Summary
Здесь мы представляем протокол для выделения ядер из мозга короткоживущей модели позвоночных Nothobranchius furzeri для последующих применений, таких как секвенирование одноядерной РНК или одноядерный анализ для транспозазно-доступного хроматина с секвенированием (ATAC-seq).
Abstract
Изучение старения мозга при одноклеточном разрешении в системах позвоночных остается сложной задачей из-за стоимости, времени и технических ограничений. Здесь мы демонстрируем протокол для генерации одноядерных библиотек секвенирования РНК (snRNA-seq) из мозга естественно недолговечных африканских бирюзовых рыб-убийц Nothobranchius furzeri. Африканская бирюзовая киллифиш имеет продолжительность жизни 4-6 месяцев и может быть размещена экономически эффективным образом, что снижает затраты и временные барьеры для изучения старения мозга позвоночных. Тем не менее, необходимы индивидуальные протоколы для выделения ядер достаточного качества для последующих одноклеточных экспериментов из мозга молодых и пожилых рыб. Здесь мы демонстрируем эмпирически оптимизированный протокол для выделения высококачественных ядер из мозга взрослых африканских бирюзовых киллифишей, что является критическим шагом в создании высококачественных одноядерных омических библиотек. Кроме того, мы показываем, что шаги по снижению загрязняющей фоновой РНК важны для четкого разграничения типов клеток. Таким образом, этот протокол демонстрирует целесообразность изучения старения мозга у нетрадиционных модельных организмов позвоночных.
Introduction
Понимание механизмов старения мозга позвоночных имеет решающее значение для решения возрастных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и деменция1. Африканская бирюзовая киллифиш (Nothobranchus furzeri) является самым короткоживущим позвоночным, которое можно разводить в неволе, и из-за его короткой продолжительности жизни и возрастных когнитивных нарушений, это отличная модель старения мозга 2,3,4,5. В последнее время появление одноклеточных «омических» технологий, таких как одиночные ядра RNA-seq (snRNA-seq) и анализ одноядер для транспозазно-доступного хроматина с секвенированием (snATAC-seq), позволили исследователям опрашивать стареющий мозг с беспрецедентным разрешением 6,7,8. Эти методы основаны на выделении ядер, поскольку восстановление клеток мозга, таких как нейроны, часто слишком сложно выделить 6,7,8,9,10. Однако большинство опубликованных протоколов выделения ядер оптимизированы для модельных организмов млекопитающих 11,12,13,14,15. Таким образом, поскольку в настоящее время существует неудовлетворенная потребность в выделении ядер мозга у киллифиша в качестве перспективного нового модельного организма в области исследований старения2, целью этого протокола является создание метода выделения высококачественных ядер из замороженной ткани киллифиша мозга.
Здесь установлен оптимизированный и надежный рабочий процесс, который использует общедоступные материалы для выделения высококачественных ядер из мозга киллифиша. Этот протокол был модифицирован из 10-кратного протокола геномики для мозга мыши, чтобы приспособиться к более низкому содержанию миелина в мозге африканской бирюзовой киллифиш, хрупкости замороженной ткани и необходимости снижения содержания мусора в окружающей среде для приложений, связанных с секвенированием16. Действительно, ранее оптимизированные протоколы длямозговой ткани млекопитающих 17,18 приводят к плохому качеству ядер (т.е. чрезмерному анализу) и/или высокому содержанию мусора при использовании на замороженном мозге киллифиш, что делает их непригодными для использования с snRNA-seq в соответствии с рекомендациями по одноядерным РНК-seq с использованием микрофлюидики (дополнительный рисунок 1).
В дополнение к выделению ядер мы демонстрируем, как оценивать качество и выход ядер с помощью микроскопии и проточной цитометрии. В этой статье приведены примеры как оптимальных, так и неоптимальных результатов, а также обсуждаются способы устранения неполадок. Этот протокол был разработан и оптимизирован для замороженного мозга киллифиша, но также может использоваться без серьезных модификаций на свежерассеченных образцах киллифиш. Ядра мозга Killifish, выделенные с помощью этого метода, были оптимизированы для использования в одноядренном RNA-seq (snRNA-seq) в качестве последующего приложения, но также должны поддаваться использованию в snATAC-seq и объемном ATAC-seq.
Protocol
Уход за животными и эксперименты на животных проводились в соответствии с Университетом Южной Калифорнии IACUC в соответствии с утвержденными протоколами No 21215. Для любой работы с использованием этого протокола необходимо получить одобрение от IACUC учреждения до начала любой исследовательской работы на позвоночных животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полный прогон протокола, начиная со флэш-замороженной ткани мозга (начиная с шага 3), должен занять ~ 2,5 ч для шести образцов (рисунок 1).
