Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera kärnor från hjärnorna i den kortlivade ryggradsdjursmodellen Nothobranchius furzeri för nedströmsapplikationer såsom enkärnig RNA-sekvensering eller enkärnanalys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering (ATAC-seq).
Abstract
Att studera hjärnans åldrande vid encellsupplösning i ryggradsdjursystem är fortfarande utmanande på grund av kostnad, tid och tekniska begränsningar. Här demonstrerar vi ett protokoll för att generera enkärniga RNA-sekvenseringsbibliotek (snRNA-seq) från hjärnorna hos den naturligt kortlivade ryggradsdjuren African turquoise killifish Nothobranchius furzeri. Den afrikanska turkosa killifisken har en livslängd på 4-6 månader och kan inrymmas på ett kostnadseffektivt sätt, vilket minskar kostnads- och tidsbarriärerna för att studera ryggradsdjurens hjärnåldring. Det behövs dock skräddarsydda protokoll för att isolera kärnor av tillräcklig kvalitet för nedströms encellsexperiment från hjärnan hos unga och åldrade fiskar. Här demonstrerar vi ett empiriskt optimerat protokoll för isolering av högkvalitativa kärnor från hjärnan hos vuxna afrikanska turkos killifish, ett kritiskt steg i genereringen av högkvalitativa enkärniga omiska bibliotek. Dessutom visar vi att stegen för att minska förorenande bakgrunds-RNA är viktiga för att tydligt skilja celltyper. Sammanfattningsvis visar detta protokoll möjligheten att studera hjärnans åldrande i icke-traditionella ryggradsdjurs modellorganismer.
Introduction
Att förstå mekanismerna för ryggradsdjurs hjärnåldring är avgörande för att ta itu med åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och demens1. Den afrikanska turkosa killifisken (Nothobranchus furzeri) är det kortaste levande ryggradsdjuret som kan födas upp i fångenskap, och på grund av dess korta livslängd och åldersassocierade kognitiva försämring är det en utmärkt hjärnåldringsmodell 2,3,4,5. Nyligen har tillkomsten av encells "omics" -teknik, såsom enkärniga RNA-seq (snRNA-seq) och enkärnanalys för transposastillgängligt kromatin med sekvensering (snATAC-seq), gjort det möjligt för forskare att förhöra den åldrande hjärnan med en aldrig tidigare skådad upplösning 6,7,8. Dessa metoder är beroende av kärnisolering, eftersom återhämtningen av hjärnceller som neuroner ofta är för utmanande för att isolera 6,7,8,9,10. De flesta publicerade kärnisoleringsprotokoll är dock optimerade för däggdjursmodellorganismer 11,12,13,14,15. Eftersom det för närvarande finns ett ouppfyllt behov av att isolera hjärnkärnor i killifish som en kommande ny modellorganism inom åldrandeforskning2, är målet med detta protokoll att etablera en metod för att isolera högkvalitativa kärnor från frusen hjärnkillifishvävnad.
Här etableras ett strömlinjeformat och robust arbetsflöde som använder allmänt tillgängliga material för att isolera högkvalitativa kärnor från killifish-hjärnor. Detta protokoll modifierades från ett 10x Genomics-protokoll för mushjärnor för att rymma hjärnan med lägre myelininnehåll hos afrikansk turkos killifish, bräckligheten hos frusen vävnad och behovet av att minska omgivande skräpinnehåll för sekvenseringsrelaterade applikationer16. Faktum är att tidigare optimerade protokoll för däggdjurs hjärnvävnad17,18 leder till dålig kärnkvalitet (dvs. överlys) och/eller högt skräpinnehåll när de används på frysta killifish-hjärnor, vilket gör dem olämpliga för användning med snRNA-seq enligt rekommendationer för RNA-seq med en kärna RNA-seq med hjälp av mikrofluidik (kompletterande figur 1).
Förutom kärnisolering visar vi hur man bedömer kärnornas kvalitet och utbyte genom mikroskopi och flödescytometri. Den här artikeln innehåller exempel på både optimala och suboptimala resultat och diskuterar felsökning. Detta protokoll designades och optimerades för frysta killifish-hjärnor men kan också användas utan större modifieringar på nyligen dissekerade killifish-prover. Killifish hjärnkärnor isolerade med denna metod har optimerats för användning i enkärnig RNA-seq (snRNA-seq) som en nedströms applikation, men bör också vara mottagliga för användning i snATAC-seq och bulk ATAC-seq.
Protocol
Djurvård och djurförsök utfördes i enlighet med University of Southern California IACUC enligt godkända protokoll #21215. För allt arbete som använder detta protokoll är det nödvändigt att erhålla godkännande från institutionens IACUC innan något forskningsarbete om ryggradsdjur påbörjas.
