Summary
यहां हम एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण या अनुक्रमण (एटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल-नाभिक परख जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अल्पकालिक कशेरुक मॉडल नोथोब्रांचियस फर्ज़ेरी के दिमाग से नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
कशेरुक प्रणालियों में एकल-कोशिका संकल्प पर मस्तिष्क की उम्र बढ़ने का अध्ययन लागत, समय और तकनीकी बाधाओं के कारण चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। यहां, हम स्वाभाविक रूप से अल्पकालिक कशेरुक अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफिश नोथोब्रांचियस फर्ज़ेरी के दिमाग से एकल-नाभिक आरएनए अनुक्रमण (एसएनआरएनए-सेक) पुस्तकालयों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश का जीवनकाल 4-6 महीने है और इसे लागत प्रभावी तरीके से रखा जा सकता है, इस प्रकार कशेरुक मस्तिष्क की उम्र बढ़ने का अध्ययन करने के लिए लागत और समय की बाधाओं को कम किया जा सकता है। हालांकि, युवा और वृद्ध मछलियों के मस्तिष्क से डाउनस्ट्रीम एकल-कोशिका प्रयोगों के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के नाभिक को अलग करने के लिए अनुरूप प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यहां, हम वयस्क अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफिश के मस्तिष्क से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक के अलगाव के लिए एक अनुभवजन्य रूप से अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, जो उच्च गुणवत्ता वाले एकल नाभिक ओमिक पुस्तकालयों की पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण कदम है। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि दूषित पृष्ठभूमि आरएनए को कम करने के कदम सेल प्रकारों को स्पष्ट रूप से अलग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सारांश में, यह प्रोटोकॉल गैर-पारंपरिक कशेरुक मॉडल जीवों में मस्तिष्क की उम्र बढ़ने का अध्ययन करने की व्यवहार्यता को दर्शाता है।
Introduction
कशेरुक मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के तंत्र को समझना अल्जाइमरऔर मनोभ्रंश जैसे उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण है। अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश (नोथोब्रांचस फर्ज़ेरी) सबसे कम समय तक रहने वाला कशेरुक है जिसे कैद में पैदा किया जा सकता है, और इसके छोटे जीवनकाल और उम्र से जुड़े संज्ञानात्मक हानि के कारण, यह एक उत्कृष्ट मस्तिष्क उम्र बढ़ने वाला मॉडल 2,3,4,5 है। हाल ही में, एकल-कोशिका "ओमिक्स" प्रौद्योगिकियों के आगमन, जैसे एकल नाभिक आरएनए-सेक (एसएनआरएनए-सेक) और अनुक्रमण (एसएनएटीएसी-सेक) के साथ ट्रांसपोसेस-सुलभ क्रोमैटिन के लिए एकल नाभिक परख ने शोधकर्ताओं को एक अभूतपूर्व रिज़ॉल्यूशन 6,7,8 पर उम्र बढ़ने वाले मस्तिष्क से पूछताछ करने की अनुमति दी है। ये विधियां नाभिक अलगाव पर निर्भर करती हैं, क्योंकि न्यूरॉन्स जैसे मस्तिष्क कोशिकाओं की वसूली अक्सर 6,7,8,9,10 को अलग करने के लिए बहुत चुनौतीपूर्ण होती है। हालांकि, अधिकांश प्रकाशित नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल स्तनधारी मॉडलजीवों 11,12,13,14,15 के लिए अनुकूलित हैं। इस प्रकार, जैसा कि वर्तमान में उम्र बढ़ने के अनुसंधान2 के क्षेत्र में एक नए मॉडल जीव के रूप में किलीफिश में मस्तिष्क नाभिक को अलग करने की आवश्यकता है, इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य जमे हुए मस्तिष्क किलीफिश ऊतक से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए एक विधि स्थापित करना है।
यहां, एक सुव्यवस्थित और मजबूत वर्कफ़्लो स्थापित किया गया है जो किलीफिश दिमाग से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को अलग करने के लिए आमतौर पर उपलब्ध सामग्रियों का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल को माउस दिमाग के लिए 10x जीनोमिक्स प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था ताकि अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश के निचले माइलिन सामग्री दिमाग, जमे हुए ऊतक की नाजुकता और अनुक्रमण से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए परिवेश मलबे सामग्री को कम करने की आवश्यकता कोसमायोजित किया जा सके। दरअसल, स्तनधारी मस्तिष्क ऊतक17,18 के लिए पहले से अनुकूलित प्रोटोकॉल खराब नाभिक गुणवत्ता (यानी, ओवरलिसिस) और / या उच्च मलबे सामग्री का कारण बनते हैं जब जमे हुए किलीफिश दिमाग पर उपयोग किया जाता है, जिससे वे माइक्रोफ्लुइडिक्स (पूरक चित्रा 1) का उपयोग करके एकल नाभिक आरएनए-सेक के लिए सिफारिशों के अनुसार एसएनआरएनए-सेक के साथ उपयोग के लिए अनुपयुक्त हो जाते हैं।
नाभिक अलगाव के अलावा, हम प्रदर्शित करते हैं कि माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नाभिक की गुणवत्ता और उपज का आकलन कैसे किया जाए। यह आलेख इष्टतम और उप-मानक परिणाम दोनों के उदाहरण प्रदान करता है और समस्या निवारण पर चर्चा करता है। इस प्रोटोकॉल को जमे हुए किलीफिश दिमाग के लिए डिज़ाइन और अनुकूलित किया गया था, लेकिन ताजा विच्छेदित किलीफिश नमूनों पर बड़े संशोधनों के बिना भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके पृथक किलीफिश मस्तिष्क नाभिक को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग के रूप में एकल नाभिक आरएनए-सेक (एसएनआरएनए-सेक) में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन एसएनएटीएसी-सीक और थोक एटीएसी-सीक में उपयोग के लिए भी अनुकूल होना चाहिए।
