Summary
Il presente protocollo descrive l'ottimizzazione dei parametri sperimentali quando si utilizza la stimolazione atriale transesofagea per valutare la suscettibilità alla fibrillazione atriale nei topi.
Abstract
Modelli murini di fattori di rischio genetici e acquisiti per la fibrillazione atriale (FA) si sono dimostrati preziosi nello studio dei determinanti molecolari della fibrillazione atriale. La stimolazione elettrica programmata può essere eseguita utilizzando la stimolazione atriale transesofagea come procedura di sopravvivenza, consentendo così test seriali nello stesso animale. Tuttavia, esistono numerosi protocolli di stimolazione, il che complica la riproducibilità. Il presente protocollo mira a fornire una strategia standardizzata per sviluppare parametri sperimentali specifici del modello per migliorare la riproducibilità tra gli studi. Vengono eseguiti studi preliminari per ottimizzare i metodi sperimentali per il modello specifico in esame, compresa l'età al momento dello studio, il sesso e i parametri del protocollo di stimolazione (ad esempio, modalità di stimolazione e definizione della suscettibilità alla fibrillazione atriale). È importante sottolineare che si presta attenzione ad evitare energie di stimolo elevate, in quanto ciò può causare la stimolazione del plesso gangliare con attivazione parasimpatica involontaria, manifestata da un blocco atrioventricolare (AV) esagerato durante la stimolazione e spesso associato all'induzione della fibrillazione atriale artifattuale. Gli animali che dimostrano questa complicanza devono essere esclusi dall'analisi.
Introduction
La fibrillazione atriale (FA) rappresenta un ultimo percorso comune per molteplici fattori di rischio acquisiti e genetici. Per gli studi che indagano i meccanismi fisiopatologici del substrato della fibrillazione atriale, i modelli murini sono vantaggiosi data la facilità di manipolazione genetica e il fatto che, in generale, riproducono la suscettibilità alla fibrillazione atriale osservata nell'uomo per diversi fenotipi clinici 1,2,3. Tuttavia, i topi raramente sviluppano AF4 spontanea, rendendo necessario l'uso di studi provocatori sulla stimolazione atriale.
La stimolazione elettrica programmata (PES) può essere eseguita per valutare l'elettrofisiologia atriale murina e la suscettibilità alla fibrillazione atriale utilizzando la stimolazione intracardiaca5 o transesofagea6. Mentre l'approccio transesofageo è particolarmente vantaggioso come procedura di sopravvivenza, il suo utilizzo è complicato dai numerosi protocolli sperimentali pubblicati 7,8 e dalle fonti di variabilità che possono ostacolare la riproducibilità9. Inoltre, i limitati confronti di protocollo segnalati rendono difficile la selezione di un protocollo di stimolazione appropriato.
L'attuale protocollo mira a utilizzare una strategia sistematica per sviluppare metodi di PES transesofagea specifici per valutare la suscettibilità alla fibrillazione atriale murina al fine di aumentare la riproducibilità. È importante sottolineare che vengono eseguiti studi pilota iniziali per ottimizzare il protocollo di stimolazione tenendo conto della variabilità dell'età, del sesso e della modalità di stimolazione, con una stimolazione progettata per ridurre al minimo la stimolazione parasimpatica involontaria che può confondere i risultati9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questa procedura è stata approvata dal Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee ed è coerente con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il protocollo è stato sviluppato utilizzando sia modelli murini genetici9 che10 (ad esempio, ipertensione) di suscettibilità alla fibrillazione atriale. L'operatore è stato cieco al fenotipo del topo in studio.
1. Selezione degli animali
- Per i modelli genetici, sottoporre i topi a stimolazione atriale bisettimanale (cioè ogni due settimane) come descritto di seguito (vedere il punto 6.) per determinare il periodo ottimale di suscettibilità alla fibrillazione atriale.
- Inizia il ritmo bisettimanale a 8 settimane di età. Usa i compagni di cucciolata selvatici come controlli per ridurre la variabilità. Studiare entrambi i sessi, poiché non si può sviluppare un fenotipo di FA9.
- Per i modelli acquisiti, condurre la stimolazione dopo che i topi hanno raggiunto la maturità fisica (~ 12 settimane di età)10. Come accennato in precedenza, studia entrambi i sessi.
