中的冰上休息2分钟。
- 通过 70 μm 细胞过滤器将样品过滤到预涂有 5% BSA 的 15 mL 锥形管中。
- 将洗涤缓冲液移液到步骤3.3中的70μm细胞过滤器上，并通过倒置轻轻混合五次，向样品中加入4 mL细胞核洗涤缓冲液。
注意：这允许回收可能被困在过滤器上的细胞核并提高产量。 - 使用水平吊桶转子在500× g，4°C下离心10分钟。轻轻倒入废液容器中，弃去上清液。将样品直立放回原位，并使用P1000移液器取出剩余的洗涤缓冲液。
注意：从一个样本中的两个大脑开始时，细胞核沉淀可能是可见的。然而，当处理来自幼畜（5-6周龄）的单个大脑时，预计产量较低，并且颗粒可能并不总是可见。在这种情况下，应小心地除去上清液，同时假设沉淀在管底部的位置。 - 立即用宽口径 P1000 移液器吸头将细胞核重悬于 1 mL 细胞核洗涤缓冲液中。
- 加入 4 mL 细胞核洗涤缓冲液，将样品调至 5 mL，并通过倒置轻轻混合 5 次。使用摆动桶转子在500× g，4°C下离心10分钟，并弃去上清液。
- 用宽口径移液器吸头将细胞核重悬于 1 mL 细胞核洗涤缓冲液中，并转移到流式细胞术 （FACS） 管中。
- 加入 300 μL 碎屑去除溶液（材料表），用宽口径吸头移液彻底混合，直到混合物均匀。
- 使用 P1000 移液管将 1 mL 细胞核洗涤缓冲液轻轻覆盖在步骤 3.9 中制备的细胞核溶液的顶部，并以轻微的角度保持试管（补充图 2）。如果分层正确，碎片去除溶液馏分和细胞核洗涤缓冲液馏分应形成清晰的界面。
- 在水平桶转子中以3000× g，4°C离心10分钟。使用 P1000 移液器完全丢弃前两相。
注意：透明的FACS管将允许离心后三个不同相的可视化（顶部，中间相，底部）。为了便于最大限度地清除碎屑，建议在去除前两相时比保守更积极（即，去除少量的底部相比延续任何顶部相更可取; 补充图2）。此外，界面层可能太薄而无法可视化。在这种情况下，请去除包含相间层的顶部（表观）层。保留的底层应包含 ~1 mL 的总体积。 - 将底层转移到预涂有 5% BSA 的 15 mL 锥形管中。
- 在锥形管中，用细胞核洗涤缓冲液将体积降至 15 mL，并倒置 3 次以混合。
- 在水平桶转子中以1000× g，4°C离心10分钟。小心地取出上清液。
- 立即使用宽口径移液器吸头重悬于 150 μL 细胞核洗涤缓冲液中。
- 切换到设置为 ~300 μL 的标准孔径移液器吸头。 摄取整个样品，然后将 40 μm 吸头过滤器连接到移液器吸头的末端，注意不要排出样品。
注意：尖端过滤器是获得较小体积所必需的，这是为下游应用保持足够的细胞核浓度所必需的。例如，对于使用微流体的snRNA-seq，建议最低浓度为>300个细胞核/μL，尽管最佳范围为700-1200个细胞核/μL18。如有必要，也可以轻松稀释更高浓度的细胞核。 - 通过将样品通过过滤器强行排出到低 DNA 结合的 1.5 mL 微量离心管中来过滤样品。最终洗脱体积应为120-150 μL。
注意：过滤可能会导致一些起泡。这似乎不会影响细胞核质量。
4. 通过显微镜评估细胞核质量
- 在单独的微量离心管中，轻轻移液将 10 μL 过滤样品与 10 μL 0.4% 台盼蓝溶液混合。样品无需延长孵育时间，与台盼蓝溶液混合后即可立即进行可视化。
- 将 10 μL 染色的细胞核沉积到计数室载玻片的腔室中。
注意：或者，将 10 μL 染色的细胞核样品沉积到血细胞计数器或显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。 - 通过光学显微镜评估细胞核质量。
注意：较低的放大倍率只能用于放大细胞核，因为细胞核缺陷只有在较高放大倍率（即60倍或更高）下才会在视觉上明显。此步骤可以快速完成，以评估细胞核制备的成功，并且不需要目视检查以外的二次分析。高质量、完整的细胞核将具有清晰定义的边界20 （图2A）。质量差的细胞核会破坏核膜，核膜附近的斑片状台盼蓝染色表明潜在的核酸泄漏，和/或起泡的证据20 （图2B）。健康的细胞核直径预计为10-15μm。
5. 通过流式细胞术定量单线态细胞核、碎片和多重比例
注意：流式细胞仪软件的具体术语和界面可能因机器品牌而异，但如果需要，这些步骤应易于适应其他系统。
- 在 FACS 管中，将 10 μL 过滤后的细胞核样品重悬于推荐用于流式细胞术的 90 μL 缓冲液中，以 1：10 稀释。为此，本研究使用0.22μm过滤灭菌PBS，pH 7.2，含2mM EDTA和0.5%BSA。
注意：虽然这种稀释适用于大多数细胞核制备，但在产量较低的样品（即稀释样品中<30个细胞核/μL）的情况下，可能需要较低的稀释度（例如，1：5）来采样足够的细胞核以进行质量评估。 - 用碘化丙啶（PI）对样品进行染色，终浓度为1μg/ mL。无需孵育时间，可立即分析细胞核。
注意：或者，用终浓度为 0.1 μg/mL DAPI 对样品进行染色。请注意，DAPI应在与PI不同的荧光通道上读取（Vioblue-A V1-A通道;激发在405 nm处，发射在450/50 nm处）。 - 在流式细胞仪上分析样品，如下所示：
- 设置工作区：
- 将流式细胞仪置于采集模式。单击“ 文件”，然后从下拉菜单中选择 “新建工作区 ”。在左侧面板的“ 试验 ”选项卡下，在各自的字段中输入 “项目名称 ”和 “示例 ID ”。
- 在左上角工具栏中，单击 “新建分析窗口 ”按钮（散点图图标）。从弹出菜单中单击包含三个图的框（绘图 4t）。屏幕上将出现三个图。单击左上角工具栏中的 “分析模式 ”按钮（A 图标），使其显示为灰色而不是橙色。
- 设置分析图：
- 更改三个图的轴，如下所示，分别按 X 轴和 Y 轴排序：
图 1： X 轴：FSC-A， Y 轴：SSC-A
图 2： X 轴：HDR-T， Y 轴：SSC-A
图 3： X 轴：PerCP-Vio700-A B3-A， Y 轴：SSC-A - 通过单击轴标签并从下拉菜单中选择所需的通道来更改 轴 。
- 通过单击每个图右上角旁边显示的方形灰色“i”图标，将图设置为密度颜色编码。将打开“ 属性 ”窗口，左侧显示一组按钮。在 “属性 ”窗口中，单击“ 散点图 ”图标（面板左侧顶部的第二个图标）。单击 确定。
注意：PerCP-Vio700-A B3-A 荧光通道对应于 488 nm 处的激发，以及 650-730 nm 范围内的发射。
- 更改三个图的轴，如下所示，分别按 X 轴和 Y 轴排序：
- 设置仪器设置：
- 单击左侧面板中的 频道 选项卡。将显示所有频道的列表，右侧有三个框。将 B3、FSC-A 和 SSC-A 设置为 Hlog，方法是单击右侧相应第一个框中的向下箭头，然后从下拉菜单中选择 Hlog 。 将 SSC 的电压设置为 640 V，将 FSC 设置为 300 V，将 B3 设置为 480 V，方法是在右侧各自的中间框中键入这些数字，然后按 Enter 键。请注意，右侧的第三个框是一个切换开关，可以交替用于键入。
- 在 “触发器 ”标题下，将 FSC 触发器设置为 4，将 SSC 和 B3 触发器设置为 0，方法是单击向下箭头，从左侧的下拉菜单中选择它们，在右侧的框中键入数字，然后按 Enter 键。请注意，右侧有一个切换框，可以替代键入。
注意：PMT电压需要针对每台特定的流式细胞仪进行优化，但细胞核的触发必须低于通常用于细胞的触发电压。此外，轴刻度应设置为 h 对数。
- 在 样品 体积文本框中输入 100 μL，在流程软件窗口左侧的 摄取体积 文本框中输入 50 μL。验证 混合样品 参数是否设置为混合 温和 ，以避免在此步骤中裂解细胞核。按右下角圆圈内的三角形（播放 图标）开始流动。