Protocol
अनुमोदित प्रोटोकॉल # 21215 के तहत दक्षिणी कैलिफोर्निया आईएसीयूसी विश्वविद्यालय के अनुसार पशु देखभाल और पशु प्रयोग किया गया था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके किसी भी काम के लिए, कशेरुक जानवरों पर कोई भी शोध कार्य शुरू करने से पहले संस्थान के आईएसीयूसी से अनुमोदन प्राप्त करना आवश्यक है।
नोट: फ्लैश-जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों (चरण 3 से शुरू) से शुरू होने वाले प्रोटोकॉल के माध्यम से एक पूर्ण रन छह नमूनों के लिए ~ 2.5 घंटे लेना चाहिए (चित्रा 1)।
1. किलीफिश दिमाग को विच्छेदित करें
- सिस्टम के पानी में मेथनोसल्फोनेट / ट्राइकेन (एमएस -222) के 1.5 ग्राम / एल के घोल का उपयोग करके किलीफिश को मानवीय रूप से इच्छामृत्यु दी जाती है।
- सभी शरीर और गिल आंदोलन बंद होने के बाद किलीफिश को तेजी से हटाने के लिए तेज कैंची का उपयोग करें।
- जैसा कि पहले वर्णित19 में वर्णित है, एक साफ पेट्री डिश पर कटे हुए सिर को विच्छेदित करें।
- डिश को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखें (8x-35x आवर्धन रेंज का उपयोग करके)। सिर को इस तरह घुमाएं कि ब्रांचियोस्टिगल किरणें फोकस में हों
- कैंची का उपयोग करके, डेंटरी के माध्यम से काटें ताकि ब्रांचियोस्टीगल किरणें और क्रैनियम प्रकट हों।
- बल का उपयोग करके, क्रैनियम के दोनों ओर शाखास्टीगल किरणों को पकड़ें। क्रेनियम से किसी भी शेष ऊतक के टुकड़ों को हटाने के लिए बल की एक और जोड़ी का उपयोग करें। वी-आकार का ऑप्टिकल चियास्म जो मस्तिष्क और आंखों को जोड़ता है, दिखाई देना चाहिए।
- मस्तिष्क से दोनों आंखों को अलग करने के लिए कैंची का उपयोग करके ऑप्टिकल चियास्म काटें। धीरे से क्रैनियम को मुक्त करने के लिए बल का उपयोग करें।
- क्रैनियम के पृष्ठीय पक्ष से मांसपेशियों को खुरचने के लिए क्रैनियम को उल्टा करें और बल का उपयोग करें।
- क्रैनियम को जगह में रखने के लिए बल की एक जोड़ी का उपयोग करें और मस्तिष्क को प्रकट करते हुए, क्रेनियम की हड्डियों को धीरे से हटाने के लिए बल की एक और जोड़ी का उपयोग करें।
- मस्तिष्क सफेद और नरम दिखाई देता है। एक बार दिखाई देने के बाद, सभी कपाल हड्डियों को हटाने की आवश्यकता नहीं होती है। धीरे-धीरे उठाने और खुरचने से मस्तिष्क को साफ बल के साथ हटा दें।
- फ्लैश मस्तिष्क को सूखी बर्फ पर संग्रहीत माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखकर फ्रीज करता है।
नोट: जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि लाइब्रेरी पीढ़ी के लिए प्रसंस्करण करते समय बैच प्रभाव को सीमित करने के लिए एक साथ संसाधित किए जाने वाले सभी नमूने एकत्र नहीं किए जाते हैं। जबकि -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों को अनिश्चित काल तक संग्रहीत नहीं किया जा सकता है, यह प्रोटोकॉल गुणवत्ता में कोई उल्लेखनीय गिरावट के साथ 12 महीने तक संग्रहीत किलीफिश दिमाग पर सफलतापूर्वक किया गया है।
2. ताजा बफर तैयार करें
- नाभिक वॉश बफर (1x PBS में 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए], फॉस्फेट-बफर्ड खारा pH 7.4, और 0.2 U/μL RNase अवरोधक) तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें। आठ नमूनों तक के लिए 250 एमएल नाभिक धोने बफर तैयार करें। 250 एमएल के लिए, 10% बीएसए स्टॉक समाधान के 50 एमएल, 10x PBS स्टॉक समाधान के 25 mL, 40 U/ μL RNase अवरोधक स्टॉक के 1.25 mL का उपयोग करें, और फिर RNASe-मुक्त ddH 2 O के साथ250mL तक मात्रा लाएं।
- नाभिक लाइसिस बफर (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.01875% v/v NP-40, और 0.2 U/μL RNase इनहिबिटर) तैयार करें और बर्फ पर स्टोर करें। आठ नमूनों तक के लिए 10 एमएल नाभिक लाइसिस बफर तैयार करें। 10 एमएल के लिए, 1 एम ट्राइस-एचसीएल पीएच 7.4 स्टॉक समाधान के 100 μL का उपयोग करें, 5 M NaCl स्टॉक समाधान का20 μL, 1 M MgCl 2 स्टॉक समाधान का 30 μL, 10% NP-40 स्टॉक समाधान का 18.75 μL, 40 U/μL RNase अवरोधक स्टॉक का 50 μL, और फिर RNASe-मुक्त ddH2O के साथ मात्रा को 10 mL तक लाएं।
3. नाभिक को अलग करें
- जमे हुए नमूनों का उपयोग करते समय, उन्हें 10 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलाएं। यदि ताजा विच्छेदित दिमाग का उपयोग कर रहे हैं, तो सीधे चरण 3.2 पर आगे बढ़ें
नोट: हालांकि यह प्रोटोकॉल एकल दिमाग पर काम कर सकता है, युवा मछली (5-6 सप्ताह पुराने) के छोटे नमूनों में खराब उपज होगी। मछली की उम्र और लिंग की परवाह किए बिना, एक नमूने के रूप में दो दिमागों को संसाधित करके पर्याप्त पैदावार प्राप्त की जा सकती है (तालिका 1)। इस प्रोटोकॉल ने 5-26 सप्ताह की आयु की मछलियों से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक को सफलतापूर्वक अलग कर दिया है, जिसमें जीआरजेड और जेडएमजेड 1001 दोनों उपभेदों के जानवर शामिल हैं। अन्य उपभेदों पर इस प्रोटोकॉल को लागू करने में कोई समस्या अपेक्षित नहीं है। - मस्तिष्क को 1 एमएल बर्फ-ठंडे नाभिक लाइसिस बफर में 2 एमएल डौंस होमोजेनाइज़र में डुबोएं। होमोजेनाइज़र को बर्फ पर रखें और नमूने को लाइस करते समय बुलबुले पैदा करने से बचें। 180° ट्विस्ट प्रति चक्र के साथ 0.5 s/downstroke और 0.5 s/upstroke की अनुमानित दर पर डौंस करें। 15 स्ट्रोक के लिए ढीले मूसल का उपयोग करना, या जब तक अतिरिक्त स्ट्रोक की आवश्यकता होती है तो ऊतक / लाइसिस बफर मिश्रण सजातीय दिखाई देता है।
