Summary
Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde med hög genomströmning för artificiell intelligens-driven segmentering av patologibekräftade regioner av intresse från färgade, tunna vävnadssektionsbilder för anrikning av histologiupplösta cellpopulationer med hjälp av lasermikrodissektion. Denna strategi inkluderar en ny algoritm som möjliggör överföring av avgränsningar som betecknar cellpopulationer av intresse direkt till lasermikroskop.
Abstract
Tumörmikromiljön (TME) representerar ett komplext ekosystem som består av dussintals distinkta celltyper, inklusive tumör-, stroma- och immuncellpopulationer. För att karakterisera variation på proteomnivå och tumörheterogenitet i stor skala behövs metoder med hög genomströmning för att selektivt isolera diskreta cellulära populationer i solida tumörmaligniteter. Detta protokoll beskriver ett arbetsflöde med hög genomströmning, aktiverat av artificiell intelligens (AI), som segmenterar bilder av hematoxylin och eosin (H&E) -färgade, tunna vävnadssektioner i patologibekräftade regioner av intresse för selektiv skörd av histologiupplösta cellpopulationer med hjälp av lasermikrodissektion (LMD). Denna strategi inkluderar en ny algoritm som möjliggör överföring av regioner som betecknar cellpopulationer av intresse, kommenterade med hjälp av digital bildprogramvara, direkt till lasermikroskop, vilket möjliggör mer enkla samlingar. Framgångsrik implementering av detta arbetsflöde utfördes, vilket demonstrerade nyttan av denna harmoniserade metod för att selektivt skörda tumörcellpopulationer från TME för kvantitativ, multiplexerad proteomisk analys genom högupplöst masspektrometri. Denna strategi integreras helt med rutinmässig histopatologisk granskning, utnyttjar digital bildanalys för att stödja anrikning av cellulära populationer av intresse och är helt generaliserbar, vilket möjliggör harmoniserade skördar av cellpopulationer från TME för multiomiska analyser.
Introduction
TME representerar ett komplext ekosystem befolkat av ett mycket varierat utbud av celltyper, såsom tumörceller, stromaceller, immunceller, endotelceller, andra mesenkymala celltyper och adipocyter, tillsammans med en komplex extracellulär matris1. Detta cellulära ekosystem varierar inom och mellan olika sjukdomsorganplatser, vilket resulterar i komplex tumörheterogenitet 2,3. Nya studier har visat att heterogena tumörer och tumörer med låg tumörcellitet (låg renhet) ofta korrelerar med dålig sjukdomsprognos 2,3.
För att förstå det molekylära samspelet mellan tumör- och icke-tumörcellpopulationer inom TME i stor skala är standardiserade strategier med hög genomströmning nödvändiga för att selektivt skörda distinkta cellulära populationer av intresse för nedströms multiomisk analys. Kvantitativ proteomik representerar en snabbt utvecklande och allt viktigare teknik för att främja förståelsen av cancerbiologi. Hittills har övervikten av studier som använder proteomik gjort det med proteiner extraherade från hela tumörvävnadspreparat (t.ex. kryopulveriserade), vilket leder till en brist i förståelsen av heterogenitet på proteomnivå i TME 4,5,6.
Utvecklingen av provinsamlingsstrategier som sömlöst integreras med och utnyttjar information från kliniska patologiarbetsflöden kommer att möjliggöra en ny generation av histologiupplöst proteomik som i hög grad kompletterar guldstandard, diagnostiska patologiarbetsflöden. LMD möjliggör direkt och selektiv insamling av cellulära subpopulationer eller regioner av intresse (ROI) genom mikroskopisk inspektion av histologiskt färgade vävnadstunna sektioner7. De senaste stora framstegen inom digital patologi och AI-aktiverad analys har visat förmågan att identifiera unika sammansättningsegenskaper och AVKASTNING inom TME på ett automatiserat sätt, varav många korrelerar med molekylära förändringar och kliniska sjukdomsegenskaper, såsom resistens mot terapi och sjukdomsprognos8.
Arbetsflödet som beskrivs i protokollet som presenteras här utnyttjar kommersiella mjukvarulösningar för att selektivt kommentera tumör-ROI inom digitala histopatologiska bilder och använder mjukvaruverktyg som utvecklats internt för att överföra dessa tumör-ROI till lasermikroskop för automatiserad insamling av diskreta cellulära populationer av intresse som sömlöst integreras med nedströms multiomiska analysarbetsflöden. Denna integrerade strategi minskar avsevärt LMD-operatörens tid och minimerar den varaktighet under vilken vävnader måste vara vid omgivningstemperatur. Integrationen av automatiserat funktionsval och LMD-skörd med kvantitativ proteomik med hög genomströmning demonstreras genom en differentiell analys av TME från två representativa epiteliala äggstockscancer histologiska subtyper, högkvalitativ serös äggstockscancer (HGSOC) och äggstocksklarcellscancer (OCCC).
Protocol
Alla studieprotokoll godkändes för användning enligt ett västerländskt IRB-godkänt protokoll "En integrerad molekylär analys av endometrie- och äggstockscancer för att identifiera och validera kliniskt informativa biomarkörer" som anses vara undantagna enligt amerikansk federal förordning 45 CFR 46.102 (f). Alla experimentella protokoll som involverade humandata i denna studie var i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Informerat samtycke erhölls från alla försökspersoner som var involverade i studien.
