Summary
Het huidige protocol beschrijft de optimalisatie van experimentele parameters bij het gebruik van transesofageale atriale pacing om de gevoeligheid voor atriumfibrilleren bij muizen te beoordelen.
Abstract
Muismodellen van genetische en verworven risicofactoren voor atriumfibrilleren (AF) zijn waardevol gebleken bij het onderzoeken van de moleculaire determinanten van AF. Geprogrammeerde elektrische stimulatie kan worden uitgevoerd met behulp van transesofageale atriale pacing als overlevingsprocedure, waardoor seriële tests bij hetzelfde dier mogelijk zijn. Er bestaan echter tal van pacingprotocollen, wat de reproduceerbaarheid bemoeilijkt. Het huidige protocol heeft tot doel een gestandaardiseerde strategie te bieden om modelspecifieke experimentele parameters te ontwikkelen om de reproduceerbaarheid tussen studies te verbeteren. Voorbereidende studies worden uitgevoerd om de experimentele methoden voor het specifieke model dat wordt onderzocht te optimaliseren, inclusief leeftijd op het moment van het onderzoek, geslacht en parameters van het pacingprotocol (bijv. Pacing-modus en definitie van AF-gevoeligheid). Belangrijk is dat er voor wordt gezorgd dat hoge stimulus-energieën worden vermeden, omdat dit stimulatie van de ganglionische plexi kan veroorzaken met onbedoelde parasympathische activering, gemanifesteerd door overdreven atrioventriculaire (AV) -blok tijdens pacing en vaak geassocieerd met artefactuele AF-inductie. Dieren die deze complicatie aantonen, moeten van de analyse worden uitgesloten.
Introduction
Boezemfibrilleren (AF) vertegenwoordigt een laatste gemeenschappelijke route voor meerdere verworven en genetische risicofactoren. Voor studies die de pathofysiologische mechanismen van het AF-substraat onderzoeken, zijn muismodellen voordelig gezien het gemak van genetische manipulatie en het feit dat ze in het algemeen de AF-gevoeligheid reproduceren die bij mensen wordt waargenomen voor verschillende klinische fenotypen 1,2,3. Muizen ontwikkelen echter zelden spontane AF4, waardoor het gebruik van provocerende atriale pacingstudies noodzakelijk is.
Geprogrammeerde elektrische stimulatie (PES) kan worden uitgevoerd om muriene atriale elektrofysiologie en AF-gevoeligheid te beoordelen met behulp van intracardiale5 of transesofageale6 pacing. Hoewel de transesofageale benadering bijzonder voordelig is als overlevingsprocedure, wordt het gebruik ervan bemoeilijkt door de talrijke gepubliceerde experimentele protocollen 7,8 en bronnen van variabiliteit die de reproduceerbaarheid kunnen belemmeren9. Bovendien maken beperkte gerapporteerde protocolvergelijkingen het selecteren van een geschikt pacingprotocol een uitdaging.
Het huidige protocol heeft tot doel een systematische strategie te gebruiken om modelspecifieke transesofageale PES-methoden te ontwikkelen voor het beoordelen van de gevoeligheid voor muizen-AF om de reproduceerbaarheid te vergroten. Belangrijk is dat de eerste pilotstudies worden uitgevoerd om het pacing-protocol te optimaliseren door rekening te houden met leeftijd, geslacht en pacing-modusvariabiliteit, met pacing ontworpen om onbedoelde parasympathische stimulatie te minimaliseren die de resultaten kan verstoren9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure is goedgekeurd door de Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee en is in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het protocol is ontwikkeld met behulp van zowel genetische9 als verworven10 (bijv. Hypertensie) muismodellen van AF-gevoeligheid. De operator was blind voor het fenotype van de onderzochte muis.
1. Dierenselectie
- Voor genetische modellen, onderwier muizen aan tweewekelijkse (d.w.z. om de week) atriale pacing zoals hieronder beschreven (zie stap 6.) om de optimale periode van AF-gevoeligheid te bepalen.
- Begin met tweewekelijkse pacing op de leeftijd van 8 weken. Gebruik wild-type nestgenoten als controles om variabiliteit te verminderen. Bestudeer beide geslachten, omdat men mogelijk geen AF-fenotype9 ontwikkelt.
- Voor verworven modellen, voer pacing uit nadat muizen fysieke volwassenheid hebben bereikt (~ 12 weken oud)10. Zoals hierboven vermeld, bestudeer beide geslachten.
