Дальнекрасный флуоресцентный датчик старения, связанный с β-галактозидазой для идентификации и обогащения стареющих опухолевых клеток с помощью проточной цитометрии

Summary

Представлен протокол флуоресцентной, проточной цитометрической количественной оценки стареющих раковых клеток, индуцированных химиотерапевтическими препаратами в клеточной культуре или в моделях опухолей мышей. Необязательные процедуры включают совместное иммуноиммунтирование, фиксацию образца для облегчения анализа больших партий или временных точек и обогащение жизнеспособных стареющих клеток путем проточной цитометрической сортировки.

Abstract

Клеточное старение - это состояние пролиферативной остановки, вызванное биологическим повреждением, которое обычно накапливается в течение многих лет в стареющих клетках, но также может быстро возникать в опухолевых клетках в ответ на повреждение, вызванное различными методами лечения рака. Старение опухолевых клеток, как правило, считается нежелательным, так как стареющие клетки становятся устойчивыми к смерти и блокируют ремиссию опухоли, усугубляя злокачественность опухоли и резистентность к лечению. Поэтому идентификация стареющих опухолевых клеток представляет постоянный интерес для сообщества исследователей рака. Существуют различные анализы старения, многие из которых основаны на активности хорошо известного маркера старения, бета-галактозидазы, связанной со старением (SA-β-Gal).

Как правило, sa-β-Gal проводится с использованием хромогенного субстрата (X-Gal) на фиксированных клетках, с медленным и субъективным перечислением «синих» стареющих клеток с помощью световой микроскопии. Улучшенные анализы с использованием проникающих в клетки флуоресцентных субстратов SA-β-Gal, включая C_12-FDG (зеленый) и DDAO-галактозид (DDAOG; дальний красный), позволили анализировать живые клетки и позволили использовать высокопроизводительные флуоресцентные аналитические платформы, включая проточные цитометры. C_12-FDG является хорошо документированным зондом для SA-β-Gal, но его зеленое флуоресцентное излучение перекрывается с внутренней клеточной автофлуоресценцией (AF), которая возникает во время старения из-за накопления агрегатов липофусцина. Используя дальний красный зонд SA-β-Gal DDAOG, зеленая клеточная автофлуоресценция может быть использована в качестве вторичного параметра для подтверждения старения, добавляя надежность анализу. Остальные флуоресцентные каналы могут быть использованы для окрашивания жизнеспособности клеток или необязательной флуоресцентной иммуномаркировки.

Используя проточную цитометрию, мы демонстрируем использование автофлуоресценции DDAOG и липофусцина в качестве двухпараметрического анализа для идентификации стареющих опухолевых клеток. Проводится количественное определение процента жизнеспособных стареющих клеток. При желании может быть включен необязательный этап иммуномаркировки для оценки интересующих антигенов клеточной поверхности. Идентифицированные стареющие клетки также могут быть цитометрически отсортированы и собраны для последующего анализа. Собранные стареющие клетки могут быть немедленно лизированы (например, для иммуноанализа или анализа омики) или дополнительно культивированы.

Introduction

Стареющие клетки обычно накапливаются в организмах в течение многих лет во время нормального биологического старения, но также могут быстро развиваться в опухолевых клетках в ответ на повреждение, вызванное различными методами лечения рака, включая лучевую и химиотерапию. Хотя опухолевые клетки больше не размножаются, вызванные терапией стареющие (ТИС) опухолевые клетки могут способствовать резистентности к лечению и вызывать рецидив ^1,2,3. Факторы, секретируемые клетками TIS, могут усугубить злокачественность опухоли, способствуя иммунному уклонению или метастазированию ^4,5. Клетки TIS развивают сложные, контекстно-зависимые фенотипы, измененные метаболические профили и уникальные иммунные реакции ^6,7,8. Поэтому идентификация и характеристика опухолевых клеток TIS, индуцированных различными подходами к лечению рака, является темой, представляющей постоянный интерес для сообщества исследователей рака.

Для обнаружения опухолевых клеток ТИС широко используются обычные анализы старения, в первую очередь основанные на обнаружении повышенной активности фермента маркера старения, лизосомальной бета-галактозидазы GLB1⁹. Обнаружение при почти нейтральном (а не кислом) лизосомальном рН позволяет специфическо обнаруживать бета-галактозидазу, связанную со старением (SA-β-Gal)¹⁰. Стандартный анализ SA-β-Gal, который использовался в течение нескольких десятилетий, использует X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид), синюю хромогенную субстрату бета-галактозидазы, для обнаружения SA-β-Gal в фиксированных клетках с помощью световой микроскопии¹¹. Анализ X-Gal позволяет качественно визуально подтвердить ТИС с использованием общедоступных реагентов и лабораторного оборудования. Базовый микроскоп пропускаемого света является единственным прибором, необходимым для оценки присутствия синего хромогена. Тем не менее, процедура окрашивания X-Gal может не иметь чувствительности, иногда требуется более 24 часов для развития цвета. Окрашивание сопровождается низкопроизводительным, субъективным подсчетом отдельных стареющих клеток на основе подсчета клеток, демонстрирующих некоторый уровень интенсивности синего хромогена под световым микроскопом. Поскольку X-Gal непроницаем, для этого анализа требуются ячейки, фиксированные растворителем, которые не могут быть восстановлены для последующего анализа. При работе с ограниченными образцами от животных или пациентов это может быть серьезным недостатком.

Улучшенные анализы SA-β-Gal с использованием клеточно-проникающих, флуоресцентных ферментных субстратов, включая C_12-FDG (5-додеканоиламинофлуоресцеин Ди-β-D-галактопиранозид, зеленый) и DDAOG (9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-один-7-ил) β-D-галактопиранозид, дальний красный) ранее появлялись в литературе 12,13,14,15. Структура химического зонда и оптические характеристики DDAOG показаны на дополнительном рисунке S1. Эти зонды, пронизывающие клетки, позволяют анализировать живые (а не фиксированные) клетки, а флуоресцентные, а не хромогенные зонды облегчают использование быстрых высокопроизводительных флуоресцентных аналитических платформ, включая инструменты скрининга с высоким содержанием и проточные цитометры. Сортировочные проточные цитометры позволяют восстанавливать обогащенные популяции живых стареющих клеток из клеточных культур или опухолей для последующего анализа (например, вестерн-блоттинг, ИФА или «омикс»). Флуоресцентный анализ также обеспечивает количественный сигнал, позволяющий более точно определить процент стареющих клеток в данном образце. Дополнительные флуоресцентные зонды, включая зонды жизнеспособности и флуорофорные антитела, могут быть легко добавлены для мультиплексированного анализа мишеней за пределами SA-β-Gal.

Подобно DDAOG, C_12-FDG является флуоресцентным зондом для SA-β-Gal, но его зеленое флуоресцентное излучение перекрывается с внутренней клеточной ФП, которая возникает во время старения из-за накопления агрегатов липофусцина в клетках¹⁶. Используя дальний красный зонд DDAOG, зеленая клеточная AF может быть использована в качестве вторичного параметра для подтверждения старения¹⁷. Это повышает надежность анализа за счет использования второго маркера в дополнение к SA-β-Gal, который часто может быть ненадежным в качестве одного маркера старения¹⁸. Поскольку обнаружение эндогенной ФП в стареющих клетках является подходом без меток, это быстрый и простой способ расширить специфичность нашего анализа на основе DDAOG.

В этом протоколе мы демонстрируем использование DDAOG и AF в качестве быстрого двухпараметрического анализа проточной цитометрии для идентификации жизнеспособных опухолевых клеток TIS из культур in vitro или выделенных из обработанных лекарственными средствами опухолей, установленных у мышей (рисунок 1). Протокол использует флуорофоры, совместимые с широким спектром стандартных коммерческих анализаторов и сортировщиков проточной цитометрии (таблица 1). Возможность количественного определения процента жизнеспособных стареющих клеток с помощью стандартного анализа проточной цитометрии. При желании может быть выполнен необязательный этап иммуномаркировки для оценки интересующих антигенов клеточной поверхности одновременно со старением. Идентифицированные стареющие клетки также могут быть обогащены с использованием стандартной методологии флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).

Рисунок 1: Экспериментальный рабочий процесс. Схема, обобщающая ключевые моменты анализа DDAOG. (A) Препарат, индуцирующий ТИС, добавляют к культивируемым клеткам млекопитающих или вводят мышам, несущим опухоль. Затем допускается время для начала ТИС: для клеток - 4 дня после лечения; для мышей , всего 22 дня, с тремя процедурами каждые 5 дней плюс 7 дней восстановления. Клетки собираются или опухоли диссоциируют на суспензию. (B) Образцы обрабатываются Baf для регулировки лизосомального рН для обнаружения SA-β-Gal в течение 30 минут; затем зонд DDAOG добавляется в течение 60 минут для обнаружения SA-β-Gal. Образцы промывают 2 раза в PBS, и ненадолго добавляется пятно жизнеспособности (15 мин). Необязательно образцы могут быть окрашены флуоресцентными антителами в открытых флуоресцентных каналах и/или зафиксированы для последующего анализа. (C) Образцы анализируются с использованием стандартного проточного цитометра. Жизнеспособные клетки визуализируются на точечных графиках, показывающих красный DDAOG (указывающий на SA-β-Gal) по сравнению с зеленой автофлуоресценцией (липофусцин). Затвор для определения процента клеток TIS устанавливается на основе необработанных контрольных образцов (не показан). Если используется сортировочный цитометр (FACS), клетки TIS могут быть собраны и помещены обратно в культуру для дальнейших анализов in vitro или лизированы и обработаны для анализов молекулярной биологии. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; TIS = старение, вызванное терапией; FL-Ab = флуорофор-конъюгированное антитело; Baf = Бафиломицин A1; SA-β-Gal = бета-галактозидаза, связанная со старением; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Флуорофор	Обнаруживает	Ex/Em (нм)	Цитометр лазерный (нм)	Детектор цитометра / полосовой фильтр (нм)
ДДАОГ	СА-β-Гал	645/6601 руб.	640	670 / 30
Автофокусиров	Липофусцин	< 600	488	525 / 50
CV450	Жизнеспособность	408/450	405	450 / 50
ЧП	Маркер антител/поверхности	565/578	561	582 / 15

Таблица 1: Оптические характеристики флуорофоров и цитометров. Спецификации цитометра, используемые в этом протоколе, перечислены для прибора с 4 лазерами и 15 детекторами излучения. DDAOG, обнаруженный при 645/660 нм, является формой зонда, расщепленного SA-β-Gal¹. Неочищенный DDAOG может проявлять флуоресценцию низкого уровня при 460/610 нм, но удаляется шагами промывки в протоколе. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; AF = автофлуоресценция; ПЭ = фикоэритрин; SA-β-Gal = бета-галактозидаза, связанная со старением.