नोट: डौंस होमोजेनाइज़र को धोया जाना चाहिए, आसुत पानी से धोया जाना चाहिए, और उपयोग के बीच मानक शुष्क आटोक्लेव नसबंदी चक्रों के साथ निष्फल किया जाना चाहिए।- छोटे ब्रेक के साथ 30 स्ट्रोक के लिए तंग मूसल का उपयोग करें, 30 सेकंड से 1 मिनट, हर 10 स्ट्रोक। 180° ट्विस्ट प्रति चक्र के साथ 0.5 s/downstroke और 0.5 s/upstroke की अनुमानित दर पर डौंस करें। नमूने को 2 मिनट के लिए डौंस होमोजेनाइज़र में बर्फ पर आराम करने दें।
नोट: यह इनक्यूबेशन समय पर्याप्त लाइसिस सुनिश्चित करता है लेकिन परमाणु अतिलिसिस देखे जाने पर इसे छोटा किया जाना चाहिए।
- छोटे ब्रेक के साथ 30 स्ट्रोक के लिए तंग मूसल का उपयोग करें, 30 सेकंड से 1 मिनट, हर 10 स्ट्रोक। 180° ट्विस्ट प्रति चक्र के साथ 0.5 s/downstroke और 0.5 s/upstroke की अनुमानित दर पर डौंस करें। नमूने को 2 मिनट के लिए डौंस होमोजेनाइज़र में बर्फ पर आराम करने दें।
- नमूने को 70 μm सेल फ़िल्टर के माध्यम से 5% बीएसए में 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में छान लें।
- चरण 3.3 से 70 μm सेल फ़िल्टर पर वॉश बफर को पाइप करके नमूने में 4 एमएल नाभिक वॉश बफर जोड़ें और धीरे से पांच बार व्युत्क्रम द्वारा मिलाएं।
नोट: यह नाभिक की वसूली के लिए अनुमति देता है जो फिल्टर पर फंस सकता है और उपज में सुधार कर सकता है। - सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 500 x g, 4 °C पर झूलती बाल्टी रोटर का उपयोग करके। एक तरल अपशिष्ट रिसेप्टेक में धीरे से डालकर सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। नमूने को एक सीधी स्थिति में वापस लाएं और पी 1000 पिपेट का उपयोग करके शेष वॉश बफर को हटा दें।
नोट: एक नमूने में दो दिमागों से शुरू होने पर नाभिक गोली दिखाई देने की संभावना है। हालांकि, युवा जानवरों (5-6 सप्ताह पुराने) से एकल दिमाग को संसाधित करते समय, कम उपज की उम्मीद है, और छर्रों हमेशा दिखाई नहीं दे सकते हैं। इस मामले में, ट्यूब के तल पर गोली की स्थिति को मानते हुए सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाना चाहिए। - तुरंत नाभिक को 1 एमएल नाभिक धोने के बफर में एक विस्तृत बोर पी 1000 पिपेट टिप के साथ पुन: निलंबित करें।
- 4 एमएल नाभिक धो बफर जोड़कर नमूने को 5 एमएल तक लाएं और धीरे से पांच बार उलटा करके मिलाएं। सेंट्रीफ्यूज 10 मिनट के लिए 500 x g, 4 °C पर झूलती बाल्टी रोटर का उपयोग करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
- नाभिक को 1 एमएल नाभिक में पुन: निलंबित करें और एक विस्तृत बोर पिपेट टिप के साथ बफर धोएं और एक प्रवाह साइटोमेट्री (एफएसीएस) ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 300 μL मलबा हटाने का घोल (सामग्री की तालिका) जोड़ें और मिश्रण के सजातीय होने तक एक विस्तृत बोर टिप के साथ पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं।
- चरण 3.9 में तैयार किए गए नाभिक समाधान के शीर्ष पर धीरे-धीरे 1 एमएल नाभिक धोने का बफर पी 1000 पिपेट का उपयोग करके और ट्यूब को मामूली कोण पर पकड़ना (पूरक चित्र 2)। मलबे हटाने के समाधान अंश और नाभिक धोने बफर अंश को सही ढंग से स्तरित होने पर एक स्पष्ट इंटरफ़ेस बनाना चाहिए।
- 10 मिनट के लिए 3000 x g, 4 °C पर एक झूलती बाल्टी रोटर में सेंट्रीफ्यूज। पी 1000 पिपेट का उपयोग करके शीर्ष दो चरणों को पूरी तरह से त्याग दें।
नोट: स्पष्ट एफएसीएस ट्यूब सेंट्रीफ्यूजेशन (ऊपर, इंटरफेज, नीचे) के बाद तीन अलग-अलग चरणों के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देगा। अधिकतम मलबे को हटाने की सुविधा के लिए, शीर्ष दो चरणों को हटाने में रूढ़िवादी की तुलना में अधिक आक्रामक होने की सलाह दी जाती है (यानी, नीचे के चरण की एक छोटी मात्रा को हटाना किसी भी शीर्ष चरण को ले जाने के लिए बेहतर है; पूरक चित्र 2)। इसके अतिरिक्त, इंटरफेज़ परत कल्पना करने के लिए बहुत पतली हो सकती है। इस मामले में, शीर्ष (स्पष्ट) परत को हटा दें, जिसमें इंटरफेज परत होती है। बनाए रखी गई निचली परत में ~ 1 एमएल कुल मात्रा होनी चाहिए। - निचली परत को 5% बीएसए के साथ प्रीकोट किए गए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- शंक्वाकार ट्यूब में, नाभिक धोने बफर के साथ मात्रा को 15 एमएल तक लाएं और मिश्रण करने के लिए तीन बार उलटा करें।
- 10 मिनट के लिए 1000 x g, 4 °C पर एक झूलती बाल्टी रोटर में सेंट्रीफ्यूज। सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें।
- एक विस्तृत बोर पिपेट टिप का उपयोग करके 150 μL नाभिक धो बफर में तुरंत पुन: निलंबित करें।
- पूरे नमूने को ऊपर उठाएं और फिर पिपेट टिप के अंत में 40 μm ऑन-टिप फ़िल्टर संलग्न करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि नमूने को निष्कासित न किया जाए।