- Voer tijdens deze voorbereidende studies zowel burst pacing8 (met behulp van een vaste pacing cycle length [CL]) als decremental pacing7 (met een steeds kortere pacing CL) uit om de optimale pacingmodus te bepalen. Scheid elke procedure met een minimum van 24 uur.
OPMERKING: Naarmate een toenemend aantal muizen wordt bestudeerd, bekijkt u de verzamelde gegevens om de optimale leeftijd, geslacht en pacing-modus te bepalen die AF bevordert bij AF-gevoelige muizen, maar niet bij controles.- Analyseer de gegevens met behulp van meerdere definities van AF-gevoeligheid (bijv. Aantal AF-episodes8, totale AF-duur9, AF-incidentie4 en aanhoudende AF-incidentie, gewoonlijk gedefinieerd als 10 s11 of 15 s12, en zelfs tot 5 min13,14) omdat sommige modellen een AF-fenotype kunnen vertonen voor één maar niet alle definities9.
OPMERKING:De definitie van een AF-episode en AF-gevoeligheid verschillen tussen gepubliceerde studies 4,7. AF episodes8 worden gewoonlijk gedefinieerd als snelle atriale activiteit met een onregelmatige ventriculaire respons die optreedt gedurende ten minste 1s (figuur 1). Naast AF kan atriale pacing ook atriale flutter veroorzaken met een regelmatige of onregelmatige ventriculaire respons.
- Analyseer de gegevens met behulp van meerdere definities van AF-gevoeligheid (bijv. Aantal AF-episodes8, totale AF-duur9, AF-incidentie4 en aanhoudende AF-incidentie, gewoonlijk gedefinieerd als 10 s11 of 15 s12, en zelfs tot 5 min13,14) omdat sommige modellen een AF-fenotype kunnen vertonen voor één maar niet alle definities9.
- Gebruik de geoptimaliseerde modelspecifieke parameters en definitie van AF-gevoeligheid voor volgende onderzoeken op extra muizen.
2. Voorbereiding van dieren
- Verdoof de muis in een inductiekamer met 3% isofluraan (zie Materiaaltabel) in 1 L/min 100% zuurstof.
OPMERKING: Isofluraan is schadelijk. Het kan de huid of het oog irriteren en kan duizeligheid, vermoeidheid en hoofdpijn veroorzaken, naast andere toxiciteiten van het centrale zenuwstelsel. Gebruik in een goed geventileerde ruimte met een geschikte opruimmethode (bijv. Actieve koolbus). - Plaats na het verlies van de pedaalreflex de muis in rugligging op een verwarmingskussen dat is ontworpen om de lichaamstemperatuur op ongeveer 37 °C te houden met de achterpoten op het padoppervlak geplakt.
- Breng bevochtigende oogzalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen.
- Plaats een verdovingsmasker stevig over de neus van de muis. Begin met het onderhoud van de anesthesie met behulp van 1% isofluraan in 1 L/min van 100% zuurstof. Zorg ervoor dat de neusgaten vrij zijn van obstructie, omdat muizen obligate neusademhalers zijn.
- Verkrijg een oppervlakte-elektrocardiogram (ECG, lood I) door de subcutane plaatsing van 27 G ECG-naaldelektroden (zie Materiaaltabel) aangesloten op een biologische versterker en data-acquisitiehardware in de voorpoten. Aard het signaal door een naaldelektrode in de linker achterpoot te plaatsen.
3. Katheter plaatsing
- Verwijder kort het isofluraanmasker van de muis.
- Breng een 2-F octapolaire elektrodekatheter (elektrodebreedte en afstand = 0,5 mm) aangesloten op een stimulator en stimulusisolator (zie Materiaaltabel) in de slokdarm (figuur 2).
- Breng in op een diepte die de afstand van de mond (met verlengde nek) tot net boven het xiphoid kraakbeen benadert.
- Plaats het isofluraanmasker over de neusgaten van de muis.
- Begin met data-acquisitie met continue registratie van ECG-lead I met behulp van analysesoftware (zie Materiaaltabel).
- Pas de stimulusisolatormodus aan op bipolair. Gebruik het distale meest paar elektroden tijdens de stimulatie.