OBS: En fullständig genomgång av protokollet med början från blixtfrusen hjärnvävnad (från och med steg 3) bör ta ~ 2,5 timmar för sex prover (figur 1).
1. Dissekera killifish hjärnor
- Avliva killifish humant med en lösning av 1,5 g / L metanosulfonat / trikain (MS-222) i systemvattnet.
- Använd vass sax för att snabbt halshugga killifish efter att all kropps- och gillrörelse har upphört.
- Dissekera det halshuggna huvudet på en ren petriskål som tidigare beskrivits19.
- Placera skålen under ett dissekerande mikroskop (med ett förstoringsområde på 8x-35x). Vrid huvudet så att de greniostegala strålarna är i fokus
- Skär genom tandbenet med sax så att greniostegalstrålarna och kraniet avslöjas.
- Använd pincett och håll ner greniostegalstrålarna på vardera sidan av kraniet. Använd ett annat par pincett för att ta bort eventuella kvarvarande vävnadsfragment från kraniet. Den V-formade optiska chiasmen som förbinder hjärnan och ögonen ska bli synlig.
- Klipp den optiska chiasmen med sax för att lossa båda ögonen från hjärnan. Använd pincett för att försiktigt frigöra kraniet.
- Vänd kraniet över och använd tång för att skrapa muskeln från kraniets dorsala sida.
- Använd ett par pincett för att hålla kraniet på plats och ett annat par pincett för att försiktigt ta bort benen i kraniet och avslöja hjärnan.
- Hjärnan verkar vit och mjuk. När det är synligt är det inte nödvändigt att ta bort alla kranialben. Ta bort hjärnan med rena pincett genom att försiktigt lyfta och skrapa.
- Blixtfrys hjärnan genom att placera den i ett mikrocentrifugrör lagrat på torris.
OBS: Den frysta hjärnvävnaden kan förvaras vid -80 °C tills alla prover som ska bearbetas tillsammans har samlats in för att begränsa batcheffekter vid bearbetning för biblioteksgenerering. Medan prover som lagras vid -80 ° C inte kan lagras på obestämd tid, har detta protokoll framgångsrikt utförts på killifish-hjärnor som lagrats i upp till 12 månader utan någon märkbar kvalitetsminskning.
2. Förbered färska buffertar
- Förbered kärntvättbuffert (2% bovint serumalbumin [BSA] i 1x PBS, fosfatbuffrat saltlösnings-pH 7,4 och 0,2 U / μL RNas-hämmare) och förvara på is. Förbered 250 ml kärntvättbuffert för upp till åtta prover. För 250 ml, använd 50 ml 10% BSA-stamlösning, 25 ml 10x PBS-stamlösning, 1,25 ml av 40 U / μL RNas-hämmare-stam och bringa sedan volymen till 250 ml med RNAse-friddH2O.
- Förbered kärnlysbuffert (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl 2, 0,01875% v/v NP-40 och0,2 U/μL RNas-hämmare) och förvara på is. Förbered 10 ml kärnlysbuffert för upp till åtta prover. För 10 ml, använd 100 μl 1 M Tris-HCl pH 7,4 stamlösning, 20 μl 5 M NaCl stamlösning, 30 μl 1 M MgCl 2 stamlösning, 18,75 μL av en 10% NP-40 stamlösning, 50 μL av 40 U / μL RNase-hämmare stam och bringa sedan volymen till 10 ml med RNAse-fri ddH2 O.
3. Isolera kärnor
- Om du använder frysta prover, tina dem på is i 10 minuter. Om du använder nyligen dissekerade hjärnor, fortsätt direkt till steg 3.2
OBS: Även om detta protokoll kan fungera på enstaka hjärnor, kommer mindre prover från unga fiskar (5-6 veckor gamla) att ha ett sämre utbyte. Tillräcklig avkastning kan alltid erhållas genom att bearbeta två hjärnor som ett prov, oavsett fiskens ålder och kön (tabell 1). Detta protokoll har framgångsrikt isolerat högkvalitativa kärnor från fisk i åldern 5-26 veckor, inklusive djur från både GRZ- och ZMZ1001-stammar. Det förväntas inga problem med att tillämpa detta protokoll på andra stammar. - Slå hjärnan i 1 ml iskall kärnlysbuffert i en 2 ml Dounce-homogenisator. Håll homogenisatorn på is och undvik att generera bubblor medan du lyserar provet. Slå till med en ungefärlig hastighet på 0,5 s/nedslag och 0,5 s/uppslag med en vridning på 180° per cykel. Slå till med den lösa stöten i 15 slag, eller tills vävnads-/lysbuffertblandningen verkar homogen om ytterligare slag behövs.