VARNING: Följande reagenser som används i hela protokollet är kända eller misstänkta cancerframkallande ämnen och / eller innehåller farliga material: etanol, DEPC-vatten, Mayers hematoxylinlösning, Eosin Y-lösning, metanol, acetonitril och myrsyra. Korrekt hantering, enligt beskrivningen i respektive säkerhetsdatablad (SDS), och användning av lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) är obligatorisk.
1. Generera standardfilen för formlistan (.sld) som innehåller calibratorfiducials
Protokollstegen som beskrivs i det här avsnittet är specifika för användning med ett inverterat lasermikroskop och tillhörande programvara (se materialförteckningen). Det är bara nödvändigt att skapa en standardfil för .sld en gång per lasermikroskop. Den resulterande filen kan användas för att skära fiducials i alla PEN-bilder som används därefter. Ungefärlig tid: 5 min (endast en gång).
- Öppna LMD-programvaran och ladda polyetennaftalatmembranet (PEN) på LMD-scenen med framsidan nedåt, med etiketten närmast användaren. Avmarkera rutan Stäng rad(er) till höger i programfönstret.
- Använd PtoP-funktionen (punkt till punkt) under hög förstoring (63x) för att rita tre "V" -pilar för att fungera som kalibreringsfiducialer. Börja vid en extern punkt på V, rita en linje till V: s mittpunkt och klicka en gång. Rita sedan en andra linje från V:ets mittpunkt till slutet av den andra externa V-punkten och dubbelklicka för att skapa en enda, osluten V-form från de två linjerna.
OBS: Dessa kalibreringsfiducials ska placeras i tre hörn av bilden: höger fram, höger bak, vänster bak. - Välj AF (autofokus) före klippalternativ . Klipp bilden i läge 1, flytta den till var och en av de återstående glidpositionerna och spåra exakt över kalibreringsskärningarna.
- Spara .sld-filen och välj alternativet Spara utan kalibrering i popup-dialogrutan för att undvika att kalibreringsfiducialerna skärs in i membranet.
OBS: En representativ .sld-fil som innehåller standardkalibreringsfiducials för fyra bildpositioner finns i tilläggsfil 1.
2. Förberedelse av LMD-objekt
Protokollstegen som beskrivs i det här avsnittet är specifika för användning med ett inverterat lasermikroskop och tillhörande programvara (se materialförteckningen). Ungefärlig tid: 5 min.
- Se till att objektglaset är helt torrt innan du skär referenskalibreringspunkterna. Öppna LMD-programvaran och öppna standardkalibreringsfilen .sld under alternativet Importera former .
- Välj AF (autofokus) före klippalternativ . Ladda bilden/bilderna med vävnaden nedåt och etiketten skjut närmare operatören i glidhållaren på LMD-scenen.
- Med hjälp av lasermikroskopet och standardkalibreringsfilen .sld skär du kalibreringsfiducials i PEN-membranet.
- VALFRITT: Skär kalibreringsfiducialerna i PEN-membranet antingen före eller efter att vävnadssektionen /vävnaderna är placerade på bilden. Om kalibreringsfiducialerna skärs före vävnadsplacering, se till att vävnaden och/eller fixeringsmedlet inte överlappar kalibratorerna när vävnaden placeras på objektsglaset i steg 2.5. Om kalibreringsfiducialer skärs efter vävnadsplacering, stoppa efter avslutad steg 2.4 och fortsätt till avsnitt 3.
- Granska alla kalibratorer individuellt för att säkerställa att varje snitt är komplett och synligt.
OBS: Använd funktionen Flytta och klipp för att manuellt rikta lasern över eventuella kalibreringsfiducials som inte helt skar genom PEN-membranet. - Placera den frysta eller formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnadssektionen på bilden som innehåller kalibreringsfiducialerna.
3. Vävnadsfärgning
OBS: Ungefärlig tid: 30 min.
- Fixera de frysta LMD-vävnadsglasen i 70% etanol (EtOH) som innehåller fosfatashämmare cocktailreagenser i 5 minuter.
- Tvätta objektglasen i dietylpyrokarbomatvatten (DEPC) som innehåller fosfatashämmare cocktailreagenser i 1 min.
- Tvätta diabilderna i DEPC-vatten i 1 min.
- Inkubera bilderna i Mayers hematoxylinlösning i 3 minuter.
- Skölj diabilderna i DEPC-vatten i 3 min.
- Skölj bilderna i ett nytt utbyte av DEPC-vatten i 1 min.
- Inkubera bilderna i vattenhaltig Eosin Y-lösning i 1 s.
- Skölj bilderna 2 x 5 s i 95% EtOH.
- Skölj bilderna 3 x 10 s i 100% EtOH.
- Torka av överflödig EtOH från baksidan av bilderna och låt bilderna lufttorka.
- Förvara objektglasen vid -80 °C om LMD inte ska utföras omedelbart.
4. Bildbehandling
Protokollstegen som beskrivs i det här avsnittet är specifika för bilder som skannas (se materialförteckningen) och de resulterande bilderna som sparas som .svs-filer. Använd valfri skanner och tillhörande programvara som genererar bildfiler i ett format som bildanalysprogramvaran (se materialförteckningen) kan öppna. Filtyper med pyramidala tiffs som stöds inkluderar JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, komponent TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB och ISYNTAX. Ungefärlig tid: 5 min.
- Slå på skannern och öppna bildskannerprogramvaran. Ladda bilden med vävnaden uppåt på det enda glidsteget i skannern. Se till att bilden är helt torr och placera försiktigt ett täckglas över vävnaden. Använd inte etanol eller nedsänkningsolja under täckglaset.
