Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के माइक्रोस्केल्ड प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए औद्योगिक, आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस-निर्देशित लेजर माइक्रोडिसेक्शन

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/64171
Automatic Translation
*1,2, *1,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1, 1,3,4, 1,2,3, 1,3,4
1Women’s Health Integrated Research Center, Gynecologic Cancer Center of Excellence, Department of Obstetrics and Gynecology, Uniformed Services University and Walter Reed National Military Medical Center, 2The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, 3The John P. Murtha Cancer Center Research Program, Department of Surgery, Uniformed Services University, 4Women’s Health Integrated Research Center, Inova Women’s Service Line, Inova Health System
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल लेजर माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करके हिस्टोलॉजी-हल सेल आबादी के संवर्धन के लिए सना हुआ, पतली ऊतक अनुभाग छवियों से ब्याज के पैथोलॉजी-पुष्टि क्षेत्रों के कृत्रिम बुद्धिमत्ता-संचालित विभाजन के लिए एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो का वर्णन करता है। इस रणनीति में एक उपन्यास एल्गोरिथ्म शामिल है जो सीधे लेजर माइक्रोस्कोप में ब्याज की सेल आबादी को दर्शाते हुए सीमांकन के हस्तांतरण को सक्षम करता है।

Abstract

ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें ट्यूमर, स्ट्रोमा और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी सहित दर्जनों अलग-अलग सेल प्रकार शामिल हैं। पैमाने पर प्रोटिओम-स्तरीय भिन्नता और ट्यूमर विषमता को चिह्नित करने के लिए, ठोस ट्यूमर दुर्दमताओं में असतत सेलुलर आबादी को चुनिंदा रूप से अलग करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियों की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) द्वारा सक्षम एक उच्च-थ्रूपुट वर्कफ़्लो का वर्णन करता है, जो लेजर माइक्रोडिसेक्शन (एलएमडी) का उपयोग करके हिस्टोलॉजी-हल सेल आबादी की चयनात्मक फसल के लिए ब्याज के पैथोलॉजी-पुष्टि वाले क्षेत्रों में हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) -दाग, पतले ऊतक वर्गों की छवियों को खंडित करता है। इस रणनीति में एक उपन्यास एल्गोरिथ्म शामिल है जो ब्याज की सेल आबादी को दर्शाने वाले क्षेत्रों के हस्तांतरण को सक्षम करता है, डिजिटल छवि सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एनोटेट किया जाता है, सीधे लेजर माइक्रोस्कोप में, इस प्रकार अधिक आसान संग्रह को सक्षम करता है। इस वर्कफ़्लो का सफल कार्यान्वयन किया गया था, उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मात्रात्मक, मल्टीप्लेक्स प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए टीएमई से ट्यूमर सेल आबादी को चुनिंदा रूप से काटने के लिए इस सामंजस्यपूर्ण विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन किया गया था। यह रणनीति नियमित हिस्टोपैथोलॉजी समीक्षा के साथ पूरी तरह से एकीकृत होती है, ब्याज की सेलुलर आबादी के संवर्धन का समर्थन करने के लिए डिजिटल छवि विश्लेषण का लाभ उठाती है और पूरी तरह से सामान्यीकृत है, मल्टीओमिक विश्लेषण के लिए टीएमई से सेल आबादी की सामंजस्यपूर्ण फसल को सक्षम करती है।

Introduction

टीएमई एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है जो ट्यूमर कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एंडोथेलियल कोशिकाओं, अन्य मेसेनकाइमल सेल प्रकारों और एडिपोसाइट्स जैसे सेल प्रकारों की एक अत्यधिक विविध सरणी द्वारा आबाद है, साथ ही एक जटिल बाह्य मैट्रिक्स1. यह सेलुलर पारिस्थितिकी तंत्र विभिन्न रोग अंग साइटों के भीतर और पार भिन्न होता है, जिसके परिणामस्वरूप जटिल ट्यूमर विषमता 2,3 होती है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि कम ट्यूमर सेलुलरिटी (कम शुद्धता) वाले विषम ट्यूमर और ट्यूमर अक्सर खराब रोग निदान 2,3 के साथ सहसंबंधित होते हैं।

पैमाने पर टीएमई के भीतर ट्यूमर और गैर-ट्यूमर सेल आबादी के बीच आणविक परस्पर क्रिया को समझने के लिए, डाउनस्ट्रीम मल्टीओमिक विश्लेषण के लिए ब्याज की अलग-अलग सेलुलर आबादी को चुनिंदा रूप से फसल करने के लिए मानकीकृत और उच्च-थ्रूपुट रणनीतियों की आवश्यकता होती है। मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स कैंसर जीव विज्ञान की समझ को आगे बढ़ाने के लिए तेजी से विकसित और तेजी से महत्वपूर्ण तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है। आज तक, प्रोटिओमिक्स को नियोजित करने वाले अध्ययनों की प्रधानता ने पूरे ट्यूमर ऊतक की तैयारी (जैसे, क्रायोपुल्वराइज्ड) से निकाले गए प्रोटीन के साथ ऐसा किया है, जिससे टीएमई 4,5,6 में प्रोटिओम-स्तर की विषमता की समझ में कमी आई है।

नमूना संग्रह रणनीतियों का विकास जो नैदानिक पैथोलॉजी वर्कफ़्लोज़ से जानकारी के साथ मूल रूप से एकीकृत और दोहन करता है, हिस्टोलॉजी-हल किए गए प्रोटिओमिक्स की एक नई पीढ़ी को सक्षम करेगा जो स्वर्ण-मानक, नैदानिक पैथोलॉजी वर्कफ़्लो के अत्यधिक पूरक हैं। एलएमडी हिस्टोलॉजिकल रूप से दाग ऊतक पतले वर्गों के सूक्ष्म निरीक्षण के माध्यम से सेलुलर उप-जनसंख्या या ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) के प्रत्यक्ष और चयनात्मक संग्रह को सक्षम बनाता है7. डिजिटल पैथोलॉजी और एआई-सक्षम विश्लेषण में हालिया प्रमुख प्रगति ने स्वचालित फैशन में टीएमई के भीतर अद्वितीय रचनात्मक विशेषताओं और आरओआई की पहचान करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है, जिनमें से कई आणविक परिवर्तन और नैदानिक रोग सुविधाओं के साथ सहसंबंधित हैं, जैसे कि चिकित्सा और रोग का निदान8 के प्रतिरोध।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में वर्णित वर्कफ़्लो डिजिटल हिस्टोपैथोलॉजी छवियों के भीतर ट्यूमर आरओआई को चुनिंदा रूप से एनोटेट करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर समाधानों का लाभ उठाता है, और इन ट्यूमर आरओआई को ब्याज की असतत सेलुलर आबादी के स्वचालित संग्रह के लिए लेजर माइक्रोस्कोप में स्थानांतरित करने के लिए इन-हाउस विकसित सॉफ़्टवेयर टूल का उपयोग करता है जो डाउनस्ट्रीम मल्टीओमिक विश्लेषण वर्कफ़्लो के साथ मूल रूप से एकीकृत होता है। यह एकीकृत रणनीति एलएमडी ऑपरेटर समय को काफी कम कर देती है और उस अवधि को कम करती है जिसके लिए ऊतकों को परिवेश के तापमान पर होना आवश्यक है। उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के साथ स्वचालित सुविधा चयन और एलएमडी फसल का एकीकरण दो प्रतिनिधि उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर हिस्टोलॉजिकल उपप्रकारों, उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि के कैंसर (एचजीएसओसी) और डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा (ओसीसीसी) से टीएमई के अंतर विश्लेषण के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है।

Protocol

सभी अध्ययन प्रोटोकॉल को पश्चिमी आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल "नैदानिक रूप से सूचनात्मक बायोमार्कर की पहचान और मान्य करने के लिए एंडोमेट्रियल और डिम्बग्रंथि के कैंसर का एक एकीकृत आणविक विश्लेषण" के तहत उपयोग के लिए अनुमोदित किया गया था, जिसे अमेरिकी संघीय विनियमन 45 सीएफआर 46.102 (एफ) के तहत छूट दी गई थी। इस अध्ययन में मानव डेटा से जुड़े सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार थे। अध्ययन में शामिल सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

सावधानी: प्रोटोकॉल भर में उपयोग किए जाने वाले निम्नलिखित अभिकर्मक ज्ञात या संदिग्ध कार्सिनोजेन्स हैं और / या खतरनाक सामग्री शामिल हैं: इथेनॉल, डीईपीसी पानी, मेयर के हेमटॉक्सिलिन समाधान, ईओसिन वाई समाधान, मेथनॉल, एसिटोनाइट्राइल और फॉर्मिक एसिड। संबंधित सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) में वर्णित उचित हैंडलिंग, और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग अनिवार्य है।