OBS: Dounce homogenisatorer ska tvättas, sköljas med destillerat vatten och steriliseras med standard torr autoklavsteriliseringscykler mellan användningarna.- Slå till med den täta stöten i 30 slag med små pauser, 30 s till 1 min, var 10: e slag. Slå till med en ungefärlig hastighet på 0,5 s/nedslag och 0,5 s/uppslag med en vridning på 180° per cykel. Låt provet vila på is i Dounce-homogenisatorn i 2 minuter.
OBS: Denna inkubationstid säkerställer adekvat lys men bör förkortas om nukleär överlys observeras.
- Slå till med den täta stöten i 30 slag med små pauser, 30 s till 1 min, var 10: e slag. Slå till med en ungefärlig hastighet på 0,5 s/nedslag och 0,5 s/uppslag med en vridning på 180° per cykel. Låt provet vila på is i Dounce-homogenisatorn i 2 minuter.
- Sila provet genom ett 70 μm cellfilter i ett 15 ml koniskt rör förbelagt med 5% BSA.
- Tillsätt 4 ml kärntvättbuffert till provet genom att pipettera tvättbufferten över 70 μm cellfiltret från steg 3.3 och blanda försiktigt genom inversion fem gånger.
OBS: Detta möjliggör återvinning av kärnor som kan fångas på filtret och förbättrar utbytet. - Centrifugera med en svängande skoprotor vid 500 x g, 4 °C, i 10 minuter. Kassera supernatanten genom att försiktigt hälla i en behållare för flytande avfall. Sätt tillbaka provet i upprätt läge och ta bort den återstående tvättbufferten med en P1000-pipett.
OBS: Kärnpelleten kommer sannolikt att vara synlig när man börjar från två hjärnor i ett prov. Men vid bearbetning av enstaka hjärnor från unga djur (5-6 veckor gamla) förväntas ett lägre utbyte, och pellets kanske inte alltid är synliga. I detta fall bör supernatanten försiktigt avlägsnas medan den antar pelletens position i botten av röret. - Återsuspendera omedelbart kärnorna i 1 ml kärntvättbuffert med en bred P1000-pipettspets.
- Ta provet till 5 ml genom att tillsätta 4 ml kärntvättbuffert och blanda försiktigt med inversion fem gånger. Centrifugera med en svängande skoprotor vid 500 x g, 4 °C, i 10 minuter och kassera supernatanten.
- Återsuspendera kärnorna i 1 ml kärntvättbuffert med en bred borrpipettspets och överför till ett flödescytometrirör (FACS).
- Tillsätt 300 μl skräpborttagningslösning (materialtabell) och blanda noggrant genom pipettering med en bred borrspets tills blandningen är homogen.
- Lägg försiktigt över 1 ml kärntvättbuffert ovanpå kärnlösningen som beretts i steg 3.9 med hjälp av en P1000-pipett och håll röret i en liten vinkel (kompletterande figur 2). Fraktionen för borttagning av skräp och kärntvättbuffertfraktionen bör bilda ett tydligt gränssnitt om de är korrekt skiktade.
- Centrifugera i en svängande skoprotor vid 3000 x g, 4 °C, i 10 minuter. Kassera helt de två översta faserna med en P1000-pipett.
OBS: Det tydliga FACS-röret tillåter visualisering av de tre distinkta faserna efter centrifugering (topp, interfas, botten). För att underlätta maximal borttagning av skräp rekommenderas det att vara mer aggressiv än konservativ när det gäller att ta bort de två översta faserna (dvs. att ta bort en liten mängd av bottenfasen är att föredra framför att överföra någon av de övre faserna; Kompletterande figur 2). Dessutom kan interfasskiktet vara för tunt för att visualisera. Ta i så fall bort det översta (uppenbara) lagret, som innehåller mellanfasskiktet. Det nedre lagret som behålls bör innehålla ~ 1 ml total volym. - Överför bottenskiktet till ett 15 ml koniskt rör förbelagt med 5% BSA.
- I det koniska röret, bringa volymen till 15 ml med kärnor tvättbuffert och invertera tre gånger för att blanda.
- Centrifugera i en svängande skoprotor vid 1000 x g, 4 °C, i 10 minuter. Ta bort supernatanten försiktigt.
- Återsuspendera omedelbart i 150 μl kärntvättbuffert med en bred borrpipettspets.
- Byt till en standardborrningspipettspets inställd på ~ 300 μl. Ta upp hela provet och fäst sedan ett 40 μm on-tip-filter i slutet av pipettspetsen, var noga med att inte utvisa provet.
OBS: On-tip-filter är nödvändiga för att erhålla mindre volymer, som behövs för att upprätthålla tillräcklig kärnkoncentration för nedströmsapplikationer. Till exempel, för snRNA-seq med användning av mikrofluidik, rekommenderas en minsta koncentration på > 300 kärnor / μL, även om det optimala intervallet är 700-1200 kärnor / μl18. Högre koncentrationer av kärnor kan också lätt spädas vid behov. - Filtrera provet genom att kraftigt driva ut provet genom filtret i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med låg DNA-bindning. Den slutliga elueringsvolymen bör vara 120-150 μl.
OBS: Viss skumning kan bero på filtrering. Detta verkar inte påverka kärnans kvalitet.
4. Bedöm kärnkvaliteten genom mikroskopi
- Blanda 10 μl av det filtrerade provet i ett separat mikrocentrifugrör med 10 μl 0,4 % trypanblå lösning genom försiktig pipettering. Prover kräver ingen förlängd inkubationstid och är redo för visualisering omedelbart efter blandning med trypanblå lösning.
- Deponera 10 μL av de färgade kärnorna i en kammare i en räknekammare.
OBS: Alternativt kan du deponera 10 μL av det färgade kärnprovet på en hemocytometer eller mikroskopiglas och täcka med en täckglidning. - Bedöm kärnkvaliteten med ljusmikroskopi.
OBS: Lägre förstoringar bör endast användas för att zooma in på kärnor, eftersom kärndefekter endast kommer att vara visuellt uppenbara vid högre förstoringar (dvs. 60x eller högre). Detta steg kan göras snabbt för att bedöma framgången med kärnberedning och kräver inte sekundär analys utöver visuell inspektion. Högkvalitativa, intakta kärnor kommer att ha en skarpt definierad kant20 (Figur 2A). Kärnor av dålig kvalitet kommer att ha stört kärnmembran, fläckvis trypanblå färgning nära kärnmembranet som indikerar potentiellt nukleinsyraläckage och / eller bevis på blebbing20 (figur 2B). Friska kärnor förväntas vara 10-15 μm i diameter.
5. Kvantifiera singletkärnor, skräp och multipelandel med flödescytometri
OBS: Den specifika terminologin och gränssnittet för flödescytometerprogramvaran kan variera beroende på maskinens märke, men dessa steg bör enkelt anpassas till andra system om det behövs.
- I ett FACS-rör, återsuspendera 10 μL av det filtrerade kärnprovet i 90 μL av den buffert som rekommenderas för flödescytometri för en utspädning på 1:10. För detta ändamål används 0,22 μm filtrerad steriliserad PBS, pH 7,2, med 2 mM EDTA och 0,5% BSA i denna studie.
OBS: Även om denna utspädning kommer att fungera för de flesta kärnförberedelser, kan en lägre utspädning (t.ex. 1:5) behövas för att ta prov på tillräckligt många kärnor för kvalitetsbedömning när det gäller ett prov med lägre avkastning (dvs. <30 kärnor/μl i det utspädda provet). - Färga proverna med propidiumjodid (PI) i en slutlig koncentration av 1 μg/ml. Ingen inkubationstid krävs och kärnor kan analyseras omedelbart.
OBS: Alternativt kan du färga proverna med en slutlig koncentration på 0,1 μg/ml DAPI. Observera att DAPI bör läsas på en annan fluorescenskanal än PI (Vioblue-A V1-A-kanal; excitation vid 405 nm, utsläpp vid 450/50 nm). - Analysera proverna på en flödescytometer enligt följande:
- Konfigurera en arbetsyta:
- Ha flödescytometern i förvärvsläge. Klicka på Arkiv och välj sedan Ny arbetsyta i rullgardinsmenyn. Under fliken Experiment i den vänstra panelen anger du Namn på projekt och Exempel-ID i respektive fält.
- I det övre vänstra verktygsfältet klickar du på knappen Nytt analysfönster (scatter-plotikon). Klicka på rutan med tre diagram (diagram 4t) på popup-menyn. Tre tomter visas på skärmen. Klicka på knappen Analysläge i det övre vänstra verktygsfältet (A-ikon) så att den är grå och inte orange.
- Ställ in analysdiagram:
- Ändra axlarna för de tre diagrammen enligt följande, ordnade som X-axel respektive Y-axel:
Diagram 1: X-axel: FSC-A, Y-axel: SSC-A
Diagram 2: X-axel: HDR-T, Y-axel: SSC-A
Diagram 3: X-axel: PerCP-Vio700-A B3-A, Y-axel: SSC-A - Ändra axlarna genom att klicka på axeletiketten och välja önskad kanal i rullgardinsmenyn.
- Ställ in diagrammen som ska densitetsfärgkodas genom att klicka på den fyrkantiga grå "i" -ikonen som visas bredvid det övre högra hörnet av varje diagram. Ett egenskapsfönster öppnas med en knapppanel till vänster. I fönstret Egenskaper klickar du på Scatterplot-ikonen (andra från toppen till vänster på panelen). Klicka på OK.
OBS: PerCP-Vio700-A B3-A-fluorescenskanalen motsvarar en excitation vid 488 nm och utsläpp i intervallet 650-730 nm.
- Ändra axlarna för de tre diagrammen enligt följande, ordnade som X-axel respektive Y-axel:
- Ställ in instrumentinställningar:
- Klicka på fliken Kanaler i den vänstra panelen. En lista över alla kanaler visas med tre rutor till höger. Ställ in B3, FSC-A och SSC-A på Hlog genom att klicka på nedåtpilen på respektive första rutor till höger och välja Hlog i rullgardinsmenyn. Ställ in spänningen på SSC till 640 V, FSC till 300 V och B3 till 480 V genom att skriva in dessa siffror i sina respektive mittrutor till höger och trycka på Enter-tangenten. Observera att den tredje rutan till höger är en växling som kan användas växelvis för att skriva.
- Under Trigger-rubriken ställer du in FSC-utlösaren till 4 och SSC- och B3-utlösaren till 0 genom att klicka på nedåtpilen, välja dem från rullgardinsmenyn till vänster, skriva in numret i rutan till höger och sedan trycka på Enter-tangenten . Observera att det finns en växlingsruta till höger som kan användas alternativt till att skriva.
OBS: PMT-spänningar måste optimeras för varje enskild flödescytometrimaskin, men utlösaren för kärnor måste vara lägre än vad som vanligtvis används för celler. Dessutom bör axelskalan ställas in på h-log.
- Skriv 100 μL i textrutan Provvolym och 50 μL i textrutan Upptagningsvolym till vänster i fönstret för flödesprogramvara. Kontrollera att parametern Mix Sample är inställd på Mix Gentle för att undvika lyseringskärnor i det här steget. Tryck på triangeln i en cirkel ( uppspelningsikonen) i det nedre högra hörnet för att starta flödet.
- Verifiera flödeskvaliteten:
- Använd sidospridningsområdet (SSC-A) jämfört med HDR-T för att kontrollera om det finns luftbubblor eller klumpar i provet. Se till att denna plot är ett smidigt kontinuum av punkter. Luftbubblor eller klumpar kommer att resultera i tomma regioner i SSC-A kontra HDR-T-diagrammet.
- Kontrollera sidospridningsdiagrammet (SSC-A) kontra framåtspridningsdiagrammet (FSC-A) för att verifiera att spänningarna som används är korrekta för provet.
OBS: Till skillnad från celler kommer kärnor inte att lösa sig helt från skräp i ett sidospridningsdiagram kontra framåtspridningsdiagram. Det bör emellertid finnas ett högdensitetskluster av händelser mot mitten av diagrammet som motsvarar kärnor (varmare färgade) med en lägre densitet av händelser (svalare färgade) i bakgrunden som motsvarar skräp.
- Analysera kärnor och kvalitet:
- Dubbelklicka på diagrammet SSC-A jämfört med PerCp-Vio-700A för en förstorad vy. Klicka på knappen i det övre vänstra verktygsfältet med vinkelräta linjer (Kvadrant) för att välja en kvadrantgrind. Klicka sedan var som helst i SSC-A vs. PerCp-Vio-700A-diagrammet och kvadranter visas inuti diagrammet.
- Klicka var som helst på kvadrantens skiljelinjer och skjut markören för att ändra kvadrantplaceringen. Placera kvadranterna så att den övre vänstra kvadranten innehåller den vänstra populationen (skräp) och den övre högra kvadranten innehåller flera droppformade kluster (kärnor) (se figur 3 för grindinställning och exempel på flödesresultat för typiska resultat med förberedelser inklusive eller inte inklusive ett skräpborttagningssteg).
- Skräp kontra kärnor räknas:
- Klicka på den fyrkantiga grå "i" -ikonen i det övre högra hörnet av tomten för att öppna fönstret Egenskaper . Klicka på fliken Regionfunktioner ; Listor över tomtområden och funktioner visas.
- Under listan Regioner ser du till att det finns en grön bock bredvid det översta objektet, vilket anger att hela diagrammet är markerat. Under listan Funktioner klickar du på Räkna / μL för att skapa en grön bock. Klicka på OK så visas ett antal / μL-mått i varje kvadrant.
- Om du vill visa råantal och procentsatser väljer du Antal och %-T på fliken Regionfunktioner om du vill. Antalen/μL i övre vänstra och högra kvadranten motsvarar skräp- respektive kärnutbytet.
- Singlet räknas:
- Det vänstra droppformade klustret i den nedre delen av den övre högra kvadranten representerar singlets. Rita en polygonal grind runt denna population genom att klicka på polygonknappen (Polygon) i det övre vänstra verktygsfältet.