- Ta mikrografbilden med inställningar som är kalibrerade för att justera för PEN-membranet istället för glasbakgrund och för att ignorera bakgrundsmembranfärgning, enligt tillverkarens instruktioner.
- Justera bildområdet genom att dra och ändra storlek på den inre gröna omkretsen för att fånga upp hela PEN-membranområdet efter behov. Lägg till fyra fokuspunkter på vävnaden genom att dubbelklicka på ögonblicksbildsöversiktsbilden och tre fokuspunkter på membranet nära kalibreringsfiducialerna (en fokuspunkt per vart och ett av de tre kalibreringsfiducialerna).
OBS: De fyra fokuspunkterna kan placeras nästan var som helst på vävnadssektionen, men placering på vävnad som är för mörkt färgad och verkar svart kan orsaka att skanningen misslyckas. - Under menyn Visa väljer du Videoövervakare. Justera fokus manuellt med skjutreglaget för fin- och/eller makrofokus, efter behov, för varje punkt runt LMD-vävnaden. Fånga bildskanningen under hög förstoring (20x). Kontrollera att alla kalibreringsobjekt är synliga och tydliga i den sparade bilden.
5. Automatiserat funktionsval med hjälp av bildanalysprogramvara
- För hela tumörsamlingar (ungefärlig tid: 5 min; fallberoende):
- Öppna bildanalysprogrammet (se materialförteckningen). Välj Öppna bilder och i popup-fönstret väljer du .svs-bildfilen som genereras från skanning av bilden på AT2-skannern.
OBS: En representativ .svs-bildfil finns i tilläggsfil 2. - Navigera till fliken Anteckningar . Välj ritstiftsverktyget i verktygsfältet Anteckning och rita en form runt vävnaden.
- Välj formen och högerklicka på bilden. I rullgardinsmenyn Avancerat väljer du Partitionering (kaklat). Ställ in Panelstorlek och Mellanslag till 500 respektive 40 och välj OK för att generera panelerna. Markera och ta bort omkretsformen som används för att generera panelerna i steg 5.1.2.
- Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Exportera för att spara de kaklade anteckningarna som en .annotation-fil.
OBS: En representativ .annotation-fil för en hel tumörvävnadssamling finns i tilläggsfil 3. - Skapa en mapp för sessionen eller projektet och spara ANTECKNINGSFILEN i en undermapp märkt med den unika identifieraren för bilden.
- Navigera till fliken Anteckningar . Välj listrutan Lageråtgärder | Ta bort alla lager om du vill ta bort alla anteckningar från bilden. Välj ritstiftsverktyget och rita en kort linje från pilspetsens innerspets för varje kalibreringsfiducial. Rita linjerna från märkena i följande ordning: uppe till vänster, uppe till höger, längst ner till höger.
- Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Exportera för att spara radanteckningarna som en .annotation-fil. Lägg till _calib i filnamnet och placera filen i undermappen som innehåller koordinaterna för de kaklade formerna.
OBS: En representativ _calib.annotation-fil finns i tilläggsfil 4. - Kopiera adressen för huvudprojektet eller sessionsmappen. Öppna XML-importgenererande skriptet "Malleator" (tillgängligt via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) med hjälp av den integrerade utvecklingsmiljön IDLE och klistra in projektmappens adress mellan citattecknen längst ner i skriptet.
- Välj rullgardinsmenyn Kör | Kör modul för att köra skriptet.
OBS: Den .xml LMD-importfilen genereras i undermappen som skapats för bilden / bilden. En representativ .xml fil finns i tilläggsfil 5.
- Öppna bildanalysprogrammet (se materialförteckningen). Välj Öppna bilder och i popup-fönstret väljer du .svs-bildfilen som genereras från skanning av bilden på AT2-skannern.
- Endast för LMD-berikade samlingar (ungefärlig tid: 15 min; skiftlägesberoende):
- Öppna bildanalysprogrammet (se materialförteckningen). Välj Öppna bilder och i popup-fönstret väljer du .svs-bildfilen som genereras från skanning av bilden.
- Navigera till fliken Anteckningar . Markera och använd anteckningsverktyget Rektangel för att rita en ruta runt vävnaden.
- Markera rutan och högerklicka på bilden. Välj rullgardinsmenyn Avancerat | Partitionering (kaklat) alternativ. Ställ in Panelstorlek och Mellanslag till 500 respektive 40 och välj OK för att generera panelerna. Markera och ta bort perimeterboxanteckningen som användes för att generera panelerna i steg 5.2.2.
- Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Exportera för att spara de kaklade anteckningarna som en .annotation-fil.
- Placera en sparad kopia av Python-algoritmen "Dapọ" (tillgänglig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), utvecklad för att slå samman de AI-klassificerade anteckningsskikten, i samma mapp som den kaklade anteckningsfilen.
- Kopiera namnet på den kaklade anteckningsfilen. Öppna Python-programmet med den integrerade utvecklingsmiljön IDLE och klistra in namnet på den kaklade anteckningsfilen mellan citaten längst ner i programmet.
- Välj rullgardinsmenyn Kör | Kör modul. Vänta tills en ny fil genereras som kommer att ha alla kaklade anteckningar sammanfogade under ett enda lager.
- Öppna bildanalysprogramvaran och navigera till fliken Anteckningar . Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Ta bort alla lager om du vill ta bort alla anteckningar från bilden.
- Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Importera lokal anteckningsfil. I popup-fönstret väljer du den sammanslagna .annotation-filen som genererades av skriptet. Se till att alla importerade paneler finns under samma anteckningslager.