- Durante questi studi preliminari, eseguire sia il burst pacing8 (utilizzando una lunghezza fissa del ciclo di pacing [CL]) che il decremental pacing7 (con un pacing CL progressivamente più breve) per determinare la modalità di stimolazione ottimale. Separare ogni procedura da un minimo di 24 ore.
NOTA: Poiché viene studiato un numero crescente di topi, rivedere i dati accumulati per determinare l'età, il sesso e la modalità di stimolazione ottimali che promuovono la fibrillazione atriale nei topi sensibili alla fibrillazione atriale ma non i controlli.- Analizzare i dati utilizzando più definizioni di suscettibilità alla fibrillazione atriale (ad esempio, numero di episodi di fibrillazione atriale8, durata totale della fibrillazione atriale 9, incidenza di fibrillazione atriale 4 e incidenza sostenuta della fibrillazioneatriale, comunemente definita come 10 s 11 o 15 s 12, e anche fino a 5 min13,14) poiché alcuni modelli possono mostrare un fenotipo di fibrillazione atriale per una ma non tutte le definizioni9.
NOTA:La definizione di un episodio di fibrillazione atriale e la suscettibilità alla fibrillazione atriale differiscono tra gli studi pubblicati 4,7. Gli episodi8 della fibrillazione atriale sono comunemente definiti come attività atriale rapida con una risposta ventricolare irregolare irregolare che si verifica per almeno 1 secondi (Figura 1). Oltre alla fibrillazione atriale, la stimolazione atriale può anche indurre flutter atriale con una risposta ventricolare regolare o irregolare.
- Analizzare i dati utilizzando più definizioni di suscettibilità alla fibrillazione atriale (ad esempio, numero di episodi di fibrillazione atriale8, durata totale della fibrillazione atriale 9, incidenza di fibrillazione atriale 4 e incidenza sostenuta della fibrillazioneatriale, comunemente definita come 10 s 11 o 15 s 12, e anche fino a 5 min13,14) poiché alcuni modelli possono mostrare un fenotipo di fibrillazione atriale per una ma non tutte le definizioni9.
- Utilizzare i parametri ottimizzati specifici del modello e la definizione della suscettibilità alla fibrillazione atriale per studi successivi su topi aggiuntivi.
2. Preparazione degli animali
- Anestetizzare il topo in una camera di induzione utilizzando isoflurano al 3% (vedere Tabella dei materiali) in 1 L/min di ossigeno al 100%.
NOTA: L'isoflurano è dannoso. Può irritare la pelle o gli occhi e può causare vertigini, affaticamento e mal di testa, tra le altre tossicità del sistema nervoso centrale. Utilizzare in un'area ben ventilata con un metodo di scavenging appropriato (ad esempio, contenitore di carbone attivo). - Dopo la perdita del riflesso del pedale, posizionare il mouse in posizione supina su una piastra riscaldante progettata per mantenere la temperatura corporea a circa 37 °C con gli arti posteriori fissati alla superficie del cuscinetto.
- Applicare unguento lubrificante per gli occhi per prevenire l'essiccazione.
- Posizionare una maschera anestetica saldamente sul naso del mouse. Iniziare il mantenimento dell'anestesia utilizzando l'1% di isoflurano in 1 L/min di ossigeno al 100%. Assicurati che le narici siano libere da ostruzioni poiché i topi sono obbligati a respirare il naso.
- Ottenere un elettrocardiogramma di superficie (ECG, derivazione I) mediante il posizionamento sottocutaneo di elettrodi con ago ECG da 27 G (vedi Tabella dei materiali) collegati a un amplificatore biologico e hardware di acquisizione dati negli arti anteriori. Mettere a terra il segnale posizionando un elettrodo ad ago nell'arto posteriore sinistro.
3. Posizionamento del catetere
- Rimuovere brevemente la maschera di isoflurano dal mouse.
- Inserire un catetere per elettrodi ottapolari 2-F (larghezza e distanza tra gli elettrodi = 0,5 mm) collegato a uno stimolatore e a un isolatore di stimolo (vedere Tabella dei materiali) nell'esofago (Figura 2).
- Inserire ad una profondità che approssimi la distanza dalla bocca (con il collo esteso) a appena sopra la cartilagine xifoide.