1. कैलिब्रेटर फिड्यूशियल युक्त डिफ़ॉल्ट आकृति सूची डेटा (.sld) फ़ाइल जनरेट करना

नोट: इस खंड में वर्णित प्रोटोकॉल चरण एक उल्टे लेजर माइक्रोस्कोप और संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ उपयोग करने के लिए विशिष्ट हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। डिफ़ॉल्ट .sld फ़ाइल का निर्माण लेजर माइक्रोस्कोप प्रति केवल एक बार आवश्यक है। परिणामी फ़ाइल का उपयोग उसके बाद उपयोग की जाने वाली सभी पेन स्लाइड्स में फिड्यूशियल काटने के लिए किया जा सकता है। अनुमानित समय: 5 मिनट (केवल एक बार)।

  1. एलएमडी सॉफ्टवेयर खोलें और पॉलीथीन नेफ्थेलेट (पेन) झिल्ली स्लाइड को एलएमडी चरण पर लोड करें, जिसमें उपयोगकर्ता के निकटतम लेबल हो। प्रोग्राम विंडो के दाईं ओर बंद करें बॉक्स का चयन रद्द करें.
  2. अंशांकन फिड्यूशियल के रूप में सेवा करने के लिए तीन "वी" तीरों को आकर्षित करने के लिए उच्च आवर्धन (63x) के तहत पीटीओपी (बिंदु से बिंदु) फ़ंक्शन का उपयोग करें। वी पर एक बाहरी बिंदु से शुरू होकर, वी के मध्य बिंदु और एकल क्लिक पर एक रेखा खींचें। फिर, वी के केंद्रीय बिंदु से दूसरे बाहरी वी बिंदु के अंत तक एक दूसरी पंक्ति खींचें, और दो पंक्तियों से एक एकल, अनक्लोज्ड वी आकार बनाने के लिए डबल-क्लिक करें।
    नोट: इन अंशांकन फिड्यूशियल को स्लाइड के तीन कोनों में रखा जाना चाहिए: सामने दाएं, पीछे दाएं, पीछे के बाएं।
  3. कट विकल्प से पहले वायुसेना (ऑटोफोकस) का चयन करें। स्थिति 1 में स्लाइड काटें, इसे शेष स्लाइड स्थितियों में से प्रत्येक में ले जाएं, और अंशांकन कटौती पर ठीक से ट्रेस करें।
  4. एसएलडी फ़ाइल सहेजें और झिल्ली में अंशांकन फिड्यूशियल काटने से बचने के लिए पॉप-अप संवाद बॉक्स से अंशांकन के बिना सहेजें विकल्प का चयन करें।
    नोट: चार स्लाइड पदों के लिए मानक कैलिब्रेटर फिड्यूशियल युक्त एक प्रतिनिधि .sld फ़ाइल पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान की जाती है।

2. एलएमडी स्लाइड (ओं) की तैयारी

नोट: इस खंड में वर्णित प्रोटोकॉल चरण एक उल्टे लेजर माइक्रोस्कोप और संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ उपयोग करने के लिए विशिष्ट हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। अनुमानित समय: 5 मिनट।

  1. सुनिश्चित करें कि स्लाइड संदर्भ अंशांकन फिड्यूशियल काटने से पहले पूरी तरह से सूखी है। LMD सॉफ़्टवेयर खोलें और आकृतियाँ आयात करें विकल्प के अंतर्गत डिफ़ॉल्ट अंशांकन .sld फ़ाइल खोलें।
  2. कट विकल्प से पहले वायुसेना (ऑटोफोकस) का चयन करें। नीचे का सामना करना पड़ ऊतक के साथ स्लाइड (ओं) लोड करें और लेबल एलएमडी चरण पर स्लाइड धारक में ऑपरेटर के करीब स्लाइड करें।
  3. लेजर माइक्रोस्कोप और डिफ़ॉल्ट अंशांकन .sld फ़ाइल का उपयोग करके, पेन झिल्ली में अंशांकन फिड्यूशियल काट लें।
    1. वैकल्पिक: अंशांकन फिड्यूशियल को पेन झिल्ली में काटें या तो ऊतक अनुभाग (ओं) से पहले या बाद में स्लाइड पर रखा गया है / यदि ऊतक प्लेसमेंट से पहले अंशांकन फिड्यूशियल काट दिए जाते हैं, तो सुनिश्चित करें कि ऊतक और / या फिक्सेटिव अंशशोधक के साथ ओवरलैप नहीं होता है जब ऊतक को चरण 2.5 में स्लाइड पर रखा जाता है। यदि ऊतक प्लेसमेंट के बाद अंशांकन फिड्यूशियल काट दिए जाते हैं, तो चरण 2.4 के पूरा होने के बाद रोकें और धारा 3 पर आगे बढ़ें।
  4. यह सुनिश्चित करने के लिए व्यक्तिगत रूप से सभी कैलिब्रेटर की समीक्षा करें कि प्रत्येक कट पूर्ण और दृश्यमान है।
    नोट: किसी भी अंशांकन फिड्यूशियल पर लेजर को मैन्युअल रूप से निर्देशित करने के लिए मूव एंड कट सुविधा का उपयोग करें जो पेन झिल्ली के माध्यम से पूरी तरह से कटौती नहीं करता है।
  5. अंशांकन फिड्यूशियल युक्त स्लाइड पर जमे हुए या फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक अनुभाग रखें।

3. ऊतक धुंधला

नोट: अनुमानित समय: 30 मिनट।

  1. 5 मिनट के लिए फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल अभिकर्मकों युक्त 70% इथेनॉल (ईटीओएच) में जमे हुए एलएमडी ऊतक स्लाइड को ठीक करें।
  2. 1 मिनट के लिए फॉस्फेट अवरोधक कॉकटेल अभिकर्मकों युक्त डायथाइल पाइरोकार्बोमेट (डीईपीसी) पानी में स्लाइड धो लें।
  3. 1 मिनट के लिए डीईपीसी पानी में स्लाइड धो लें।
  4. 3 मिनट के लिए मेयर के हेमटॉक्सिलिन समाधान में स्लाइड सेते हैं।
  5. 3 मिनट के लिए डीईपीसी पानी में स्लाइड कुल्ला।
  6. 1 मिनट के लिए डीईपीसी पानी के ताजा आदान-प्रदान में स्लाइड कुल्ला।
  7. 1 एस के लिए जलीय ईओसिन वाई समाधान में स्लाइड सेते हैं।
  8. 95% ईटीओएच में स्लाइड 2 x 5 एस कुल्ला।
  9. 100% ईटीओएच में स्लाइड 3 x 10 एस कुल्ला।
  10. स्लाइड्स के पीछे से अतिरिक्त ईटीओएच को पोंछें और स्लाइड्स को हवा-सूखने दें।
  11. यदि एलएमडी तुरंत नहीं किया जाना है तो स्लाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. स्लाइड इमेजिंग

नोट:: इस खंड में वर्णित प्रोटोकॉल चरण स्कैन की गई स्लाइड्स के लिए विशिष्ट हैं ( सामग्री की तालिका देखें) और परिणामी छवियों को .svs फ़ाइलों के रूप में सहेजा गया है। किसी भी स्कैनर और उससे संबंधित सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें जो छवि फ़ाइलों को एक प्रारूप में उत्पन्न करता है जिसे छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) खोल सकता है। समर्थित पिरामिड टिफ्स का उपयोग करने वाले फ़ाइल प्रकारों में जेपीजी, टीआईएफ, एमआरएक्सएस, क्यूपीटीआईएफएफ, घटक टीआईएफएफ, एसवीएस, एएफआई, एससीएन, एलआईएफ, डीसीएम, ओएमई शामिल हैं। टीआईएफएफ, एनडी 2, वीएसआई, एनडीपीआई, एनडीपीआईएस, सीजेडआई, बीआईएफ, केएफबी और इसिंटैक्स। अनुमानित समय: 5 मिनट।