- Navigera till fliken Klassificerare och följ tillverkarens instruktioner för att generera former för avkastning på sysselsatt kapital. Innan du kör klassificeraren väljer du önskat anteckningslager (dvs. tumör- eller stromalagret) genom att markera ROI-rutan eller rutorna på fliken Anteckningar under Avancerade klassificeringsalternativ. Använd alternativet Anteckningslager på menyn Åtgärder för klassificerare för att köra klassificeraren.
- När klassificeraranalysen är klar navigerar du till fliken Anteckningar och väljer det anteckningslager som genereras från analysen. Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Ta bort alla lager utom aktuella om du vill ta bort alla andra anteckningslager från bilden.
- Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Exportera för att spara anteckningarna som en .annotation-fil. Skapa en mapp för sessionen eller projektet och spara ANTECKNINGSFILEN i en undermapp märkt med den unika identifieraren för bilden.
OBS: En representativ .annotation-fil för en klassificerad LMD-anrikad vävnadssamling finns i tilläggsfil 6. - Navigera till fliken Anteckningar och välj listrutan Lageråtgärder | Ta bort alla lager om du vill ta bort alla anteckningar från bilden. Välj ritstiftsverktyget och rita en kort linje från varje kalibreringsfiducial. Rita linjer från märkena i följande ordning: uppe till vänster, uppe till höger, längst ner till höger.
- Välj rullgardinsmenyn Lageråtgärder | Exportera för att spara radanteckningarna som en .annotation-fil. Lägg till _calib i filnamnet och placera filen i undermappen som innehåller koordinaterna för de kaklade formerna.
- Kopiera adressen för huvudprojektet eller sessionsmappen. Öppna XML-importgenererande skriptet "Malleator" (tillgängligt via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) med hjälp av den integrerade utvecklingsmiljön IDLE och klistra sedan in projektmappens adress mellan citattecknen längst ned i skriptet.
- Välj rullgardinsmenyn Kör | Kör modul för att köra skriptet.
OBS: Den .xml LMD-importfilen genereras inuti undermappen som skapats för bilden / bilden.
6. Lasermikrodissektion
Protokollstegen som beskrivs i det här avsnittet är specifika för användning med ett inverterat lasermikroskop och tillhörande programvara (se materialförteckningen). Ungefärlig tid: 2 h; fallberoende.
- Ladda den markerade membranglidningen (som innehåller kalibreringsfiducials) med vävnaden nedåt och etikettsidan närmare operatören i glidhållaren på lasermikroskopsteget.
- Välj Importera former från rullgardinsmenyn Arkiv . Välj den .xml LMD-importfilen som genereras för bilden. Välj Nej i popup-fönstret för att undvika att läsa in referenspunkter från filen och Nej i det andra popup-fönstret för att undvika att använda tidigare lagrade referenspunkter för kalibrering.
- Följ anvisningarna från LMD-applikationen och rikta kalibreringskorset mot vart och ett av de tre kalibreringsfiducialerna på bilden. Leta efter kalibreringsfiducials som visas längst upp till vänster, uppe till höger och längst ned till höger i bilden i bildanalysprogramvaran som motsvarar referenspunkter i det främre högra, bakre högra respektive bakre vänstra hörnet av den inverterade LMD-bilden på mikroskopsteget. Växla mellan att använda 5x objektivlinsen för att hitta och 63x-målet för att justera varje kalibreringsfiducial. Välj Nej i popup-fönstret för att undvika att spara referenspunkterna i filen och OK i det andra popup-fönstret för att bekräfta att bilden är infogad.
- Flytta 5x objektivlinsen på plats och välj Ja i popup-fönstret för att använda den faktiska förstoringen. När de importerade formerna visas fokuserar du kameran på vävnaden.
- Markera och markera alla former i fönstret Figurlista , dra dem på plats med en eller två anteckningar inom synfältet som referenser och justera den lodräta z-axeln för skärning med lasern.
- Granska de importerade formerna och tilldela dem till lämplig rörposition för insamling. Tryck på Start Cut för att starta lasern.
OBS: Importerade former i .xml-filen tilldelas automatiskt till "inget lock" -positionen i fönstret Formerlista . För att skörda vävnad måste de importerade formerna omplaceras till en plats som innehåller ett laddat rör.
7. Proteinsmältning med tryckcykelteknik (PCT)
OBS: Ungefärlig tid: 4 h (3 h utan torkningstid för vakuumcentrifug).
- Placera 0,5 ml rör som innehåller de kapslade PCT-mikrorören som innehåller LMD-skördad vävnad i 20 μl 100 mM TEAB/10% acetonitril i en termocykling och värm vid 99 °C i 30 minuter och kyl sedan till 50 °C i 10 minuter.
- Snurra rören i 30 s vid 4 000 × g och ta sedan bort MicroTubes från 0,5 ml-rören. Använd MicroCap-verktyget och ta bort MicroCaps från PCT MicroTubes. Tillsätt trypsin (se materialtabellen) i förhållandet 1 μg per 30 mm2 vävnad och sätt in en MicroPestle i MicroTube med microcap-verktyget.
- Överför MicroTubes till en barocyclerpatron och montera hela patronen. Placera patronen i barocyclertryckkammaren och säkra locket. Barocykel vid 45 000 psi i 50 s och atmosfärstryck i 10 s vid 50 °C i 60 cykler.