- Klicka en enda gång, skjut musen för att börja rita och klicka igen för att avsluta ett linjärt segment av porten och börja nästa. Dubbelklicka för att avsluta porten. Klicka på grindens kant och skjut musen för att flytta grinden.
- Klicka på portens hörn för att ändra formen. Antal/μL av den gated populationen (singlets) kommer att visas. Detta är koncentrationen av kärnförberedelsen med den initiala utspädningen.
OBS: Det framåtriktade spridningsområdet kontra höjden 1: 1 linjärt förhållande, som vanligtvis används för att bestämma singlethastighet vid flytande celler, gäller inte för kärnor och kan bortses från.
- Med hjälp av koncentrationen av de utspädda kärnorna och utspädningsfaktorn ska koncentrationen av den ursprungliga prepen (t.ex. multiplicera den observerade koncentrationen med 10 för en utspädning på 1:10). Koncentrationer från >300 kärnor/μl är lämpliga för snRNA-seq.
- Konfigurera en arbetsyta:
Representative Results
Killifish hjärnkärnor isoleringsprotokoll som beskrivs här är optimerat specifikt för killifish och sammanfattas i figur 1. Förutom kärnextraktion beskriver protokollet olika metoder för att bedöma kvaliteten och kvantiteten av isolerade kärnor. Figur 2 visar exempel på både friska (figur 2A) och ohälsosamma (figur 2B) kärnor som bedömts med ljusmikroskopi. Friska kärnor lämpliga för nedströmsanalys (figur 2A) närvarande som singletkärnor med intakta membran. Som visas i figur 2B är det vanligaste felläget för detta protokoll (och andra kärnisoleringsprotokoll) genereringen av överlyserade kärnor, som kännetecknas av skadade kärnmembran. Detta leder ofta till klumpar av kärnor och kan bidra till bakgrundssignaler i nedströms applikationer på grund av läckage av nukleinsyror från de brustna kärnorna. Om överdriven klumpning observeras rekommenderar vi att du är skonsammare under dounce-stegen och / eller minskar inkubationstiderna i lysbufferten.
Detta protokoll använder flödescytometri för att kvantifiera antalet isolerade kärnor och bestämma den relativa andelen multipletkärnor i ett prov. Dessutom kan flödescytometri användas för att bedöma det relativa innehållet av förorenande skräp, ofta brustna kärnfragment och annat cellulärt skräp som kan påverka nedströmsanalyser i kärnprovet negativt. Representativa flödesdata kan ses i figur 3. Ett högkvalitativt kärnisoleringsförfarande kommer att producera: 1) en liten skräpfraktion och 2) en hög fraktion av singlet kontra multipletkärnor (> 80% av kärnfraktionen). Användningen av PI-färgning, som fläckar nukleinsyror, gör att singletkärnor kan separeras från skräp och multipletkärnor. Figur 3A är ett exempel på en förberedelse som förorenats av skräp, medan figur 3B är ett exempel på ett högkvalitativt experiment.
Figur 1: Arbetsflöde för isolering av Killifish-hjärnkärnor. Experimentellt arbetsflöde för kärnisolering från frysta eller färska killifish-hjärnor. När de har isolerats och bedömts kan kärnor användas för olika nedströms "omics" -analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Bedömning av kärnkvalitet genom mikroskopi. Kärnor blandades 1: 1 i en lösning av 0,4% Trypan Blue och visualiserades på ett Echo Revolve-mikroskop genom brightfield-avbildning vid 60x. (A) Ett exempel på en högkvalitativ kärna. Kärnan är närvarande som en singlet och kärnmembranet är intakt. (B) Ett exempel på kärnor av dålig kvalitet. Kärnmembranen är skadade och kärnor klumpar sig i en dublett, troligen på grund av läckage av klibbigt DNA, vilket kan ses läcka från toppen av den översta kärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av kärnor och renhetsbedömning genom flödescytometri. Kärnprover färgades med en 1:100 utspädning av PI och kördes på en flödescytometer. Kärnor finns i singlet- och multipletformer i den övre högra kvadranten av (A,B) med singlets som det lägsta molnet av händelser följt av dubletter, trillingar etc. i stigande ordning. Skräp präglas av händelserna i de två kvadranterna till vänster. (A) Ett exempel på en kärnförberedelse av låg kvalitet, där skräpborttagningssteget utelämnades och skräp utgör >40% av händelserna. (B) Ett exempel på ett kärnprov av hög kvalitet, med det medföljande skräpborttagningssteget. I det här exemplet utgör skräp < 10% av alla händelser som registrerats av flödescytometern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Provtyp (2 hjärnor) | Genomsnittlig avkastning (4 oberoende preps) |
| 5-veckors manliga hjärnor | 3,59 ± 1,76 x 105 |
| 10-veckors manliga hjärnor | 6,41 ± 1,33 x 105 |
| 15-veckors manliga hjärnor | 14,59 ± 2,05 x 105 |
| 5-veckors kvinnliga hjärnor | 2,54 ± 0,75 x 105 |
| 10-veckors kvinnliga hjärnor | 4,66 ± 1,29 x 105 |
| 15-veckors kvinnliga hjärnor | 7,95 ± 3,51 x 105 |
Tabell 1: Genomsnittlig förväntad avkastning från två hjärnor av afrikansk turkos killifish över kön och ålder. Genomsnittliga utbyten uttryckta som 105 kärnor ± medelfelet i medelvärdet för fyra oberoende kärnberedningar i varje kategori.