- Riposizionare la maschera di isoflurano sulle narici del topo.
- Iniziare l'acquisizione dei dati con la registrazione continua della derivazione ECG I utilizzando il software di analisi (vedi Tabella dei materiali).
- Regolare la modalità di isolamento dello stimolo su bipolare. Utilizzare la coppia di elettrodi più distali durante la stimolazione.
- Posizionare correttamente il catetere all'interno dell'esofago per consentire la cattura. Per fare ciò, applicare uno stimolo di 1,5 mA con una larghezza di impulso di 2 ms a una CL leggermente più corta della CL sinusale (ad esempio, utilizzare una CL di 100 ms se la CL sinusale è di 120 ms). Posizionare con attenzione il catetere fino ad ottenere una cattura atriale coerente.
4. Determinazione della soglia
- Per determinare la soglia di cattura diastolica atriale (TH), iniziare la stimolazione a 1,5 mA con una larghezza di impulso di 2 ms al CL utilizzato per la cattura atriale. Diminuire l'ampiezza dello stimolo con incrementi di 0,05 mA fino alla perdita della cattura atriale, con conseguente aumento fino alla cattura.
NOTA: L'ampiezza più bassa alla quale si ottiene una cattura atriale coerente è il TH atriale. A causa della preoccupazione per la stimolazione parasimpatica ad alte ampiezze di stimolo, che si riflette in un eccessivo blocco AV durante la stimolazione con induzione AF artefice9, il TH massimo accettabile è 0,75 mA. Se necessario, riposizionare il catetere per ottenere un TH ≤0,75 mA. - Regolare l'ampiezza dello stimolo al doppio TH.
5. Determinazione delle proprietà elettrofisiologiche
- Misurare i parametri elettrofisiologici, tra cui il tempo di recupero del nodo del seno (SNRT), la lunghezza del ciclo di Wenckebach (WCL) e il periodo refrattario effettivo atrioventricolare (AVERP) prima della stimolazione atriale rapida per l'induzione della fibrillazione atriale15.
6. Suscettibilità all'aritmia atriale
- Eseguire la stimolazione a due volte TH con una larghezza di impulso di 2 ms utilizzando la stimolazione a raffica a CL diversi o la stimolazione decrementale come determinato dagli studi iniziali (fasi 1.1.-1.4.).
- Per il ritmo a raffica, passo a un CL iniziale di 50 ms per 15 s con treni successivi che si verificano a CL di 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms e 15 ms 8,10. Mettere in pausa il ritmo per 30 secondi dopo ogni treno di stimolazione per consentire il recupero prima di procedere. Se l'AF si verifica dopo un treno di stimolazione, attendere 30 s dopo la terminazione prima di procedere con la stimolazione successiva.
- Per la stimolazione decrementale, andare a un CL di 40 ms e diminuire il CL di 2 ms ogni 2 s fino alla terminazione a 20 ms7. Esegui i treni di stimolazione in triplice16 o quintuplicate17, con una pausa di 30 s per il recupero dopo ogni treno. Come sopra, se si sviluppa AF, attendere 30 s dopo la terminazione prima di procedere.
NOTA: Quando si ottimizzano i parametri del protocollo durante gli esperimenti preliminari (ad esempio, i passaggi 1.1.-1.5.), eseguire la stimolazione decrementale con cinque treni. Condurre un'analisi post hoc per determinare se tre o cinque treni forniscono la massima sensibilità. - Terminare la procedura dopo 30 secondi di ritmo sinusale seguendo l'ultimo treno di stimolazione o dopo un episodio di 10 minuti di AF, a seconda dell'evento che si verifica per primo.
7. Post-procedura
- Interrompere l'acquisizione dei dati.
- Rimuovere delicatamente il catetere e gli elettrodi ECG.
- Interrompere l'anestesia.
- Posizionare il topo anestetizzato in una gabbia e osservare per 10 minuti per garantire il recupero.
- Salvare il file di dati. In caso di test seriale, attendere un minimo di 24 ore prima di ripetere la procedura di stimolazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gli studi di stimolazione atriale transesofagea valutano le proprietà elettrofisiologiche dei linfonodi SA e AV determinando SNRT e AVERP, nonché la suscettibilità alla fibrillazione atriale6 (Figura 1). La registrazione ECG consente di misurare la durata dell'onda P, l'intervallo PR, la durata QRS e gli intervalli QT/QTc. La registrazione continua dell'ECG durante la stimolazione atriale rapida può fornire le seguenti misurazioni della vulnerabilità della fibrillazione atriale: il numero di episodi indotti durante lo studio, la durata cumulativa e media degli episodi e il numero di episodi di fibrillazione atriale sostenuti. Episodi di eccessivo blocco AV durante la stimolazione possono dimostrare periodi di stimolazione parasimpatica indotta dalla stimolazione (Figura 3), a significare che la FA associata è un artefatto di questo fenomeno piuttosto che la fisiopatologia del modello stesso9.
Figura 1: Risultati rappresentativi della stimolazione atriale. Registrazioni ECG superficiali che descrivono (A) ritmo sinusale e (B) fibrillazione atriale dopo stimolazione atriale rapida. La velocità di stimolazione supera il CL di Wenckebach, con conseguente perdita della conduzione nodale AV 1:1 durante la stimolazione. L'artefatto di base è correlato alla respirazione del topo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione visiva del catetere transesofageo e sua vicinanza al plesso gangliare. (A) Una fotografia raffigurante il catetere ottapolare 2-F. (B) Rappresentazione della vicinanza del catetere al plesso gangliare atriale sinistro posteriore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi di un eccessivo blocco AV durante la stimolazione atriale rapida. Registrazioni ECG di superficie che dimostrano il ritmo atriale con (A) e senza (B) eccessivo blocco AV che può verificarsi durante la stimolazione atriale, specialmente durante la stimolazione con maggiore intensità di stimolo e a brevi CL. Le frecce rosse indicano complessi QRS. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La stimolazione atriale transesofagea non solo consente studi seriali nello stesso animale, ma la sua durata è tipicamente più breve rispetto agli studi intracardiaci (~ 20 min), riducendo così al minimo l'uso di anestetico e i suoi effetti sui parametri elettrofisiologici.
È fondamentale ottimizzare inizialmente i metodi per ogni singolo modello murino. L'invecchiamento aumenta l'inducibilità della fibrillazione atriale nei topi normali18,19 e i singoli modelli genetici possono dimostrare l'induzionalità della fibrillazione atriale in un periodo di tempo limitato. L'esecuzione di studi pilota a settimane alterne può determinare una finestra di età durante la quale il topo fenotipo della fibrillazione atriale è inducibile, ma i topi di controllo non lo sono. Il sesso può essere un fattore determinante, in quanto uno o entrambi i sessi possono mostrare AF9 inducibile. Inoltre, topi specifici possono mostrare suscettibilità AF in risposta a un solo tipo di modalità di stimolazione, mentre altri dimostrano la suscettibilità AF a una modalità diversa o a più modalità9.
Durante la stimolazione atriale rapida, i topi possono sperimentare un eccessivo blocco AV che è spesso coincidente con l'induzione della fibrillazione atriale. Questo fenomeno è causato dalla stimolazione involontaria del plesso gangliare situato nell'atrio posteriore sinistro, con conseguente attivazione parasimpatica9. Il blocco AV significativo è definito come bradicardia ventricolare che dura ≥10% di un singolo treno di stimolazione e si incontra più frequentemente quando si stimola con alte intensità di stimolo e a brevi CL di stimolazione. Questo tipo di induzione dell'aritmia aumenta l'incidenza di FA nei topi di controllo e causa una maggiore variabilità dell'aritmia all'interno di un gruppo sperimentale. Date queste caratteristiche contaminanti, gli animali che soffrono di fibrillazione atriale in queste condizioni devono essere esclusi dall'analisi.
Se durante la stimolazione si verifica un blocco AV profondo nonostante TH ≤0,75 mA, è ragionevole ridurre l'ampiezza di stimolazione a 1,5x TH7. Inoltre, se un fenotipo di FA non viene osservato durante gli esperimenti preliminari, è concepibile ritentare di utilizzare 10 ms come stimolazione più bassa CL16. Se un fenotipo di FA non viene osservato a 12 settimane di età per un modello acquisito, prendere in considerazione studi preliminari bisettimanali per esplorare gli effetti dell'aumento della maturità fenotipica20.