Protocol

Все описанные работы с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Чикагском университете.

1. Подготовка и хранение стоковых растворов

ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки будут отсортированы потоком, все растворы должны быть приготовлены с использованием стерильных методов и отфильтрованы через фильтрующее устройство 0,22 мкм.

1. Готовят стандартный раствор DDAO-галактозида в дозе 5 мг/мл в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C в темноте до 1 года.
2. Готовят стоковый раствор бафиломицина А1 на 1 мМ в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C до 6 месяцев.
3. Приготовьте запасной раствор Calcein Violet 450 AM при 1 мМ в ДМСО. Аликвота при 50 мкл на пробирку (или желаемый объем). Хранить при температуре −20 °C в темноте до 1 года.
4. Для обработки культивируемых клеток in vitro готовят 10 мМ концентрированных растворов агента (агентов), вызывающего старение, в соответствующем растворителе и стерилизуют с использованием шприцевых фильтров 0,2 мкм. Хранить при температуре −20 °C или по указанию производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для доставки вызывающих старение химиотерапевтических агентов in vivo (мышам с установленными опухолями) агенты должны быть класса USP и разбавляться в физиологический раствор из концентрированного запаса непосредственно перед инъекцией.
5. Подготовьте полную питательную среду для используемой клеточной линии (линий).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, подготовьте среду для клеток B16-F10 или A549 с DMEM 1x + 10% FBS + 1x заменитель глутамина + 1x пенициллин/стрептомицин. Носители должны быть стерильными. Могут быть использованы и другие специфические для клеточных линий составы сред. Некоторые компоненты, такие как глутатион, могут, в некоторых случаях, мешать наступлению старения. Эмпирическое тестирование различных составов сред должно проводиться, если начало старения ниже, чем ожидалось, или не наблюдается с контрольными химиотерапевтическими агентами.
6. Подготовьте фильтры для окрашивания и стирки.
   1. Приготовьте 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS для использования в процедурах окрашивания. Растворить 2 г BSA в 200 мл PBS и перемешивать в течение 10 мин или до полного растворения при комнатной температуре.
   2. Приготовьте 0,5% BSA в 1x PBS в качестве промывочного буфера. Разбавить 100 мл 1% BSA, полученного на стадии 1.6.1, в 100 мл 1x PBS для 0,5% BSA.
   3. Храните буферы при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
7. Приготовьте 4% параформальдегида в 1x PBS. Используйте коммерчески доступные, герметичные ампулы параформальдегида (например, 16% v/v) для удобства и стабильности: 2,5 мл 16% PFA + 7,5 мл 1x PBS (= 10 мл 4% PFA). Отрегулируйте подготовленный объем в зависимости от общего объема, необходимого для эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подготовьтесь только к фиксации клеток; каждый раз готовьте свежим.
8. Подготовьте сортировочный буфер FACS: 1x PBS, 1 мМ EDTA, 25 мМ HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Стерильный фильтр через фильтрующее устройство 0,22 мкм и хранить при 4 °C до 1 месяца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости подготовьтесь только к сортировке FACS. Составы буферов для сортировки потоков могут различаться в зависимости от приборов FACS. Приведенная выше формулировка совместима с прибором, используемым в данном исследовании (см. Таблицу материалов). Ознакомьтесь с рекомендациями производителя.
9. Приготовьте раствор для диссоциации опухоли: 20 мкг/мл Liberase TL + 100 мкг/мл DNAse I в среде RPMI-1640 (без FBS или других добавок). Стоковые растворы полезно держать под рукой Liberase TL (приготовленный и хранящийся по указанию производителя) и DNAse I (100 мг/мл в двойной дистиллированной воде [ddH₂O], хранящийся при −20 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте по мере необходимости, если используете только опухоли; каждый раз готовьте свежим.

2. Индукция старения химиотерапевтическими препаратами в культивируемых раковых клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы клеточных манипуляций в этом разделе должны выполняться в шкафу биобезопасности с использованием стерильной практики. Этот раздел написан для адгезивных типов клеток. Суспензионные элементы могут использоваться с соответствующими модификациями, как указано выше.

1. Вырастите линию (линии) раковых клеток в соответствии со стандартным протоколом от поставщика или лаборатории, которая предоставила конкретную используемую клеточную линию (линии).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки с низким проходом (p < 10), как правило, предпочтительны, поскольку в необработанных образцах клеток будут более низкие уровни репликативного старения, т.е. более низкий фон.
2. За сутки до индукции старения лекарственными препаратами собирают клетки с трипсином-ЭДТА 0,25% (или по рекомендации). Нейтрализуют трипсин, добавляя равный объем полной питательной среды, и переносят клеточную суспензию в стерильную коническую трубку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не требуется для суспензионных ячеек.
3. Подсчитайте ячейки с помощью стандартного метода гемацитометра и запишите ячейки/мл. Пластинчатые ячейки на 1 × 10^3-10 × 10³ клетки/^см2 в стандартных 6-луночных пластиковых культуральных чашках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность покрытия зависит от скорости пролиферации клеток и должна определяться пользователем. Клетки должны находиться в росте логарифмической фазы примерно при 10%-20% конфюлюзии во время обработки (т.е. после инкубации через 18-24 ч после нанесения покрытия). Начальная плотность (ячейки/мл) суспензионных ячеек должна определяться пользователем. Пластины с шестью скважинами обычно дают достаточно стареющих клеток на скважину для одного стандартного образца анализа проточной цитометрии. При потоковой сортировке следует использовать гораздо большую площадь поверхности (например, несколько пластин P150), чтобы обеспечить восстановление достаточного количества стареющих клеток для последующих анализов (≥1 × 10⁶).
4. Инкубировать покрытые ячейки в течение ночи (18-24 ч) в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO₂ и поддоном влажности.
5. Обработайте покрытые клетки с помощью химиотерапевтических препаратов, вызывающих старение. Включают, по меньшей мере, один положительный контроль, например, этопозид (ETO) или блеомицин (BLM). Подготовьте дубликаты лунок для каждого препарата. Включите один комплект, обработанный только с транспортным средством в качестве контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кривая дозы для каждого экспериментального агента должна быть проверена пользователем для определения оптимальной концентрации для индукции старения в используемой клеточной линии (линиях).
6. Инкубируйте клетки в течение 4 дней в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO₂ и поддоном влажности, чтобы обеспечить начало старения. Ежедневно исследуйте ожидаемые изменения морфологии с помощью светового микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации от 3-5 дней может быть приемлемым в зависимости от скорости начала старения. Среда может быть изменена, и агент повторно применяется (или нет), по желанию, для содействия здоровым условиям роста при достижении приемлемого процента стареющих клеток.
7. После наступления старения собирают клетки, добавляя трипсин-ЭДТА 0,25% в течение 5 мин при 37 °C. Когда клетки диссоциируют на суспензию, нейтрализуют трипсин равным объемом полной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не нужен для клеток, растущих в суспензии. Если будет проведено окрашивание поверхностным маркером, избегайте использования трипсина-ЭДТА, так как он может временно разрушить поверхностные антигены на клетках. Вместо этого осторожно диссоциируйте монослой, используя стерильный пластиковый клеточный скребок (или альтернативный реагент диссоциации, предназначенный для сохранения поверхностных антигенов).
8. Подсчитайте клетки в каждом образце с помощью гемацитометра. Рассчитайте ячейки/мл для каждого образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трипан синий может быть добавлен для оценки процента мертвых клеток на этом этапе (т. Е. Из-за медикаментозного лечения), но гибель клеток также будет определяться с помощью флуоресцентного красителя жизнеспособности во время рабочего процесса окрашивания DDAOG.
9. Aliquot ≥0,5 × 10⁶ клеток на образец в микроцентрифужные пробирки объемом 1,7 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек на образец должно быть стандартизировано для всех образцов.
10. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1000 × г в микроцентрифуге при 4 °C. Удалите супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлажденная микроцентрифуга недоступна, может быть приемлемо выполнять центрифугирование при температуре окружающей среды для определенных типов устойчивых клеток.
11. Перейдите к окрашиванию DDAOG в разделе 4.

3. Индукция старения химиотерапевтическими препаратами в опухоли, установленные у мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: Если опухолевые клетки будут отсортированы FACS, обеспечьте стерильность на каждом этапе, работая в шкафу биобезопасности и работая со стерильными инструментами, процедурами и реагентами.

1. Создание моделей опухолей мышей путем введения раковых клеток подкожно, в соответствии со стандартными методами (например, Appelbe et ^al.19).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раковых клеток, подлежащих инъекции, место инъекции и соответствующий штамм мыши должны быть оптимизированы для каждого протокола. Здесь клетки B16-F10 вводили подкожно через 1 × 10⁶ клеток в 0,1 мл физиологического раствора (1 × 10⁷ клеток/мл).
   1. Убедитесь, что жизнеспособность клеток, использующих трипан синий, составляет >90%, прежде чем выполнять инъекции. Обезболивают мышей изофлураном.
   2. Обезболить 6-7-недельных самок мышей C57/BL6 смесью 3% изофлурана и воздуха и поддерживать в этих условиях в индукционной камере, помещенной в стерильный шкаф биобезопасности. Подтвердите анестезию, осторожно зажав ногу мыши. Нанесите стерильную ветеринарную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры. Во время процедуры поддерживайте температуру тела мыши с помощью нагревательной лампы.
   3. Работая внутри стерильного шкафа биобезопасности, извлеките мышь из индукционной камеры и поместите ее в контакт с носовым конусом, обеспечивающим подачу 3% изофлурана. Побрейте область бока в месте инъекции с помощью чистой электрической бритвы. Кратковременно перемешайте приготовленную клеточную суспензию, вручную перевернув трубку непосредственно перед инъекцией, и введите клеточную суспензию подкожно в бритую бок (бока) с помощью стерильного шприца объемом 0,5 мл, оснащенного стерильной иглой 27 г. Выньте мышь из капота и перенесите ее в клетку восстановления.
   4. В клетке восстановления непрерывно следите за жизненно важными показателями мышей, пока они не придут в достаточное сознание, чтобы поддерживать стернальную упругость, демонстрировать корректирующий рефлекс и безопасно передвигаться в клетке. Не оставляйте мышей без присмотра и не возвращайте животных, перенесших прививку опухолевых клеток, компании других животных до полного выздоровления. Ежедневно контролировать всех инокулированных мышей на предмет потери веса, снижения активности / подвижности и неврологических симптомов; усыпляют мышей, проявляющих тяжелые симптомы в любой категории. Мышам, проявляющим болевые симптомы после прививки, вводят бупренорфин (0,1-0,2 мг/кг) однократно подкожно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, проявляющие постоянную боль после бупренорфина, должны быть усыплены.
2. Начиная с 5-7 дней после посева раковых клеток, измеряйте рост опухоли суппортами каждые 2-3 дня. Начинают прозенесцентное лечение, когда опухоль достигла 50 мм³ ± 10^мм3 в объеме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе дозы доксорубицина гидрохлорида (DOX) класса USP или ПЭГилированного липосомального доксорубицина (PLD) при 10 мг/кг вводили в инъекции 0,9% хлорида натрия (USP). Препараты вводили внутрибрюшинно 3 раза, один раз в 5 дней, начиная с того момента, когда опухоли достигали 50^мм3 ± 10^мм3. Мыши выздоравливали в течение 7 дней после окончательного лечения, чтобы обеспечить начало ТИС в опухолях. Дозы и условия индукции старения для других методов лечения и / или моделей опухолей должны быть оптимизированы.
3. Через 7 дней после окончательного медикаментозного лечения принесите мышей в жертву при передозировке_CO2 и вывихе шейки матки или другими утвержденными методами в соответствии с рекомендациями по работе с лабораторными животными. Иссечь опухоли и собрать их в стерильные трубки или 6-луночные пластины, заполненные стерильной питательной средой RPMI (для сохранения жизнеспособности при обработке).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении гистологического исследования (например, X-Gal или иммуногистохимии) опухоли могут быть разделены здесь пополам, с одной половиной замороженной в O.C.T. встраивающей среде и криосекцией с использованием стандартных процедур для гистологии замороженных тканей. Оставшаяся половина опухоли должна давать обильный материал для диссоциации и окрашивания DDAOG.
4. Перенесите одну опухоль на пластиковую посуду P100, содержащую 5 мл среды RPMI. Измельчите опухоль на кусочки с помощью скальпеля.
5. Переведите 5 мл суспензии опухолевых кусочков, содержащих взвешенные клетки и мусор, в коническую трубку объемом 15 мл. Используйте более широкий наконечник серологического пипетка объемом 25 мл для переноса этой суспензии, если присутствует крупный мусор. Смойте блюдо дополнительным объемом стерильного RPMI для сбора материалов. Колпачок и поместите коническую трубку на лед.
6. Повторите шаги 3.45-3.5 для остальных опухолей. Используйте отдельную пластину и скальпель для каждой опухоли, чтобы избежать перекрестного загрязнения, или хорошо промойте PBS между опухолями. Используйте 5 мл свежей среды для измельчения каждой опухоли.
7. Готовят раствор для диссоциации опухоли: 20 мкг/мл Liberase TL + 100 мкг/мл DNAse I в среде RPMI-1640 (без FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество эффективных составов для диссоциации опухолей, которые могут включать в себя различные ферменты и другие компоненты от разных производителей. Оптимальные концентрации компонентов могут сильно варьироваться в зависимости от типа опухоли. Если эритроциты сильно присутствуют в опухоли, может быть дополнительно проведен лизис эритроцитов; если мертвые клетки являются проблемой, можно использовать комплект для удаления мертвых клеток. Пользователю настоятельно рекомендуется самостоятельно определять оптимальные условия диссоциации опухоли, обеспечивающие высокую жизнеспособность и низкое присутствие загрязняющих клеток, соединительного материала и мусора.
8. Центрифугировать все образцы опухолей в конических пробирках в течение 5 мин при 1000 × г (4 °C). Удалите супернатант.
9. Добавляют 1-5 мл раствора для диссоциации опухоли к каждому образцу опухоли, в зависимости от объема опухолевого материала. Убедитесь, что в пробирке имеется 1-2 мл сверх гранул опухолевого материала. Вихрь с умеренной скоростью смешивается.
10. Поместите образцы в инкубатор с температурой 37 °C с быстрым вращением в течение 45 мин. Вихрь ненадолго каждые 15 мин.
11. Фильтруйте каждый образец через клеточный сетчатый фильтр 100 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Если образцы слишком вязкие для прохождения через фильтр, добавьте 10 мл среды RPMI-1640 для разбавления. Промойте фильтры средой RPMI для сбора остаточных ячеек.
12. Используйте гемацитометр для подсчета клеток/мл для каждого образца.
13. Aliquot две или более реплицирует 5 × 10⁶ клеток на образец опухоли.
14. Центрифуга в течение 5 мин при 1000 × г (4 °C). Удалите супернатант.
15. (Необязательно) Криоконсервируйте образцы опухоли для последующего окрашивания DDAOG, если это необходимо.
    1. Повторное суспендирование диссоциированной гранулы опухолевых клеток в криоконсервационной среде: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, приготовленных в стерильных условиях при 5 × 10⁶ клеток/мл.
    2. Аликвот 1 мл клеточной суспензии в каждую криовиальку.
    3. Заморозить криовиалы в течение 24 ч в контейнере для замораживания изопропаноловых клеток при −80 °C; затем перевести на криохранилище жидкого азота для длительного хранения (>1 неделю).
    4. Когда окрашивание желательно, разморозьте криовиалы на льду и приступайте к окрашиванию DDAOG в разделе 4.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые опухоли могут оставаться нежизнеспособными посредством криоконсервации, и устойчивость к этому процессу должна быть оценена пользователем для интересующей опухолевой модели.
16. Перейдите к разделу 4 для окрашивания DDAOG.

4. DDAOG окрашивание SA-β-Gal в образцах клеток или опухолей

1. Разбавить 1 мМ запаса бафиломицина А1 при 1:1000x в среде DMEM (без FBS) для получения конечной концентрации 1 мкМ.
2. Добавляют приготовленный раствор Baf-DMEM к образцам клеточных гранул (со стадии 2.11 или стадии 3.16) для концентрации 1 × 10⁶ клеток/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при использовании 0,5 × 10⁶ ячеек на образец, добавьте 0,5 мл Baf-DMEM. Для опухолей 5 × 10⁶ клеток могут быть окрашены в 5 мл Baf-DMEM.
3. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C (без CO₂) на ротаторе/шейкере, установленном на медленной скорости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте инкубаторов CO₂ для процесса окрашивания, которые могут подкислять растворы и тем самым мешать окрашиванию Baf и DDAOG.
4. Не промывая, добавьте раствор DDAOG (5 мг/мл) в 1:500x (10 мкг/мл окончательный) к каждому образцу. Пипетку для смешивания. Замените на ротаторе/шейкере при 37 °C (без CO₂) в течение 60 мин. Защита от прямого света.
5. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1 000 х г при 4 °C. Удалите супернатант.
6. Промыть 1 мл ледяного 0,5% BSA на тюбик и пипетку для смешивания. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1000 х г при 4 °C и удалите супернатант. Повторите этот шаг 2x, чтобы тщательно промыть клетки. Удалите супернатант и продолжайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить шаги промывки на шаге 4.6 для удаления неочищенного DDAOG, который может проявлять нежелательное флуоресцентное излучение (460/610 нм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При иммуноокрашивании маркеров клеточной поверхности перейдите к разделу 5 ниже.
7. (Необязательно) Фиксация и хранение окрашенных DDAOG клеток для последующего анализа
   1. Добавьте 0,5 мл ледяного 4% параформальдегида по каплям к каждому промытому образцу. Пипетку для смешивания.
   2. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
   3. Промыть ячейки 2x с 1 мл PBS.
   4. Храните образцы до 1 недели при температуре 4 °C до анализа проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксированных образцов пропустите шаг 4.8.
8. Разбавьте запас Calcein Violet 450 AM (1 мМ) при 1:1000x в 1% BSA-PBS (1 мкМ конечный). Добавьте 300 мкл (для культивируемых образцов клеток) или 1000 мкл (для образцов опухолей) к промытым клеточным гранулам со стадии 4.6. Инкубировать в течение 15 мин на льду в темное время суток.
9. Перейдите к настройке проточной цитометрии (раздел 6).

5. (Необязательно) Иммуноокрашивание маркеров клеточной поверхности в сочетании с DDAOG

ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в любом эксперименте по проточной цитометрии, контрольные образцы с одним окрашиванием только с DDAOG и только флуоресцентными антителами должны быть подготовлены к определению перекрестных помех (если таковые имеются) через флуоресцентные каналы. При наблюдении перекрестных помех следует выполнить стандартную компенсацию проточной цитометрии²⁰.

1. Повторно суспендируют гранулы клеток, полученные на стадии 4,6 в 100 мкл окрашивающего буфера (1% BSA в 1x PBS).
2. Добавьте реагент, блокирующий рецептор Fc, подходящий для видов клеток (мыши или человека) при титровании, рекомендованном производителем. Инкубировать в течение 10 мин при 24 °C.
3. Добавляют флуорофор-конъюгированные антитела при титровании, рекомендованном производителем (или определенном пользователем). Инкубировать в течение 20 мин на льду, защищенном от света.
4. Центрифугируйте пробирки в течение 5 мин при 1000 × г при 4 °C. Удалите супернатант.
5. Промыть 1 мл ледяного буфера для промывки (0,5% BSA-PBS) на трубку и пипетку для смешивания. Центрифугируют пробирки в течение 5 мин при 1000 × г при 4 °C и удаляют супернатант. Повторите этот шаг 2x, чтобы тщательно промыть клетки.
6. Разбавить 1 мМ Calcein Violet 450 AM при 1:1000x в 1% BSA-PBS. Добавьте 300 мкл к гранулам промытой ячейки со стадии 5.5. Инкубировать в течение 15 мин на льду в темное время суток.
7. Приступают к анализу проточной цитометрии (разделы 6-7).

6. Настройка проточного цитометра и сбор данных

1. Перенесите образцы клеток в пробирки, совместимые с прибором проточной цитометрии. Поместите трубки на лед и держите их защищенными от света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в клеточных суспензиях наблюдаются агрегаты, пропустите суспензию через клеточные сетчатые фильтры 70-100 мкм перед анализом. Не используйте ситечки 40 мкм, потому что они могут исключить некоторые из более крупных стареющих клеток.
2. В указанном программном обеспечении (см. Таблицу материалов) откройте следующие графики: 1) точечный график FSC-A против SSC-A, 2) гистограмма фиолетового канала, 3) дальний красный канал (например, APC-A) против зеленого канала (например, FITC-A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Графики исключения дублетов и одноканальные гистограммы также могут использоваться, но не являются строго обязательными.
3. Инициировать сбор данных цитометра.
   1. Поместите контрольный образец только для транспортного средства, окрашенный DDAOG, на впускное отверстие. При низкой скорости всасывания начинают получать образцовые данные.
   2. Отрегулируйте напряжения FSC и SSC таким образом, чтобы >90% событий содержались на графике. Если ячейки плохо вписываются в график, уменьшите настройку масштабирования площади до 0,33-0,5 единицы.
   3. Извлеките образец, предназначенный только для транспортного средства, без записи данных.
   4. (Необязательно) Добавьте одну каплю радужных калибровочных микросфер в трубку цитометра с 1 мл PBS. Поместите трубку на входное отверстие цитометра. Начните собирать образцы данных.
   5. Отрегулируйте фиолетовое, зеленое и дальнекрасное напряжения канала так, чтобы верхний пик радужной микросферы находился в диапазоне 10^{4-10 5} единиц относительной флуоресценции в каждом канале и все пики были хорошо разделены в каждом канале. Рекорд 10 000 событий. Извлеките трубку.
4. Поместите положительный контрольный образец (например, BLM, ETO), окрашенный DDAOG, на впускное отверстие. На низкой скорости получайте образцы данных. Наблюдайте за событиями в FSC, SSC, фиолетовых, зеленых и дальних красных каналах, чтобы убедиться, что более 90% событий содержатся во всех участках. Обратите внимание на увеличение сигнала АВТОФО и DDAOG по сравнению с управлением только транспортным средством.
5. Если используется сортировочный цитометр, запустите сортировку на этом шаге.
   1. Для целей ведения учета запишите 10 000 ячеек для контрольного образца и каждого отсортированного образца.
   2. Отсортируйте желаемое количество клеток (≥1 × 10⁶ обычно подходит) в подходящую для инструмента сборную трубку с 3-5 мл питательной среды.
   3. После сортировки перейдите к нисходящему языку и региональным параметрам или анализу.
   4. Перейдите к разделу 7 для рутинного анализа отсортированных образцов.
6. При использовании флуоресцентных антител оптимизируйте напряжение канала здесь, используя неокрашенные, одноокрашенные и двойные окрашенные образцы, подготовленные в разделе 5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для калиброванного проточного цитометра, используемого в настоящем описании, оптимальные напряжения канала обычно падают между 250 и 600 (средний диапазон), но оптимальные напряжения и диапазоны напряжения канала будут варьироваться в зависимости от прибора. Избегайте использования напряжений в очень низких или высоких диапазонах, которые могут подавлять сигнал или усиливать шум.
7. После выполнения шагов 6.1-6.5 и внесения необходимых корректировок в настройки цитометра запишите данные для всех образцов. Убедитесь, что настройки остаются одинаковыми для всех записей сэмплов. Запись ≥10 000 событий на культивируемый образец клеток или ≥100 000 событий на образец опухолевой клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя анализ и анализ могут быть выполнены с использованием программного обеспечения для сбора данных (например, FACSDiva), полный рабочий процесс сбора и анализа, который будет проводиться после сбора с использованием отдельного аналитического программного обеспечения (FlowJo), описан в разделе 7 ниже. Анализ после сбора предпочтительнее, чтобы сократить время на рабочей станции цитометра и воспользоваться дополнительными инструментами, включенными в специализированное программное обеспечение для анализа.
8. Сохраните образцы данных в формате FCS. Экспортируйте файлы на компьютер рабочей станции, оснащенный программным обеспечением для анализа проточной цитометрии (например, FlowJo). Перейдите к разделу 7.

7. Анализ данных проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный рабочий процесс использует программное обеспечение FlowJo. Альтернативное программное обеспечение для анализа данных проточной цитометрии может быть использовано, если аналогичным образом соблюдаются ключевые шаги, описанные в этом разделе.

1. С помощью программного обеспечения FlowJo откройте файлы данных .fcs из шага 6.7.
2. Откройте окно макета.
3. Перетащите все примеры в окно макета.
4. Ворота жизнеспособных ячеек.
   1. Сначала дважды щелкните образец данных для элемента управления, предназначенного только для транспортного средства, чтобы открыть окно данных.
   2. Визуализируйте данные в виде гистограммы фиолетового канала. Идентифицируйте жизнеспособные клетки, окрашенные CV450, на основе их более яркой флуоресценции, чем мертвые клетки.
   3. Нарисуйте ворота с помощью инструмента гистограммы с одним затвором, чтобы включить только жизнеспособные ячейки. Назовите ворота жизнеспособными.
   4. Затем из окна макета образца перетащите жизнеспособный затвор на другие образцы ячеек, чтобы применить затвор равномерно.
   5. В окне макета визуализируйте все образцы в виде гистограмм фиолетового канала (жизнеспособности). Прежде чем продолжить, убедитесь, что жизнеспособная клеточная решетка подходит для всех образцов; если нет, внесите необходимые коррективы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание жизнеспособности может демонстрировать вариации между методами лечения или опухолями.
5. Ворота стареющих клеток.
   1. Дважды щелкните на закрытой жизнеспособной ячейке данных для элемента управления, предназначенного только для транспортного средства, чтобы открыть окно данных.
   2. Визуализируйте данные в виде точечной диаграммы для дальнего красного канала (DDAOG) и зеленого канала (AF).
   3. Нарисуйте затвор с помощью инструмента прямоугольного затвора, чтобы включить <5% ячеек, которые являются DDAOG⁺ и AF⁺ (верхний правый квадрант). Назовите стареющие ворота.
   4. Затем из окна макета образца перетащите стареющий затвор на жизнеспособные подмножества других образцов клеток, чтобы применить затвор равномерно.
   5. В окно макета перетащите все жизнеспособные подмножества ячеек, указанные в разделе 7.4. Визуализируйте все жизнеспособные образцы в виде точечных графиков с дальним красным цветом (например, APC-A) и зеленым каналом (например, FITC-A).
   6. Убедитесь, что стареющие ворота, нарисованные на шаге 7.5.3, видны на всех участках и что ворота для контроля только для транспортного средства демонстрируют ≤5%-10% стареющих ячеек.
6. После того, как процент стареющих клеток был определен с помощью описанных выше шагов, представьте полученные данные с помощью графиков FlowJo, обобщенных в таблице данных и / или статистически проанализированных с использованием стандартного программного обеспечения.

Representative Results

Было проведено несколько экспериментов для демонстрации сопоставимости DDAOG с X-Gal и C_12-FDG для обнаружения старения SA-β-Gal. Во-первых, X-Gal использовался для окрашивания стареющих клеток меланомы B16-F10, индуцированных ETO (рисунок 2A). Интенсивный синий цвет развился в подмножестве клеток, обработанных ETO, в то время как другие клетки демонстрировали менее интенсивное синее окрашивание. Морфология была увеличена в большинстве клеток, обработанных ETO. Окрашивание клеток, обработанных ETO, флуоресцентной подложкой SA-β-Gal C_12-FDG (зеленый) или DDAOG (дальний красный), продемонстрировало сопоставимые модели окрашивания и изменения интенсивности с X-Gal (рисунок 2B). Однако зеленое излучение C_12-FDG перекрывается с клеточной ФП (рисунок 2C), которая, как известно, накапливается в стареющих клетках¹⁷. Напротив, АВТОФО была незначительной в дальнем красном диапазоне излучения DDAOG.

Вместо того, чтобы использовать флуоресцентный микроскоп для оценки и подсчета стареющих клеток, было более целесообразно воспользоваться высокопроизводительными возможностями проточного цитометра для получения данных о тысячах клеток на образец за короткое время (<5 мин на образец). Во-первых, был реализован ряд стандартных параметров настройки проточной цитометрии для обеспечения оптимального сбора данных (рисунок 3). Следуя типичному подходу, параметры рассеяния света были установлены для визуализации объема (прямое рассеяние, FSC) и гранулярности (боковое рассеяние, SSC) ячеек (рисунок 3A). Здесь мы отметили тенденцию увеличения объема клеток, обработанных ETO, что согласуется с увеличенной морфологией, обычно наблюдаемой для стареющих клеток с помощью микроскопии. Для визуализации большего количества более крупных ячеек на графике необходимо было уменьшить настройки масштабирования площади по умолчанию (до 0,33-0,50 единиц в зависимости от типа ячейки и обработки). Для некоторых клеточных линий /методов лечения повышенная гранулярность (SSC) также была очевидна (данные не показаны). В целом, оценка рассеяния использовалась в качестве этапа контроля качества для проверки того, что данные рассеяния клеток выглядели так, как ожидалось, чрезмерный клеточный мусор отсутствовал, а клетки обрабатывались через цитометр с соответствующей скоростью потока (~ 100-1000 клеток / с). В качестве этапа контроля качества, используемого только для настройки прибора, здесь не проводилось никаких измерений или анализа.

Вторым (необязательным) этапом в установке проточной цитометрии был краткий анализ образца коммерчески доступных «радужных» калибровочных частиц для обеспечения того, чтобы флуоресцентные напряжения детектирования были установлены в допустимых диапазонах (рисунок 3B). Самый яркий пик был установлен между 1 × 10⁴ единицами и 1 × 10⁵ единицами относительной флуоресцентной интенсивности в каждом канале, с четко определенными пиками более низкой интенсивности, достаточным разделением между каждым пиком и отсутствием перекрытия соседних пиков. Контрольный образец из 10 000 микросфер был записан с использованием этих настроек напряжения. Затем микросферы использовались таким образом в каждом сеансе цитометрии для улучшения единообразия сбора данных в течение протокола.

Затем образцы клеток, обработанных только транспортным средством или ETO, были визуализированы в каждом флуоресцентном канале, и ворота были установлены. Ворота жизнеспособности клеток были установлены на основе сигнала cv450 пятна жизнеспособности в фиолетовом канале (рисунок 3C). Клетки, обработанные только транспортным средством, продемонстрировали 88% жизнеспособности, а клетки, обработанные ETO, показали 75% жизнеспособности (в конечном образце клеток; дополнительные мертвые клетки, вероятно, были первоначально удалены в выброшенной культуральной среде и механически распались в процессе окрашивания). Затем жизнеспособные закрытые ячейки были визуализированы в зеленых (рисунок 3D) и дальних красных (рисунок 3E) эмиссионных каналах. Затворы для зеленого AF^HI и темно-красного DDAOG^HI были установлены на <5% ячеек, предназначенных только для транспортных средств, и эти ворота затем были применены к ячейкам, обработанным ETO. Используя этот подход, было определено, что 46% клеток, обработанных ETO, были AF^HI и 33% были DDAOG^HI; эти значения были в ожидаемом диапазоне, основанном на литературе и результатах многочисленных экспериментов в нашей лаборатории. Как только настройка цитометра была завершена, все образцы клеток в эксперименте были запущены с использованием идентичных настроек сбора данных. Получены данные по 10 000 событий на выборку.

Репрезентативные данные анализа показаны на рисунке 4. В качестве моделей линии раковых клеток использовались клетки мышиной меланомы B16-F10 или клетки аденокарциномы легких A549 человека. Каждую клеточную линию обрабатывали химиотерапевтическим агентом, который, как известно, индуцирует старение (ETO или BLM) в течение 4 дней, чтобы вызвать старение или только в транспортном средстве. Кроме того, известный сенолитический агент ABT-263²¹ добавляли к индуцированным стареющим клеткам в течение 2 дней, чтобы продемонстрировать специфичность зонда DDAOG. В качестве дополнительного контроля были подготовлены только образцы АБТ-263. Здесь данные визуализируются в виде 2D-точечных графиков с DDAOG (излучение 670 нм) против AF (525 нм). Рабочий процесс из рисунка 3 был использован для настройки цитометра, а затвор TIS был установлен таким образом, что <5% ячеек только для транспортных средств, оцененных как TIS. Результаты с использованием клеток B16-F10 (рисунок 4A) показали, что ETO индуцировал TIS в 35% жизнеспособных клеток B16-F10 (аналогично сопоставимым данным, показанным на рисунке 2D, E), а сенолитический агент почти полностью устранял клетки TIS (<2%). В клетках A549 (рисунок 4B) BLM индуцировал TIS в 66% жизнеспособных клеток, а ABT-263 снижал процент до 15%. ABT-263 сам по себе не был токсичен для необработанных, пролиферирующих клеток.

Мы также стремились продемонстрировать, что совместное окрашивание флуоресцентных антител совместимо с анализом старения DDAOG для облегчения скрининга TIS-ассоциированных или новых поверхностных маркеров. Здесь клетки меланомы мышей B16-F10 снова лечили ТИС-индуцирующим ЭТО (или транспортным средством) в течение 4 дней. Затем клетки окрашивали DDAOG для оценки TIS и флуоресцентным антителом для обнаружения TIS-ассоциированного поверхностного маркера DPP4²² (рисунок 5). Был использован анти-DPP4, конъюгированный с R-фикоэритрином (PE), и мы подтвердили незначительное перекрытие ПЭ с DDAOG и AF на используемом проточном цитометре (дополнительный рисунок S2). Гистограмма данных канала ПЭ (рисунок 5А) для >5000 жизнеспособных клеток показала, что 42% клеток, обработанных ETO, были DPP4⁺ (с использованием образца только для транспортного средства для установки затвора позитивности). Визуализация 2D-точечных графиков для одних и тех же образцов (рисунок 5B, C) показала, что 44% клеток, обработанных ETO, были дважды положительными для DDAOG (т.е. стареющих) и DPP4 по сравнению с 4% клеток, предназначенных только для транспортных средств. Эти данные демонстрируют, что окрашивание живых клеток поверхностными маркерными антителами возможно в сочетании с анализом старения DDAOG.

Потенциальные проблемы с любым методом окрашивания живых клеток включают гибель клеток, происходящую во время длительных сеансов анализа (>1 ч), и как наиболее эффективно окрашивать и анализировать образцы во многих различных временных точках (с интервалом до нескольких дней). Фиксация окрашенных клеток на основе растворителя решает обе эти проблемы, поскольку образцы могут быть зафиксированы, как только они окрашиваются, а затем храниться в холодильнике до анализа в одной термостабильной партии. Таким образом, мы проверили, могут ли живые клетки, окрашенные DDAOG, быть зафиксированы 100% метанолом или 4% параформальдегидом (PFA) и храниться до 1 недели при 4 °C. Нежелательно, что фиксация метанола уменьшила сигнал DDAOG и значительно снизила AF (данные не показаны); следовательно, следует избегать использования метанола в качестве фиксирующего растворителя. Однако фиксация с помощью PFA была гораздо более успешной, как показано на рисунке 6 для клеток, зафиксированных в 4% PFA в течение 10 мин после окрашивания DDAOG. По сравнению с нефиксированными контрольными образцами (рисунок 6A; необработанные, 5% и BLM, 67% DDAOG^HI AF^HI), фиксированные образцы (рисунок 6B) демонстрировали несколько более высокий фон в необработанных клетках (9%), а также более высокий процент клеток, оцениваемых как стареющие в клетках, обработанных BLM (80%). Этот эффект также наблюдался в фиксированных образцах, хранящихся в течение ночи (рисунок 6C; необработанный, 12% и BLM, 72%) и хранимых в течение 1 недели при 4 °C (рисунок 6D; 14% и 70%). Несмотря на небольшое увеличение флуоресценции, вызванное фиксацией PFA, индукция старения BLM все еще была очевидна во всех фиксированных образцах по сравнению с соответствующим необработанным образцом. Кроме того, клетки оставались нетронутыми при хранении с незначительным ухудшением к 7-му дню, и не наблюдалось проблемной агрегации. Мы пришли к выводу, что удобство возможности фиксации и хранения образцов клеток для последующего пакетного анализа будет оправдывать терпимость к несколько более высокому фону, вызванному фиксацией PFA, особенно в экспериментах со многими образцами или временными точками.

Общей проблемой в исследованиях клеточного старения является гетерогенное начало старения в клеточных популяциях. Здесь мы показываем, что DDAOG может быть использован для FACS жизнеспособных стареющих клеток и что собранные клетки выживают в культуре для последующих анализов in vitro (рисунок 7). Для сортировки клеток по FACS клетки обрабатываются и окрашиваются, как описано, и сортируются проточным цитометром с поддержкой FACS с использованием стратегии DDAOG против AF, показанной здесь (рисунок 7A). Поскольку зонд жизнеспособности здесь не используется из-за долгосрочных проблем токсичности, мы рекомендуем проводить строгую разброс-тиранию до окончательного старения клеток (дополнительный рисунок S3) для устранения ложноположительного мусора из собранных клеток. Это стандартные процедуры захвата FACS, которые должны быть знакомы умеренно опытному пользователю и могут быть быстро установлены с помощью программного обеспечения на приборе (<10 мин).

После сортировки образца клеток A549, обработанных BLM, мы вернули клетки для культивирования в стандартных многолуночных чашках в течение 5 дней (n = 6 реплик) при 10 × 10³ клетки /^см2. Несортированные контрольные элементы были покрыты с одинаковой плотностью, выращены рядом, и были включены необработанные и обработанные BLM клетки. Клетки наблюдались ежедневно; для отсортированных клеток не наблюдалось значительной гибели клеток или возврата к пролиферации. Отсортированные клетки оставались разреженными (то есть не размножались) в течение 5 дней в культуре, в то время как необработанные и обработанные BLM клетки сливались, как показано на рисунке. На 5-й день клетки были зафиксированы в PFA и окрашены для морфологии и маркеров пролиферации (рисунок 7B). Характерная увеличенная морфология отсортированных клеток была выявлена флуоресцентным фаллоидиновым окрашиванием нитевидного актина с окрашиванием DAPI для демонстрации увеличенных ядер. Отсортированные ячейки были очень большими в диаметре (>10 мкм) с характерным округлым внешним видом. Как и ожидалось, окрашивание антитела Ki67 выявило полную потерю маркера пролиферации в отсортированном образце по сравнению с частичной потерей в несортированном образце, обработанном BLM, и нормальные уровни Ki67 были замечены во многих клетках в необработанном несортированном образце. По крайней мере, три изображения были сделаны на каждую скважину с использованием единообразных настроек визуализации по образцам. Показаны репрезентативные изображения (рисунок 7B).

Наконец, мы оценили, могут ли стареющие клетки, возникающие в опухолях, обнаруженных у мышей, получавших химиотерапевтические препараты, быть идентифицированы с помощью DDAOG. Опухоли меланомы B16-F10 индуцировались во фланке мышей C57/BL6, которые затем трижды (т.., каждые 5 дней) только физиологическим раствором (рисунок 8A), DOX (рисунок 8B) или PLD (рисунок 8C). После третьего лечения мыши выздоравливали в течение 7 дней, чтобы допустить начало старения, а затем были принесены в жертву, а опухоли иссечены. Опухоли были уменьшены вдвое, причем половина из них использовалась для подготовки замороженных тканевых слайдов для окрашивания X-Gal (рисунок 8), а половина диссоциировала на одноклеточные суспензии и окрашивалась DDAOG (рисунок 8 и дополнительный рисунок S4). Окрашивание X-Gal в тканях было довольно слабым, несмотря на длительную продолжительность окрашивания (72 ч), но синее окрашивание было очевидно в опухолях DOX и PLD при ближайшем рассмотрении, особенно в опухолях, которые также получили положительный результат на старение с помощью анализа потока DDAOG (рисунок 8B, C). По крайней мере, три изображения были сделаны на слайде ткани, и показаны репрезентативные изображения.

По сравнению с X-Gal, DDAOG был более чувствительным и точным способом количественной оценки старения опухолей (рисунок 8). Для анализа опухоли DDAOG опухоль, обработанная физиологическим раствором, с самым высоким фоном флуоресценции была использована для установки ворот старения на уровне <5%, так что другие опухоли, обработанные физиологическим раствором, не набрали более 5% старения. Затем эти ворота старения были периодически применены к закрытым жизнеспособным клеткам из всех опухолей. Оба химиотерапевтических агента индуцировали старение в некоторых опухолях (две из пяти опухолей для DOX, три из пяти для PLD), причем процент стареющих опухолевых клеток варьировался от 3% до 36% на опухоль. Графики данных цитометрии для всех 15 опухолей показаны на дополнительном рисунке S4, а сводка данных цитометрии опухолей показана на рисунке 8D (n = 5; (*) p < 0,05 по сравнению с контрольной группой, содержащей только физиологический раствор, с помощью F-теста дисперсии). Мы пришли к выводу, что DDAOG по сравнению с флоу-цитометрией ФП является приемлемым методом скрининга опухолей и химиотерапевтических агентов для индукции старения in vivo.

Рисунок 2: DDAOG является чувствительным и специфическим пятном для SA-β-Gal. (A) Обычное окрашивание для SA-β-Gal с использованием X-Gal, показывающее необработанные (слева) или обработанные ETO (справа) клетки мышиной меланомы B16-F10. Старение, вызванное ETO: клетки демонстрируют увеличенную морфологию и синее окрашивание из-за расщепления X-Gal повышенным SA-β-Gal. Шкала стержней = 10 мкм. (B) Флуоресцентное окрашивание для SA-β-Gal в клетках, обработанных ETO, с использованием либо C_12-FDG (эмиссия 515 нм, зеленый), либо DDAOG (660 нм, красный). Распределение окрашивания аналогично для обоих зондов, что указывает на то, что DDAOG обнаруживает SA-β-Gal аналогично C_12-FDG. (C) Оценка ФП в неокрашенных, обработанных ETO ячейках либо в зеленом (излучение 525 нм, слева), либо в дальневом красном (660 нм, справа) эмиссионном канале. AF от липофусцина высока в зеленом эмиссионном канале и незначительна в дальне-красном канале. Время экспозиции = 2 000 мс для каждого изображения. Шкала стержней = 10 мкм. Этот рисунок перепечатан из Flor and Kron²³. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; X-Gal = 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид; ЕНТ = без лечения; ETO = этопозид; AF = автофлуоресценция; C_12-FDG = 5-додеканоиламинофлуоресцеин ди-β-D-галактопиранозид; SA-β-Gal = бета-галактозидаза, связанная со старением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Настройка сбора данных проточного цитометра. (A) Репрезентативная диаграмма рассеяния распределения ячеек. FSC-A - это считывание объема ячейки, а SSC-A указывает на клеточную гранулярность. Левая панель, обработка ячеек A549 только для автомобиля. Правая панель, лечение ETO для индуцирования старения. Обратите внимание на тенденцию к увеличению клеточного объема клеток, обработанных ETO, в соответствии с увеличенной морфологией, очевидной из микроскопии. (B) Факультативное использование 5-пиковых коммерческих "радужных" флуоресцентных калибровочных микросфер для установки напряжения детектора цитометра. В каждом используемом флуоресцентном канале максимальный пик должен быть установлен ≤1 x 10⁵ относительных флуоресцентных единиц путем регулировки напряжения детектора цитометра во время работы образцов. Левая панель, BV421 (фиолетовый) канал; центр, FITC (зеленый) канал; справа, канал APC (красный). Пять флуоресцентных пиков должны демонстрировать отчетливое расстояние, как показано на рисунке. (С-Е) Репрезентативные одноканальные флуоресцентные данные для окрашивания (C) жизнеспособности с использованием фиолетового красителя CV450; (D) зеленая автофлуоресценция клеток; (E) дальний красный сигнал от DDAOG, обнаруживающий SA-β-Gal. Гистограмма более темного цвета, обработка только для транспортных средств; гистограмма более светлого цвета, лечение ЭТО. Родительские ворота указаны над каждым участком. Сокращения: FSC-A = прямая пиковая площадь рассеяния; SSC-A = площадь бокового рассеяния-пика; ETO = этопозид; BV421-A = Пиковая область канала Brilliant Violet 421; FITC-A = пиковая область флуоресцеина изотиоцианатного канала; APC-A = пиковая область аллофикоцианового канала; AF = автофлуоресценция; DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; VEH = транспортное средство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Репрезентативные данные для анализа старения проточной цитометрии. (A) Клетки мышиной меланомы B16-F10, обработанные только (верхним левым) транспортным средством, (верхний правый) ETO, (нижний левый) ABT-263 (1 мкМ) или (нижний правый) ETO плюс ABT-263. (B) A549 Клетки аденокарциномы легкого человека, обработанные только (верхним левым) транспортным средством, (верхний правый) BLM, (нижний левый) ABT-263 или (нижний правый) BLM плюс ABT-263. (А,Б) Прямоугольные ворота в правом верхнем квадрантах всех участков определяют стареющие ячейки (DDAOG^HI AF^HI). Процент стареющих клеток (от общего количества жизнеспособных клеток на образец) указан на каждом участке. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; ETO = этопозид; BLM = блеомицин; VEH = транспортное средство; TIS = старение, вызванное терапией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Совместное окрашивание примера маркера клеточной поверхности с анализом старения. (А) Иммунодетекция маркера старения DPP4 на поверхности жизнеспособных культивируемых клеток B16-F10; темно-оранжевый, только для автомобиля; светло-оранжевый, ЭТО. (В,С) Центральная и правая панели: ячейки, окрашенные совместно с DDAOG и анти-DPP4:PE. Ячейки DDAOG^HI DPP4^HI содержатся в прямоугольных затворах, показанных на графиках, и указан процент двойных положительных клеток на образец. Показано: жизнеспособные закрытые ячейки. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; ETO = этопозид; VEH = транспортное средство; DPP4 = дипептидилпептидаза 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Фиксация и хранение образцов клеток, окрашенных DDAOG, для последующего анализа. (A) Контрольные, нефиксированные образцы живых клеток A549 либо необработанные (слева), либо обработанные BLM (справа), чтобы вызвать старение, а затем окрашенные и немедленно проанализированные с использованием протокола DDAOG (без фиксации, день 0). (B) Образцы, приготовленные как в (А), а затем немедленно зафиксированные в 4% параформальдегиде и проанализированные (День 0). (C) Образцы, приготовленные в виде (А), немедленно зафиксированные в 4% параформальдегида и хранящиеся в течение ночи при температуре 4°С перед анализом. (D) Образцы, подготовленные в соответствии с пунктом (А), немедленно фиксируемые и хранящиеся в течение 7 дней до анализа. Прямоугольные ворота в правом верхнем квадрантах всех участков определяют стареющие клетки (DDAOG^HI AF^HI). Процент стареющих клеток указан на каждом участке. Сокращения: TIS = старение, вызванное терапией; DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; BLM = блеомицин; AF = автофлуоресценция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Проточная цитометрическая сортировка и валидация обогащенных популяций стареющих клеток. (A) Данные цитометрической сортировки потока, показывающие (слева) необработанный, окрашенный DDAOG контроль, используемый для установки затвора для сортировки стареющих клеток (<5% стареющих клеток в закрытой области) и (справа) обработанный BLM, окрашенный DDAOG образец, который был отсортирован с использованием сортировочного затвора, как показано на рисунке. (B) Флуоресцентные микроскопические изображения для (левая колонка) клеток, окрашенных фаллоидином-Alexa Fluor 647 (оранжевый псевдоцвет), для обнаружения F-актина и DAPI (синий) для контрокраширования ядер, демонстрирующих увеличенную морфологию стареющих клеток, или (правая колонка) клеток, окрашенных антителом Кролика Ki67 и анти-кроликом Alexa Fluor 594 для обнаружения потери пролиферации в стареющих клетках. Верхний ряд, необработанные и несортированные ячейки. Центральный ряд, обработанные BLM и несортированные клетки. Нижний ряд, обработанные BLM и отсортированные ячейки. Шкала стержней = 10 мкм. Сокращения: TIS = старение, вызванное терапией; DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; BLM = блеомицин; ЕНТ = без лечения; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Количественная оценка старения опухолей у мышей, получавших химиотерапевтические препараты. Опухоли меланомы B16-F10 были установлены на боках мышей C67BL/6, которых затем лечили тремя дозами (A) физиологического раствора, (B) DOX или (C) PLD каждые 5 дней плюс 1 неделю, чтобы обеспечить начало старения. Опухоли иссекались и уменьшались вдвое; замороженные тканевые слайды готовили из одной половины для окрашивания X-Gal (верхний ряд), а другая половина была диссоциирована для окрашивания DDAOG (нижний ряд). На изображениях, окрашенных X-Gal, синие клетки являются SA-β-Gal ^HI стареющими клетками, в то время как коричневые области обусловлены меланином в опухолях. Репрезентативные результаты показаны для DOX и PLD из двух опухолей в группе, которые показали старение. Все опухоли, содержащие только физиологический раствор, демонстрировали незначительное старение. (D) Количественная оценка старения в опухолях, обработанных лекарственными препаратами, у мышей. (*) p < 0,05 по F-тесту дисперсии, n = 5 мышей на группу. Погрешности, среднее ± SEM. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; DOX = доксорубицин; PLD = ПЭГилированный липосомальный доксорубицин; X-Gal = 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид; AF = автофлуоресценция. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Химическая структура зонда DDAOG. DDAOG представляет собой конъюгат 7-гидрокси-9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он) и бета-галактозида. При расщеплении бета-галактозидазой гидролизованный продукт расщепления демонстрирует сдвиг эмссии дальней красной флуоресценции на 50 нм, что позволяет его специфическое обнаружение при возбуждении выше 600 нм. Сокращения: DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Спектральное сканирование перекрестных помех DDAOG с другими флуоресцентными каналами проточного цитометра. Для выявления доступных каналов обнаружения флуоресцентных антител проводили спектральное сканирование на 4-лазерном 15-канальном проточном цитометре с использованием клеток A549, обработанных BLM и окрашенных DDAOG (красный) или неокрашенный (черный). Данные в каждом канале проточного цитометра были получены для 10 000 клеток. (A) Каналы излучения лазера 405 нм: слева направо, BV421, BV510, BV605, BV660 и BV711. Перекрестные помехи, наблюдаемые в каналах BV605, BV660 и BV711, делают их непригодными для совместного окрашивания с DDAOG без компенсации. BV421 и BV510 подходят для совместного окрашивания (обратите внимание, что BV421 обычно используется для окрашивания жизнеспособности). (B) Каналы излучения лазера 488 нм: FITC и PerCP-Cy5. Высокие перекрестные помехи наблюдались для канала PerCP-Cy5. FITC подходит для совместного окрашивания; однако обратите внимание, что канал FITC обычно используется в анализе DDAOG для оценки зеленой эмиссионной автофокусировки. (C) Каналы излучения лазера 561 нм: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 и PE-Cy7. Каналы PE и PE-Dazzle 594 подходят для обнаружения антител, меченных этими флуорофорами (ПЭ продемонстрировано для обнаружения DPP4 в этом исследовании). (D) Каналы излучения 640-нм лазера: APC, APC-H700 и APC-Cy7. Сигнал DDAOG стареющих клеток виден в канале APC (47,8% стареющих). Сигнал перекрывается в каналы APC-H700 и APC-Cy7, что делает их непригодными для совместного окрашивания без значительной спектральной компенсации. Сокращения: BLM = блеомицин; BV = Бриллиантовая фиалка; FITC = флуоресцеин изотиоцианат; PerCP = перидинин-хлорофилловый белок; ПЭ = фикоэритрин; DZ594 = Ослепление 594; APC = аллофиоцианин; AF = автофлуоресценция; DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Стратегия захвата клеток для сортировки FACS стареющих клеток. Прохождение суспензии ячеек через чувствительный цитометр FACS может потребовать дополнительной решетки для обеспечения чистоты сортировки и оптимальной функциональности прибора. Пример стратегии показан здесь. Другие стратегии возможны в зависимости от рекомендаций производителя для используемого цитометра FACS. Левая колонка, контроль клеток, обработанных только транспортным средством. Правый столбец, клетки A549, обработанные BLM, чтобы вызвать старение для сортировки. (A) FSC-A (объем ячейки) по сравнению с SSC-A (гранулярность клеток) интактных клеток. Неповрежденный затвор удаляет обломки клеток из отсортированного образца. (B) измерение чистоты FSC-A в сравнении с FSC-H; удаляет дублеты и мусор. (C) SSC-A по сравнению с SSC-H чистоты; удаляет дублеты и мусор. D) решетка для интересующей населения с использованием канала APC-A (возбуждение 637 нм, излучение 670 нм ± 30 нм, используемое для DDAOG) по сравнению с каналом FITC-A (возбуждение 488 нм, излучение 530 нм ± 30 нм, используемое для автофокусировки); удаляет возможные окрашивающие артефакты. (E) Старение клеток для окончательной сортировки. Сокращения: FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; BLM = блеомицин; FSC-A = прямая пиковая площадь рассеяния; SSC-A = площадь бокового рассеяния-пика; FSC-H = прямая пиковая высота рассеяния; SSC-H = высота бокового пика рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: DDAOG старение проточной цитометрии окрашивание опухолей. Данные проточной цитометрии для ≥50 000 жизнеспособных опухолевых клеток. Стареющие клеточные ворота, верхний правый квадрант каждого участка. Процент стареющих (жизнеспособных) опухолевых клеток показан в пределах ворот. Лечение опухолей включало (А) только физиологический раствор; B) ДОКС; и с) ПЛД. Мышей лечили три раза, один раз в 5 дней, с 7 днями для восстановления, чтобы обеспечить начало старения до жертвоприношения. Было проанализировано пять опухолей на каждое состояние. Сокращения: AF = автофлуоресценция; DDAO = 9H-(1,3-дихлор-9,9-диметилакридин-2-он); DDAOG = DDAO-галактозид; DOX = доксорубицин; PLD = ПЭГилированный липосомальный доксорубицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

За последнее десятилетие или около того, проточная цитометрия стала более распространенной платформой для анализа в исследованиях рака из-за растущей популярности иммунологии опухолей, разработки более дешевых проточных цитометров и улучшения общих инструментальных средств в академических учреждениях. Многоцветные анализы теперь являются стандартными, так как большинство новых инструментов оснащены фиолетовыми, сине-зелеными и красными и дальнекрасными оптическими массивами. Таким образом, этот протокол DDAOG, вероятно, будет совместим с широким спектром проточных цитометров. Конечно, любой проточный цитометр должен быть оценен пользователем. Особую осторожность следует соблюдать при добавлении дополнительных флуорофоров (например, флуоресцентных, конъюгированных антител) в анализ DDAOG. Оценка перекрестных помех флуорофора между каналами должна проводиться с использованием элементов управления с одним окрашиванием, визуализированных во всех других соответствующих каналах. Если наблюдается перекрытие, спектральная компенсация может быть выполнена²⁰ для коррекции по типичным методам.

Результаты, показанные в настоящем описании, в первую очередь предназначены для демонстрации того, что анализ проточной цитометрии DDAOG может давать быстрые, количественные, легко интерпретируемые результаты для ТИС, индуцированных химиотерапевтическими препаратами в клетках или опухолях. Используемые здесь агенты, в том числе ETO^23,24, DOX ^7,25 и BLM^26,27, были задокументированы для индуцирования TIS в различных линиях раковых клеток²⁴. Чтобы продемонстрировать специфичность зонда DDAOG, было продемонстрировано, что известный сенолитический агент ABT-263²¹ избирательно устраняет стареющие клетки в культуре. Эта статья демонстрирует использование одной мышиной (B16-F10) и одной человеческой (A549) культивируемой линии раковых клеток, а также опухолей B16-F10, установленных у мышей. Однако могут быть использованы любые клетки, которые экспрессируют β-Gal и сохраняют жизнеспособность с помощью стандартной пробоподготовки для проточной цитометрии. Некоторые типы клеток могут быть более хрупкими или менее склонными к ТИС, и это следует оценить, прежде чем приступать к большому экрану или исследованию. Если клетки распадаются при подготовке, жизнеспособность плохая, или TIS намного ниже, чем ожидалось, при использовании положительных агентов контроля, тип клеток не может быть идеальной моделью для исследований старения. Агенты и клеточные линии, показанные здесь, могут быть использованы другими группами в качестве контроля при дальнейшем скрининге потенциальных ТИС-индуцирующих агентов или новых сенолитиков, что остается активной целью в этой области.

Токсичность, вызванная химиотерапевтическими препаратами, может варьироваться в зависимости от типа клеток и влиять на результаты анализа. Если основным наблюдаемым эффектом используемого агента и/или концентрации является острая гибель клеток, общее старение может быть минимальным. In vivo следует избегать высокого некроза опухоли или системной токсичности у животных, снижая дозировку агента. Ключом к успеху анализа является тестирование диапазона концентраций агентов с тщательной проверкой данных анализа жизнеспособности (например, предоставленных CV450 в рамках анализа DDAOG). In vitro, если многие мертвые клетки отделяются от пластины во время лечения, включая культуральную среду в анализируемом образце, важно оценить гибель клеток в целом. CV450 не является единственным пятном жизнеспособности, совместимым с этим анализом; могут использоваться другие фиолетовые/синие флуорофоры, излучающие фиолетовую/синюю. Поправимые датчики жизнеспособности также могут быть использованы, если пользователь планирует зафиксировать окрашенные образцы с помощью PFA, при условии, что флуоресценция зонда существенно не перекрывается с DDAOG или AF (или пользователь проводит спектральную компенсацию для исправления перекрытия). В некоторых случаях, когда токсичность агента низкая, а клетки надежны, уничтожение неповрежденных клеток рассеянием света (FSC против SSC) может быть достаточным для выделения «жизнеспособных» клеток для анализа.

Ключевым шагом в этом протоколе in vitro является пластинчатость клеток в нижнем диапазоне плотности роста log (обычно 2 × 10^3-5 × 10³ клеток /^см2), чтобы обеспечить быструю начальную пролиферацию, что облегчает поглощение химиотерапевтического препарата большинством клеток. После лечения также важно выделить время для начала ТИС: in vitro, 4 дня ± 1 день в присутствии препарата; in vivo, 7 дней восстановления после заключительного химиотерапевтического лечения. После окрашивания DDAOG, как описано, количественный анализ цитометрических данных должен быть выполнен, как показано на рисунке, т. Е. Необязательные этапы включают использование флуоресцентных «радужных» калибровочных микросфер для стандартизации проточной цитометрии, фиксацию PFA окрашенных образцов, коиммунотраживание для поверхностных маркеров и сортировку потока для обогащения стареющих клеток для последующих анализов. Однако каждый из этих дополнительных шагов обеспечивает ключевые преимущества в определенных приложениях. Калибровочные микросферы стандартизируют настройку цитометрии в течение нескольких сеансов и позволяют пользователю первоначально устанавливать напряжения в полезном диапазоне для обнаружения старения и жизнеспособности с минимальными корректировками после этого. Фиксация образцов PFA стабилизирует клетки и позволяет проводить пакетный анализ больших наборов клеток в более позднее время. Коиммуноразделение поверхностных маркеров может быть использовано для скрининга новых белков, связанных со старением, и иммунных взаимодействий. В будущих исследованиях мы планируем проверить совместное окрашивание внутриклеточных маркеров старения с помощью DDAOG.

Сортировка TIS-клеток с помощью FACS позволяет обогащать жизнеспособные TIS-клетки из гетерогенных популяций, что может смешивать показания для последующих анализов, таких как вестерн-блоттинг, протеомика или транскриптомика. После сортировки не наблюдалось значительной токсичности DDAOG в клетках TIS, помещенных обратно в культуру на срок до 5 дней. Однако следует учитывать, что отсортированные клетки были обработаны Baf, интернализованным DDAOG (который расщепляется SA-β-Gal на DDAO, акридиновый краситель) и подвергались механическому воздействию, проходящему через инструмент FACS. Поэтому в отсортированных клетках могут присутствовать определенные биологические изменения, не связанные со старением. Однако в этом исследовании отсортированные клетки сохранили сильные черты старения и предоставили характерные результаты протеомики и транскриптомики²⁸ по сравнению с несортированными контрольными группами. Несмотря на несколько очевидную полезность использования FACS для сбора и анализа стареющих клеток от опухолей, эта процедура редко использовалась в литературе. Некоторые группы использовали люциферазу p16^Ink4a или флуоресцентные репортеры для идентификации стареющих клеток в тканях мышей, а флуоресцентные репортеры позволяли сортировать FACS в некоторых исследованиях ^29,30. Полученные данные в целом сходятся в том, что, независимо от индукционного агента или типа опухоли, ТИС в опухолях является частичным или редким явлением, редко достигая 100% опухолевых клеток³¹. FacS сортировка клеток с использованием метода DDAOG легко позволяет собирать редкие TIS-клетки из опухолей без необходимости экспрессии трансгенных конструкций.

В настоящее время большинство исследований старения на мышиных моделях проводится ex vivo с использованием комбинации X-Gal и иммуногистохимических маркеров^32,33. Тем не менее, оценка TIS ex vivo с использованием опухолевых тканей может быть длительным процессом, особенно при использовании X-Gal. Эта процедура требует криоконсервации опухоли, криосекции на слайдах, окрашивания X-Gal, крепления покровного стекла, сушки, визуализации и оценки «синих» клеток - как минимум многодневный подход. Иммуногистохимия не намного быстрее или проще, и различные участки ткани должны использоваться и оцениваться для каждого маркера плюс X-Gal в каждой опухоли, если только мультиплексированный анализ не оптимизирован, добавляя больше времени на переднем крае процесса. Срезы тканей отбирают только одно тонкое поперечное сечение опухоли, в то время как стареющие клетки (как и многие типы клеток) могут быть распределены неравномерно в 3D-пространстве по всем опухолям²⁹. В полевых условиях крайне необходимо перейти от медленных, устаревших методов гистологии к более быстрому и легко поддающемуся количественной оценке анализу старения опухолей. Используя проточную цитометрию DDAOG, набор из 15 опухолей может быть диссоциирован и окрашен для получения убедительных количественных данных о старении менее чем за 1 день практического времени после сбора опухоли. Одна половина опухоли была обработана для каждого образца, улучшая выборку 3D-пространства на опухоль. Этот подход к проточной цитометрии DDAOG значительно быстрее и надежнее, чем методы оценки ТИС в опухолях на основе тканевых слайдов.

Обладая многочисленными преимуществами по сравнению с X-Gal и другими методами, мы выступаем за то, чтобы протокол DDAOG стал новым золотым стандартом анализа старения. Он использует как общепринятый маркер старения, SA-β-Gal, так и обнаружение af, связанной с возрастом, без меток в качестве второго маркера. Эти флуорофоры совместимы с большинством стандартных проточных цитометров. Анализ включает в себя пятно жизнеспособности для исключения мертвых клеток и мусора с использованием образцов, легко полученных из обработанных лекарственными средствами культивируемых клеточных линий или опухолей. Образцы живых клеток могут быть опционально зафиксированы растворителем или криоконсервированы для облегчения пакетного анализа крупных исследований, например, с использованием временных точек для оценки начала TIS с течением времени с использованием нескольких агентов Процесс окрашивания занимает менее половины дня лабораторных работ для завершения, а сбор данных обычно составляет <5 минут на образец. Анализ данных также является быстрым и простым, давая количественные данные о проценте клеток TIS на образец без утомительной оценки и подсчета клеток. Образцы могут быть отсортированы FACS для восстановления обогащенных популяций клеток TIS, что снижает шум от клеточной гетерогенности в последующих анализах. Мы считаем, что анализ DDAOG может во многих случаях заменить X-Gal, облегчая скрининг TIS-индуцирующих агентов и сенолитиков in vitro и in vivo, что приводит к более быстрым и надежным открытиям в области исследований старения.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bafilomycin A1	Research Products International	B40500
Bleomycin sulfate	Cayman	13877
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye	ThermoFisher Scientific	65-0854-39	eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate	Biolegend	137803	Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma	American Type Culture Collection	CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma	American Type Culture Collection	CRL-6475
Cell scraper	Corning	3008
Cell strainers, 100 µm	Falcon	352360
DDAO-Galactoside	Life Technologies	D6488
DMEM medium 1x	Life Technologies	11960-069
DMSO	Sigma	D2438
DNAse I	Sigma	DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP)	Pfizer	NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP)	Sun Pharmaceutical	NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M	Life Technologies	15575-038
Etoposide	Cayman	12092
FBS	Omega	FB-11
Fc receptor blocking reagent	Biolegend	101320	Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer)	Becton Dickinson (BD)	Various	LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter)	Becton Dickinson (BD)	Various	FACSAria
GlutaMax 100x	Life Technologies	35050061
HEPES 1 M	Lonza	BW17737
Liberase TL	Sigma	5401020001	Roche
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin/Streptomycin 100x	Life Technologies	15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x	Corning	MT21031CV	Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit	SpheroTech	UCRP-38-2K	3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x	Life Technologies	11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP)	Baxter Healthcare Corporation	2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva"	Becton Dickinson (BD)	n/a	Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo"	TreeStar	n/a	Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25%	Life Technologies	25200-114