1. Рассечение мозга киллифиша
- Гуманно усыпляют киллифиш, используя раствор 1,5 г/л метаносульфоната/трикаина (MS-222) в системной воде.
- Используйте острые ножницы, чтобы быстро обезглавить киллифиш после того, как все движения тела и жабр прекратились.
- Рассекните обезглавленную голову на чистой чашке Петри, как описано ранее19.
- Поместите блюдо под рассекающий микроскоп (используя диапазон увеличения 8x-35x). Поверните голову так, чтобы ветвиостегальные лучи оказались в фокусе
- С помощью ножниц прорежьте зубной протез так, чтобы были выявлены ветвиостегальные лучи и череп.
- Используя щипцы, удерживайте ветвиостеговые лучи по обе стороны черепа. Используйте еще одну пару щипцов, чтобы удалить оставшиеся фрагменты ткани из черепа. V-образный оптический хиазм, который соединяет мозг и глаза, должен стать видимым.
- Вырежьте оптический хиазм ножницами, чтобы отделить оба глаза от мозга. Используйте щипцы, чтобы мягко освободить череп.
- Переверните череп и используйте щипцы, чтобы соскоблить мышцу с дорсальной стороны черепа.
- Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать череп на месте, и другую пару щипцов, чтобы аккуратно удалить кости черепа, раскрывая мозг.
- Мозг кажется белым и мягким. После того, как он виден, не требуется удалять все черепные кости. Удалите мозг чистыми щипцами, осторожно поднимая и соскабливая.
- Вспышка замораживает мозг, помещая его в микроцентрифужную трубку, хранящуюся на сухом льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная ткань мозга может храниться при -80 °C до тех пор, пока не будут собраны все образцы, подлежащие обработке вместе, чтобы ограничить пакетные эффекты при обработке для генерации библиотеки. В то время как образцы, хранящиеся при -80 ° C, не могут храниться бесконечно, этот протокол был успешно выполнен на мозге киллифиша, хранящемся до 12 месяцев без заметного снижения качества.
2. Подготовьте свежие буферы
- Подготавливают промывной буфер ядер (2% бычьего сывороточного альбумина [BSA] в 1x PBS, фосфатно-буферный физиологический раствор pH 7,4 и ингибитор РНКазы 0,2 ЕД/мкл) и хранят на льду. Подготовьте 250 мл промывочного буфера ядер для восьми образцов. Для 250 мл используйте 50 мл 10% раствора BSA, 25 мл 10-кратного раствора PBS, 1,25 мл из запаса ингибитора РНКазы 40 Ед/мкл, а затем доведите объем до 250 мл с РНКаз-свободным ddH2O.
- Готовят буфер лизиса ядер (10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 0,01875% v/v NP-40 и ингибитор РНКазы 0,2 Ед/мкл) и хранят на льду. Подготовьте 10 мл буфера лизиса ядер для восьми образцов. Для 10 мл используют 100 мкл 1 M Tris-HCl pH 7,4 стокового раствора, 20 мкл 5 М Раствора NaCl, 30 мкл 1 М МгCl2 исходного раствора, 18,75 мкл 10% раствора NP-40, 50 мкл из запаса ингибитора РНКАзы 40 Ед/мкл, а затем доводят объем до 10 мл с РНГаз-свободным ddH2O.
3. Изолируйте ядра
- При использовании замороженных образцов разморозьте их на льду в течение 10 мин. При использовании свежерассеченного мозга перейдите непосредственно к шагу 3.2
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя этот протокол может работать на одном мозге, меньшие образцы из молодых рыб (5-6 недель) будут иметь более низкий выход. Достаточные урожаи всегда можно получить, обработав два мозга как один образец, независимо от возраста и пола рыбы (табл. 1). Этот протокол успешно изолировал высококачественные ядра из рыб в возрасте 5-26 недель, включая животных из штаммов GRZ и ZMZ1001. При применении этого протокола к другим штаммам не ожидается никаких проблем. - Обработайте мозг 1 мл ледяного буфера лизиса ядер в гомогенизаторе Dounce объемом 2 мл. Держите гомогенизатор на льду и избегайте образования пузырьков при лизировании образца. Выполняйте упражнения с приблизительной скоростью 0,5 с/нисходящий ход и 0,5 с/восходящий ход с поворотом 180° за цикл. Используйте рыхлый пестик в течение 15 ударов или до тех пор, пока буферная смесь ткани/лизиса не станет однородной, если необходимы дополнительные штрихи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизаторы Dounce следует мыть, промывать дистиллированной водой и стерилизовать стандартными циклами сухой автоклавной стерилизации между использованием.- Используйте тугой пестик в течение 30 ударов с небольшими перерывами, от 30 с до 1 мин, каждые 10 ударов. Выполняйте упражнения с приблизительной скоростью 0,5 с/нисходящий ход и 0,5 с/восходящий ход с поворотом 180° за цикл. Дайте образцу покоиться на льду в гомогенизаторе Dounce в течение 2 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации обеспечивает адекватный лизис, но должно быть сокращено, если наблюдается ядерный чрезмерный анализ.