- När barocykling är klar överför du mikrorören till ett 0,5 ml mikrocentrifugrör och centrifugerar i 2 minuter vid 4 000 × g.
- Ta bort MicroTube från 0,5 ml mikrocentrifugröret med hjälp av lockverktyget. Ta försiktigt bort stöten med lockverktyget och skölj den nedre halvan av stöten med 20 μL vatten av vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) och samla upp tvätten i ett rent 0,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tryck försiktigt på MicroTube på bänkskivan för att flytta vätskan till botten och överför all lösning från MicroTube till 0,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 20 μL LC-MS-vatten till MicroTube och knacka försiktigt på bänkskivan. Överför tvättlösningen till 0,5 ml röret och upprepa detta tvättsteg en gång till.
- Vakuumcentrifugera för att torka ner proverna till ~ 2 μL och tillsätt 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0.
- Bestäm peptidkoncentrationen med hjälp av en kolorimetrisk analys (bicinchoninic acid (BCA) analys; se materialtabellen) enligt tillverkarens protokoll.
8. Tandem-mass tag (TMT) märkning och EasyPep-rengöring
OBS: Ungefärlig tid: 7 h 20 min (2 h 20 min utan torkningstid för vakuumcentrifug).
- Bringa de isobariska TMT-märkningsreagenserna till omgivningstemperatur innan de öppnas. Tillsätt 500 μl 100 % acetonitril till varje TMT-injektionsflaska (5 mg). Inkubera i 10 min med enstaka virvlar.
- Lös upp 5 μg av peptidprovet i 100 μl 100 mM TEAB, pH 8,0 och tillsätt 10 μL av ett givet TMT-reagens. Konstruera och inkludera referenspooler som representerar varje enskilt prov i experimentet i varje TMT-multiplex uppsättning prover för att underlätta kvantifiering av prover över flera TMT-multiplexer9. Inkubera reaktioner i 1 timme vid omgivningstemperatur med tillfällig skakning/knackning.
- Släck TMT-märkningsreaktionen genom att tillsätta 10 μl 5% hydroxylamin och inkubera i 30 minuter vid omgivningstemperatur med tillfällig tappning. Efter släckning, kombinera de TMT-märkta proverna i ett rör och torka till cirka 200 μL.
- Tillsätt 1 800 μl 0,1 % myrsyra. Kontrollera pH med pH-papper: om pH ~ 3, tillsätt 1 ml 0,1% myrsyra; om pH >3, tillsätt 10-20 μl 5% myrsyra tills pH ~ 3. Tillsätt 0,1% myrsyra för att få till en slutlig volym på 3 ml.
- Ta bort fliken längst ner på peptidrengöringskolonnen, ta bort locket och placera det i ett 15 ml koniskt rör. Överför det TMT-märkta provet till kolumnen och fortsätt med rengöring enligt tillverkarens protokoll.
- Vakuumcentrifugera för att torka ner de eluerade peptiderna till ~ 20 μL, överför till en LC-injektionsflaska med 25 mM ammoniumbikarbonat för en slutlig volym på 80 μL och fortsätt till offline fraktionering.
9. Fraktionering och sammanslagning av TMT-multiplexprov
OBS: Ungefärlig tid: 3 h 30 min (1 h 30 min utan torkningstid för vakuumcentrifug).
- Fraktionera de TMT-märkta peptidmultiplexerna genom grundläggande omvänd faskromatografi i 96 fraktioner genom att utveckla en ökande linjär gradient (0,69% min-1) av mobil fas B (acetonitril) till mobil fas A (10 mMNH4HCO3, pH 8,0).
- Generera 36 sammanfogade fraktioner genom att slå samman provbrunnar. Vakuumcentrifugera till torra fraktioner till ~ 2 μL och återsuspendera i 25 mM ammoniumbikarbonat (slutkoncentration 1,5 μg / 10 μL), centrifugera vid 15 000 × g i 10-15 minuter och överföra till LC-injektionsflaskor för MS-analys.
10. Vätskekromatografi tandemmasspektrometri (LC-MS / MS)
OBS: Ungefärlig tid: Instrumentmetod och experimentell design beroende.
- Kalibrera masspektrometern enligt tillverkarens instruktioner/protokoll.
- Förbered nya mobila faser och standarder och utför lämpliga LC-förkörningsförberedelser (inklusive men inte begränsat till reningslösningsmedel, spolluft och läckagetestskript för det refererade instrumentet [se materialtabellen]). Balansera pre- och analyskolonner och provslinga innan analyserna påbörjas.
- Före och mellan seriella TMT-multiplexanalyser, validera att LC-MS-systemet uppfyller tidigare benchmarkade prestandamått med hjälp av kvalitetssäkring/kvalitetskontroll (QA/QC) TMT-märkta peptidrötningar och (t.ex. MSPE (se materialtabellen), HeLa).
- Ladda autosamplerflaskor i lämpliga positioner i LC autosampler. Analysera enskilda fraktioner med en lämplig gradient/MS-metod. Varva en "tvätt" -körning med peptidstandard (t.ex. peptidretentionstidskalibrering [PRTC]) ungefär en gång dagligen för att utvärdera kromatografisk och masspektral prestanda. Efter analysen av varje TMT-multiplexprovfraktionsserie kör du QA/QC TMT-benchmarkstandarder för att utvärdera systemets prestanda.
- Kör utvärderingsrutiner för masspektrometer efter QA/QC TMT-benchmarkstandarder för att bedöma prestanda efter provet och kalibrera sedan systemet som i steg 10.1 för nästa provuppsättning.