  1. स्कैनर चालू करें और स्लाइड स्कैनर सॉफ़्टवेयर खोलें। स्कैनर में एकल स्लाइड चरण पर ऊतक का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड लोड करें। सुनिश्चित करें कि स्लाइड पूरी तरह से सूखी है और धीरे-धीरे ऊतक पर एक कवरस्लिप रखें। कवरस्लिप के नीचे इथेनॉल या विसर्जन तेल का उपयोग न करें।
  2. कांच की पृष्ठभूमि के बजाय पेन झिल्ली के लिए समायोजित करने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार पृष्ठभूमि झिल्ली धुंधला को अनदेखा करने के लिए कैलिब्रेटेड सेटिंग्स का उपयोग करके माइक्रोग्राफ छवि कैप्चर करें।
  3. आवश्यकतानुसार पूरे पेन झिल्ली क्षेत्र को पकड़ने के लिए आंतरिक हरे रंग की परिधि को खींचकर और आकार देकर इमेजिंग क्षेत्र को समायोजित करें। स्नैपशॉट अवलोकन छवि पर डबल-क्लिक करके ऊतक पर चार फोकस बिंदु जोड़ें, और अंशांकन फिड्यूशियल के पास झिल्ली पर तीन फोकस बिंदु (तीन अंशांकन फिड्यूशियल में से प्रत्येक के अनुसार एक फोकस बिंदु)।
    नोट: चार फोकस बिंदुओं को ऊतक अनुभाग पर लगभग कहीं भी रखा जा सकता है, हालांकि ऊतक पर रखने से जो बहुत गहरा दागदार है और काला दिखाई देता है, स्कैन विफल हो सकता है।
  4. दृश्य मेनू के अंतर्गत, वीडियो मॉनिटर का चयन करें। एलएमडी ऊतक के चारों ओर प्रत्येक बिंदु के लिए आवश्यकतानुसार ठीक और / या मैक्रो फोकस स्लाइडर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से फोकस समायोजित करें। उच्च आवर्धन (20x) के तहत छवि स्कैन पर कब्जा। पुष्टि करें कि सहेजी गई छवि में सभी अंशांकन फिड्यूशियल दिखाई दे रहे हैं और स्पष्ट हैं।

5. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्वचालित सुविधा चयन

  1. पूरे ट्यूमर संग्रह के लिए (अनुमानित समय: 5 मिनट; केस-निर्भर):
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। छवियाँ खोलें का चयन करें और पॉप-अप विंडो से, AT2 स्कैनर पर स्लाइड स्कैन करने से उत्पन्न .svs छवि फ़ाइल का चयन करें।
      नोट: एक प्रतिनिधि .svs छवि फ़ाइल पूरक फ़ाइल 2 में प्रदान की जाती है।
    2. एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें। एनोटेशन टूलबार पर पेन टूल का चयन करें और ऊतक के चारों ओर एक आकार खींचें।
    3. आकृति का चयन करें और छवि पर राइट-क्लिक करें। उन्नत ड्रॉपडाउन मेनू से, विभाजन (टाइल) का चयन करें। टाइल आकार और स्थान क्रमशः 500 और 40 के बीच सेट करें, और टाइल्स उत्पन्न करने के लिए ठीक का चयन करें। चरण 5.1.2 में टाइल्स उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली परिधि आकृति का चयन करें और हटाएं।
    4. परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | टाइल वाले एनोटेशन को .एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात करें.
      नोट: एक पूरे ट्यूमर ऊतक संग्रह के लिए एक प्रतिनिधि .एनोटेशन फ़ाइल पूरक फ़ाइल 3 में प्रदान की जाती है।
    5. सत्र या प्रोजेक्ट के लिए कोई फ़ोल्डर बनाएँ, और स्लाइड के लिए अनन्य पहचानकर्ता के साथ लेबल किए गए सबफ़ोल्डर के अंदर .एनोटेशन फ़ाइल सहेजें.
    6. एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें। लेयर एक्शन ड्रॉपडाउन | का चयन करें छवि से सभी एनोटेशन को हटाने के लिए सभी परतें हटाएं। पेन टूल का चयन करें और प्रत्येक अंशांकन फिड्यूशियल के लिए एरोहेड की आंतरिक नोक से एक छोटी रेखा खींचें। निम्नलिखित क्रम में चिह्नों से रेखाएँ खींचें: ऊपर बाएँ, ऊपर दाएँ, नीचे दाएँ।
    7. परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | पंक्ति एनोटेशन को .एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात करें. फ़ाइल नाम में _calib जोड़ें और फ़ाइल को सबफ़ोल्डर में रखें जिसमें टाइल वाली आकृतियों के लिए निर्देशांक हैं।
      नोट: एक प्रतिनिधि _calib.एनोटेशन फ़ाइल पूरक फ़ाइल 4 में प्रदान की जाती है।
    8. मुख्य प्रोजेक्ट या सत्र फ़ोल्डर के लिए पते की प्रतिलिपि बनाएँ। एक्सएमएल आयात जनरेटिंग स्क्रिप्ट खोलें, "मैलेटर" (https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 के माध्यम से उपलब्ध), आईडीएलई एकीकृत विकास वातावरण का उपयोग करके और स्क्रिप्ट के निचले भाग में उद्धरणों के बीच प्रोजेक्ट फ़ोल्डर पता पेस्ट करें।
    9. | ड्रॉपडाउन चलाएँ मेनू का चयन करें स्क्रिप्ट निष्पादित करने के लिए मॉड्यूल चलाएँ।
      नोट:: .xml एलएमडी आयात फ़ाइल छवि/स्लाइड के लिए बनाए गए सबफ़ोल्डर के अंदर उत्पन्न किया जाएगा। एक प्रतिनिधि .xml फ़ाइल पूरक फ़ाइल 5 में प्रदान की जाती है।
  2. केवल एलएमडी-समृद्ध संग्रह के लिए (अनुमानित समय: 15 मिनट; केस-निर्भर):
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। छवियाँ खोलें का चयन करें और पॉप-अप विंडो से, स्लाइड स्कैन करने से उत्पन्न .svs छवि फ़ाइल का चयन करें।
    2. एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें। ऊतक के चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित करने के लिए आयत एनोटेशन टूल का चयन करें और उपयोग करें।
    3. बॉक्स एनोटेशन का चयन करें और छवि पर राइट-क्लिक करें। उन्नत ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | विभाजन (टाइल) विकल्प। टाइल आकार और स्थान क्रमशः 500 और 40 के बीच सेट करें, और टाइल्स उत्पन्न करने के लिए ठीक का चयन करें। चरण 5.2.2 में टाइल्स उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले परिधि बॉक्स एनोटेशन का चयन करें और हटाएं।
    4. परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | टाइल वाले एनोटेशन को .एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात करें.
    5. पायथन "डैप" (https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 के माध्यम से उपलब्ध) एल्गोरिथ्म की सहेजी गई प्रतिलिपि रखें, जिसे एआई-वर्गीकृत एनोटेशन परतों को मर्ज करने के लिए विकसित किया गया है, टाइल एनोटेशन फ़ाइल के समान फ़ोल्डर में।
    6. टाइल एनोटेशन फ़ाइल के नाम की प्रतिलिपि बनाएँ। आईडीएलई एकीकृत विकास वातावरण का उपयोग करके पायथन प्रोग्राम खोलें और प्रोग्राम के निचले भाग में उद्धरणों के बीच टाइल एनोटेशन फ़ाइल का नाम पेस्ट करें।
    7. | ड्रॉपडाउन चलाएँ मेनू का चयन करें मॉड्यूल चलाएँ। एक नई फ़ाइल उत्पन्न होने की प्रतीक्षा करें जिसमें सभी टाइल वाले एनोटेशन एक परत के नीचे विलय हो जाएंगे।
    8. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें। लेयर एक्शन ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | छवि से सभी एनोटेशन को हटाने के लिए सभी परतें हटाएं।
    9. परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | स्थानीय एनोटेशन फ़ाइल आयात करें। पॉप-अप विंडो में, स्क्रिप्ट द्वारा जनरेट किया गया था जो मर्ज की गई .एनोटेशन फ़ाइल का चयन करें। सुनिश्चित करें कि सभी आयातित टाइलें एक ही एनोटेशन परत के तहत हैं।
    10. क्लासिफायर टैब पर नेविगेट करें और आरओआई के लिए आकार उत्पन्न करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। क्लासिफायर चलाने से पहले, उन्नत क्लासिफायर विकल्प के तहत, एनोटेशन टैब पर आरओआई बॉक्स या बक्से की जांच करके वांछित एनोटेशन परत (ओं) (यानी, ट्यूमर या स्ट्रोमा परत) का चयन करें। क्लासीफायर चलाने के लिए क्लासिफायर क्रियामेनू से एनोटेशन लेयर विकल्प का उपयोग करें।
    11. एक बार क्लासिफायर विश्लेषण पूरा हो जाने के बाद, एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें और विश्लेषण से उत्पन्न एनोटेशन परत का चयन करें। लेयर एक्शन ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | छवि से अन्य सभी एनोटेशन परतों को हटाने के लिए सभी परतें लेकिन वर्तमान हटाएं।
    12. परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | एनोटेशन को .एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात करें. सत्र या प्रोजेक्ट के लिए कोई फ़ोल्डर बनाएँ और स्लाइड के लिए अनन्य पहचानकर्ता के साथ लेबल किए गए सबफ़ोल्डर के अंदर .एनोटेशन फ़ाइल सहेजें.
      नोट: एक वर्गीकृत एलएमडी समृद्ध ऊतक संग्रह के लिए एक प्रतिनिधि .एनोटेशन फ़ाइल पूरक फ़ाइल 6 में प्रदान की जाती है।
    13. एनोटेशन टैब पर नेविगेट करें, लेयर एक्शन ड्रॉपडाउन का चयन करें | छवि से सभी एनोटेशन को हटाने के लिए सभी परतें हटाएं। पेन टूल का चयन करें और प्रत्येक अंशांकन फिड्यूशियल से एक छोटी रेखा खींचें। निम्नलिखित क्रम में चिह्नों से रेखाएँ खींचें: ऊपर बाएँ, ऊपर दाएँ, नीचे दाएँ।
    14. परत क्रियाएँ ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें | पंक्ति एनोटेशन को .एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए निर्यात करें. फ़ाइल नाम में _calib जोड़ें और फ़ाइल को सबफ़ोल्डर में रखें जिसमें टाइल वाली आकृतियों के लिए निर्देशांक हैं।
    15. मुख्य प्रोजेक्ट या सत्र फ़ोल्डर के लिए पते की प्रतिलिपि बनाएँ। एक्सएमएल आयात जनरेटिंग स्क्रिप्ट खोलें, "मैलेटर" (https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 के माध्यम से उपलब्ध), आईडीएलई एकीकृत विकास वातावरण का उपयोग करके, फिर स्क्रिप्ट के निचले भाग में उद्धरणों के बीच प्रोजेक्ट फ़ोल्डर पता पेस्ट करें।
    16. | ड्रॉपडाउन चलाएँ मेनू का चयन करें स्क्रिप्ट निष्पादित करने के लिए मॉड्यूल चलाएँ।
      नोट:: .xml एलएमडी आयात फ़ाइल छवि/स्लाइड के लिए बनाए गए सबफ़ोल्डर के अंदर उत्पन्न होगा।