नोट: छोटी मात्रा प्राप्त करने के लिए ऑन-टिप फिल्टर आवश्यक हैं, जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त नाभिक एकाग्रता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। उदाहरण के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग करके एसएनआरएनए-सेक के लिए, >300 नाभिक / 1 एल की न्यूनतम एकाग्रता की सिफारिश की जाती है, हालांकि इष्टतम सीमा 700-1200 नाभिक / यदि आवश्यक हो तो नाभिक की उच्च सांद्रता को भी आसानी से पतला किया जा सकता है। - फ़िल्टर के माध्यम से नमूने को कम डीएनए बाइंडिंग 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में जबरन निष्कासित करके नमूने को फ़िल्टर करें। अंतिम क्षालन मात्रा 120-150 μL होनी चाहिए।
नोट: निस्पंदन के परिणामस्वरूप कुछ झाग हो सकते हैं। यह नाभिक की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करता है।
4. माइक्रोस्कोपी द्वारा नाभिक की गुणवत्ता का आकलन करें
- एक अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, फ़िल्टर किए गए नमूने के 10 μL को कोमल पिपेटिंग द्वारा 0.4% ट्रिपैन ब्लू समाधान के 10 μL के साथ मिलाएं। नमूने को समय के विस्तारित इनक्यूबेशन आवश्यकता नहीं होती है और ट्रिपैन ब्लू समाधान के साथ मिश्रण के तुरंत बाद विज़ुअलाइज़ेशन के लिए तैयार होते हैं।
- दाग वाले नाभिक के 10 μL को एक गिनती कक्ष स्लाइड के कक्ष में जमा करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, दाग वाले नाभिक के नमूने के 10 μL को हेमोसाइटोमीटर या माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर जमा करें और कवर स्लिप के साथ कवर करें। - प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा नाभिक की गुणवत्ता का आकलन करें।
नोट: कम आवर्धन का उपयोग केवल नाभिक पर ज़ूम इन करने के लिए किया जाना चाहिए, क्योंकि नाभिक दोष केवल उच्च आवर्धन (यानी, 60x या उच्चतर) पर स्पष्ट रूप से स्पष्ट होंगे। यह कदम नाभिक तैयारी की सफलता का आकलन करने के लिए जल्दी से किया जा सकता है और दृश्य निरीक्षण से परे माध्यमिक विश्लेषण की आवश्यकता नहीं है। उच्च गुणवत्ता, बरकरार नाभिक में तेजी से परिभाषित सीमा20 (चित्रा 2 ए) होगी। खराब गुणवत्ता वाले नाभिक में परमाणु झिल्ली बाधित होगी, परमाणु झिल्ली के पास पैची ट्रिपैन नीला धुंधलापन संभावित न्यूक्लिक एसिड रिसाव का संकेत देगा, और / याब्लेबिंग 20 (चित्रा 2 बी) के सबूत। स्वस्थ नाभिक व्यास में 10-15 μm होने की उम्मीद है।
5. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एकल नाभिक, मलबे और एकाधिक अनुपात की मात्रा निर्धारित करें
नोट: प्रवाह साइटोमीटर सॉफ्टवेयर की विशिष्ट शब्दावली और इंटरफ़ेस मशीन के ब्रांड के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, लेकिन यदि आवश्यक हो तो इन चरणों को आसानी से अन्य प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
- एफएसीएस ट्यूब में, 1:10 कमजोर पड़ने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के लिए अनुशंसित बफर के 90 μL में फ़िल्टर किए गए नाभिक के नमूने के 10 μL को पुन: निलंबित करें। इस उद्देश्य के लिए, इस अध्ययन में 2 एमएम ईडीटीए और 0.5% बीएसए के साथ 0.22 μm फ़िल्टर्ड स्टरलाइज़्ड पीबीएस, पीएच 7.2 का उपयोग किया जाता है।
नोट: यद्यपि यह कमजोर पड़ने वाला अधिकांश नाभिक तैयारियों के लिए काम करेगा, कम उपज नमूने के मामले में गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए पर्याप्त नाभिक का नमूना लेने के लिए कम कमजोर पड़ने (जैसे, 1: 5) की आवश्यकता हो सकती है (यानी, पतला नमूने में <30 नाभिक / - नमूनों को प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ 1 μg / mL की अंतिम सांद्रता पर दाग दें। कोई इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता नहीं है, और नाभिक का तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है।
नोट: वैकल्पिक रूप से, नमूने को 0.1 μg / mL DAPI की अंतिम एकाग्रता के साथ दाग दें। ध्यान दें कि DAPI को PI (Vioblue-A V1-A चैनल; 405 nm पर उत्तेजना, 450/50 nm पर उत्सर्जन) की तुलना में एक अलग प्रतिदीप्ति चैनल पर पढ़ा जाना चाहिए। - प्रवाह साइटोमीटर पर नमूने का विश्लेषण निम्नानुसार करें:
- कोई कार्यस्थान सेट करें:
- अधिग्रहण मोड में प्रवाह साइटोमीटर रखें। फ़ाइल पर क्लिक करें, फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से नया कार्यस्थान का चयन करें. बाएं पैनल में प्रयोग टैब के तहत, परियोजना का नाम और नमूना आईडी उनके संबंधित क्षेत्रों में दर्ज करें।
- ऊपरी बाएँ टूलबार में, नई विश्लेषण विंडो बटन (स्कैटर प्लॉट आइकन) पर क्लिक करें। पॉप-अप मेनू से तीन प्लॉट (प्लॉट 4 टी) वाले बॉक्स पर क्लिक करें। स्क्रीन पर तीन प्लॉट दिखाई देंगे। ऊपरी बाएं टूलबार (एक आइकन) में विश्लेषण मोड बटन पर क्लिक करें ताकि यह ग्रे हो और नारंगी न हो।
- विश्लेषण प्लॉट सेट करें:
- तीन भूखंडों के अक्षों को क्रमशः X-अक्ष और Y-अक्ष के रूप में क्रमबद्ध करें:
प्लॉट 1: एक्स-अक्ष: एफएससी-ए, वाई-अक्ष: एसएससी-ए
प्लॉट 2: एक्स-अक्ष: एचडीआर-टी, वाई-अक्ष: एसएससी-ए
प्लॉट 3: एक्स-अक्ष: PERCP-Vio700-A B3-A, Y-अक्ष: SSC-A - अक्ष लेबल पर क्लिक करके और ड्रॉप-डाउन मेनू से वांछित चैनल का चयन करके अक्षों को बदलें।