11. Bioinformatisk dataanalys
OBS: Ungefärlig tid: Experimentell designberoende.
- Överför alla exempeldata (t.ex. .raw filer) till en lämplig nätverkslagrings-/datorenhet.
- Sök alla fraktioner tillsammans med hjälp av önskad dataanalysapplikation (t.ex. Proteome Discover, Mascot) med lämpliga parametrar9 mot en artspecifik proteinreferensdatabas för att generera peptidspektrala matchningar (PSM) och extrahera TMT-reporterjonsignalintensiteter. Filtrera PSM baserat på lämpliga kvalitetskontrollmått och aggregera normaliserade, medianlogg2-transformerade TMT-reporterjonförhållande överflöd till globala proteinnivåmängder, som tidigare beskrivits 3,9.
- Jämföra proteinförändringar under intressanta förhållanden med hjälp av önskad differentialanalysprogramvara.
Representative Results
Färskfrysta vävnadstunna sektioner från två HGSOC- och två OCCC-patienter analyserades med hjälp av denna integrerade AI-drivna vävnads ROI-identifiering, segmentering, LMD och kvantitativt proteomiskt analysarbetsflöde (Figur 1). Representativa H&E-färgade vävnadssektioner för varje tumör granskades av en styrelsecertifierad patolog; tumörcellitet varierade från 70% till 99%. Vävnader tunnades på PEN-membranglas (Kompletterande fil 2) och förklipptes med kalibratorfiducials (Kompletterande fil 1), vilket möjliggjorde integration av positionsorienteringsdata från anteckningar som genererades i bildanalysprogramvaran (se materialförteckningen) med kartesisk koordinatorientering i LMD-programvaran. Efter H&E-färgning togs högupplösta bilder (20x) av PEN-bilderna som innehåller vävnaden plus kalibratorerna.
Tumör- och stromacellpopulationer i mikrograferna segmenterades med hjälp av bildanalysprogramvara (se materialtabellen) för selektiv skörd av LMD, tillsammans med skördar som representerar hela den vävnadstunna sektionen (t.ex. hela tumörvävnaden) (Figur 1). Icke-diskriminerande anteckningar för hela tumörvävnadssamlingar genererades genom att partitionera hela vävnadssektionen med plattor på 500 μm2, vilket lämnade ett mellanrum på 40 μm mellan plattorna för att upprätthålla PEN-membranets integritet och förhindra att membranet krullar under LMD. På bilder för histologiupplöst LMD-anrikning utbildades AI-klassificeraren i bildanalysprogramvaran (se materialtabellen) för att skilja mellan tumör- och stromaceller, tillsammans med den tomma glasglasbakgrunden. Representativa tumör-, stroma- och blankglasregioner markerades manuellt, och klassificeringsverktyget användes för att segmentera dessa ROI genom hela vävnadssektionen. De segmenterade skikten som representerar hel vävnad, tumörepitel och stroma sparades separat som enskilda .annotation-filer (Supplemental File 3 och Supplemental File 6). I en separat kopia av bildfilen (utan de partitionerade ROI-anteckningarna) kommenterades en kort rad från den mittersta spetsen av var och en av de tre fiduciella kalibratorerna och sparades som en .annotation-fil med samma filnamn som var och en av LMD-anteckningslagerfilerna men bifogades med suffixet "_calib" (Tilläggsfil 4). Dessa linjer användes för att samregistrera positionen för PEN-membrankalibratorerna med de annoteringsformlistdata som ritades i bildanalysprogramvaran.
Den aktuella studien tillhandahåller två algoritmer, "Malleator" och "Dapọ" i Python för att stödja detta AI-drivna LMD-arbetsflöde, som finns tillgängliga på https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. Malleator-algoritmen extraherar de specifika kartesiska koordinaterna för alla enskilda anteckningar (vävnads-ROI och kalibratorer) från de parade .annotation-filerna och sammanfogar dessa till en enda XML-importfil (Extensible Markup Language) (Kompletterande fil 5). Mer specifikt använder Malleator-algoritmen katalognamnet från en överordnad mapp som indata för att söka i alla underkatalogmappar och genererar .xml filer för alla undermappar som inte redan har en .xml sammanslagna fil. Malleator-algoritmen sammanfogar alla anteckningslager i bildanalysprogramvaran (se materialförteckningen) till ett enda lager och konverterar AI-genererade formlistdata, som sparas som proprietär .annotation-filtyp, till .xml format som är kompatibelt med LMD-programvaran. Efter sammanslagning av antecknings- och calibratorfilerna sparas den algoritmgenererade .xml-filen och importeras till LMD-programvaran. Små justeringar är nödvändiga för att manuellt justera inriktningen av anteckningar, vilket också tjänar till att registrera den vertikala (z-plan) positionen för glidsteget på lasermikroskopet. Dapọ-algoritmen används specifikt för LMD-berikade samlingar. Partitionerade paneler tilldelas automatiskt till enskilda anteckningslager av bildanalysprogramvaran. Dapọ-algoritmen sammanfogar alla partitionerade paneler till ett enda anteckningslager innan klassificeringsverktyget används, vilket minskar körningstiden för klassificeraranalys för LMD-berikade samlingar.
Hela tumören och LMD-berikade vävnadsprover smältes, märktes med TMT-reagenser, multiplexerades, fraktionerades offline och analyserades via kvantitativ MS-baserad proteomik som tidigare beskrivits9. Det genomsnittliga peptidutbytet (43-60 μg) och återvinningen (0,46-0,59 μg/mm2) för prover som skördats med detta AI-drivna arbetsflöde var jämförbara med tidigare rapporter 9,10. Totalt 5 971 proteiner samkvantifierades för alla prover (kompletterande tabell S1). Oövervakad hierarkisk klustring med de 100 mest variabla proteinerna resulterade i segregering av HGSOC- och OCCC-histotyperna från de LMD-berikade och hela tumörproverna (figur 2A), liknande den som tidigare beskrivits11. Däremot grupperade de LMD-berikade stromaproverna från både HGSOC och OCCC tillsammans och oberoende av de LMD-berikade tumör- och hela tumörproverna. Bland de 5 971 kvantifierade proteinerna förändrades 215 signifikant (LIMMA adj. p < 0,05) mellan hela tumörsamlingar från HGSOC- och OCCC-prover (Tilläggstabell S2). Dessa förändrade proteiner jämfördes med de som identifierades för att differentiera HGSOC- och OCCC-tumörvävnad av Hughes et al.11. Av de 76 signaturproteiner som kvantifierades av Hughes et al., var 57 medkvantifierade i denna dataset och var starkt korrelerade (Spearman Rho = 0,644, p < 0,001) (Figur 2B).
Figur 1: Sammanfattning av det integrerade arbetsflödet för automatiserad vävnadsregion av intresse för lasermikrodissektion för nedströms kvantitativ proteomik. Kalibreringsfiducials skärs på PEN-membranglas för att samregistrera positionsorienteringsdata från AI-härledda segment av vävnadsavkastning i bildanalysprogramvaran HALO med horisontell positionering på LMD-mikroskopet. Malleator-algoritmen används för att slå samman kommenterade segmenteringsdata över alla anteckningslager för en bild med _calib-referensfilen och för att konvertera den till en .xml-fil som är kompatibel med LMD-programvaran. LMD-skördad vävnad för proteomisk analys smälts och analyseras med kvantitativ proteomik med hög genomströmning som tidigare beskrivits9. Förkortningar: LMD = lasermikrodissektion; ROI = region av intresse; TMT = tandem massa tagg; = kvantifiering; Ident. = identifiering, LC-MS/MS = vätskekromatografi-tandemmasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Analys av proteinerna i LMD-berikade och hela tumörprover. (B) Korrelation av log 2-faldigt proteinmängder mellan HGSOC och OCCC hela tumörskördar i den aktuella studien (Mitchell et al., x-axis) och en liknande studie av Hughes m.fl. (y-axeln)11. Förkortningar: LMD = lasermikrodissektion; HGSOC = högkvalitativ serös äggstockscancer; OCCC = äggstocksklar cellcancer; log2FC = log2-transformerad proteomisk överflöd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande tabell S1: Överflöd av 5 971 proteiner som samkvantifieras över alla LMD-berikade och hela tumörprover från HGSOC- och OCCC-vävnadsprover. Förkortningar: LMD = lasermikrodissektion; HGSOC = högkvalitativ serös äggstockscancer; OCCC = ovariellt klarcellscancer. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande tabell S2: Differentiellt uttryckta proteiner (215) i hela tumörsamlingar från HGSOC vs OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Förkortningar: HGSOC = högkvalitativ serös äggstockscancer; OCCC = ovariellt klarcellscancer. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tilläggsfil 1: Representativ formlistedatafil (.sld) som innehåller standardkalibreringsfiducials för fyra bildpositioner. Filen kan importeras till LMD-programvaran. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 2: Representativ .svs-bildfil för en H&E-färgad högupplöst (20x) vävnadssektion. Filen kan öppnas och visas med hjälp av bildanalysprogramvara eller LMD-programvara. Förkortning: H&E = hematoxylin och eosin; LMD = lasermikrodissektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Representativ .annotation-fil för partitionerade hela tumörsegment. Filen kan importeras till bildanalysprogramvara. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 4: Representativ _calib.annotation-fil med calibrator-fiduciella segment. Koordinatinformation representerar orientalisk positionering av de korta kalibratorlinjerna som dras från varje pilspetsfiducial. Filen kan importeras till bildanalysprogramvara. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: Representativ utökningsbar markeringsspråkfil (.xml) som genereras av Malleator-algoritmen. Filen kan importeras till lasermikrodissektionsprogramvaran. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 6: Representativ .annotation-fil för partitionerade AI-klassificerade segment för LMD-berikade samlingar. Filen kan importeras till bildanalysprogramvara. Förkortningar: AI = artificiell intelligens; LMD = lasermikrodissektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Även om det har funnits flera studieprejudikat som syftar till att utveckla och/eller förbättra arbetsflöden för anrikning av målcellulära subpopulationer från FFPE och/eller färskfrysta vävnader och metoder för att upprätthålla provkvaliteten under bearbetningen 9,12,13,14,15, finns det ett betydande behov av att utveckla automatiserade strategier för att förbereda kliniska vävnadsprover för molekylära analyser för att minska variationen och öka reproducerbarheten. Detta arbetsflöde beskriver ett standardiserat, halvautomatiserat protokoll som integrerar befintliga programvaruverktyg för bildanalys (se materialförteckningen) för histologiupplöst skörd av diskreta cellpopulationer av LMD från kliniska vävnadsprover.
Rumsligt upplöst LMD-anrikning av ROI som fångar diskreta cellpopulationer representerar ett nästa generations vävnadsbehandlingssteg före multiomiska analyser för att förbättra molekylär karakterisering och identifiering och underlätta upptäckt av cellselektiva biomarkörer. Detta protokoll förbättrar befintliga metoder genom att minska den ofta långa exponeringen av vävnadssektioner för den omgivande miljön som är förknippad med manuell segmentering av ROI av en histolog (vilket kan ta >1-2 timmar före LMD-samlingen). Det här arbetsflödet gör att ROI i stället kan föridentifieras genom AI-guidad klassificering och segmentering. Att begränsa vävnadens uppehållstid kommer att minska falska variationer i bedömningarna av mycket labila molekylära mål, såsom fosfopeptider och mRNA, eller för antikroppsbaserade analystekniker som förlitar sig på att ett målprotein är i sin ursprungliga konformation för detektion.
Att klippa snygga kalibratorfiducialer på PEN-membranglaset som är tydligt synliga i den skannade bilden är en av nyckelkomponenterna som möjliggör integration av bildanalysprogramvaran (se materialtabellen) med LMD-arbetsflödet. Genom att säkerställa att kalibratorerna har en exakt ("ren") punkt längst ner på "V"-formen kan du välja en exakt punkt i bildanalysprogramvaran för de kalibratorlinjer som ska dras från, enligt beskrivningen i steg 5.1.6 och 5.2.13. Justering av dessa punkter under import till LMD-programvaran är avgörande för korrekt överlagring av anteckningarna (underlättas genom generering av en kompatibel .xml-fil med hjälp av algoritmerna "Malleator" och / eller "Dapọ") på relevant vävnadsavkastning på den fysiska LMD-bilden. Det är nödvändigt att markera alla former och kollektivt "dra och släppa" på plats även när inriktningen är exakt vid import till LMD-programvaran för att registrera den vertikala (z-plan) positionen för glidsteget på lasermikroskopet. Mindre justeringar av placeringen av anteckningarna över vävnadens ROI kan också göras under detta steg, om det behövs.
En begränsning med den nuvarande versionen av Malleator-algoritmen är att den inte är kompatibel med de fördefinierade anteckningsformverktygen som tillhandahålls av bildanalysprogramvaran (se materialtabellen), även om framtida uppdateringar/versioner av algoritmen kommer att syfta till att förbättra denna kompatibilitet. ANNOTERINGSFILEN för former som ritas med dessa verktyg innehåller bara två uppsättningar parade x- och y-koordinater för varje anteckning, utan fullständig rumslig orientering runt dessa punkter. Den aktuella användningen av dessa verktyg resulterar i att anteckningarna konverteras till raka linjer som definieras av endast två punkter under importprocessen. Manuell definition av ROI-segment för mjukpapper krävs för framgångsrik konvertering till XML-format och LMD-import. Detta kan antingen utföras genom att manuellt definiera varje ROI med individuella frihandspolygonala anteckningar som är specifika för målområdet eller genom att tillämpa en approximativ cirkulär eller rektangulär anteckning över alla vävnads-ROI-segment, om så önskas, och kommer att vara kompatibel med detta arbetsflöde.
Medan arbetsflödet som presenteras här demonstrerades för proteomisk analys av nyfrysta mänskliga cancervävnadsprover, kan detta AI-drivna LMD-arbetsflöde användas på motsvarande sätt med FFPE-vävnader, icke-cancerösa vävnadstyper och de från icke-mänskliga källor. Det kan också stödja andra nedströms molekylära profileringsarbetsflöden, inklusive transkriptomiska, genomiska eller fosfoproteomiska analyser. Detta arbetsflöde kan också utnyttja andra användningsområden för bildanalysprogramvaran (se materialförteckningen), inklusive med funktioner associerade med cellräkning eller andra analytiska moduler, inklusive modulen "Multiplex IHC" eller "Tissue Microarray (TMA) Add-on". Framtida tillämpningar av detta arbetsflöde kan också dra nytta av att fördefiniera antalet celler per ROI-segment, vilket säkerställer ekvivalenta cellulära ingångar över flera samlingar, eller genom att använda alternativa metoder för att definiera cellulära ROI av intresse, såsom genom immunohistokemi eller cellsociologi.
Disclosures
T.P.C. är medlem i ThermoFisher Scientific, Inc SAB och får forskningsmedel från AbbVie.
Acknowledgments
Finansiering för detta projekt tillhandahölls delvis av Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 och HU0001-16-2-00014) till Uniformed Services University för Gynecologic Cancer Center of Excellence. Sponsorerna hade ingen roll i utformningen, genomförandet, tolkningen eller skrivandet av studien. Friskrivning: De åsikter som uttrycks här är författarnas och återspeglar inte den officiella politiken för Department of Army / Navy / Air Force, Department of Defense eller US Government.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
| 96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
| 96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
| 96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
| 9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
| Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
| Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
| Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
| BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
| EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
| EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
| Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
| Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
| ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
| HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
| IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
| iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
| iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
| limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
| LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
| LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
| Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
| Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
| Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
| PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
| Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
| PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
| Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
| Python | Python Software Foundation | ||
| Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
| R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
| RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
| Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
| Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |
References
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971 (2015).
- Hunt, A. L., et al. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757 (2021).
- Dou, Y., et al. Proteogenomic characterization of endometrial carcinoma. Cell. 180 (4), 729-748 (2020).
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Gillette, M. A., et al. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).
- Echle, A., et al. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).
- Lee, S., et al. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502 (2020).
- Xuan, Y., et al. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248 (2020).
- Hughes, C. S., et al. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949 (2016).
- Espina, V., et al. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Havnar, C. A., et al. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394 (2021).
- Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).