- Используйте тугой пестик в течение 30 ударов с небольшими перерывами, от 30 с до 1 мин, каждые 10 ударов. Выполняйте упражнения с приблизительной скоростью 0,5 с/нисходящий ход и 0,5 с/восходящий ход с поворотом 180° за цикл. Дайте образцу покоиться на льду в гомогенизаторе Dounce в течение 2 минут.
- Процедите образец через 70-мкм клеточный фильтр в коническую трубку объемом 15 мл, предварительно покрытую 5% BSA.
- Добавьте 4 мл буфера промывки ядер в образец путем пипетки промывочного буфера над 70-мкм клеточным фильтром со стадии 3.3 и осторожно перемешайте путем инверсии пять раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет восстанавливать ядра, которые могут быть захвачены на фильтре, и улучшает выход. - Центрифуга с использованием качающегося ротора ковша при 500 х г, 4 °C, в течение 10 мин. Выбросьте супернатант, осторожно перелив его в емкость для жидких отходов. Верните образец в вертикальное положение и извлеките оставшийся буфер промывки с помощью пипетки P1000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы ядер, вероятно, будут видны при запуске с двух мозгов в одном образце. Однако при обработке одиночных мозгов у молодняка (5-6 недель) ожидается более низкий выход, и гранулы могут быть не всегда видны. В этом случае супернатант следует осторожно удалить, принимая положение гранулы на дне трубки. - Немедленно повторно суспендируют ядра в 1 мл промывочного буфера ядер с широким отверстием наконечника пипетки Р1000.
- Доведите образец до 5 мл, добавив 4 мл промывочного буфера ядер и аккуратно перемешайте путем инверсии пять раз. Центрифуга с помощью качающегося ротора ковша при 500 х г, 4 °C, в течение 10 мин и выбросьте супернатант.
- Повторное суспендирование ядер в 1 мл буфера промывки ядер широким отверстием пипетки и перенос в трубку проточной цитометрии (FACS).
- Добавьте 300 мкл раствора для удаления мусора (Таблица материалов) и тщательно перемешайте путем пипетки с широким наконечником отверстия до однородности смеси.
- Аккуратно наложить 1 мл буфера промывки ядер поверх раствора ядер, приготовленного на стадии 3.9, используя пипетку P1000 и удерживая трубку под небольшим углом (дополнительный рисунок 2). Фракция раствора для удаления мусора и буферная фракция промывки ядер должны образовывать четкий интерфейс при правильном наложении.
- Центрифуга в качающемся роторе ковша при 3000 x g, 4 °C, в течение 10 мин. Полностью откажитесь от двух верхних фаз с помощью пипетки P1000.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачная трубка FACS позволит визуализировать три отдельные фазы после центрифугирования (верхняя, межфазная, нижняя). Чтобы облегчить максимальное удаление мусора, рекомендуется быть более агрессивным, чем консервативным при удалении двух верхних фаз (т.е. удаление небольшого количества нижней фазы предпочтительнее переноса любой из верхних фаз); Дополнительный рисунок 2). Кроме того, межфазный слой может быть слишком тонким для визуализации. В этом случае удаляют верхний (кажущийся) слой, который содержит межфазный слой. Нижний слой, который сохраняется, должен содержать ~1 мл общего объема. - Переложите нижний слой на коническую трубку объемом 15 мл, предварительно покрытую 5% BSA.
- В конической трубке доведите объем до 15 мл с буфером промывки ядер и трижды переверните для смешивания.
- Центрифуга в качающемся роторе ковша при 1000 х г, 4 °C, в течение 10 мин. Удалите супернатант осторожно.
- Немедленно повторно суспендировать в 150 мкл буфера промывки ядер с помощью широкого отверстия наконечника пипетки.