- 验证流量质量：
- 使用侧向散射区域 （SSC-A） 与 HDR-T 检查样品中的气泡或团块。确保此图是点的平滑连续体。气泡或团块将导致SSC-A与HDR-T图中的空白区域。
- 检查侧向散射（SSC-A）与前向散射（FSC-A）图，以验证所用电压对样品是否正确。
注意：与细胞不同，细胞核不会完全从侧向散射与前向散射图中的碎片中分离出来。但是，在对应于原子核（较暖的颜色）的图的中间应该有一个高密度的事件簇，而对应于碎片的背景中应有较低密度的事件（较冷的颜色）。
- 分析细胞核计数和质量：
- 双击 SSC-A 与 PerCp-Vio-700A 图 可查看放大视图。单击左上角工具栏上带有垂直线（象限）的按钮以选择象限门。然后，单击 SSC-A与PerCp-Vio-700A 图中的任意位置，象限将出现在图中。
- 单击象限分隔线上的任意位置，然后滑动光标以修改象限位置。放置象限，使左上象限包含最左侧的群体（碎片），右上象限包含几个泪滴形簇（核）（有关浇口设置和流动结果示例，请参阅 图3 ，以获取包括或不包括碎片清除步骤的制备的典型结果）。
- 碎片与细胞核计数：
- 单击绘图右上角的方形灰色“i”图标以打开 “属性 ”窗口。单击 区域功能 选项卡;将出现绘图区域和功能的列表。
- 在 “区域” 列表下，确保顶部项目旁边有一个绿色复选标记，表示已选择整个绘图。在 “功能 ”列表下，单击 “计数/μL ”以生成绿色复选标记。单击“ 确定”，每个象限中将显示一个计数/μL 指标。
- 要查看原始计数和百分比，请根据需要从“区域函数”选项卡中选择“计数和 %-T”。左上象限和右象限的计数/μL分别对应于碎片和细胞核产量。
- 单线态计数：
- 右上象限下部最左边的泪滴形簇代表单线。通过单击左上角工具栏上的多边形按钮 （Polygon） 在此人口周围绘制面门。
- 单击一次，滑动鼠标开始绘制，然后再次单击以完成门的线性段并开始下一个。双击以完成门。单击门的边框，然后滑动鼠标以重新定位门。
- 单击门的顶点以修改形状。将出现门控群体（单线管）的计数/μL。这是初始稀释液中细胞核制备的浓度。
注意：前向散射面积与高度 1：1 线性关系，通常用于确定流动细胞时的单重态速率，不适用于细胞核，可以忽略不计。
- 使用稀释的细胞核制备物的浓度和稀释因子，反向计算初始制备的浓度（例如，对于1：10的稀释度，将观察到的浓度乘以10）。浓度从 >300 个细胞核/μL 开始适用于 snRNA-seq。
- 设置工作区：
Representative Results
这里描述的鳉鱼脑核分离方案是专门针对鳉鱼优化的，总结在 图1中。除了细胞核提取外，该协议还详细介绍了评估分离细胞核质量和数量的不同方法。图 2 显示了通过光学显微镜评估的健康（图2A）和不健康（图2B）细胞核的示例。适合下游分析的健康细胞核（图2A）以具有完整膜的单线态细胞核形式存在。 如图2B所示，该协议（和其他细胞核分离协议）最常见的故障模式是产生过度溶解的细胞核，其特征在于核膜受损。这通常会导致细胞核结块，并且由于核酸从破裂的核中泄漏，可能导致下游应用中的背景信号。如果观察到过度结块，我们建议在跳跃步骤中保持温和和/或减少裂解缓冲液中的孵育时间。
该协议使用流式细胞术来量化分离的细胞核的数量并确定样品中多个细胞核的相对比例。此外，流式细胞术可用于评估污染碎片的相对含量，通常是破裂的细胞核碎片和其他细胞碎片，这些碎片会对细胞核样品中的下游测定产生不利影响。代表性的流量数据如图 3所示。高质量的细胞核分离程序将产生：1）小碎片部分，2）单核与多核的高比例（>80%的细胞核部分）。使用PI染色对核酸进行染色，可以将单线态核与碎片和多重核分离。图 3A 是被碎片污染的制备方法的示例，而 图3B 是高质量实验的示例。