Kompletterande figur 1: Jämförelse av kärnisoleringskvalitet med hjälp av standardprotokoll och vårt optimerade protokoll på frysta killifish-hjärnor. (A) Kärnkvalitetsbedömning genom mikroskopi. Kärnor blandades 1: 1 i en lösning av 0,4% Trypan Blue och visualiserades på ett mikroskop genom brightfield-avbildning vid 60x. (B) Kvantifiering av kärnor och skräpbelastning genom flödescytometri. Kärnprover färgades med en 1:100 utspädning av PI och kördes på en flödescytometer. (C) Sammanfattning av kvalitetsbedömningsmått per mikroskopi och flödescytometri med de olika benchmarkade protokollen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Schematisk representation av stegen för borttagning av skräp. (A) Schema för avlägsnande av skräpskikt före centrifugering. (B) Schema för avlägsnande av supernatant efter centrifugering. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Protokollet som presenteras här kan användas för att reproducerbart generera högkvalitativa kärnor från killifish-hjärnor. Detta protokoll måste utformas speciellt för killifish-hjärnan eftersom typiska däggdjursbaserade hjärnkärnor isoleringsprotokoll som tillämpas på killifish-hjärnor konsekvent resulterade i dålig kärnkvalitet i våra händer. Vi misstänker att detta beror på det lägre relativa myelininnehållet i killifish-hjärnan jämfört med deras däggdjurs motsvarigheter, vilket skulle lysera och klumpa sig som svar på de hårda förhållanden som krävs för däggdjurs hjärncellslys. Detta protokoll är ett framsteg inom åldrande- och killifish-fälten eftersom det underlättar utforskningen av hjärnans åldrande på encellsnivå i en kostnads- och tidseffektiv modell av ryggradsdjurs hjärnåldring.
Detta protokoll är robust för färska eller frysta prover, även om man måste överväga nedströmsapplikationerna när man använder färsk eller frusen vävnad. Fryst vävnad är ofta bekvämt eftersom den kan samlas in och lagras i månader medan prover samlas in. Sådana prover kan säkert användas för applikationer som snRNA-seq. Frysningsprover kan dock störa kärnstrukturen och därmed förmågan att noggrant mäta kromatinlandskapet med ATAC-seq21. För nedströmsapplikationer som bulk ATAC-seq eller snATAC-seq rekommenderas det därför att använda nyligen dissekerade hjärnor istället för frysta hjärnor. Dessutom, eftersom alla steg efter hjärnhomogenisering kan utföras parallellt, är detta protokoll mottagligt för att köra flera prover inom en rimlig tidsram, vilket begränsar RNA-nedbrytning orsakad av långvarig inkubation på is.
Dessutom är det absolut nödvändigt att förbereda buffertar färska (inom några timmar) efter att ha utfört kärnextraktion. Vi fann att tvättmedel såväl som BSA måste tillsättas i buffertar omedelbart innan protokollet påbörjas. Buffertar som endast innehåller salter (PBS, NaCl, etc.) kan tillverkas som koncentrat, filtreras steriliseras (0,22 μm) och förvaras på obestämd tid vid rumstemperatur. BSA-stamlösningar kan beredas, steriliseras och förvaras vid 4 °C inom några dagar efter extraktionen av kärnorna (om de framställs av pulver) men bör alltid tillsättas de buffertar som används i detta protokoll omedelbart innan protokollet genomförs. Vi rekommenderar dock att du förbereder BSA-lösningar på protokollets dag. Om du använder färdiga BSA-lösningar från en tredje part rekommenderas det att använda färska, oöppnade flaskor. Att använda färsk BSA leder i allmänhet till lägre skräpinnehåll i kärnförberedelser.