Una limitazione di questo approccio è l'uso dell'anestesia isoflurano. È noto che l'isoflurano sopprime la funzione autonomica21 e questo effetto non può essere escluso nonostante un'esposizione relativamente breve. Questo protocollo rappresenta il primo rapporto dettagliato di una strategia ottimizzata per sviluppare metodi PES transesofagei nei topi. Mentre questo studio si concentra sulla suscettibilità alla fibrillazione atriale, le future applicazioni di questo protocollo potrebbero essere utilizzate per valutare le aritmie ventricolari22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La Figura 2 è stata creata con BioRender.com. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Heart, Lung, and Blood Institute presso il National Institutes of Health (HL096844 e HL133127); l'American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 e 903918 [MBM]); e il National Center for Advancing Translational Sciences del National Institute of Health (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
References
- Sumitomo, N., et al. Association of atrial arrhythmia and sinus node dysfunction in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation Journal. 71 (10), 1606-1609 (2007).
- Fukui, A., et al. Role of leptin signaling in the pathogenesis of angiotensin II-mediated atrial fibrosis and fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 6 (2), 402-409 (2013).
- Schutter, D., et al. Animal models of atrial fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- Li, N., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium leak drives progressive development of an atrial fibrillation substrate in a transgenic mouse model. Circulation. 129 (12), 1276-1285 (2014).
- Wakimoto, H., et al. Induction of atrial tachycardia and fibrillation in the mouse heart. Cardiovascular Research. 50 (3), 463-473 (2001).
- Schrickel, J. W., et al. Induction of atrial fibrillation in mice by rapid transesophageal atrial pacing. Basic Research in Cardiology. 97 (6), 452-460 (2002).
- Verheule, S., et al. Increased vulnerability to atrial fibrillation in transgenic mice with selective atrial fibrosis caused by overexpression of TGF-beta1. Circulation Research. 94 (11), 1458-1465 (2004).
- Faggioni, M., et al. Suppression of spontaneous ca elevations prevents atrial fibrillation in calsequestrin 2-null hearts. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 7 (2), 313-320 (2014).
- Murphy, M. B., et al. Optimizing transesophageal atrial pacing in mice to detect atrial fibrillation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 332 (1), 36-43 (2022).
- Prinsen, J. K., et al. Highly reactive isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. JACC: Basic to Translational Science. 5 (6), 602-615 (2020).
- Aschar-Sobbi, R., et al. Increased atrial arrhythmia susceptibility induced by intense endurance exercise in mice requires TNFα. Nature Communications. 6, 6018 (2015).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic termination of atrial fibrillation in mice. Cardiovascular Research. 114 (5), 713-723 (2017).
- Matsushita, N., et al. IL-1β plays an important role in pressure overload-induced atrial fibrillation in mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 42 (4), 543-546 (2019).
- Sato, S., et al. Cardiac overexpression of perilipin 2 induces atrial steatosis, connexin 43 remodeling, and atrial fibrillation in aged mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 317 (6), 1193-1204 (2019).
- Li, N., Wehrens, X. H. T. Programmed electrical stimulation in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), e1730 (2010).
- Yao, C., et al. Enhanced cardiomyocyte NLRP3 inflammasome signaling promotes atrial fibrillation. Circulation. 138 (20), 2227-2242 (2018).
- Purohit, A., et al. Oxidized Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II triggers atrial fibrillation. Circulation. 128 (16), 1748-1757 (2013).
- Jansen, H. J., et al. Atrial fibrillation in aging and frail mice. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 14 (9), 01077 (2021).
- Luo, T., et al. Characterization of atrial histopathological and electrophysiological changes in a mouse model of aging. International Journal of Molecular Medicine. 31 (1), 138-146 (2013).
- McCauley, M. D., et al. Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896 (2020).
- Kato, M., et al. Spectral analysis of heart rate variability during isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 77 (4), 669-674 (1992).
- Schmeckpeper, J., et al. Abstract 11402: Targeting RyR2 to suppress ventricular arrhythmias and improve left ventricular function in chronic ischemic heart disease. Circulation. 144, Suppl_1 11402 (2021).
- Kim, K., et al. Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease. Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57 (2021).