- प्रत्येक प्लॉट के ऊपरी दाएं कोने के बगल में दिखाई देने वाले स्क्वायर ग्रे "आई" आइकन पर क्लिक करके भूखंडों को घनत्व रंग-कोडित करने के लिए सेट करें। एक गुण विंडो बाईं ओर बटन के एक पैनल के साथ खुलती है। गुण विंडो में, स्कैटरप्लॉट आइकन पर क्लिक करें (पैनल के बाईं ओर शीर्ष से दूसरा)। OK पर क्लिक करें।
नोट: PerCP-Vio700-A B3-A प्रतिदीप्ति चैनल 488 nm पर उत्तेजना और 650-730 nm रेंज में उत्सर्जन से मेल खाता है।
- तीन भूखंडों के अक्षों को क्रमशः X-अक्ष और Y-अक्ष के रूप में क्रमबद्ध करें:
- उपकरण सेटिंग्स सेट करें:
- बाएं पैनल में चैनल टैब पर क्लिक करें। सभी चैनलों की एक सूची दाईं ओर तीन बक्से के साथ दिखाई देगी। दाईं ओर अपने संबंधित पहले बक्से पर नीचे तीर पर क्लिक करके और ड्रॉप-डाउन मेनू से Hlog का चयन करके B3, FSC-A और SSC-A को Hlog पर सेट करें। एसएससी के वोल्टेज को 640 वी, एफएससी को 300 वी और बी 3 से 480 वी पर सेट करें, इन संख्याओं को उनके संबंधित मध्य बक्से में दाईं ओर टाइप करके और एंटर कुंजी दबाकर। नोट दाईं ओर तीसरा बॉक्स एक टॉगल है जिसका उपयोग टाइपिंग के लिए वैकल्पिक रूप से किया जा सकता है।
- ट्रिगर हेडर के तहत, नीचे तीर पर क्लिक करके, बाईं ओर ड्रॉप-डाउन मेनू से उनका चयन करके, दाईं ओर बॉक्स में नंबर टाइप करके, और फिर एंटर कुंजी दबाकर एफएससी ट्रिगर को 4 और एसएससी और बी 3 ट्रिगर को 0 पर सेट करें। ध्यान दें कि दाईं ओर एक टॉगल बॉक्स है जिसका उपयोग वैकल्पिक रूप से टाइप करने के लिए किया जा सकता है।
नोट: पीएमटी वोल्टेज को प्रत्येक विशेष प्रवाह साइटोमेट्री मशीन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है, लेकिन नाभिक के लिए ट्रिगर आमतौर पर कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले से कम होना चाहिए। इसके अलावा, अक्ष पैमाने को एच-लॉग पर सेट किया जाना चाहिए।
- फ्लो सॉफ्टवेयर विंडो के बाईं ओर टेक्स्ट बॉक्स नमूना वॉल्यूम में 100 μL और टेक्स्ट बॉक्स अपटेक वॉल्यूम में 50 μL टाइप करें। सत्यापित करें कि इस चरण में लाइसिंग नाभिक से बचने के लिए मिक्स सैंपल पैरामीटर मिक्स जेंटल पर सेट है। प्रवाह शुरू करने के लिए निचले दाएं कोने पर एक सर्कल (प्ले आइकन) के भीतर त्रिकोण दबाएं।
- प्रवाह गुणवत्ता की जाँच करें:
- नमूने में हवा के बुलबुले या झुरमुट की जांच के लिए साइड स्कैटर क्षेत्र (एसएससी-ए) बनाम एचडीआर-टी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि यह प्लॉट बिंदुओं की एक चिकनी निरंतरता है। एयर बबल या झुरमुट के परिणामस्वरूप एसएससी-ए बनाम एचडीआर-टी प्लॉट में खाली क्षेत्र होंगे।
- नमूने के लिए उपयोग किए गए वोल्टेज को सही सत्यापित करने के लिए साइड स्कैटर (एसएससी-ए) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी-ए) प्लॉट की जांच करें।
नोट: कोशिकाओं के विपरीत, नाभिक एक साइड स्कैटर बनाम फॉरवर्ड स्कैटर प्लॉट में मलबे से पूरी तरह से हल नहीं होगा। हालांकि, मलबे के अनुरूप पृष्ठभूमि में घटनाओं (कूलर रंग) के कम घनत्व के साथ नाभिक (गर्म रंग) के अनुरूप भूखंड के मध्य की ओर घटनाओं का एक उच्च घनत्व समूह होना चाहिए।
- नाभिक गणना और गुणवत्ता का विश्लेषण करें:
- बढ़े हुए दृश्य के लिए SSC-A बनाम PerCp-Vio-700A प्लॉट पर डबल क्लिक करें। क्वाड्रंट गेट का चयन करने के लिए लंबवत रेखाओं (क्वाड्रंट) के साथ ऊपरी बाएं टूलबार पर बटन पर क्लिक करें। फिर, एसएससी-ए बनाम परसीपी-वियो -700 ए प्लॉट में कहीं भी क्लिक करें और प्लॉट के अंदर क्वाड्रंट दिखाई देंगे।
- क्वाड्रंट विभाजन रेखाओं पर कहीं भी क्लिक करें और क्वाड्रंट प्लेसमेंट को संशोधित करने के लिए कर्सर को स्लाइड करें। चतुर्थांश को इस तरह रखें कि ऊपरी बाएं चतुर्थांश में सबसे दूर बाईं आबादी (मलबा) होती है, और ऊपरी दाएं चतुर्थांश में कई टियरड्रॉप के आकार के क्लस्टर (नाभिक) होते हैं (गेट सेटअप के लिए चित्रा 3 देखें और मलबे को हटाने के चरण सहित या नहीं सहित तैयारी के साथ विशिष्ट परिणामों के लिए प्रवाह परिणामों के उदाहरण देखें)।
- मलबे बनाम नाभिक की गिनती:
- प्रॉपर्टी विंडो खोलने के लिए प्लॉट के ऊपरी दाएं कोने में स्क्वायर ग्रे "आई" आइकन पर क्लिक करें। क्षेत्र फ़ंक्शन टैब पर क्लिक करें; प्लॉट क्षेत्रों और कार्यों की सूची दिखाई देगी।
- क्षेत्र सूची के तहत, शीर्ष आइटम के बगल में एक हरा चेक मार्क सुनिश्चित करें, यह दर्शाता है कि पूरे भूखंड का चयन किया गया है। फ़ंक्शंस सूची के तहत, हरे रंग का चेक मार्क बनाने के लिए काउंट/L पर क्लिक करें। ओके पर क्लिक करें, और प्रत्येक क्वाड्रंट में एक गिनती / μL मीट्रिक दिखाई देगा।
- कच्ची गणना और प्रतिशत देखने के लिए, यदि वांछित हो तो क्षेत्र फ़ंक्शंस टैब से गणना और %-T का चयन करें. ऊपरी बाएं और दाएं चतुर्थांश में गणना / μL क्रमशः मलबे और नाभिक उपज के अनुरूप है।
- सिंगलेट गिनती:
- ऊपरी दाएं चतुर्थांश के निचले हिस्से में बाएं-सबसे आंसू के आकार का क्लस्टर सिंगल्स का प्रतिनिधित्व करता है। ऊपरी बाएं टूलबार पर बहुभुज बटन (बहुभुज) पर क्लिक करके इस आबादी के चारों ओर एक बहुभुज द्वार खींचें।
- एकल समय पर क्लिक करें, ड्राइंग शुरू करने के लिए माउस स्लाइड करें, और गेट के रैखिक खंड को समाप्त करने और अगला शुरू करने के लिए फिर से क्लिक करें। गेट खत्म करने के लिए डबल क्लिक करें। गेट की सीमा पर क्लिक करें और गेट को पुनर्स्थापित करने के लिए माउस स्लाइड करें।