6. लेजर माइक्रोडिसेक्शन

नोट: इस खंड में वर्णित प्रोटोकॉल चरण एक उल्टे लेजर माइक्रोस्कोप और संबंधित सॉफ़्टवेयर के साथ उपयोग करने के लिए विशिष्ट हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। अनुमानित समय: 2 घंटे; केस निर्भर है।

  1. चिह्नित झिल्ली स्लाइड लोड (अंशांकन फिड्यूशियल युक्त) ऊतक के साथ नीचे का सामना करना पड़ रहा है और लेजर माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड धारक में ऑपरेटर के करीब लेबल पक्ष।
  2. फ़ाइल ड्रॉपडाउन मेनू से आकृतियाँ आयात करें का चयन करें. स्लाइड के लिए जनरेट की गई .xml LMD आयात फ़ाइल का चयन करें। अंशांकन के लिए किसी भी पहले संग्रहीत संदर्भ बिंदुओं का उपयोग करने से बचने के लिए फ़ाइल से संदर्भ बिंदुओं को लोड करने से बचने के लिए पॉप-अप विंडो में नहीं और दूसरी पॉप-अप विंडो में नहीं का चयन करें।
  3. एलएमडी एप्लिकेशन से संकेतों का पालन करें और स्लाइड पर तीन अंशांकन फिड्यूशियल में से प्रत्येक के लिए अंशांकन क्रॉस संरेखित करें। छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में स्लाइड छवि के ऊपरी बाएँ, ऊपरी दाएँ और निचले दाएँ में दिखाई देने वाले अंशांकन फिड्यूशियल की तलाश करें जो माइक्रोस्कोप चरण पर उल्टे एलएमडी स्लाइड के क्रमशः सामने दाएँ, पीछे दाएँ और पीछे के बाएँ कोनों में संदर्भ बिंदुओं के अनुरूप होंगे। पता लगाने के लिए 5x उद्देश्य लेंस का उपयोग करने और प्रत्येक अंशांकन फिड्यूशियल को संरेखित करने के लिए 63x उद्देश्य के बीच स्विच करें। स्लाइड सम्मिलित होने की पुष्टि करने के लिए दूसरी पॉप-अप विंडो में संदर्भ बिंदुओं को फ़ाइल और ठीक सहेजने से बचने के लिए पॉप-अप विंडो पर नहीं का चयन करें।
  4. 5x उद्देश्य लेंस को स्थिति में ले जाएं और वास्तविक आवर्धन का उपयोग करने के लिए पॉप-अप विंडो में हाँ का चयन करें। एक बार आयातित आकार दिखाई देने के बाद, कैमरे को ऊतक पर केंद्रित करें।
  5. आकृतियाँ सूची विंडो में सभी आकृतियों को हाइलाइट और चुनें, संदर्भ के रूप में दृश्य के क्षेत्र में एक या दो एनोटेशन का उपयोग करके उन्हें जगह में खींचें, और लेजर के साथ काटने के लिए ऊर्ध्वाधर z-अक्ष संरेखित करें।
  6. आयातित आकृतियों की समीक्षा करें और उन्हें संग्रह के लिए उपयुक्त ट्यूब स्थिति में असाइन करें। लेजर शुरू करने के लिए स्टार्ट कट दबाएं।
    नोट:: .xml फ़ाइल में आयातित आकृतियाँ स्वचालित रूप से आकृतियाँ सूची विंडो में "कोई टोपी" स्थिति के लिए असाइन किया जाएगा। ऊतक की कटाई के लिए, आयातित आकृतियों को लोड की गई ट्यूब वाली स्थिति में फिर से असाइन किया जाना चाहिए।

7. दबाव चक्र प्रौद्योगिकी (पीसीटी) द्वारा प्रोटीन पाचन

नोट: अनुमानित समय: 4 घंटे (वैक्यूम अपकेंद्रित्र सुखाने के समय के बिना 3 घंटे)।

  1. 10% एसिटोनिट्राइल के 20 μL में एलएमडी कटे हुए ऊतक युक्त कैप्ड पीसीटी माइक्रोट्यूब युक्त 0.5 एमएल ट्यूब रखें और 30 मिनट के लिए 99 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, फिर 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. 4,000 × ग्राम पर 30 एस के लिए ट्यूबों को स्पिन करें और फिर 0.5 एमएल ट्यूबों से माइक्रोट्यूब को हटा दें। माइक्रोकैप टूल का उपयोग करके, पीसीटी माइक्रोट्यूब से माइक्रोकैप्स को हटा दें और त्यागें। 30 मिमी2 ऊतक प्रति 1 μg के अनुपात में ट्रिप्सिन (सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और माइक्रोकैप टूल का उपयोग करके माइक्रोट्यूब में एक माइक्रोपेस्टल डालें।
  3. माइक्रोट्यूब को बैरोसाइक्लर कारतूस में स्थानांतरित करें और पूर्ण कारतूस को इकट्ठा करें। कारतूस को बैरोसाइक्लर दबाव कक्ष में रखें और ढक्कन को सुरक्षित करें। 50 एस के लिए 45,000 पीएसआई पर बैरोसाइकल और 60 चक्रों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर 10 एस के लिए वायुमंडलीय दबाव।
  4. एक बार बैरोसाइक्लिंग पूरा हो जाने के बाद, माइक्रोट्यूब को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4,000 × ग्राम पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  5. टोपी उपकरण का उपयोग कर 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब से माइक्रोट्यूब निकालें। सावधानी से टोपी उपकरण का उपयोग कर मूसल को हटा दें और तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) ग्रेड पानी के 20 μL के साथ मूसल के निचले आधे हिस्से को कुल्लाएं और धोने को एक साफ 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें।
  6. तरल को नीचे ले जाने के लिए बेंच टॉप पर माइक्रोट्यूब को धीरे-धीरे टैप करें और माइक्रोट्यूब से सभी समाधानों को 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. माइक्रोट्यूब में 20 μL एलसी-एमएस-ग्रेड पानी जोड़ें और इसे बेंच टॉप पर धीरे से टैप करें। धोने के समाधान को 0.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इस धोने के चरण को एक बार फिर दोहराएं।
  8. वैक्यूम अपकेंद्रित्र ~ 2 μL करने के लिए नमूने सूखने और 100 एमएम टीईएबी, पीएच 8.0 के 100 μL जोड़ने के लिए।
  9. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक वर्णमितीय परख (बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख का उपयोग करके पेप्टाइड एकाग्रता का निर्धारण करें; सामग्री की तालिका देखें)।