图 1：鳉鱼脑核分离工作流程。 从冷冻或新鲜鳉鱼脑中分离细胞核的实验工作流程。一旦分离和评估，细胞核可用于各种下游“组学”分析。 请点击此处查看此图的大图。
图2：通过显微镜评估细胞核质量。 将细胞核在0.4%台盼蓝溶液中以1：1混合，并在回波旋转显微镜上通过60倍的明场成像可视化。 （A）高质量细胞核的一个例子。细胞核以单线态形式存在，核膜完整。（B）劣质细胞核的例子。核膜受损，细胞核聚集成双峰，可能是由于粘性DNA的泄漏，可以看到粘性DNA从最顶层的细胞核顶部泄漏。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：流式细胞术的细胞核定量和纯度评估。 用1：100稀释的PI染色细胞核样品，并在流式细胞仪上运行。细胞核以单重态和多重形式存在于（A，B）的右上象限，单重体是事件的最低云，然后是双峰，三重态等，按升序排列。碎片由最左边两个象限中的事件标记。（A）低质量的细胞核制备示例，其中省略了碎片清除步骤，碎片占事件的>40%。（B） 高质量核样品的实例，包括碎片清除步骤。在本例中，碎片占流式细胞仪记录的所有事件的<10%。 请点击此处查看此图的大图。
| 样本类型（2 个大脑） | 平均产量（4 次独立制备） |
| 5周男性大脑 | 3.59 ± 1.76 x 105 |
| 10周男性大脑 | 6.41 ± 1.33 x 105 |
| 15周男性大脑 | 14.59 ± 2.05 x 105 |
| 5周女性大脑 | 2.54 ± 0.75 x 105 |
| 10周女性大脑 | 4.66 ± 1.29 x 105 |
| 15周女性大脑 | 7.95 ± 3.51 x 105 |
表1：非洲绿松石鳉鱼两个大脑在性别和年龄方面的平均预期产量。 平均产量表示为105 个细胞核±每个类别中四个独立核制备的平均值的标准误差。
补充图1：使用标准方案和我们优化的冷冻鳉鱼大脑方案的细胞核分离质量比较。 （A）通过显微镜进行细胞核质量评估。将细胞核在0.4%台盼蓝的溶液中以1：1的比例混合，并在显微镜上通过60x的明场成像可视化。 （B）通过流式细胞术定量细胞核和碎片负荷。用1：100稀释的PI染色细胞核样品，并在流式细胞仪上运行。（C）使用不同基准方案的显微镜和流式细胞术总结质量评估指标。 请点击此处下载此文件。
补充图2：碎片清除步骤的示意图。 （一）碎屑清除分层预离心方案。（B）离心后去除上清液的方案。 请点击此处下载此文件。
Discussion
这里介绍的协议可用于从鳉鱼大脑中可重复地生成高质量的细胞核。该协议必须专门为鳉鱼大脑设计，因为应用于鳉鱼大脑的典型基于哺乳动物的脑细胞核分离方案始终导致我们手中的细胞核质量差。我们怀疑这是由于与哺乳动物相比，鳉鱼大脑的相对髓磷脂含量较低，它们会响应哺乳动物脑细胞裂解所需的恶劣条件而裂解和结块。该协议是衰老和鳉鱼领域的进步，因为它有助于在脊椎动物大脑衰老的成本和时间有效模型中在单细胞水平上探索大脑衰老。
该协议对新鲜或冷冻样品具有鲁棒性，但在使用新鲜或冷冻组织时必须考虑下游应用。冷冻组织通常很方便，因为它可以在收集样本时收集和储存数月。此类样品可以安全地用于snRNA-seq等应用。然而，冷冻样品可能会破坏核结构，从而破坏通过ATAC-seq21准确测量染色质景观的能力。因此，对于下游应用，如散装ATAC-seq或snATAC-seq，建议使用新鲜解剖的大脑而不是冷冻的大脑。此外，由于脑匀浆后的所有步骤都可以并行进行，因此该协议适合在合理的时间范围内运行多个样品，从而限制了长时间在冰上孵育引起的RNA降解。
此外，必须在进行细胞核提取后（数小时内）制备新鲜的缓冲液。我们发现，在方案开始之前 ，必须将 去垢剂和BSA添加到缓冲液中。仅含有盐（PBS，NaCl等）的缓冲液可以制成浓缩物，过滤灭菌（0.22μm），并在室温下无限期储存。BSA储备溶液可以在细胞核提取后几天内制备，灭菌和储存在4°C（如果由粉末制备），但应始终在进行方案之前立即添加到本协议中使用的缓冲液中。但是，我们建议在协议当天准备BSA溶液。如果使用第三方的预制BSA溶液，建议使用新鲜的未开封瓶子。使用新鲜的BSA通常会导致细胞核制备中的碎片含量降低。