- आकृति को संशोधित करने के लिए गेट के शीर्ष पर क्लिक करें। गेटेड आबादी (सिंगल्स) की गणना / यह प्रारंभिक कमजोर पड़ने के साथ नाभिक तैयारी की एकाग्रता है।
नोट: आगे स्कैटर क्षेत्र बनाम ऊंचाई 1: 1 रैखिक संबंध, आमतौर पर बहने वाली कोशिकाओं के दौरान एकल दर निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, नाभिक पर लागू नहीं होता है और इसकी अवहेलना की जा सकती है।
- पतला नाभिक की एकाग्रता और कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करके, प्रारंभिक तैयारी की एकाग्रता की गणना करें (उदाहरण के लिए, 1: 10 कमजोर पड़ने के लिए, देखी गई एकाग्रता को 10 से गुणा करें)। >300 नाभिक /μL से सांद्रता snRNA-seq के लिए उपयुक्त हैं।
- कोई कार्यस्थान सेट करें:
Representative Results
यहां वर्णित किलीफिश मस्तिष्क नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल विशेष रूप से किलीफिश के लिए अनुकूलित है और चित्र 1 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। नाभिक निष्कर्षण के अलावा, प्रोटोकॉल पृथक नाभिक की गुणवत्ता और मात्रा का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों का विवरण देता है। चित्रा 2 प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में स्वस्थ (चित्रा 2 ए) और अस्वास्थ्यकर (चित्रा 2 बी) नाभिक दोनों के उदाहरण दिखाता है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयुक्त स्वस्थ नाभिक (चित्रा 2 ए) बरकरार झिल्ली के साथ एकल नाभिक के रूप में मौजूद हैं। जैसा कि चित्रा 2 बी में दिखाया गया है, इस प्रोटोकॉल (और अन्य नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल) का सबसे आम विफलता मोड अत्यधिक नाभिक की पीढ़ी है, जो क्षतिग्रस्त परमाणु झिल्ली की विशेषता है। यह अक्सर नाभिक के झुरमुट की ओर जाता है और टूटे हुए नाभिक से न्यूक्लिक एसिड के रिसाव के कारण डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में पृष्ठभूमि संकेतों में योगदान कर सकता है। यदि अत्यधिक झुरमुट देखा जाता है, तो हम डूंस चरणों के दौरान सौम्य होने और / या लाइसिस बफर में इनक्यूबेशन समय को कम करने की सलाह देते हैं।
यह प्रोटोकॉल पृथक नाभिक की संख्या को निर्धारित करने और एक नमूने में एकाधिक नाभिक के सापेक्ष अनुपात को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। इसके अतिरिक्त, फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग दूषित मलबे की सापेक्ष सामग्री का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, अक्सर टूटे हुए नाभिक के टुकड़े और अन्य सेलुलर मलबे जो नाभिक के नमूने में डाउनस्ट्रीम परख को हानिकारक रूप से प्रभावित कर सकते हैं। प्रतिनिधि प्रवाह डेटा चित्रा 3 में देखा जा सकता है। एक उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक अलगाव प्रक्रिया का उत्पादन होगा: 1) एक छोटा मलबा अंश, और 2) एकल बनाम एकाधिक नाभिक का एक उच्च अंश (नाभिक अंश का 80% >)। पीआई धुंधला का उपयोग, जो न्यूक्लिक एसिड को दाग देता है, एकल नाभिक को मलबे और एकाधिक नाभिक से अलग करने की अनुमति देता है। चित्रा 3 ए मलबे से दूषित एक प्रेप का एक उदाहरण है, जबकि चित्रा 3 बी एक उच्च गुणवत्ता वाले प्रयोग का एक उदाहरण है।
चित्रा 1: किलीफिश मस्तिष्क नाभिक अलगाव वर्कफ़्लो। जमे हुए या ताजा किलीफिश दिमाग से नाभिक अलगाव के लिए प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो। एक बार पृथक और मूल्यांकन किए जाने के बाद, नाभिक का उपयोग विभिन्न डाउनस्ट्रीम "ओमिक्स" विश्लेषणों के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: माइक्रोस्कोपी द्वारा नाभिक की गुणवत्ता का आकलन। नाभिक को 0.4% ट्रिपैन ब्लू के घोल में 1: 1 मिलाया गया था और 60x पर ब्राइटफील्ड इमेजिंग द्वारा इको रिवॉल्व माइक्रोस्कोप पर कल्पना की गई थी। नाभिक एक एकल के रूप में मौजूद है और परमाणु झिल्ली बरकरार है। (बी) खराब गुणवत्ता वाले नाभिक का एक उदाहरण। परमाणु झिल्ली क्षतिग्रस्त हो जाती है, और नाभिक एक डबल में झुरमुट होते हैं, संभवतः चिपचिपे डीएनए के रिसाव के कारण, जिसे सबसे ऊपरी नाभिक के शीर्ष से लीक होते देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नाभिक परिमाणीकरण और शुद्धता मूल्यांकन। नाभिक के नमूने पीआई के 1:100 कमजोर पड़ने से दागदार थे और प्रवाह साइटोमीटर पर चलते थे। नाभिक (ए, बी) के ऊपरी दाएं चतुर्थांश में एकल और बहुगुणित रूपों में मौजूद होते हैं, जिसमें घटनाओं के सबसे कम बादल के रूप में सिंगलेट होते हैं, जिसके बाद बढ़ते क्रम में डबल्स, ट्रिपल आदि होते हैं। मलबे को सबसे बाएं दो चतुर्थांशों में घटनाओं द्वारा चिह्नित किया गया है। (ए) कम गुणवत्ता वाले नाभिक तैयारी का एक उदाहरण, जहां मलबे को हटाने के चरण को छोड़ दिया गया था और मलबे >40% घटनाओं का निर्माण करता है। (बी) एक उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक नमूने का एक उदाहरण, जिसमें शामिल मलबे को हटाने का कदम है। इस उदाहरण में, मलबे प्रवाह साइटोमीटर द्वारा पंजीकृत सभी घटनाओं का <10% बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| नमूना प्रकार (2 दिमाग) | औसत उपज (4 स्वतंत्र तैयारी) |
| 5 सप्ताह के पुरुष दिमाग | 3.59 ± 1.76 x 105 |
| 10 सप्ताह के पुरुष दिमाग | 6.41 ± 1.33 x 105 |
| 15 सप्ताह के पुरुष दिमाग | 14.59 ± 2.05 x 105 |
| 5 सप्ताह की महिला दिमाग | 2.54 ± 0.75 x 105 |
| 10 सप्ताह महिला दिमाग | 4.66 ± 1.29 x 105 |
| 15 सप्ताह महिला दिमाग | 7.95 ± 3.51 x 105 |
तालिका 1: सेक्स और उम्र में अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश के दो दिमागों से औसत अपेक्षित पैदावार। औसत पैदावार 10 5 नाभिकके रूप में व्यक्त की जाती है ± प्रत्येक श्रेणी में चार स्वतंत्र नाभिक तैयारी पर औसत की मानक त्रुटि होती है।
पूरक चित्रा 1: मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके नाभिक अलगाव की गुणवत्ता की तुलना और जमे हुए किलीफिश दिमाग पर हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल। (ए) माइक्रोस्कोपी द्वारा नाभिक गुणवत्ता मूल्यांकन। नाभिक को 0.4% ट्रिपैन ब्लू के घोल में 1: 1 मिलाया गया था और 60x पर ब्राइटफील्ड इमेजिंग द्वारा माइक्रोस्कोप पर कल्पना की गई थी। नाभिक के नमूने पीआई के 1:100 कमजोर पड़ने से दागदार थे और प्रवाह साइटोमीटर पर चलते थे। (ग) विभिन्न बेंचमार्क प्रोटोकॉल के साथ माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा गुणवत्ता मूल्यांकन मैट्रिक्स का सारांश। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 2: मलबे हटाने के चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (क) मलब हटाने की पूर्व-सेंट्रीफ्यूजेशन परत की योजना। (ख) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सतह पर तैरने वाले को हटाने की योजना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग किलीफिश दिमाग से उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को विशेष रूप से किलीफिश मस्तिष्क के लिए डिज़ाइन किया जाना था क्योंकि विशिष्ट स्तनधारी-आधारित मस्तिष्क नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल किलीफिश दिमाग पर लागू होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप हमारे हाथों में खराब नाभिक की गुणवत्ता होती है। हमें संदेह है कि यह उनके स्तनधारी समकक्षों की तुलना में किलीफिश मस्तिष्क की कम सापेक्ष माइलिन सामग्री के कारण है, जो स्तनधारी मस्तिष्क कोशिका लाइसिस के लिए आवश्यक कठोर परिस्थितियों के जवाब में लाइस और क्लंप होगा। यह प्रोटोकॉल उम्र बढ़ने और किलीफिश क्षेत्रों में एक प्रगति है क्योंकि यह कशेरुक मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के लागत और समय प्रभावी मॉडल में एकल-कोशिका स्तर पर मस्तिष्क की उम्र बढ़ने की खोज की सुविधा प्रदान करता है।
यह प्रोटोकॉल ताजा या जमे हुए नमूनों के लिए मजबूत है, हालांकि ताजा या जमे हुए ऊतक का उपयोग करते समय डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों पर विचार करना चाहिए। जमे हुए ऊतक अक्सर सुविधाजनक होते हैं क्योंकि इसे महीनों तक एकत्र और संग्रहीत किया जा सकता है जबकि नमूने एकत्र किए जाते हैं। इस तरह के नमूने एसएनआरएनए-सेक जैसे अनुप्रयोगों के लिए सुरक्षित रूप से उपयोग किए जा सकते हैं। हालांकि, ठंड के नमूने परमाणु संरचना को बाधित कर सकते हैं और इस प्रकार एटीएसी-सेक21 द्वारा क्रोमैटिन परिदृश्य को सटीक रूप से मापने की क्षमता। इस प्रकार, थोक एटीएसी-सेक या एसएनएटीएसी-सेक जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, जमे हुए दिमाग के बजाय ताजा विच्छेदित दिमाग का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, क्योंकि मस्तिष्क होमोजेनाइजेशन के बाद सभी चरण समानांतर में किए जा सकते हैं, यह प्रोटोकॉल एक उचित समय सीमा में कई नमूने चलाने के लिए उत्तरदायी है, इस प्रकार बर्फ पर लंबे समय तक इनक्यूबेशन के कारण आरएनए क्षरण को सीमित करता है।
इसके अलावा, नाभिक निष्कर्षण करने के बफर को ताजा (घंटों के भीतर) तैयार करना अनिवार्य है। हमने पाया कि प्रोटोकॉल शुरू करने से तुरंत पहले डिटर्जेंट के साथ-साथ बीएसए को बफर में जोड़ा जाना चाहिए। केवल लवण (पीबीएस, एनएसीएल, आदि) वाले बफर को एकाग्रता के रूप में बनाया जा सकता है, फ़िल्टर निष्फल (0.22 μm), और कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल तक संग्रहीत किया जा सकता है। बीएसए स्टॉक समाधान नाभिक निष्कर्षण के दिनों के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार, निष्फल और संग्रहीत किया जा सकता है (यदि पाउडर से तैयार किया गया है) लेकिन प्रोटोकॉल शुरू करने से तुरंत पहले इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर में हमेशा जोड़ा जाना चाहिए। हालांकि, हम प्रोटोकॉल के दिन बीएसए समाधान तैयार करने की सलाह देते हैं। यदि किसी तीसरे पक्ष से पूर्वनिर्मित बीएसए समाधान का उपयोग कर रहे हैं, तो ताजा, खुली बोतलों का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। ताजा बीएसए का उपयोग करने से आम तौर पर नाभिक की तैयारी में मलबे की मात्रा कम हो जाती है।
चाहे ताजा या जमे हुए नमूने इनपुट के रूप में उपयोग किए जाते हैं, नाभिक अलगाव के बाद नाभिक की गुणवत्ता का आकलन करना महत्वपूर्ण है। हालांकि यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से अतिलिसिस से बचने के लिए डिज़ाइन किया गया है, यह नाभिक की गुणवत्ता के नुकसान का सबसे आम कारण है। ओवरलिसिस का परिणाम लाइसिस बफर में बहुत अधिक समय बिताने, नाभिक के अत्यधिक खुरदरे हैंडलिंग जैसे कि मानक बोर पिपेट टिप के साथ अत्यधिक पाइपिंग, या नाभिक अलगाव और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (>1 घंटे) के बीच अत्यधिक समय बिताने के कारण हो सकता है। अत्यधिक नाभिक में अक्सर परमाणु पेरिफेरीज क्षतिग्रस्त होते हैं, जो डीएनए को लीक करते हैं और झुरमुट का कारण बनते हैं (चित्रा 2 बी)। इससे मल्टीपल्स की संख्या में वृद्धि होगी और पृष्ठभूमि न्यूक्लिक एसिड का योगदान होगा जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों, विशेष रूप से एसएनआरएनए-सेक में हस्तक्षेप करेगा। नाभिक अलगाव के बाद माइक्रोस्कोपी द्वारा दोनों गुणों का मूल्यांकन किया जा सकता है। यदि अत्यधिक परमाणु झुरमुट देखा जाता है, तो हम ओवरलिसिस की संभावना को कम करने के लिए इनक्यूबेशन लाइसिस चरण को छोटा करने की कोशिश करने की सलाह देते हैं। नाभिक सिंगल्स को बढ़ाने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में, फ्लोरेसेंस-असिस्टेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग इस प्रोटोकॉल के डाउनस्ट्रीम सिंगल्स के लिए समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, हम ध्यान दें कि, जमे हुए ऊतक से पहले से ही नाजुक नाभिक के साथ काम करते समय, छंटाई के दौरान होने वाले कतरनी तनाव से परमाणु टूटना बढ़ सकता है और इस प्रकार परिवेश आरएनए / डीएनए में वृद्धि हो सकती है। इसके अलावा, हम ध्यान दें कि कई नमूनों को संसाधित करते समय नाभिक के लिए एफएसीएस उपज प्रकार चलाने के लिए आवश्यक समय के लिए सभी नाभिक के नमूनों को घंटों तक बर्फ पर रहने की आवश्यकता होगी, जबकि अन्य नमूनों को क्रमबद्ध किया जा रहा है। इस प्रकार, एफएसीएस दृष्टिकोण के समानांतर कई नमूनों को संसाधित करते समय प्रतीक्षा समय में वृद्धि से समग्र रूप से नाभिक की गुणवत्ता कम हो सकती है और आरएनए क्षरण का खतरा बढ़ सकता है। इस प्रकार, यदि एफएसीएस कम दोगुनी दर के लिए वांछित है, तो हम अनुशंसा करते हैं कि उपज प्रकार के बाद मलबे की सामग्री को फिर से जांचा जाना चाहिए और संभावित चेतावनी के रूप में एकल सेल आरएनए-सेक अनुप्रयोगों के लिए संभावित कम आरएनए गुणवत्ता को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
नाभिक की गणना और एकल अनुपात का एक सटीक अनुमान लगभग सभी डाउनस्ट्रीम "ओमिक्स" अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक है और अत्यंत महत्वपूर्ण है। आकार द्वारा नाभिक को आसानी से गेट और गिनने की क्षमता के कारण, फ्लो साइटोमेट्री नाभिक की गणना करने का सबसे सटीक तरीका है जिसका हमने आकलन किया है। वैकल्पिक रूप से, कोई इनविट्रोजेन काउंटेस 2 एफएल ऑटोमेटेड सेल काउंटर या डीनोविक्स सेलड्रॉप ऑटोमेटेड सेल काउंटर जैसे सेल काउंटर का उपयोग करके नाभिक की मात्रा निर्धारित कर सकता है। ध्यान देने के लिए, इनविट्रोजेन के काउंटेस 2 एफएल ऑटोमेटेड सेल काउंटर, और बहुत कम हद तक डीनोविक्स, मलबे को नाभिक के रूप में गिनकर नाभिक की गिनती को अधिक महत्व देते हैं, जिसका अर्थ है कि मैन्युअल आकार गेटिंग की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमीटर किसी को नाभिक की शुद्धता का आसानी से आकलन करने की अनुमति देता है। कोई मात्रात्मक तरीके से एकल बनाम एकाधिक नाभिक के सापेक्ष अनुपात को समझ सकता है जो माइक्रोस्कोपी द्वारा मुश्किल है। यह एसएनआरएनए-सेक और एसएनटीएसी-सेक के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे प्रोटोकॉल एकाधिक नमूनों के अधिशेष से पीड़ित होंगे, जिन्हें डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए। मल्टीपल्स के अलावा, "मलबे" (खंडित नाभिक, सेलुलर मलबे) के सापेक्ष अनुपात को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित किया जा सकता है और अपेक्षाकृत कम होना चाहिए, क्योंकि इस सामग्री में अक्सर दूषित न्यूक्लिक एसिड होते हैं जो पृष्ठभूमि संकेत और भ्रष्ट एकल नाभिक "ओमिक्स" डेटा का योगदान कर सकते हैं।
जैसा कि पहले वर्णित नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल के साथ होता है, मूल ऊतक में सेल प्रकारों के अनुपात को नाभिक प्रीप19 में ईमानदारी से पुन: परिभाषित नहीं किया जा सकता है, और इस प्रकार सावधानी के साथ व्याख्या की जानी चाहिए। ध्यान देने के लिए, सभी टेलोस्ट की तरह, अफ्रीकी फ़िरोज़ा किलीफ़िश में न्यूक्लियेटेड एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, जिन्हें नाभिक की तैयारी में भी प्रतिनिधित्व करने की उम्मीद है। इन नाभिकों को हीमोग्लोबिन जीन की उच्च अभिव्यक्ति / पहुंच द्वारा एसएनआरएनए-सेक और एसएनएटीएएसी-सेक डेटासेट में पहचाना जा सकता है और वांछित होने पर कम्प्यूटेशनल रूप से बाहर रखा जा सकता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
कुछ पैनल BioRender.com के साथ उत्पन्न किए गए थे। हमारी प्रयोगशाला में इस काम को एनआईए टी 32 एजी 052374 पोस्टडॉक्टरल ट्रेनिंग ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था, एजिंग ब्रेन में प्लास्टिसिटी के लिए सिमंस सहयोग के हिस्से के रूप में सिमंस फाउंडेशन से अनुदान, नेविज फाउंडेशन से एक पायलट अनुदान, और बीएबी को हैनसन-थोरेल फैमिली अवार्ड।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
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