- Переключитесь на стандартный наконечник пипетки с отверстием, установленный на ~300 мкл. Захватите весь образец, а затем прикрепите фильтр с наконечником 40 мкм к концу наконечника пипетки, следя за тем, чтобы не выгнать образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтры с наконечником необходимы для получения меньших объемов, которые необходимы для поддержания достаточной концентрации ядер для последующих применений. Например, для snRNA-seq с использованием микрофлюидики рекомендуется минимальная концентрация >300 ядер/мкл, хотя оптимальный диапазон составляет 700-1200 ядер/мкл18. Более высокие концентрации ядер также могут быть легко разбавлены при необходимости. - Отфильтруйте образец, принудительно вытеснив образец через фильтр в микроцентрифужную трубку с низким содержанием ДНК, связывающую 1,5 мл. Конечный объем элюирования должен составлять 120-150 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторая пена может возникнуть в результате фильтрации. Это, по-видимому, не влияет на качество ядер.
4. Оценка качества ядер с помощью микроскопии
- В отдельной микроцентрифужной трубке смешайте 10 мкл отфильтрованного образца с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего цвета путем щадящей пипетки. Образцы не требуют длительного времени инкубации и готовы к визуализации сразу после смешивания с раствором трипан синего цвета.
- Внесите 10 мкл окрашенных ядер в камеру слайда счетной камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы нанесите 10 мкл окрашенного образца ядер на гемоцитометр или микроскопический слайд и накройте крышкой. - Оцените качество ядер с помощью световой микроскопии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкие увеличения следует использовать только для увеличения ядер, поскольку дефекты ядер будут визуально видны только при более высоких увеличениях (т. Е. 60x или выше). Этот шаг может быть выполнен быстро для оценки успешности подготовки ядер и не требует вторичного анализа за пределами визуального осмотра. Высококачественные, интактные ядра будут иметь резко очерченную границу20 (рисунок 2A). Ядра низкого качества будут иметь нарушенные ядерные мембраны, пятнистое синее окрашивание трипана вблизи ядерной мембраны, указывающее на потенциальную утечку нуклеиновых кислот, и / или доказательства блеббинга20 (рисунок 2B). Здоровые ядра должны быть 10-15 мкм в диаметре.
5. Количественная оценка синглетных ядер, обломков и мультиплетной пропорции с помощью проточной цитометрии
ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретная терминология и интерфейс программного обеспечения проточного цитометра могут отличаться в зависимости от марки машины, но эти шаги должны быть легко адаптированы к другим системам, если это необходимо.
- В пробирке FACS повторно суспендировать 10 мкл отфильтрованного образца ядер в 90 мкл буфера, рекомендованного для проточной цитометрии для разбавления 1:10. Для этой цели в данном исследовании используется 0,22 мкм отфильтрованный стерилизованный PBS, pH 7,2, с 2 мМ ЭДТА и 0,5% BSA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это разбавление будет работать для большинства препаратов ядер, может потребоваться более низкое разбавление (например, 1:5) для отбора достаточного количества ядер для оценки качества в случае образца с более низким выходом (т.е. ядра <30/мкл в разбавленном образце). - Окрашивают образцы йодидом пропидия (PI) в конечной концентрации 1 мкг/мл. Время инкубации не требуется, и ядра могут быть проанализированы немедленно.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы окрашивают образцы конечной концентрацией 0,1 мкг/мл DAPI. Обратите внимание, что DAPI следует считывать на канале флуоресценции, отличном от PI (канал Vioblue-A V1-A; возбуждение при 405 нм, излучение при 450/50 нм). - Проанализируйте образцы на проточном цитометре следующим образом:
- Настройте рабочую область:
- Иметь проточный цитометр в режиме захвата. Нажмите «Файл», затем выберите «Новая рабочая область» в раскрывающемся меню. На вкладке Эксперимент на левой панели введите имя проекта и идентификатор образца в соответствующие поля.
- На левой верхней панели инструментов нажмите кнопку Новое окно анализа (значок точечной диаграммы). Щелкните поле с тремя графиками (Plot 4t) во всплывающем меню. На экране появятся три сюжета. Нажмите кнопку «Режим анализа» на верхней левой панели инструментов (значок A), чтобы она была серой, а не оранжевой.
- Настройка графиков анализа:
- Измените оси трех графиков следующим образом, упорядоченные как оси X и Y соответственно:
График 1: Ось X: FSC-A, ось Y: SSC-A
График 2: Ось X: HDR-T, Ось Y: SSC-A
График 3: Ось X: PerCP-Vio700-A B3-A, ось Y: SSC-A - Измените оси, щелкнув метку оси и выбрав нужный канал в раскрывающемся меню.