- Plaats de katheter op de juiste manier in de slokdarm om opname mogelijk te maken. Om dit te doen, past u een stimulus van 1,5 mA toe met een pulsbreedte van 2 ms bij een CL die iets korter is dan de sinus CL (gebruik bijvoorbeeld een CL van 100 ms als de sinus CL 120 ms is). Plaats de katheter voorzichtig totdat een consistente atriale opname is verkregen.
4. Bepaling van de drempel
- Om de atriale diastolische vangstdrempel (TH) te bepalen, start u pacing bij 1,5 mA met een pulsbreedte van 2 ms bij de CL die wordt gebruikt voor atriale vangst. Verlaag de stimulusamplitude met stappen van 0,05 mA tot het verlies van atriale opname, met daaropvolgende toename tot de opname.
OPMERKING: De laagste amplitude waarbij consistente atriale vangst wordt verkregen, is de atriale TH. Vanwege bezorgdheid over parasympathische stimulatie bij hoge stimulusamplitudes, die wordt weerspiegeld door overmatig AV-blok tijdens pacing met artefactuele AF-inductie9, is de maximaal aanvaardbare TH 0,75 mA. Plaats indien nodig de katheter om een TH-≤0,75 mA te bereiken. - Pas de stimulusamplitude aan op tweemaal TH.
5. Bepaling van elektrofysiologische eigenschappen
- Meet elektrofysiologische parameters, waaronder de hersteltijd van de sinusknoop (SNRT), de Wenckebach-cycluslengte (WCL) en de atrioventriculaire effectieve refractaire periode (AVERP) voorafgaand aan een snelle atriale pacing voor AF-inductie15.
6. Atriale aritmie gevoeligheid
- Voer pacing uit bij tweemaal TH met een pulsbreedte van 2 ms met behulp van burst pacing op verschillende CLs of decremental pacing zoals bepaald uit de eerste studies (stappen 1.1.-1.4.).
- Voor burst pacing, tempo op een initiële CL van 50 ms gedurende 15 s met daaropvolgende treinen optreden op CLs van 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms en 15 ms 8,10. Pauzeer het tempo gedurende 30 s na elke pacing-trein om herstel mogelijk te maken voordat u verder gaat. Als AF optreedt na een pacing-trein, wacht dan 30 s na beëindiging voordat u doorgaat met de volgende pacing.
- Voor decremental pacing, tempo op een CL van 40 ms en verlaag de CL met 2 ms elke 2 s tot beëindiging bij 20 ms7. Voer pacing-treinen uit in drievoud16 of kwintuplicaat17, met een pauze van 30 s voor herstel na elke trein. Zoals hierboven, als AF zich ontwikkelt, wacht dan 30 s na beëindiging voordat u doorgaat.
OPMERKING: Bij het optimaliseren van protocolparameters tijdens voorbereidende experimenten (d.w.z. stappen 1.1.-1.5.), voert u decremental pacing uit met vijf treinen. Voer een post-hocanalyse uit om te bepalen of drie of vijf treinen de grootste gevoeligheid bieden. - Beëindig de procedure op 30 s sinusritme na de laatste pacing-trein of na een aflevering van 10 minuten van AF, afhankelijk van wat zich het eerst voordoet.
7. Na de procedure
- Stop data-acquisitie.
- Verwijder voorzichtig de katheter- en ECG-elektroden.
- Stop met anesthesie.
- Plaats de verdoofde muis in een kooi en observeer gedurende 10 minuten om herstel te garanderen.
- Sla het gegevensbestand op. In het geval van seriële tests wacht u minimaal 24 uur voordat u de pacingprocedure herhaalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transesofageale atriale pacingstudies beoordelen de elektrofysiologische eigenschappen van de SA- en AV-knooppunten door de SNRT- en AVERP-gevoeligheid te bepalen, evenals AF-gevoeligheid6 (figuur 1). ECG-opname maakt metingen van P-golfduur, PR-interval, QRS-duur en QT/QTc-intervallen mogelijk. Continue registratie van het ECG tijdens snelle atriale pacing kan de volgende metingen van AF-kwetsbaarheid opleveren: het aantal episodes dat tijdens het onderzoek is geïnduceerd, de cumulatieve en gemiddelde duur van de afleveringen en het aantal aanhoudende AF-episodes. Episodes van overmatig AV-blok tijdens pacing kunnen perioden van pacing-geïnduceerde parasympathische stimulatie aantonen (figuur 3), wat betekent dat de bijbehorende AF een artefact is van dit fenomeen in plaats van de pathofysiologie van het model zelf9.
Figuur 1: Representatieve resultaten van atriale pacing. Oppervlakte-ECG-opnames van (A) sinusritme en (B) atriumfibrilleren na snelle atriale pacing. De pacingsnelheid overschrijdt Wenckebach CL, wat resulteert in het verlies van 1:1 AV nodale geleiding tijdens pacing. Het basislijnartefact is gerelateerd aan de ademhaling van muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Visuele weergave van de transesofageale katheter en de nabijheid van de ganglionische plexi. (A) Een foto van de 2-F octapolaire katheter. (B) Weergave van de nabijheid van de katheter tot de achterste linker ganglionaire plexi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van overmatig AV-blok tijdens snelle atriale pacing. Oppervlakte-ECG-opnames die een atriaal temporitme aantonen met (A) en zonder (B) overmatig AV-blok dat kan optreden tijdens atriale pacing, vooral tijdens pacing met een hogere stimulusintensiteit en bij korte CLs. Rode pijlen duiden QRS-complexen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transesofageale atriale pacing maakt niet alleen seriële studies bij hetzelfde dier mogelijk, maar de duur ervan is meestal korter dan intracardiale studies (~ 20 min), waardoor het gebruik van anesthetica en de effecten ervan op elektrofysiologische parameters worden geminimaliseerd.
Het is van cruciaal belang om de methoden in eerste instantie voor elk individueel muismodel te optimaliseren. Veroudering verhoogt de AF-induceerbaarheid bij normale muizen18,19, en individuele genetische modellen kunnen af-induceerbaarheid gedurende een beperkte periode aantonen. Het uitvoeren van pilotstudies om de week kan een leeftijdsvenster bepalen waarin de AF-fenotypemuis induceerbaar is, maar controlemuizen niet. Seks kan een bepalende factor zijn, omdat een of beide geslachten induceerbare AF9 kunnen vertonen. Bovendien kunnen specifieke muizen AF-gevoeligheid vertonen als reactie op slechts één type pacing-modus, terwijl anderen AF-gevoeligheid voor een andere modus of voor meerdere modi9 aantonen.
Tijdens snelle atriale pacing kunnen muizen een overmatig AV-blok ervaren dat vaak samenvalt met AF-inductie. Dit fenomeen wordt veroorzaakt door onbedoelde stimulatie van de ganglionische plexi op het achterste linker atrium, resulterend in parasympathische activering9. Significant AV-blok wordt gedefinieerd als ventriculaire bradycardie die ≥ 10% van een enkele pacing-trein duurt en het meest wordt aangetroffen bij pacing met hoge stimulusintensiteiten en bij korte pacing-CLs. Dit type aritmie-inductie verhoogt de incidentie van AF bij controlemuizen en veroorzaakt een grotere aritmievariabiliteit binnen een experimentele groep. Gezien deze verontreinigende kenmerken moeten dieren die onder deze omstandigheden AF ervaren, van de analyse worden uitgesloten.
Mocht er tijdens het pacen een diepgaand AV-blok optreden ondanks TH ≤0,75 mA, dan is het redelijk om de pacing amplitude te verminderen tot 1,5x TH7. Bovendien, als een AF-fenotype niet wordt waargenomen tijdens voorbereidende experimenten, is het denkbaar om 10 ms opnieuw te gebruiken als de laagste pacing CL16. Als een AF-fenotype niet wordt waargenomen op de leeftijd van 12 weken voor een verworven model, overweeg dan tweewekelijkse voorbereidende studies om de effecten van toenemende fenotyperijpheid te onderzoeken20.
Een beperking van deze aanpak is het gebruik van isofluraan anesthesie. Van isofluraan is bekend dat het de autonome functie onderdrukt21, en dit effect kan niet worden uitgesloten ondanks een relatief korte blootstelling. Dit protocol vertegenwoordigt het eerste gedetailleerde rapport van een geoptimaliseerde strategie om transesofageale PES-methoden bij muizen te ontwikkelen. Hoewel deze studie zich richt op af-gevoeligheid, kunnen toekomstige toepassingen van dit protocol worden gebruikt om ventriculaire aritmieënte beoordelen 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Figuur 2 is gemaakt met BioRender.com. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health (HL096844 en HL133127); de American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 en 903918 [MBM]); en het National Center for Advancing Translational Sciences van het National Institute of Health (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