Oavsett om färska eller frysta prover används som insatsvaror är det viktigt att bedöma kärnkvaliteten efter kärnisolering. Även om detta protokoll är speciellt utformat för att undvika överlys, är detta den vanligaste orsaken till förlust av kärnkvalitet. Överlys kan bero på för mycket tid i lysbufferten, alltför grov hantering av kärnorna, såsom överdriven pipettering med en standardborrningspipettspets eller en överdriven tid mellan kärnisolering och nedströmsapplikationer (>1 h). Överlyserade kärnor har ofta skadade kärnperiferier, som läcker DNA och orsakar klumpar (figur 2B). Detta kommer att leda till ett ökat antal multiplets och bidra med bakgrundsnukleinsyror som kommer att störa nedströmsapplikationer, särskilt snRNA-seq. Båda egenskaperna kan bedömas genom mikroskopi efter kärnisolering. Om överdriven kärnklumpning observeras rekommenderar vi att du försöker förkorta lysstegsinkubationen för att minska risken för överlys. Som en alternativ metod för att öka kärnor singlets kan fluorescensassisterad cellsortering (FACS) användas för att berika för singlets nedströms detta protokoll. Vi noterar dock att när man arbetar med redan bräckliga kärnor från frusen vävnad kan skjuvspänningen som uppstår under sortering leda till ökad kärnbrott och därmed ökat omgivande RNA / DNA. Dessutom noterar vi att den tid som krävs för att köra en FACS-avkastningssortering för kärnor vid bearbetning av flera prover skulle kräva att alla kärnprover förblir på is i timmar, medan andra prover sorteras. Således kan ökade väntetider vid bearbetning av flera prover parallellt med FACS-metoden sannolikt också leda till övergripande minskad kärnkvalitet och öka risken för RNA-nedbrytning. Således, om FACS önskas för reducerad dubletthastighet, rekommenderar vi att skräpinnehållet kontrolleras igen efter avkastningssorteringen och att eventuell reducerad RNA-kvalitet beaktas för encells RNA-seq-applikationer som en potentiell varning.
En exakt uppskattning av kärnantal och singlet-andel är avgörande för nästan alla nedströms "omics" -applikationer och är av yttersta vikt. På grund av förmågan att enkelt grinda och räkna kärnor efter storlek är flödescytometri den mest exakta metoden för att räkna kärnor som vi har bedömt. Alternativt kan man kvantifiera kärnor med hjälp av cellräknare som Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter eller DeNovix CellDrop Automated Cell Counter. Observera att Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter, och i mycket mindre utsträckning DeNovix, tenderar att överskatta kärnor genom att räkna skräp som kärnor, vilket innebär att manuell storlek gating kan krävas. Dessutom gör flödescytometern att man enkelt kan bedöma kärnornas renhet. Man kan urskilja den relativa andelen singlet kontra multiplet kärnor på ett kvantitativt sätt som är svårt med mikroskopi. Detta är avgörande för snRNA-seq och snATAC-seq, eftersom dessa protokoll kommer att drabbas av ett överskott av flera prover, som måste uteslutas från analyser nedströms. Förutom multipleter kan den relativa andelen "skräp" (fragmenterade kärnor, cellulära skräp) kvantifieras med flödescytometri och måste vara relativt låg, eftersom detta material ofta innehåller förorenande nukleinsyror som kan bidra med en bakgrundssignal och korrupta "omics" -data med en kärna.
Som med tidigare beskrivna kärnisoleringsprotokoll kan proportionerna av celltyper i den ursprungliga vävnaden inte rekapituleras troget i kärnorna prep19 och bör därför tolkas med försiktighet. Att notera, som alla teleostar, har afrikanska turkosa killifish kärnade erytrocyter, som också förväntas representeras i kärnförberedelserna. Dessa kärnor kan identifieras i snRNA-seq- och snATAC-seq-dataset genom det högre uttrycket / tillgängligheten av hemoglobingener och kan uteslutas beräkningsmässigt om så önskas.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vissa paneler genererades med BioRender.com. Detta arbete i vårt laboratorium stöddes av NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant till B.T., ett bidrag från Simons Foundation som en del av Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, ett pilotbidrag från Navigage Foundation och ett Hanson-Thorell Family-pris till B.A.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| 10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
| 15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
| 2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
| DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
| FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
| Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
| MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
| Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
| Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
| Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
| Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
| NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
| Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
| PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
| TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
| Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
| TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
| Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |
References
- Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. The aging brain. Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).
- Hu, C. K., Brunet, A. The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause. Aging Cell. 17 (3), 12757 (2018).
- McKay, A., et al. An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning. bioRxiv. , (2021).
- Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri. Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).
- Vanhunsel, S., et al. The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation. NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22 (2021).
- Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes. Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Ziffra, R. S., et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development. Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Kalish, B. T., et al. Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
- Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus. STAR Protocols. 2 (4), 100844 (2021).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Narayanan, A., et al. Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq. Journal of Visualized Experiments. (162), e61542 (2020).
- Saunders, A., et al. Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain. Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).
- Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k (2021).
- Martin, C., et al. Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2. protocols.io. , (2020).
- Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing (2022).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression- (2022).
- Rocks, D., et al. Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain. Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).