8. अग्रानुक्रम-द्रव्यमान टैग (टीएमटी) लेबलिंग और ईज़ीपप क्लीनअप

नोट: अनुमानित समय: 7 घंटे 20 मिनट (वैक्यूम अपकेंद्रित्र सुखाने के समय के बिना 2 घंटे 20 मिनट)।

  1. खोलने से पहले आइसोबेरिक टीएमटी लेबलिंग अभिकर्मकों को परिवेश के तापमान पर लाएं। प्रत्येक टीएमटी शीशी (5 मिलीग्राम) में 100% एसिटोनाइट्राइल के 500 μL जोड़ें। कभी-कभी भंवर के साथ 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  2. 100 एमएम टीईएबी, पीएच 8.0 के 100 μL में पेप्टाइड नमूने के 5 μg को भंग करें, और किसी दिए गए टीएमटी अभिकर्मक के 10 μL जोड़ें। निर्माण और कई टीएमटी मल्टीप्लेक्स9 भर में नमूनों की मात्रा का ठहराव की सुविधा के लिए नमूनों के प्रत्येक टीएमटी मल्टीप्लेक्स सेट में प्रयोग में प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने का प्रतिनिधित्व करने वाले संदर्भ पूल शामिल हैं। कभी-कभी मिलाते हुए/दोहन के साथ परिवेश के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
  3. 5% हाइड्रॉक्सिलमाइन के 10 μL जोड़कर टीएमटी लेबलिंग प्रतिक्रिया को बुझाएं और कभी-कभी दोहन के साथ परिवेश के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। शमन के बाद, टीएमटी-लेबल वाले नमूनों को एक ट्यूब में मिलाएं और लगभग 200 μL तक सूखें।
  4. 0.1% फॉर्मिक एसिड के 1,800 μL जोड़ें। पीएच पेपर के साथ पीएच की जांच करें: यदि पीएच ~ 3, तो 0.1% फॉर्मिक एसिड का 1 एमएल जोड़ें; यदि पीएच >3 है, तो पीएच ~ 3 तक 5% फॉर्मिक एसिड के 10-20 μL जोड़ें। 3 एमएल की अंतिम मात्रा में लाने के लिए 0.1% फॉर्मिक एसिड जोड़ें।
  5. पेप्टाइड क्लीन-अप कॉलम के नीचे टैब निकालें, टोपी को हटा दें, और इसे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें। टीएमटी-लेबल वाले नमूने को कॉलम में स्थानांतरित करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सफाई के साथ आगे बढ़ें।
  6. वैक्यूम अपकेंद्रित्र ~ 20 μL करने के लिए एल्यूटेड पेप्टाइड्स को सूखने के लिए, 80 μL की अंतिम मात्रा के लिए 25 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट का उपयोग करके एक एलसी शीशी में स्थानांतरित करें, और ऑफ़लाइन विभाजन के लिए आगे बढ़ें।

9. टीएमटी मल्टीप्लेक्स नमूना विभाजन और पूलिंग

नोट: अनुमानित समय: 3 घंटे 30 मिनट (वैक्यूम अपकेंद्रित्र सुखाने के समय के बिना 1 ज 30 मिनट)।

  1. मोबाइल चरण ए (10 एमएम एनएच4एचसीओ 3, पीएच 8.0) में मोबाइल चरण बी (एसिटोनाइट्राइल) के बढ़ते रैखिक ढाल (0.69% मिनट -1) को विकसित करके 96 अंशों में बुनियादी उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी द्वारा टीएमटी-लेबल वाले पेप्टाइड मल्टीप्लेक्सको विभाजित करें।
  2. नमूना कुओं को पूल करके 36 संक्षिप्त अंश उत्पन्न करें। ~ 2 μL के लिए शुष्क अंशों के लिए वैक्यूम अपकेंद्रित्र और 25 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (अंतिम एकाग्रता 1.5 μg / 10 μL) में पुन: निलंबित, 10-15 मिनट के लिए 15,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और एमएस विश्लेषण के लिए एलसी शीशियों में स्थानांतरण।

10. तरल क्रोमैटोग्राफी अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस /

नोट: अनुमानित समय: साधन विधि और प्रयोगात्मक डिजाइन निर्भर।

  1. निर्माता के निर्देशों/प्रोटोकॉल के अनुसार द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को कैलिब्रेट करें।
  2. ताजा मोबाइल चरण ों और मानकों को तैयार करें और उचित एलसी प्री-रन तैयारी करें (संदर्भित उपकरण के लिए सॉल्वैंट्स, फ्लश एयर और रिसाव परीक्षण स्क्रिप्ट को शुद्ध करने तक सीमित नहीं है [ सामग्री की तालिका देखें])। विश्लेषण शुरू करने से पहले पूर्व और विश्लेषणात्मक कॉलम और नमूना लूप को संतुलित करें।
  3. सीरियल टीएमटी मल्टीप्लेक्स विश्लेषण से पहले और बीच में, मान्य करें कि एलसी-एमएस सिस्टम गुणवत्ता आश्वासन / गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूए / क्यूसी) टीएमटी-लेबल पेप्टाइड डाइजेस्ट और (जैसे, एमएसपीई ( सामग्री की तालिका देखें), हेला का उपयोग करके पहले बेंचमार्क किए गए प्रदर्शन मैट्रिक्स को पूरा करता है।
  4. एलसी ऑटोसैंपलर में उपयुक्त स्थिति में ऑटोसैंपलर शीशियों को लोड करें। एमएस विधि के साथ व्यक्तिगत अंशों का विश्लेषण करें। क्रोमैटोग्राफिक और मास स्पेक्ट्रल प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए पेप्टाइड मानक (जैसे, पेप्टाइड प्रतिधारण समय अंशांकन [पीआरटीसी]) के साथ लगभग एक बार "वॉश" रन को इंटरस्पर्स करें। प्रत्येक टीएमटी मल्टीप्लेक्स नमूना अंश श्रृंखला के विश्लेषण के बाद, सिस्टम प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए क्यूए /
  5. क्यूसी टीएमटी बेंचमार्क मानकों के बाद बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर मूल्यांकन दिनचर्या चलाएं ताकि नमूना प्रदर्शन का आकलन किया जा सके और फिर अगले नमूना सेट के लिए चरण 10.1 के रूप में सिस्टम को कैलिब्रेट किया जा सके।

11. जैव सूचनात्मक डेटा विश्लेषण

नोट: अनुमानित समय: प्रायोगिक डिजाइन निर्भर।

  1. सभी नमूना डेटा (जैसे, .raw फ़ाइलें) को उपयुक्त नेटवर्क स्टोरेज /
  2. पेप्टाइड वर्णक्रमीय मैच (पीएसएम) उत्पन्न करने और टीएमटी रिपोर्टर आयन सिग्नल तीव्रता निकालने के लिए प्रजाति-विशिष्ट प्रोटीन संदर्भ डेटाबेस के खिलाफ उपयुक्त पैरामीटर 9 का उपयोग करके वांछित डेटा विश्लेषण एप्लिकेशन (जैसे,प्रोटियोम डिस्कवर, शुभंकर) का उपयोग करके सभी अंशों को एक साथ खोजें। उपयुक्त गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स के आधार पर फ़िल्टर पीएसएम, और कुल सामान्यीकृत, औसत लॉग2-परिवर्तित टीएमटी रिपोर्टर आयन अनुपात वैश्विक प्रोटीन स्तर बहुतायत में बहुतायत, जैसा कि पहले 3,9 वर्णित है।
  3. वांछित अंतर विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ब्याज की स्थितियों में प्रोटीन परिवर्तन की तुलना करें।

Representative Results

दो एचजीएसओसी और दो ओसीसीसी रोगियों से ताजा जमे हुए ऊतक पतले वर्गों का विश्लेषण इस एकीकृत एआई-संचालित ऊतक आरओआई पहचान, विभाजन, एलएमडी और मात्रात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण वर्कफ़्लो (चित्रा 1) का उपयोग करके किया गया था। प्रत्येक ट्यूमर के लिए प्रतिनिधि एच एंड ई-दाग ऊतक वर्गों की समीक्षा बोर्ड-प्रमाणित रोगविज्ञानी द्वारा की गई थी; ट्यूमर सेलुलरिटी 70% से 99% तक थी। ऊतकों को पेन झिल्ली स्लाइड (पूरक फ़ाइल 2) पर पतला-खंडित किया गया था और कैलिब्रेटर फिड्यूशियल (पूरक फ़ाइल 1) के साथ प्रीकट किया गया था, जो एलएमडी सॉफ्टवेयर में कार्टेशियन समन्वय अभिविन्यास के साथ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में उत्पन्न एनोटेशन से स्थितीय अभिविन्यास डेटा के एकीकरण को सक्षम करता है। एच एंड ई धुंधला होने के बाद, ऊतक प्लस कैलिब्रेटर युक्त पेन स्लाइड्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों (20x) पर कब्जा कर लिया गया था।