无论是使用新鲜样品还是冷冻样品作为输入，在细胞核分离后评估细胞核质量都很重要。虽然该协议是专门为避免过度分析而设计的，但这是细胞核质量损失的最常见原因。过度裂解可能是由于在裂解缓冲液中花费的时间过长，对细胞核的处理过于粗糙，例如使用标准孔径移液器吸头过度移液，或在细胞核分离和下游应用之间花费的时间过长（>1小时）。过度裂解的细胞核通常会损坏核外围，从而泄漏DNA并导致结块（图2B）。这将导致多重检测数量增加，并产生背景核酸，从而干扰下游应用，尤其是snRNA-seq。这两种品质都可以在细胞核分离后通过显微镜进行评估。如果观察到过多的核结块，我们建议尝试缩短裂解步骤孵育，以减少过度裂解的机会。作为增加细胞核单晶态的替代方法，荧光辅助细胞分选（FACS）可用于富集本协议下游的单晶态。然而，我们注意到，当处理来自冷冻组织的已经脆弱的细胞核时，分选过程中发生的剪切应力可能导致核破裂增加，从而增加环境RNA/DNA。此外，我们注意到，在处理多个样品时，对细胞核进行FACS产量排序所需的时间需要所有细胞核样品在冰上停留数小时，而其他样品正在分拣中。因此，与FACS方法并行处理多个样品时，等待时间增加也可能导致细胞核质量整体下降并增加RNA降解的风险。因此，如果需要FACS以降低双峰速率，我们建议在产量分类后再次检查碎片含量，并且作为潜在的警告，在单细胞RNA-seq应用中考虑可能降低的RNA质量。
准确估计细胞核计数和单重态比例对于几乎所有下游“组学”应用都至关重要，并且至关重要。由于能够轻松地按大小对细胞核进行门控和计数，流式细胞术是我们评估过的最准确的细胞核计数方法。或者，可以使用细胞计数器（例如Invitrogen的Countess 2 FL自动细胞计数器或DeNovix CellDrop自动细胞计数器）来量化细胞核。需要注意的是，Invitrogen的Countess 2 FL自动细胞计数器，以及在较小程度上的DeNovix，倾向于通过将碎片计数为细胞核来高估细胞核计数，这意味着可能需要手动尺寸门控。此外，流式细胞仪可以轻松评估细胞核的纯度。人们可以通过显微镜难以定量的方式辨别单重态核与多晶核的相对比例。这对于snRNA-seq和snATAC-seq至关重要，因为这些协议将受到多重样品过剩的影响，必须将其排除在下游分析之外。除了多重材料外，“碎片”（碎片核、细胞碎片）的相对比例可以通过流式细胞术进行定量，并且必须相对较低，因为这种材料通常含有污染核酸，这些核酸可以提供背景信号并破坏单核“组学”数据。
与前面描述的细胞核分离方案一样，原始组织中细胞类型的比例可能无法在细胞核制备19中忠实地概括，因此应谨慎解释。需要注意的是，像所有硬骨鱼一样，非洲绿松石鳉鱼也有有核红细胞，预计这些红细胞也有望在细胞核制备中代表。这些细胞核可以通过血红蛋白基因的更高表达/可及性在snRNA-seq和snATAC-seq数据集中鉴定，如果需要，可以通过计算排除。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
一些面板是用 BioRender.com 生成的。我们实验室的这项工作得到了NIA T32 AG052374博士后培训基金的支持，西蒙斯基金会的资助，作为西蒙斯衰老大脑可塑性合作的一部分，导航基金会的试点资助，以及汉森 - 托雷尔家族奖给B.A.B。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
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