- Задайте для участков цветовую кодировку плотности, щелкнув квадратный серый значок «i», который появляется рядом с правым верхним углом каждого участка. Откроется окно Свойства с панелью кнопок слева. В окне Свойства нажмите на значок Scatterplot (второй сверху слева от панели). Нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный канал PerCP-Vio700-A B3-A соответствует возбуждению при 488 нм и излучению в диапазоне 650-730 нм.
- Измените оси трех графиков следующим образом, упорядоченные как оси X и Y соответственно:
- Настройка настроек прибора:
- Нажмите на вкладку Каналы на левой панели. Появится список всех каналов с тремя полями справа. Установите для B3, FSC-A и SSC-A значение Hlog , щелкнув стрелку вниз в соответствующих первых полях справа и выбрав Hlog в раскрывающемся меню. Установите напряжение SSC на 640 В, FSC на 300 В и B3 на 480 В, введя эти цифры в соответствующих средних полях справа и нажав клавишу Enter . Обратите внимание, что третье поле справа представляет собой переключатель, который можно использовать поочередно для ввода текста.
- Под заголовком Триггер установите для триггера FSC значение 4, а для триггеров SSC и B3 значение 0, щелкнув стрелку вниз, выбрав их в раскрывающемся меню слева, введя число в поле справа и нажав клавишу ВВОД . Обратите внимание, что справа есть переключатель, который можно использовать в качестве альтернативы вводу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение PMT должно быть оптимизировано для каждой конкретной проточной цитометрической машины, но триггер для ядер должен быть ниже, чем тот, который обычно используется для клеток. Кроме того, для масштаба оси должно быть установлено значение h-log.
- Введите 100 мкл в текстовом поле Объем образца и 50 мкл в текстовом поле Объем поглощения в левой части окна программного обеспечения потока. Убедитесь, что для параметра Mix Sample установлено значение Mix Gentle , чтобы избежать лизирования ядер на этом шаге. Нажмите треугольник внутри круга (значок воспроизведения ) в правом нижнем углу, чтобы запустить поток.
- Проверьте качество потока:
- Используйте область бокового рассеяния (SSC-A) по сравнению с HDR-T, чтобы проверить наличие пузырьков или сгустков воздуха в образце. Убедитесь, что этот график представляет собой гладкий континуум точек. Пузырьки или сгустки воздуха приведут к пустым областям на графике SSC-A против HDR-T.
- Проверьте график бокового рассеяния (SSC-A) и прямого рассеяния (FSC-A), чтобы убедиться, что используемые напряжения верны для образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от клеток, ядра не будут полностью рассасываться из обломков в боковом рассеянии против прямого рассеяния. Однако к середине участка должно быть скопление событий высокой плотности, соответствующее ядрам (более теплого цвета) с более низкой плотностью событий (более холодным цветом) на фоне, соответствующем обломкам.
- Анализ количества и качества ядер:
- Дважды щелкните график SSC-A и PerCp-Vio-700A для увеличения. Нажмите кнопку на верхней левой панели инструментов с перпендикулярными линиями (квадрант), чтобы выбрать ворота квадранта. Затем щелкните в любом месте графика SSC-A vs. PerCp-Vio-700A , и квадранты появятся внутри участка.
- Щелкните в любом месте разделительных линий квадранта и проведите курсором, чтобы изменить расположение квадранта. Поместите квадранты таким образом, чтобы верхний левый квадрант содержал крайнюю левую популяцию (мусор), а верхний правый квадрант содержал несколько каплевидных кластеров (ядер) (см. Рисунок 3 для установки затвора и примеры результатов Потока для типичных результатов с препами, включая или не включая этап удаления мусора).
- Количество мусора и ядер:
- Нажмите на квадратный серый значок «i» в правом верхнем углу участка, чтобы открыть окно «Свойства ». Перейдите на вкладку Функции региона ; появятся списки областей и функций участка.
- В списке Регионы установите зеленую галочку рядом с верхним элементом, указывая, что выбран весь участок. Под списком Функции щелкните Количество/мкл , чтобы создать зеленую галочку. Нажмите OK, и метрика counts/μL появится в каждом квадранте.
- Чтобы просмотреть необработанные счетчики и проценты, при необходимости выберите Количество и %-T на вкладке Функции региона . Количество/мкл в верхнем левом и правом квадрантах соответствует выходу мусора и ядер соответственно.