माइक्रोग्राफ में ट्यूमर और स्ट्रोमल सेल आबादी को एलएमडी द्वारा चयनात्मक फसल के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके खंडित किया गया था, साथ ही पूरे ऊतक पतले खंड (जैसे, पूरे ट्यूमर ऊतक) (चित्रा 1) का प्रतिनिधित्व करने वाली फसल के साथ। पूरे ट्यूमर ऊतक संग्रह के लिए गैर-भेदभाव एनोटेशन 500 μm2 की टाइल्स के साथ पूरे ऊतक अनुभाग को विभाजित करके उत्पन्न किए गए थे, पेन झिल्ली अखंडता को बनाए रखने और एलएमडी के दौरान झिल्ली को कर्लिंग से रोकने के लिए टाइल्स के बीच 40 μm अंतर छोड़कर। हिस्टोलॉजी-हल एलएमडी संवर्धन के लिए स्लाइड पर, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एआई क्लासिफायर ( सामग्री की तालिका देखें) को खाली ग्लास स्लाइड पृष्ठभूमि के साथ ट्यूमर और स्ट्रोमल कोशिकाओं के बीच भेदभाव करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था। प्रतिनिधि ट्यूमर, स्ट्रोमा और रिक्त ग्लास क्षेत्रों को मैन्युअल रूप से हाइलाइट किया गया था, और क्लासिफायर टूल का उपयोग पूरे ऊतक अनुभाग में इन आरओआई को खंडित करने के लिए किया गया था। पूरे ऊतक, ट्यूमर उपकला और स्ट्रोमा का प्रतिनिधित्व करने वाली खंडित परतों को अलग-अलग एनोटेशन फाइलों (पूरक फ़ाइल 3 और पूरक फ़ाइल 6) के रूप में अलग से सहेजा गया था। छवि फ़ाइल की एक अलग प्रतिलिपि में (विभाजन आरओआई एनोटेशन के बिना), तीन फिड्यूशियल कैलिब्रेटर में से प्रत्येक के केंद्र की नोक से एक छोटी रेखा को एनोटेट किया गया था और एलएमडी एनोटेशन परत फ़ाइलों में से प्रत्येक के समान फ़ाइल नाम का उपयोग करके .एनोटेशन फ़ाइल के रूप में सहेजा गया था, लेकिन प्रत्यय "_calib" (पूरक फ़ाइल 4) के साथ संलग्न किया गया था। इन लाइनों का उपयोग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में खींचे गए एनोटेशन आकार सूची डेटा के साथ पेन झिल्ली कैलिब्रेटर की स्थिति को सह-पंजीकृत करने के लिए किया गया था।

वर्तमान अध्ययन इस एआई-संचालित एलएमडी वर्कफ़्लो का समर्थन करने के लिए पायथन में दो एल्गोरिदम, "मैलेटर" और "डैप" प्रदान करता है, जो https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 पर उपलब्ध हैं। मैलेटर एल्गोरिथ्म युग्मित .एनोटेशन फ़ाइलों से सभी व्यक्तिगत एनोटेशन (ऊतक आरओआई और कैलिब्रेटर) के लिए विशिष्ट कार्टेशियन निर्देशांक निकालता है और इन्हें एक एकल एक्सटेंसिबल मार्कअप लैंग्वेज (एक्सएमएल) आयात फ़ाइल (पूरक फ़ाइल 5) में विलय कर देता है। विशेष रूप से, मैलेटर एल्गोरिथ्म सभी उपनिर्देशिका फ़ोल्डरों को खोजने के लिए इनपुट के रूप में पैरेंट फ़ोल्डर से निर्देशिका नाम का उपयोग करता है और किसी भी सबफ़ोल्डर के लिए .xml फ़ाइलें जनरेट करता है जिसमें पहले से ही .xml मर्ज की गई फ़ाइल नहीं है। मैलेटर एल्गोरिथ्म छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में सभी एनोटेशन परतों को विलय कर देता है ( सामग्री की तालिका देखें) एक परत में और एआई-जनरेटेड आकार सूची डेटा को परिवर्तित करता है, जिसे मालिकाना .एनोटेशन फ़ाइल प्रकार के रूप में सहेजा जाता है, एलएमडी सॉफ़्टवेयर के साथ संगत .xml प्रारूप में। एनोटेशन और कैलिब्रेटर फ़ाइलों को विलय करने के बाद, एल्गोरिथ्म-जनरेटेड .xml फ़ाइल को एलएमडी सॉफ़्टवेयर में सहेजा और आयात किया जाता है। एनोटेशन के संरेखण को मैन्युअल रूप से समायोजित करने के लिए मामूली समायोजन आवश्यक हैं, जो लेजर माइक्रोस्कोप पर स्लाइड चरण की ऊर्ध्वाधर (जेड-प्लेन) स्थिति को पंजीकृत करने के लिए भी कार्य करता है। डैप एल्गोरिथ्म का उपयोग विशेष रूप से एलएमडी-समृद्ध संग्रह के लिए किया जाता है। विभाजित टाइल्स स्वचालित रूप से छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा व्यक्तिगत एनोटेशन परतों को सौंपा जाता है। डैप एल्गोरिथ्म क्लासिफायर टूल के उपयोग से पहले सभी विभाजित टाइल्स को एक एकल एनोटेशन परत में विलय कर देता है, जिससे एलएमडी समृद्ध संग्रह के लिए क्लासिफायर विश्लेषण रन टाइम कम हो जाता है।

पूरे ट्यूमर और एलएमडी-समृद्ध ऊतक के नमूनों को पचाया गया था, टीएमटी अभिकर्मकों के साथ लेबल किया गया था, मल्टीप्लेक्स, ऑफ़लाइन अंशित किया गया था, और मात्रात्मक एमएस-आधारित प्रोटिओमिक्स के माध्यम से विश्लेषण किया गया था जैसा कि पहलेवर्णित है 9. इस एआई संचालित वर्कफ़्लो का उपयोग करके काटे गए नमूनों के लिए औसत पेप्टाइड उपज (43-60 μg) और वसूली (0.46-0.59 μg / मिमी2) पिछली रिपोर्ट 9,10 के साथ तुलनीय थी। कुल 5,971 प्रोटीन सभी नमूनों (पूरक तालिका एस 1) में सह-मात्रा निर्धारित किए गए थे। 100 सबसे चर प्रोटीन का उपयोग करके असुरक्षित पदानुक्रमित क्लस्टरिंग के परिणामस्वरूप एलएमडी-समृद्ध और पूरे ट्यूमर नमूनों (चित्रा 2 ए) से एचजीएसओसी और ओसीसीसी हिस्टोटाइप का अलगाव हुआ, जो पहले वर्णित11 के समान था। इसके विपरीत, एचजीएसओसी और ओसीसीसी दोनों से एलएमडी-समृद्ध स्ट्रोमा नमूने एक साथ और स्वतंत्र रूप से एलएमडी-समृद्ध ट्यूमर और पूरे ट्यूमर के नमूनों से क्लस्टर किए गए। एचजीएसओसी और ओसीसीसी नमूनों (पूरक तालिका एस 2) से पूरे ट्यूमर संग्रह के बीच 5,971 मात्रा निर्धारित प्रोटीनों में से 215 को काफी बदल दिया गया था (एलआईएमएमए एडीजे पी < 0.05)। इन परिवर्तित प्रोटीनों की तुलना ह्यूजेस एट अल द्वारा एचजीएसओसी और ओसीसीसी ट्यूमर ऊतक को अलग करने के लिए पहचाने गए लोगों के साथ की गई थी। ह्यूजेस एट अल द्वारा मात्रा निर्धारित 76 हस्ताक्षर प्रोटीनों में से, 57 को इस डेटासेट में सह-मात्रा निर्धारित किया गया था और अत्यधिक सहसंबद्ध थे (स्पीयरमैन रो = 0.644, पी < 0.001) (चित्रा 2 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: डाउनस्ट्रीम मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स के लिए लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए ब्याज चयन के स्वचालित ऊतक क्षेत्र के लिए एकीकृत वर्कफ़्लो का सारांश। अंशांकन फिड्यूशियल एलएमडी माइक्रोस्कोप पर क्षैतिज स्थिति के साथ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, एचएएलओ में ऊतक आरओआई के एआई-व्युत्पन्न खंडों से स्थितिगत अभिविन्यास डेटा को सह-पंजीकृत करने के लिए पेन झिल्ली स्लाइड पर काट दिया जाता है। मैलेटर एल्गोरिथ्म का उपयोग _calib संदर्भ फ़ाइल के साथ स्लाइड के लिए सभी एनोटेशन परतों में एनोटेट विभाजन डेटा को मर्ज करने और इसे एलएमडी सॉफ़्टवेयर के साथ संगत .xml फ़ाइल में परिवर्तित करने के लिए किया जाता है। प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए एलएमडी-कटाई ऊतक को उच्च-थ्रूपुट मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स द्वारा पचाया और विश्लेषण किया जाता है जैसा कि पहले वर्णितहै 9. संक्षिप्त नाम: एलएमडी = लेजर माइक्रोडिसेक्शन; आरओआई = ब्याज का क्षेत्र; टीएमटी = अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग; क्वांट = परिमाणीकरण; अध्यक्ष। = पहचान; एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एलएमडी-समृद्ध और पूरे ट्यूमर के नमूनों में प्रोटीन का विश्लेषण( ए) एचजीएसओसी और ओसीसीसी एलएमडी समृद्ध और पूरे ट्यूमर नमूनों में 100 सबसे विविध प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का असुरक्षित पदानुक्रमित क्लस्टर विश्लेषण। (बी) वर्तमान अध्ययन (मिशेल एट अल, एक्स-अक्ष) में एचजीएसओसी और ओसीसीसी पूरे ट्यूमर फसल के बीच लॉग2 गुना-परिवर्तन प्रोटीन बहुतायत का सहसंबंध और ह्यूजेस एट अल द्वारा एक समान अध्ययन। संक्षिप्त नाम: एलएमडी = लेजर माइक्रोडिसेक्शन; एचजीएसओसी = उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि का कैंसर; ओसीसीसी = डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा; लॉग2एफसी = लॉग2-रूपांतरित प्रोटिओमिक बहुतायत। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका एस 1: एचजीएसओसी और ओसीसीसी ऊतक नमूनों से सभी एलएमडी समृद्ध और पूरे ट्यूमर नमूनों में 5,971 प्रोटीन की प्रचुरता सह-मात्रा निर्धारित की गई। संक्षिप्त नाम: एलएमडी = लेजर माइक्रोडिसेक्शन; एचजीएसओसी = उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि का कैंसर; ओसीसीसी = डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका एस 2: एचजीएसओसी बनाम ओसीसीसी (एलआईएमएमए एडीजे पी < 0.05) से पूरे ट्यूमर संग्रह में अलग-अलग व्यक्त प्रोटीन (215)। संक्षिप्त नाम: एचजीएसओसी = उच्च ग्रेड सीरस डिम्बग्रंथि का कैंसर; ओसीसीसी = डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: प्रतिनिधि आकृति सूची डेटा (.sld) फ़ाइल जिसमें चार स्लाइड स्थितियों के लिए मानक कैलिब्रेटर फिड्यूशियल होते हैं। फ़ाइल को एलएमडी सॉफ़्टवेयर में आयात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: एक एच एंड ई-दाग वाले उच्च-रिज़ॉल्यूशन (20x) ऊतक अनुभाग की प्रतिनिधि .svs छवि फ़ाइल। फ़ाइल को छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर या एलएमडी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके खोला और देखा जा सकता है। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन; एलएमडी = लेजर माइक्रोडिसेक्शन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 3: पूरे ट्यूमर खंडों के प्रतिनिधि .एनोटेशन फ़ाइल। फ़ाइल को छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आयात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 4: अंशशोधक फिड्यूशियल सेगमेंट की प्रतिनिधि _calib.एनोटेशन फ़ाइल। समन्वय जानकारी प्रत्येक एरोहेड फिड्यूशियल से खींची गई छोटी कैलिब्रेटर लाइनों की ओरिएंटल स्थिति का प्रतिनिधित्व करती है। फ़ाइल को छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आयात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 5: प्रतिनिधि एक्स्टेंसिबल मार्कअप भाषा (.xml) फ़ाइल जो मैलेटर एल्गोरिथ्म द्वारा उत्पन्न होती है। फ़ाइल को लेजर माइक्रोडिसेक्शन सॉफ़्टवेयर में आयात किया जा सकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 6: एलएमडी-समृद्ध संग्रह के लिए विभाजित एआई-वर्गीकृत खंडों की प्रतिनिधि .एनोटेशन फ़ाइल। फ़ाइल को छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में आयात किया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: एआई = कृत्रिम बुद्धिमत्ता; एलएमडी = लेजर माइक्रोडिसेक्शन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हालांकि एफएफपीई और/या ताजा जमे हुए ऊतकों से लक्ष्य सेलुलर उप-जनसंख्या के संवर्धन के लिए वर्कफ़्लो को विकसित करने और / या सुधारने के उद्देश्य से कई अध्ययन मिसालें हैं और प्रसंस्करण 9,12,13,14,15 के दौरान नमूना गुणवत्ता बनाए रखने के तरीके, परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए आणविक विश्लेषण के लिए नैदानिक ऊतक नमूने तैयार करने के लिए स्वचालित रणनीतियों को विकसित करने की पर्याप्त आवश्यकता है और प्रजनन क्षमता में वृद्धि। यह वर्कफ़्लो एक मानकीकृत, अर्धस्वचालित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो नैदानिक ऊतक नमूनों से एलएमडी द्वारा असतत सेल आबादी की ऊतक विज्ञान-हल फसल के लिए मौजूदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर टूल (सामग्री की तालिका देखें) को एकीकृत करता है।

असतत सेल आबादी पर कब्जा करने वाले आरओआई के स्थानिक रूप से हल किए गए एलएमडी संवर्धन आणविक लक्षण वर्णन और पहचान में सुधार और सेल-चयनात्मक बायोमार्कर खोज की सुविधा के लिए मल्टीओमिक विश्लेषण से पहले अगली पीढ़ी के ऊतक प्रसंस्करण चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह प्रोटोकॉल परिवेश पर्यावरण के लिए ऊतक वर्गों के अक्सर लंबे जोखिम को कम करके मौजूदा तरीकों में सुधार करता है जो एक हिस्टोलॉजिस्ट द्वारा आरओआई के मैनुअल विभाजन से जुड़ा होता है (जो एलएमडी संग्रह से पहले >1-2 घंटे लग सकता है)। यह वर्कफ़्लो इसके बजाय आरओआई को एआई-निर्देशित वर्गीकरण और विभाजन द्वारा पूर्व-पहचानने की अनुमति देता है। ऊतक निवास समय को सीमित करने से अत्यधिक लेबिल आणविक लक्ष्यों, जैसे फॉस्फोपेप्टाइड्स और एमआरएनए, या एंटीबॉडी-आधारित विश्लेषणात्मक तकनीकों के आकलन में नकली विविधताएं कम हो जाएंगी जो पता लगाने के लिए अपने मूल विरूपण में लक्ष्य प्रोटीन पर भरोसा करती हैं।

स्कैन की गई स्लाइड छवि में स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाली पेन झिल्ली स्लाइड पर स्वच्छ कैलिब्रेटर फिड्यूशियल काटना एलएमडी वर्कफ़्लो के साथ छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) के एकीकरण को सक्षम करने वाले प्रमुख घटकों में से एक है। यह सुनिश्चित करना कि कैलिब्रेटर में "वी" आकार के तल पर एक सटीक ("स्वच्छ") बिंदु है, कैलिब्रेटर लाइनों के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में एक सटीक बिंदु के चयन की अनुमति देता है, जैसा कि चरण 5.1.6 और 5.2.13 में वर्णित है। एलएमडी सॉफ़्टवेयर में आयात के दौरान इन बिंदुओं का संरेखण भौतिक एलएमडी स्लाइड पर प्रासंगिक ऊतक आरओआई पर एनोटेशन ("मैलेटर" और / या "डैप" एल्गोरिदम का उपयोग करके संगत .xml फ़ाइल की पीढ़ी के माध्यम से सुविधाजनक) को ठीक से ओवरले करने के लिए महत्वपूर्ण है। लेजर माइक्रोस्कोप पर स्लाइड चरण की ऊर्ध्वाधर (जेड-प्लेन) स्थिति को पंजीकृत करने के लिए एलएमडी सॉफ़्टवेयर में आयात पर संरेखण सटीक होने पर भी सभी आकृतियों और सामूहिक रूप से "ड्रैग एंड ड्रॉप" को उजागर करना आवश्यक है। यदि आवश्यक हो, तो इस चरण के दौरान ऊतक आरओआई पर एनोटेशन की स्थिति में मामूली समायोजन भी किया जा सकता है।