- Количество синглетов:
- Самое левое каплевидное скопление в нижней части верхнего правого квадранта представляет синглеты. Нарисуйте полигональные ворота вокруг этой популяции, нажав кнопку полигона (Polygon) на верхней левой панели инструментов.
- Щелкните один раз, проведите мышью, чтобы начать рисование, и щелкните еще раз, чтобы закончить линейный сегмент ворот и начать следующий. Дважды щелкните, чтобы закончить ворота. Щелкните границу ворот и проведите мышью, чтобы изменить положение ворот.
- Щелкните вершины ворот, чтобы изменить фигуру. Появится количество/мкл закрытой популяции (синглетов). Это концентрация ядра при первоначальном разведении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Линейное соотношение области прямого рассеяния и высоты 1:1, обычно используемое для определения скорости синглета при протекании клеток, не применяется к ядрам и может быть проигнорировано.
- Используя концентрацию разбавленного ядра и коэффициент разбавления, повторно рассчитайте концентрацию исходного препарата (например, для разбавления 1:10 умножьте наблюдаемую концентрацию на 10). Концентрации из ядер >300/мкл пригодны для snRNA-seq.
- Настройте рабочую область:
Representative Results
Описанный здесь протокол выделения ядер мозга киллифиш оптимизирован специально для киллифиша и обобщен на рисунке 1. В дополнение к извлечению ядер, протокол детализирует различные методы оценки качества и количества изолированных ядер. На рисунке 2 показаны примеры как здоровых (рисунок 2A), так и нездоровых (рисунок 2B) ядер, оцениваемых с помощью световой микроскопии. Здоровые ядра, пригодные для последующего анализа (рисунок 2A), присутствуют в виде синглетных ядер с интактными мембранами. Как показано на рисунке 2B, наиболее распространенным режимом отказа этого протокола (и других протоколов изоляции ядер) является генерация чрезмерно разрозненных ядер, которые характеризуются поврежденными ядерными мембранами. Это часто приводит к слипанию ядер и может способствовать фоновым сигналам в последующих приложениях из-за утечки нуклеиновых кислот из разорванных ядер. Если наблюдается чрезмерное слипание, мы рекомендуем быть более мягкими во время этапов доунса и / или сократить время инкубации в буфере лизиса.
Этот протокол использует проточную цитометрию для количественной оценки числа изолированных ядер и определения относительной доли мультиплетных ядер в образце. Кроме того, проточная цитометрия может быть использована для оценки относительного содержания загрязняющих обломков, часто разорванных фрагментов ядер и другого клеточного мусора, которые могут пагубно влиять на последующие анализы в образце ядер. Репрезентативные данные о потоке можно увидеть на рисунке 3. Высококачественная процедура выделения ядер даст: 1) небольшую фракцию мусора и 2) высокую фракцию синглета по сравнению с мультиплетными ядрами (> 80% фракции ядер). Использование окрашивания PI, которое окрашивает нуклеиновые кислоты, позволяет отделять синглетные ядра от мусора и множественных ядер. Рисунок 3А является примером подготовки, загрязненной мусором, тогда как рисунок 3В является примером высококачественного эксперимента.
Рисунок 1: Рабочий процесс выделения ядер мозга Killifish. Экспериментальный рабочий процесс для выделения ядер из замороженного или свежего мозга рыбы-убийцы. После выделения и оценки ядра могут быть использованы для различных последующих «омических» анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка качества ядер с помощью микроскопии. Ядра были смешаны 1:1 в растворе 0,4% Trypan Blue и визуализированы на микроскопе Echo Revolve с помощью визуализации яркого поля в 60x. (A) Пример высококачественного ядра. Ядро присутствует в виде синглета, а ядерная мембрана неповреждена. (B) Пример некачественных ядер. Ядерные мембраны повреждаются, и ядра слипаются в дублет, вероятно, из-за утечки липкой ДНК, которую можно увидеть протекающей из верхней части самого верхнего ядра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Количественная оценка ядер и оценка чистоты с помощью проточной цитометрии. Образцы ядер окрашивали разбавлением ПИ 1:100 и запускали на проточном цитометре. Ядра присутствуют в синглетных и мультиплетных формах в правом верхнем квадранте (A,B) с синглетами как наименьшим облаком событий, за которым следуют дублеты, триплеты и т. д. в порядке возрастания. Обломки отмечены событиями в двух левых квадрантах. (A) Пример подготовки низкокачественных ядер, когда этап удаления мусора был опущен, а мусор составляет >40% событий. (B) Пример высококачественного образца ядер с включенным этапом удаления мусора. В этом примере мусор составляет <10% всех событий, зарегистрированных проточным цитометром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Тип образца (2 мозга) | Средняя урожайность (4 независимых препарата) |
| 5-недельный мужской мозг | 3,59 ± 1,76 x 105 |
| 10-недельный мужской мозг | 6,41 ± 1,33 x 105 |
| 15-недельный мужской мозг | 14,59 ± 2,05 x 105 |
| 5-недельный женский мозг | 2,54 ± 0,75 x 105 |
| 10-недельный женский мозг | 4,66 ± 1,29 x 105 |
| 15-недельный женский мозг | 7,95 ± 3,51 x 105 |
Таблица 1: Средние ожидаемые урожаи двух мозгов африканской бирюзовой киллифиш по полу и возрасту. Средние выходы, выраженные в виде 105 ядер ± стандартной погрешности среднего значения по четырем независимым препаратам ядер в каждой категории.
Дополнительный рисунок 1: Сравнение качества выделения ядер с использованием стандартных протоколов и нашего оптимизированного протокола по замороженному мозгу киллифиша. (A) Оценка качества ядер с помощью микроскопии. Ядра смешивали 1:1 в растворе 0,4% трипанового синего цвета и визуализировали на микроскопе с помощью визуализации яркого поля при 60x. (B) Количественных ядер и нагрузки мусора с помощью проточной цитометрии. Образцы ядер окрашивали разбавлением ПИ 1:100 и запускали на проточном цитометре. (C) Резюме показателей оценки качества с помощью микроскопии и проточной цитометрии с использованием различных эталонных протоколов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Схематическое изображение этапов удаления мусора. А) Схема удаления мусора, наслоения предварительного центрифугирования. (B) Схема удаления супернатанта после центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Представленный здесь протокол может быть использован для воспроизводимого генерирования высококачественных ядер из мозга киллифиша. Этот протокол должен был быть специально разработан для мозга киллифиша, поскольку типичные протоколы изоляции ядер мозга млекопитающих, применяемые к мозгу киллифиш, последовательно приводили к ухудшению качества ядер в наших руках. Мы подозреваем, что это связано с более низким относительным содержанием миелина в мозге киллифиша по сравнению с их коллегами-млекопитающими, которые будут лизироваться и сгущаться в ответ на суровые условия, необходимые для лизиса клеток мозга млекопитающих. Этот протокол является прогрессом в области старения и киллифиша, поскольку он облегчает исследование старения мозга на уровне одной клетки в дорогостоящей и эффективной по времени модели старения мозга позвоночных.
Этот протокол надежен для свежих или замороженных образцов, хотя при использовании свежей или замороженной ткани необходимо учитывать последующие применения. Замороженная ткань часто удобна, так как ее можно собирать и хранить в течение нескольких месяцев, пока собираются образцы. Такие образцы могут быть безопасно использованы для таких применений, как snRNA-seq. Однако замораживание образцов может нарушить ядерную структуру и, следовательно, способность точно измерять ландшафт хроматина с помощью ATAC-seq21. Таким образом, для последующих применений, таких как объемный ATAC-seq или snATAC-seq, рекомендуется использовать свежерассеченный мозг вместо замороженного мозга. Кроме того, поскольку все этапы после гомогенизации мозга могут выполняться параллельно, этот протокол поддается запуску нескольких образцов в разумные сроки, тем самым ограничивая деградацию РНК, вызванную длительной инкубацией на льду.
Кроме того, необходимо подготовить буферы, свежие (в течение нескольких часов) после извлечения ядер. Мы обнаружили, что моющие средства, а также BSA должны быть добавлены в буферы непосредственно перед началом протокола. Буферы, содержащие только соли (PBS, NaCl и т.д.), могут быть изготовлены в виде концентратов, стерилизованы фильтром (0,22 мкм) и храниться неопределенно долго при комнатной температуре. Растворы BSA могут быть приготовлены, стерилизованы и сохранены при 4°C в течение нескольких дней после экстракции ядер (если они приготовлены из порошка), но всегда должны быть добавлены к буферам, используемым в настоящем протоколе, непосредственно перед выполнением протокола. Тем не менее, мы рекомендуем готовить растворы BSA в день протокола. При использовании готовых растворов BSA от третьей стороны рекомендуется использовать свежие, неоткрытые бутылки. Использование свежего BSA обычно приводит к снижению содержания мусора в ядрах препов.
Независимо от того, используются ли свежие или замороженные образцы в качестве входных данных, важно оценить качество ядер после выделения ядер. Хотя этот протокол специально разработан, чтобы избежать чрезмерного анализа, это наиболее распространенная причина потери качества ядер. Чрезмерный анализ может быть результатом слишком большого количества времени, проведенного в буфере лизиса, чрезмерно грубого обращения с ядрами, такого как чрезмерное пипетирование стандартным наконечником пипетки, или чрезмерного количества времени, затрачиваемого между выделением ядер и последующим применением (>1 ч). Чрезмерно разрозненные ядра часто имеют поврежденные ядерные периферии, которые просачиваются в ДНК и вызывают слипание (рисунок 2B). Это приведет к увеличению числа мультиплетов и внесет фоновые нуклеиновые кислоты, которые будут мешать последующим приложениям, особенно snRNA-seq. Оба качества могут быть оценены с помощью микроскопии после выделения ядер. Если наблюдается чрезмерное слипание ядер, мы рекомендуем попытаться сократить инкубацию стадии лизиса, чтобы уменьшить вероятность чрезмерного лизиса. В качестве альтернативного метода увеличения синглетов ядер флуоресцентная сортировка клеток (FACS) может быть использована для обогащения синглетов ниже по этому протоколу. Однако мы отмечаем, что при работе с уже хрупкими ядрами из замороженной ткани напряжение сдвига, возникающее во время сортировки, может привести к увеличению ядерного разрыва и, следовательно, к увеличению окружающей РНК/ДНК. Кроме того, мы отмечаем, что время, необходимое для проведения сортировки выходов FACS для ядер при обработке нескольких образцов, потребует, чтобы все образцы ядер оставались на льду в течение нескольких часов, в то время как другие образцы сортируются. Таким образом, увеличение времени ожидания при обработке нескольких образцов параллельно с подходом FACS также может привести к общему снижению качества ядер и увеличению риска деградации РНК. Таким образом, если FACS желателен для снижения скорости дублетирования, мы рекомендуем, чтобы содержание мусора было проверено еще раз после сортировки выхода и чтобы возможное снижение качества РНК было принято во внимание для одноклеточных применений РНК-seq в качестве потенциального предостережения.
Точная оценка количества ядер и солидетной пропорции имеет важное значение почти для всех последующих применений «омики» и имеет первостепенное значение. Благодаря способности легко засекречивать и подсчитывать ядра по размеру, проточная цитометрия является наиболее точным методом подсчета ядер, который мы оценили. В качестве альтернативы можно количественно определить ядра с помощью клеточных счетчиков, таких как автоматизированный клеточный счетчик Countess 2 FL от Invitrogen или автоматизированный клеточный счетчик DeNovix CellDrop. Следует отметить, что автоматизированный счетчик клеток Графини 2 FL от Invitrogen и в гораздо меньшей степени DeNovix, как правило, переоценивают количество ядер, подсчитывая мусор как ядра, что означает, что может потребоваться ручное измерение размера. Кроме того, проточный цитометр позволяет легко оценить чистоту ядер. Можно различить относительную пропорцию синглетных и мультиплетных ядер количественным образом, что трудно с помощью микроскопии. Это жизненно важно для snRNA-seq и snATAC-seq, поскольку эти протоколы будут страдать от избытка мультиплетных образцов, которые должны быть исключены из последующих анализов. В дополнение к мультиплеттам, относительная доля «мусора» (фрагментированные ядра, клеточный мусор) может быть количественно определена с помощью проточной цитометрии и должна быть относительно низкой, поскольку этот материал часто содержит загрязняющие нуклеиновые кислоты, которые могут способствовать фоновому сигналу и повреждать данные «омиков» одного ядра.
Как и в случае с ранее описанными протоколами выделения ядер, пропорции типов клеток в исходной ткани не могут быть точно повторены в ядрах prep19 и, следовательно, должны интерпретироваться с осторожностью. Отметим, что, как и все телеосты, африканские бирюзовые киллифиши имеют ядра эритроцитов, которые, как ожидается, также будут представлены в ядрах преп. Эти ядра могут быть идентифицированы в наборах данных snRNA-seq и snATAC-seq по более высокой экспрессии/доступности генов гемоглобина и при желании могут быть исключены вычислительно.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Некоторые панели были сгенерированы с BioRender.com. Эта работа в нашей лаборатории была поддержана грантом NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant to B.T., грантом от Simons Foundation в рамках Сотрудничества Саймонса по пластичности в стареющем мозге, пилотным грантом от Navigage Foundation и премией семьи Хэнсон-Торелл B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
- Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. The aging brain. Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757 (2018).
- McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
- Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
- Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22 (2021).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542 (2020).
- Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
- Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
- Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
- Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
- Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).