मैलेटर एल्गोरिथ्म के वर्तमान संस्करण की एक सीमा यह है कि यह छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रदान किए गए पूर्वनिर्धारित एनोटेशन आकार उपकरणों के साथ संगत नहीं है ( सामग्री की तालिका देखें), हालांकि एल्गोरिथ्म के भविष्य के अपडेट / इन उपकरणों का उपयोग करके खींची गई आकृतियों के लिए .एनोटेशन फ़ाइल में उन बिंदुओं के आसपास पूर्ण स्थानिक अभिविन्यास के बिना, प्रत्येक एनोटेशन के लिए युग्मित एक्स और वाई निर्देशांक के केवल दो सेट होते हैं। इन उपकरणों के वर्तमान उपयोग के परिणामस्वरूप आयात प्रक्रिया के दौरान केवल दो बिंदुओं द्वारा परिभाषित सीधी रेखाओं में एनोटेशन परिवर्तित हो जाते हैं। एक्सएमएल प्रारूप और एलएमडी आयात में सफल रूपांतरण के लिए ऊतक आरओआई खंडों की मैनुअल परिभाषा आवश्यक है। यह या तो लक्ष्य क्षेत्र के लिए विशिष्ट व्यक्तिगत फ्री-हैंड बहुभुज एनोटेशन के साथ प्रत्येक आरओआई को मैन्युअल रूप से परिभाषित करके या वांछित होने पर सभी ऊतक आरओआई खंडों में अनुमानित परिपत्र या आयताकार एनोटेशन लागू करके किया जा सकता है, और इस वर्कफ़्लो के साथ संगत होगा।

जबकि यहां प्रस्तुत वर्कफ़्लो को ताजा जमे हुए मानव कैंसर ऊतक नमूनों के प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रदर्शित किया गया था, इस एआई-संचालित एलएमडी वर्कफ़्लो का उपयोग एफएफपीई ऊतकों, गैर-कैंसर ऊतक प्रकारों और गैर-मानव स्रोतों के साथ समान रूप से किया जा सकता है। यह ट्रांसक्रिप्टोमिक, जीनोमिक या फॉस्फोप्रोटिओमिक विश्लेषण सहित अन्य डाउनस्ट्रीम आणविक प्रोफाइलिंग वर्कफ़्लो का भी समर्थन कर सकता है। यह वर्कफ़्लो छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के अन्य उपयोगों का भी लाभ उठा सकता है ( सामग्री की तालिका देखें), जिसमें सेल गिनती या अन्य विश्लेषणात्मक मॉड्यूल से जुड़ी क्षमताएं शामिल हैं, जिनमें "मल्टीप्लेक्स आईएचसी" मॉड्यूल या "टिशू माइक्रोएरे (टीएमए) ऐड-ऑन" शामिल हैं। इस वर्कफ़्लो के भविष्य के अनुप्रयोगों को आरओआई सेगमेंट प्रति कोशिकाओं की संख्या को पूर्वनिर्धारित करने से भी लाभ हो सकता है, जिससे कई संग्रहों में समतुल्य सेलुलर इनपुट सुनिश्चित हो सकते हैं, या ब्याज के सेलुलर आरओआई को परिभाषित करने के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करके, जैसे कि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या सेल समाजशास्त्र।

Disclosures

टीपीसी एक थर्मोफिशर वैज्ञानिक, इंक एसएबी सदस्य है और एबवी से अनुसंधान वित्त पोषण प्राप्त करता है।

Acknowledgments

इस परियोजना के लिए वित्त पोषण रक्षा स्वास्थ्य कार्यक्रम (एचयू0001-16-2-0006 और एचयू0001-16-2-00014) द्वारा स्त्री रोग कैंसर उत्कृष्टता केंद्र के लिए वर्दीधारी सेवा विश्वविद्यालय को प्रदान किया गया था। अध्ययन के डिजाइन, निष्पादन, व्याख्या या लेखन में प्रायोजकों की कोई भूमिका नहीं थी। अस्वीकरण: यहां व्यक्त किए गए विचार लेखकों के हैं और सेना / नौसेना / वायु सेना विभाग, रक्षा विभाग या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीति को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1260 Infinity II System Agilent Technologies Inc Offline LC system
96 MicroCaps (150uL) in bulk Pressure Biosciences Inc MC150-96
96 MicroPestles in bulk Pressure Biosciences Inc MP-96
96 MicroTubes in bulk (no caps) Pressure Biosciences Inc MT-96
9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits Fisher Scientific 03-060-058 Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade Fisher Chemical A995-4 Mobile phase solvent
Aperio AT2 Leica Microsystems 23AT2100 Slide scanner
Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap Fisher Scientific 14-222-292 Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler
Barocycler 2320EXT Pressure Biosciences Inc 2320-EXT Barocycler
BCA Protein Assay Kit Fisher Scientific P123225
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836170001
Easy-nLC 1200 Thermo Fisher Scientific Liquid Chromatography 
EasyPep Maxi Sample Prep Kit Thermo Fisher Scientific NCI5734 Post-label sample clean up column
EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 Fisher Scientific ES903 Analytical column
Eosin Y Solution Aqueous Sigma Aldrich HT110216
Formic Acid, 99+ % Thermo Fisher Scientific 28905 Mobile phase additive
ggplot2 version 3.3.5 CRAN https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/
HALO Indica Labs Image analysis software
IDLE (Integrated Development and Learning Environment) Python Software Foundation
iheatmapr version 0.5.1 CRAN https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/
iRT Kit Biognosys Ki-3002-1 LC-MS QAQC Standard
limma version 3.42.2 Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
LMD Scanning stage Ultra LMT350 Leica Microsystems 11888453 LMD stage model outfitted with PCT tube holder
LMD7 (software version 8.2.3.7603) Leica Microsystems LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet)
Mascot Server Matrix Science Data analysis software
Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest Promega V6951 LC-MS QAQC Standard
Mayer’s Hematoxylin Solution Sigma Aldrich MHS32
PEN Membrane Glass Slides Leica Microsystems 11532918
Peptide Retention Time Calibration Mixture Thermo Fisher Scientific 88321 LC-MS QAQC Standard
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 Sigma Aldrich P5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 Sigma Aldrich P0044
Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution Thermo Fisher Scientific 88323 Instrument calibration solution
PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK Fisher Scientific 164535 Pre-column
Proteome Discoverer Thermo Fisher Scientific OPTON-31040 Data analysis software
Python Python Software Foundation
Q Exactive HF-X Thermo Fisher Scientific Mass spectrometer
R version 3.6.0 CRAN https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/
RColorBrewer version 1.1-2 CRAN https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/
Soluble Smart Digest Kit Thermo Fisher Scientific 3251711 Digestion reagent
TMTpro 16plex Label Reagent Set Thermo Fisher Scientific A44520 isobaric TMT labeling reagents
Veriti 60 well thermal cycler Applied Biosystems 4384638 Thermocycler
Water, Optima LC/MS Grade Fisher Chemical W6-4 Mobile phase solvent
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) Agilent Technologies Inc 821125-932 Offline LC trap column
ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm Agilent Technologies Inc 763750-902 Offline LC analytical column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
  2. Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971 (2015).
  3. Hunt, A. L., et al. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757 (2021).
  4. Dou, Y., et al. Proteogenomic characterization of endometrial carcinoma. Cell. 180 (4), 729-748 (2020).
  5. Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  6. Gillette, M. A., et al. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).
  7. Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).
  8. Echle, A., et al. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).
  9. Lee, S., et al. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502 (2020).
  10. Xuan, Y., et al. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248 (2020).
  11. Hughes, C. S., et al. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949 (2016).
  12. Espina, V., et al. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).
  13. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  14. Havnar, C. A., et al. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394 (2021).
  15. Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 184 हिस्टोपैथोलॉजी छवि विश्लेषण लेजर माइक्रोडिसेक्शन ताजा जमे हुए ऊतक फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड ऊतक दबाव साइकिल चालन प्रौद्योगिकी अग्रानुक्रम द्रव्यमान टैग मात्रात्मक प्रोटिओमिक्स
ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के माइक्रोस्केल्ड प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए औद्योगिक, आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस-निर्देशित लेजर माइक्रोडिसेक्शन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mitchell, D., Hunt, A. L., Conrads,… More

Mitchell, D., Hunt, A. L., Conrads, K. A., Hood, B. L., Makohon-Moore, S. C., Rojas, C., Maxwell, G. L., Bateman, N. W., Conrads, T. P. Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (184), e64171, doi:10.3791/64171 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter