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Cancer Research

远红荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针,用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176

Summary

提出了一种荧光流式细胞术定量由细胞培养或小鼠肿瘤模型中化疗药物诱导的衰老癌细胞的方案。可选程序包括共免疫染色、便于大批量或时间点分析的样品固定,以及通过流式细胞术分选富集活衰老细胞。

Abstract

细胞衰老是由生物损伤引起的增殖性停滞状态,通常在衰老细胞中累积多年,但也可能在肿瘤细胞中迅速出现,作为对各种癌症治疗诱导的损伤的反应。肿瘤细胞衰老通常被认为是不可取的,因为衰老细胞对死亡产生抵抗力并阻止肿瘤缓解,同时加剧肿瘤恶性肿瘤和治疗耐药性。因此,衰老肿瘤细胞的鉴定是癌症研究界持续关注的问题。存在各种衰老测定,许多基于众所周知的衰老标志物,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)的活性。

通常,SA-β-Gal测定是在固定细胞上使用显色底物(X-Gal)进行的,通过光学显微镜缓慢而主观地计数“蓝色”衰老细胞。使用细胞渗透性荧光SA-β-Gal底物(包括C12-FDG(绿色)和DDAO-半乳糖苷(DDAOG;远红色))的改进检测能够分析活细胞,并允许使用高通量荧光分析平台,包括流式细胞仪。C12-FDG是SA-β-Gal的有据可查的探针,但其绿色荧光发射与衰老期间由于脂褐素聚集体的积累而产生的固有细胞自发荧光(AF)重叠。通过使用远红SA-β-Gal探针DDAOG,绿色细胞自发荧光可用作确认衰老的次要参数,从而增加测定的可靠性。其余荧光通道可用于细胞活力染色或可选的荧光免疫标记。

使用流式细胞术,我们证明了使用DDAOG和脂褐素自发荧光作为双参数测定来鉴定衰老肿瘤细胞。进行活衰老细胞百分比的定量。如果需要,可以包括可选的免疫标记步骤来评估感兴趣的细胞表面抗原。鉴定出的衰老细胞也可以进行流式细胞术分选和收集以进行下游分析。收集的衰老细胞可以立即裂解(例如,用于免疫测定或“组学分析”)或进一步培养。

Introduction

衰老细胞通常在正常的生物衰老过程中在生物体内积累多年,但也可能在肿瘤细胞中迅速发展,作为对各种癌症治疗(包括放疗和化疗)引起的损伤的反应。虽然不再增殖,但治疗诱导的衰老(TIS)肿瘤细胞可能有助于治疗耐药性并导致复发123。TIS细胞分泌的因子可以通过促进免疫逃避或转移来加剧肿瘤恶性肿瘤45。TIS细胞产生复杂的,上下文特异性表型,改变的代谢谱和独特的免疫反应678因此,各种癌症治疗方法诱导的TIS肿瘤细胞的鉴定和表征是癌症研究界持续关注的课题。

为了检测TIS肿瘤细胞,常规衰老测定被广泛使用,主要基于检测衰老标志酶溶酶体β-半乳糖苷酶GLB19的活性增加。在接近中性(而不是酸性)溶酶体 pH 下检测可以特异性检测衰老相关的 β-半乳糖苷酶 (SA-β-Gal)10。已经使用了几十年的标准SA-β-Gal测定使用X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷),一种蓝色显色β-半乳糖苷底物,通过光学显微镜检测固定细胞中的SA-β-Gal11。X-Gal 测定允许使用常用试剂和实验室设备对 TIS 进行定性视觉确认。基本的透射光显微镜是评估蓝色显色原存在所需的唯一仪器。然而,X-Gal 染色程序可能缺乏敏感性,有时需要超过 24 小时才能显色。染色之后,根据在光学显微镜下对表现出一定强度的蓝色色原的细胞进行计数,对单个衰老细胞进行低通量主观评分。由于X-Gal是不可渗透的,因此该测定需要溶剂固定的细胞,这些细胞无法回收用于下游分析。当处理来自动物或患者的有限样本时,这可能是一个主要缺点。

使用细胞通透性荧光酶底物改进的 SA-β-Gal 测定,包括 C 12-FDG(5-十二烷基氨基荧光素 Di-β-D-吡喃半乳糖苷,绿色)和 DDAOG(9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷,远红色)先前已出现在文献12,13,1415。DDAOG的化学探针结构和光学特性见补充图S1。这些细胞通透性探针允许分析活细胞(而不是固定细胞),荧光探针而不是显色探针有助于使用快速高通量荧光分析平台,包括高内涵筛选仪器和流式细胞仪。分选流式细胞仪能够从细胞培养物或肿瘤中回收富集的活衰老细胞群,以进行下游分析(例如,蛋白质印迹、ELISA或“组学”。荧光分析还提供定量信号,可以更准确地确定给定样品中衰老细胞的百分比。可以轻松添加其他荧光探针,包括活性探针和荧光团标记的抗体,用于SA-β-Gal以外的靶标的多重分析。

与DDAOG类似,C12-FDG是SA-β-Gal的荧光探针,但其绿色荧光发射与内在细胞AF重叠,后者在衰老期间由于细胞16中脂褐素聚集体的积累而产生。通过使用远红DDAOG探针,绿色细胞AF可以用作确认衰老的辅助参数17。这通过在SA-β-Gal之外使用第二个标记物来提高测定可靠性,而SA--Gal作为衰老的单一标记物通常不可靠18。由于检测衰老细胞中的内源性AF是一种无标记的方法,因此它是扩展我们基于DDAOG的测定特异性的快速简便方法。

在该协议中,我们证明了使用DDAOG和AF作为快速,双参数流式细胞术测定,用于鉴定来自 体外 培养物或从小鼠中建立的药物治疗肿瘤中分离的活TIS肿瘤细胞(图1)。该方案使用与各种标准商业流式细胞仪和分选仪兼容的荧光团(表1)。使用标准流式细胞术分析可以定量活衰老细胞的百分比。如果需要,可以执行可选的免疫标记步骤以评估与衰老同时感兴趣的细胞表面抗原。鉴定的衰老细胞也可以使用标准的荧光激活细胞分选(FACS)方法进行富集。

Figure 1
图 1:实验性工作流程。 总结DDAOG测定关键点的示意图。(A)将TIS诱导药物添加到哺乳动物培养的细胞中或施用于荷瘤小鼠。然后允许时间用于TIS的发作:对于细胞,治疗后4天;对于小鼠,总共22天,每5天进行三次治疗,外加7天恢复。收获细胞或将肿瘤解离成悬浮液。(B)用Baf处理样品以调节溶酶体pH以检测SA-β-Gal30分钟;然后,加入DDAOG探针60分钟以检测SA-β-Gal。将样品在PBS中洗涤2次,并短暂添加活性染色剂(15分钟)。或者,样品可以在开放的荧光通道中用荧光抗体染色和/或固定以供以后分析。(C)使用标准流式细胞仪分析样品。活细胞在点图中可视化,显示红色DDAOG(指示SA-β-Gal)与绿色自发荧光(脂褐素)。基于未处理的对照样品(未显示)建立确定TIS细胞百分比的门。如果使用分选细胞仪(FACS),则可以收集TIS细胞并将其放回培养物中以进行进一步的 体外 测定,或者裂解并处理以进行分子生物学测定。缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;TIS=治疗诱导的衰老;FL-Ab = 荧光团偶联抗体;Baf = 巴非霉素 A1;SA-β-Gal = 衰老相关的 β-半乳糖苷酶;PBS = 磷酸盐缓冲盐水;FACS = 荧光激活细胞分选。 请点击此处查看此图的大图。

荧光基团 检测 防爆/电磁(纳米) 激光细胞仪(纳米) 细胞仪检测器/带通滤光片(纳米)
东道格 SA-β-加尔 645/6601 640 670 / 30
自动对焦 脂褐素 < 600 488 525 / 50
CV450 可行性 408/450 405 450 / 50
体育 抗体/表面标志物 565/578 561 582 / 15

表 1:荧光团和细胞仪光学规格。 本协议中使用的细胞仪规格列出了总共具有 4 个激光器和 15 个发射检测器的仪器。在 645/660 nm 处检测到的 DDAOG 是被 SA-β-Gal1 切割的探针的形式。未裂解的DDAOG可以在460/610nm处表现出低水平的荧光,但通过方案中的洗涤步骤去除。缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;AF = 自发荧光;PE = 藻红蛋白;SA-β-Gal = 衰老相关的 β-半乳糖苷酶。

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Protocol

所描述的所有动物工作都得到了芝加哥大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 储备溶液的制备和储存

注意:如果要对细胞进行流动分选,则应使用无菌技术制备所有溶液,并通过0.22μm过滤装置过滤。

  1. 在DMSO中制备5 mg / mL的DDAO-半乳糖苷储备溶液。每管 50 μL(或所需体积)等分。在黑暗中在-20°C下储存长达1年。
  2. 在DMSO中以1mM制备巴非洛霉素A1的储备溶液。每管 50 μL(或所需体积)等分。在-20°C下储存长达6个月。
  3. 在DMSO中以1mM制备钙黄绿素紫450 AM的储备溶液。每管 50 μL(或所需体积)等分。在黑暗中在-20°C下储存长达1年。
  4. 为了在 体外处理培养的细胞,在适当的溶剂中制备10mM浓缩的衰老诱导剂储备溶液,并使用0.2μm注射器过滤器灭菌。储存在-20°C或按照制造商的指示。
    注意:为了 在体内 递送衰老诱导化疗药物(对于具有已确定肿瘤的小鼠),这些药物应为USP级,并在注射前从浓缩原液中稀释成盐水。
  5. 为所使用的细胞系准备完整的培养基。
    注意:例如,使用 DMEM 1x + 10% FBS + 1x 谷氨酰胺替代品 + 1x 青霉素/链霉素为 B16-F10 或 A549 细胞准备培养基。培养基必须保持无菌。可以使用其他细胞系特异性培养基配方。在某些情况下,某些成分(如谷胱甘肽)可能会干扰衰老的开始。如果衰老的开始时间低于预期或对照化疗药物未观察到,则应对各种培养基制剂进行实证性检测。
  6. 准备染色和洗涤缓冲液。
    1. 在 1x PBS 中制备 1% 牛血清白蛋白 (BSA),用于染色程序。将 2 g BSA 溶解到 200 mL PBS 中,并在室温下搅拌 10 分钟或直至完全溶解。
    2. 在 1x PBS 中制备 0.5% BSA 作为洗涤缓冲液。将步骤1.6.1中制备的1%BSA的100mL稀释到100mL的1x PBS中,用于0.5%BSA。
    3. 将缓冲液在4°C下储存长达1个月。
  7. 在1x PBS中制备4%的多聚甲醛。为方便起见,使用市售的密封多聚甲醛安瓿(例如 16% v/v):2.5 mL 16% PFA + 7.5 mL 1x PBS(= 10 mL 4% PFA)。根据每次实验所需的总体积调整制备的体积。
    注意:仅根据需要准备细胞固定;每次都准备新鲜的。
  8. 制备 FACS 分选缓冲液:1x PBS、1 mM EDTA、25 mM HEPES、1% BSA (pH 7.2)。通过0.22μm过滤装置无菌过滤,并在4°C下储存长达1个月。
    注意:仅根据需要准备 FACS 分类。流动分选缓冲液配方可能因 FACS 仪器而异。上述配方与本研究中使用的仪器兼容(见 材料表)。请参阅制造商指南。
  9. 制备肿瘤解离溶液:RPMI-1640培养基中的20μg/ mL自由酶TL + 100μg/ mL DNAse I(不含FBS或其他补充剂)。储备溶液可用于保留Libase TL(按照制造商的指示制备和储存)和DNAse I(100 mg / mL在双蒸水中[ddH2O],储存在-20°C)。
    注意:如果仅使用肿瘤,请根据需要准备;每次都准备新鲜的。

2. 化疗药物诱导培养的癌细胞衰老

注意:本节中的所有细胞操作步骤都应使用无菌实践在生物安全柜中进行。本节是为贴壁细胞类型编写的。悬浮细胞可以按照适当的修改使用,如前所述。

  1. 根据提供所用特定细胞系的供应商或实验室的标准方案培养癌细胞系。
    注意:低传代细胞(p < 10)通常是首选,因为在未经处理的细胞样品中会有较低水平的复制性衰老,即较低的背景。
  2. 在药物诱导衰老前一天,用0.25%胰蛋白酶-EDTA(或按照推荐)收获细胞。通过加入等体积的完全培养基来中和胰蛋白酶,并将细胞悬液转移到无菌锥形管中。
    注意:悬浮细胞不需要此步骤。
  3. 使用标准血细胞计数器方法计数细胞并记录细胞/mL。在标准 1 孔塑料培养皿中以 1 × 10 3-10 × 103 细胞/cm2 平板细胞
    注意:最佳铺板密度取决于细胞的增殖速率,应由用户确定。细胞在处理时(即,在铺板后孵育18-24小时后)应处于约10%-20%汇合的对数期生长。悬浮细胞的起始密度(细胞/mL)应由用户确定。六孔板通常每孔产生足够的衰老细胞,用于一个标准流式细胞术分析样品。如果是流动分选,应使用更大的表面积(例如,多个P150板)来回收足够数量的衰老细胞以进行下游测定(≥1×106)。
  4. 将铺板细胞在具有5%CO2 和湿度盘的37°C培养箱中孵育过夜(18-24小时)。
  5. 用衰老诱导的化疗药物治疗铺板细胞。包括至少一种阳性对照,例如依托泊苷 (ETO) 或博来霉素 (BLM)。每种药物准备重复孔。包括一组仅用车辆作为对照处理的集合。
    注意:用户应测试每种实验剂的剂量曲线,以确定所用细胞系中衰老诱导的最佳浓度。
  6. 将细胞在具有5%CO2 和湿度盘的37°C培养箱中孵育4天,以允许衰老开始。每天使用光学显微镜检查预期的形态变化。
    注意:根据衰老开始的速度,3-5天的潜伏时间可能是可以接受的。可以根据需要更换培养基并重新应用(或不重新应用)药剂,以促进健康的生长条件,同时达到可接受的衰老细胞百分比。
  7. 衰老开始后,通过在37°C下添加胰蛋白酶 - EDTA 0.25%5分钟来收获细胞。 当细胞解离成悬浮液时,用等体积的完全培养基中和胰蛋白酶。
    注意:悬浮生长的细胞不需要此步骤。如果要进行表面标志物染色,请避免使用胰蛋白酶-EDTA,因为它会暂时破坏细胞上的表面抗原。相反,使用无菌塑料细胞刮刀(或设计用于保存表面抗原的替代解离试剂)轻轻解离单层。
  8. 使用血细胞计数器计数每个样品中的细胞。计算每个样品的细胞/mL。
    注意:此时可以添加台盼蓝来评估死细胞的百分比(即,由于药物治疗),但在DDAOG染色工作流程中,细胞死亡也将使用荧光活性染料确定。
  9. 将每个样品≥ 0.5 × 10个 6 个细胞分装到 1.7 mL 微量离心管中。
    注意:每个样品的细胞数量应在所有样品中标准化。
  10. 在4°C的微量离心机中以1,000× g 离心管5分钟。 除去上清液。
    注意:如果没有冷藏微量离心机,则可以在环境温度下对某些弹性细胞类型进行离心。
  11. 在第 4 节中进行 DDAOG 染色。

3.化疗药物诱导小鼠肿瘤衰老

注意:如果肿瘤细胞将被FACS分选,请在生物安全柜中工作并使用无菌仪器,程序和试剂来确保每一步的无菌性。

  1. 根据标准方法(例如,Appelbe等人19),通过皮下注射癌细胞来创建小鼠肿瘤模型。
    注意:应针对每个方案优化要注射的癌细胞数量,注射部位和适当的小鼠品系。在这里,B16-F10细胞以1×106 个细胞在0.1mL盐水(1×107 个细胞/mL)中皮下注射。
    1. 在进行进样之前,验证使用台盼蓝的细胞活力是否为>90%。用异氟醚麻醉小鼠。
    2. 用3%异氟醚和空气的混合物麻醉6-7周龄的雌性C57 / BL6小鼠,并在这些条件下保持在放置在无菌生物安全柜内的诱导室中。通过轻轻捏住鼠标的脚来确认麻醉。在双眼上涂抹无菌兽药膏,以防止手术过程中角膜干燥。在此过程中,使用加热灯保持小鼠体温。
    3. 在无菌生物安全柜内工作,将小鼠从诱导室中取出,并将其与提供3%异氟醚供应的鼻锥接触。使用干净的电动剃须刀在注射部位剃除侧翼区域。通过在注射前手动倒置试管来短暂混合制备的细胞悬液,并使用装有无菌 27 G 针头的无菌 0.5 mL 注射器将细胞悬液皮下注射到剃光的侧腹中。从引擎盖中取出鼠标并将其转移到恢复架中。
    4. 在恢复笼中,连续监测小鼠的生命体征,直到它们恢复足够的意识以维持胸骨卧位,表现出矫正反射,并能够在笼子中安全地四处走动。不要让小鼠无人看管或将经过肿瘤细胞接种的动物送回其他动物的陪伴下,直到完全康复。每天监测所有接种的小鼠体重减轻、活动/活动减少和神经系统症状;对任何类别表现出严重症状的小鼠实施安乐死。对于接种后出现疼痛症状的小鼠,皮下注射一次丁丙诺啡(0.1-0.2mg / kg)。
      注意:丁丙诺啡后表现出持续疼痛的小鼠应实施安乐死。
  2. 从癌细胞接种后5-7天开始,每2-3天用卡尺测量肿瘤生长。当肿瘤体积达到50mm 3±10mm3时开始早期治疗。
    注意:在这项工作中,在0.9%氯化钠注射液(USP)中施用10mg / kg的USP级多柔比星(DOX)或聚乙二醇化脂质体阿霉素(PLD)的剂量。从肿瘤达到50mm 3±10mm 3开始腹膜内注射药物3次,每5天一次。小鼠在最终治疗后恢复7天,以允许TIS在肿瘤中发作。应优化衰老诱导剂量和其他治疗和/或肿瘤模型的条件。
  3. 在最后一次药物治疗后7天,通过CO2 过量和颈椎脱位或其他符合实验动物工作指南的批准方法处死小鼠。切除肿瘤并将其收集在装有无菌RPMI生长培养基的无菌管或6孔板中(以在处理过程中保持活力)。
    注意:如果进行组织学检查(例如,X-Gal或免疫组织化学),则可以在此处将肿瘤一分为二,其中一半在O.C.T.包埋培养基中快速冷冻并使用冷冻组织学的标准程序进行冷冻切片。剩余的肿瘤一半应产生丰富的解离和DDAOG染色材料。
  4. 将一个肿瘤转移到含有 5 mL RPMI 培养基的 P100 塑料培养皿中。用手术刀将肿瘤切成碎片。
  5. 将含有悬浮细胞和碎片的肿瘤碎片的5 mL悬浮液转移到15 mL锥形管中。如果存在大碎片,请使用 25 mL 血清移液管的较宽尖端转移该悬浮液。用额外体积的无菌RPMI冲洗培养皿以收集材料。盖上盖子并将锥形管放在冰上。
  6. 对剩余的肿瘤重复步骤3.45-3.5。对每个肿瘤使用单独的板和手术刀以避免交叉污染,或在肿瘤之间用PBS冲洗干净。使用5 mL新鲜培养基切碎每个肿瘤。
  7. 制备肿瘤解离溶液:RPMI-1640培养基(不含FBS)中的20μg/ mL自由酶TL + 100μg/ mL DNAse I。
    注意:存在许多用于肿瘤解离溶液的有效配方,并且可以包括来自不同制造商的各种酶和其他成分。不同肿瘤类型的最佳成分浓度差异很大。如果红细胞在肿瘤中高度存在,则可以额外进行红细胞溶解;如果死细胞是一个问题,可以使用死细胞去除试剂盒。强烈建议用户独立确定最佳的肿瘤解离条件,以提供高活力和低污染细胞、结缔材料和碎片的存在。
  8. 将所有肿瘤样品在锥形管中以1,000× g (4°C)离心5分钟。除去上清液。
  9. 根据肿瘤材料的体积,向每个肿瘤样品中加入1-5mL肿瘤解离溶液。确保管中有超过 1-2 mL 的肿瘤材料沉淀。以中等速度涡旋混合。
  10. 将样品置于快速旋转的37°C培养箱中45分钟。每15分钟短暂涡旋一次。
  11. 通过 100 μm 细胞过滤器将每个样品过滤到 50 mL 锥形管中。如果样品太粘而无法通过过滤器,请加入 10 mL RPMI-1640 培养基进行稀释。用RPMI培养基冲洗过滤器以收集残留细胞。
  12. 使用血细胞计数器计数每个样品的细胞/mL。
  13. 每个肿瘤样本等分两个或多个重复的5×106 个细胞。
  14. 在1,000× g (4°C)下离心5分钟。除去上清液。
  15. (可选)如果需要,冷冻保存肿瘤样本以供以后的DDAOG染色。
    1. 将解离的肿瘤细胞沉淀重悬于冷冻保存培养基中:50%FBS,40%RPMI-1640,10%DMSO,在无菌条件下以5×106 细胞/ mL制备。
    2. 将 1 mL 细胞悬液等分到每个冷冻管中。
    3. 将冷冻管在-80°C的异丙醇细胞冷冻容器中冷冻24小时;然后,转移到液氮冷冻储存中长期储存(>1周)。
    4. 当需要染色时,在冰上解冻冷冻管,然后在第 4 节中进行 DDAOG 染色。
      注意:某些肿瘤可能无法通过冷冻保存保持活力,用户应针对感兴趣的肿瘤模型评估对此过程的恢复力。
  16. 继续第 4 部分进行 DDAOG 染色。

4. 细胞或肿瘤样本中SA-β-Gal的DDAOG染色

  1. 将 1 mM 巴非霉素 A1 储备液以 1:1,000 倍稀释到 DMEM 培养基(不含 FBS)中,终浓度为 1 μM。
  2. 将制备好的Baf-DMEM溶液添加到细胞沉淀样品中(来自步骤2.11或步骤3.16),浓度为1×106 细胞/ mL。
    注意:例如,如果每个样品使用 0.5 × 10 个6 个 细胞,请添加 0.5 mL Baf-DMEM。对于肿瘤,可以在 5 mL Baf-DMEM 中染色 5 ×10 6 个细胞。
  3. 在37°C(无CO2)下在以慢速设置的旋转器/振荡器上孵育30分钟。
    注意:染色过程中避免使用CO2 培养箱,这可能会使溶液酸化,从而干扰Baf和DDAOG染色。
  4. 无需洗涤,以 1:500x(10 μg/mL 最终)的比例向每个样品中加入 DDAOG 储备溶液 (5 mg/mL)。移液器混合。在37°C(无CO2)的旋转器/振荡器上更换60分钟。避免光线直射。
  5. 在4°C下以1,000× g 离心管5分钟。 除去上清液。
  6. 每管用 1 mL 冰冷的 0.5% BSA 洗涤,移液器混合。在4°C下以1,000× g 离心管5分钟,并除去上清液。重复此步骤2次以彻底洗涤细胞。取出上清液并继续。
    注意:重要的是执行步骤4.6中的洗涤步骤以去除未切割的DDAOG,DDAOG可能会表现出不需要的荧光发射(460 / 610 nm)。
    注意:如果对细胞表面标志物进行免疫染色,请继续执行下面的第5节。
  7. (可选)固定和储存DDAOG染色细胞以供以后分析
    1. 向每个洗涤的样品中滴加 0.5 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛。移液器混合。
    2. 在室温下孵育10分钟。
    3. 用 1 mL PBS 洗涤细胞 2 次。
    4. 在流式细胞术分析之前,将样品在4°C下储存长达1周。
      注意:对于固定样本,请跳过步骤 4.8。
  8. 将钙黄绿素紫 450 AM 原液 (1 mM) 以 1:1,000 倍稀释到 1% BSA-PBS(1 μM 最终)。向步骤 4.6 中洗涤的细胞沉淀中加入 300 μL(用于培养细胞样品)或 1,000 μL(用于肿瘤样品)。在黑暗中在冰上孵育15分钟。
  9. 继续流式细胞术设置(第6节)。

5. (可选)结合DDAOG对细胞表面标志物进行免疫染色

注意:与任何流式细胞术实验一样,应制备仅使用DDAOG和仅使用荧光抗体的单染色对照样品,以确定荧光通道之间的串扰(如果有)。如果观察到串扰,应进行标准流式细胞术补偿20

  1. 将步骤4.6中获得的细胞沉淀重悬于100μL染色缓冲液(1x PBS中的1%BSA)中。
  2. 在制造商推荐的滴定下添加适用于细胞种类(小鼠或人类)的Fc受体封闭试剂。在24°C孵育10分钟。
  3. 在制造商推荐的滴定(或由用户确定)下添加荧光团偶联抗体。在冰上孵育20分钟,避光。
  4. 将试管在4°C下以1,000× g 离心5分钟。 除去上清液。
  5. 每管用 1 mL 冰冷洗涤缓冲液 (0.5% BSA-PBS) 洗涤,并移液器进行混合。在4°C下以1,000× g 离心管5分钟,并除去上清液。重复此步骤2次以彻底洗涤细胞。
  6. 将 1 mM 钙黄绿素紫 450 AM 以 1:1,000 倍稀释到 1% BSA-PBS 中。向步骤 5.5 中洗涤的细胞沉淀中加入 300 μL。在黑暗中在冰上孵育15分钟。
  7. 继续进行流式细胞术分析(第6-7节)。

6. 流式细胞仪设置和数据采集

  1. 将细胞样品转移到与流式细胞仪兼容的试管中。将试管放在冰上并避光。
    注意:如果在细胞悬液中观察到聚集体,请在分析前将悬浮液通过70-100μm细胞过滤器。不要使用40μm过滤器,因为它们可以排除一些较大的衰老细胞。
  2. 在参考的软件(请参阅 材料表)中,打开以下图:1) FSC-A 与 SSC-A 点图,2) 紫色通道直方图,3) 远红色通道(例如,APC-A)与绿色通道(例如,FITC-A)点图。
    注意:也可以使用双峰排除图和单通道直方图,但不是严格要求的。
  3. 启动细胞仪数据采集。
    1. 将用DDAOG染色的车辆专用对照样品放在进气口上。在低进气速度下,开始采集样本数据。
    2. 调整FSC和SSC电压,使>90%的事件包含在图中。如果像元不能很好地适应图,请将面积缩放设置降低到 0.33-0.5 个单位。
    3. 删除仅车辆样本而不记录数据。
    4. (可选)将一滴彩虹校准微球加入含有 1 mL PBS 的细胞仪管中。将试管放在细胞仪进气口上。开始获取样本数据。
    5. 调整紫色、绿色和远红色通道电压,使彩虹微球的顶峰在每个通道中处于 104-10 5 个单位的相对荧光范围内,并且每个通道中的所有峰都很好地分离。记录 10,000 个事件。取出试管。
  4. 将用DDAOG染色的阳性对照样品(例如BLM,ETO)放在进气口。以低速采集样本数据。观察FSC,SSC,紫色,绿色和远红色通道中的事件,以确保超过90%的事件包含在所有图中。寻找自动对焦和DDAOG信号的增加,而不是仅车辆控制。
  5. 如果使用分选细胞仪,请在此步骤中启动分选。
    1. 出于记录保存目的,记录对照样品和每个分类样品的 10,000 个细胞。
    2. 将所需数量的细胞(通常适合≥1×106 )分选到装有3-5 mL培养基的适合仪器的收集管中。
    3. 分拣后,进行下游培养或分析。
    4. 跳至第 7 节,对分选样品进行常规分析。
  6. 如果使用荧光抗体,请使用第 5 节中制备的未染色、单染色和双染色样品优化通道电压。
    注意:对于本文使用的校准流式细胞仪,最佳通道电压通常介于 250 和 600(中档)之间,但最佳电压和通道电压范围因仪器而异。避免使用非常低或很高范围的电压,这可能会抑制信号或放大噪声。
  7. 完成步骤6.1-6.5并根据需要调整细胞仪设置后,记录所有样品的数据。确保所有样本记录的设置保持一致。每个培养细胞样本记录 ≥10,000 个事件或每个肿瘤细胞样本记录 ≥100,000 个事件。
    注意:虽然可以使用数据采集软件(例如FACSDiva)执行门控和分析,但下面的第7节描述了使用单独的分析软件(FlowJo)在采集后进行的完整门控和分析工作流程。采集后分析是首选,以减少在细胞仪工作站上的时间,并利用专用分析软件中包含的其他工具。
  8. 以 .fcs 文件格式保存示例数据。将文件导出到配备流式细胞术分析软件(例如FlowJo)的工作站计算机。继续执行第 7 部分。

7. 流式细胞术数据分析

注意:显示的工作流程使用 FlowJo 软件。如果类似地遵循本节中描述的关键步骤,则可以使用替代流式细胞术数据分析软件。

  1. 使用 FlowJo 软件,打开步骤 6.7 中的 .fcs 数据文件。
  2. 打开布局窗口。
  3. 将所有示例拖放到布局窗口中。
  4. 门禁活细胞。
    1. 首先双击仅车辆控件的示例数据以打开其数据窗口。
    2. 将数据可视化为紫色通道直方图。根据CV450染色的活细胞比死细胞更亮的荧光来鉴定活细胞。
    3. 使用单门直方图工具绘制门以仅包含活细胞。将门命名为可行。
    4. 然后,从示例布局窗口中,将活门拖到其他细胞样本上以均匀应用门。
    5. 在布局窗口中,将所有样本可视化为紫色通道(活力)直方图。在继续之前,验证活细胞门控是否适合跨样品;如果没有,请根据需要进行调整。
      注意:活力染色可能会因治疗或肿瘤而异。
  5. 门衰老细胞。
    1. 双击仅车辆控件的门控可行单元数据以打开其数据窗口。
    2. 将数据可视化为远红通道 (DDAOG) 与绿色通道 (AF) 的点图。
    3. 使用矩形门控工具绘制门,以包含 <5% 的 DDAOG+ 和 AF+(右上象限)单元格。将门命名为衰老。
    4. 然后,从样品布局窗口中,将衰老门拖动到其他细胞样本的活子集上,以均匀应用门。
    5. 在布局窗口中,拖放第 7.4 节中设控的所有活细胞子集。将所有活样本可视化为远红色(例如,APC-A)与绿色通道(例如,FITC-A)点图。
    6. 确保在步骤7.5.3中绘制的衰老门在所有图上可见,并且仅载体对照的门表现出≤5%-10%的衰老细胞。
  6. 使用上述步骤确定衰老细胞的百分比后,使用FlowJo图呈现结果数据,汇总在数据表中和/或使用标准软件进行统计分析。

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Representative Results

进行了几个实验,以证明DDAOG与X-Gal和C12-FDG在SA-β-Gal检测衰老方面的可比性。首先,X-Gal用于染色由ETO诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞(图2A)。在ETO处理的细胞亚群中出现强烈的蓝色,而其他细胞表现出不太强烈的蓝色染色。大多数ETO处理的细胞的形态扩大。用荧光SA-β-Gal底物C12-FDG(绿色)或DDAOG(远红)染色ETO处理的细胞显示出与X-Gal相当的染色模式和强度变化(图2B)。然而,绿色C12-FDG发射与细胞AF重叠(图2C),已知细胞AF在衰老细胞中积累17。相比之下,在DDAOG的远红光发射范围内,自动对焦可以忽略不计。

与其使用荧光显微镜对衰老细胞进行评分和计数,不如利用流式细胞仪的高通量功能在短时间内(每个样品<5分钟)采集每个样品数千个细胞的数据。首先,实施一系列标准流式细胞术设置参数,以确保最佳数据采集(图3)。按照典型方法,设置光散射参数以可视化细胞的体积(前向散射,FSC)和粒度(侧向散射,SSC)(图3A)。在这里,我们注意到ETO处理的细胞体积增加的趋势,这与使用显微镜观察到的衰老细胞通常观察到的扩大形态一致。需要减少默认区域缩放设置(根据细胞类型和处理减少到 0.33-0.50 个单位)才能可视化图上更多较大的像元。对于某些细胞系/处理,粒度(SSC)增加也很明显(数据未显示)。总体而言,散射评估被用作质量控制步骤,以验证细胞散射数据是否按预期出现,不存在过多的细胞碎片,并且细胞以适当的流速(~100-1000个细胞/秒)通过细胞仪进行处理。作为仅用于仪器设置的质量控制步骤,此处未进行门控或分析。

流式细胞术设置的第二个(可选)步骤是简要分析市售“彩虹”校准颗粒样品,以确保荧光检测电压设置在可接受的范围内(图3B)。每个通道中相对荧光强度设置在1 × 104 单位和1 × 105 单位之间最亮峰,具有明确定义的较低强度峰,每个峰之间有足够的间隔,并且相邻峰没有重叠。使用这些电压设置记录了10,000个微球的对照样品。然后在每个细胞术会话中以这种方式使用微球,以提高方案过程中数据采集的均匀性。

接下来,在每个荧光通道中可视化仅载体或ETO处理的细胞样品,并设置门。根据紫色通道中CV450活力染色的信号设置细胞活力门(图3C)。仅载体处理的细胞表现出88%的活力,ETO处理的细胞表现出75%的活力(在最终的细胞样品中;额外的死细胞可能最初在丢弃的培养基中去除,并在染色过程中机械分解)。接下来,在绿色(图3D)和远红色(图3E)发射通道中可视化活的门控细胞。绿色AFHI 和远红色DDAOGHI 的门设置为仅载体细胞的<5%,然后将这些门应用于ETO处理的细胞。使用这种方法,确定46%的ETO处理细胞是AFHI ,33%是DDAOGHI;根据文献和我们实验室中大量重复实验的结果,这些值在预期范围内。细胞仪设置完成后,使用相同的数据采集设置运行实验中的所有细胞样品。每个样本获得了 10,000 个事件的数据。

代表性测定数据如图 4所示。B16-F10小鼠黑色素瘤细胞或A549人肺腺癌细胞作为癌细胞系模型。每个细胞系用已知诱导衰老的化疗药物(ETO或BLM)处理4天以诱导衰老或仅载体。此外,将已知的senolytic试剂ABT-26321 加入到诱导衰老细胞中2天,以证明DDAOG探针的特异性。仅制备ABT-263样品作为附加对照。在这里,数据可视化为具有DDAOG(670 nm发射)与AF(525 nm)的2D点图。 图3 中的工作流程用于细胞仪设置,并设置TIS门,使<5%的仅载体细胞评分为TIS。使用B16-F10细胞(图4A)的结果显示,ETO在35%的活B16-F10细胞中诱导TIS(类似于 图2DE中显示的可比数据)和senolytic试剂几乎完全消除了TIS细胞(<2%)。在A549细胞中(图4B),BLM在66%的活细胞中诱导TIS,ABT-263将百分比降低到15%。单独的ABT-263对未经处理的增殖细胞没有毒性。

我们进一步旨在证明荧光抗体共染色与DDAOG衰老测定相容,以促进TIS相关或新型表面标志物的筛选。在这里,B16-F10小鼠黑色素瘤细胞再次用TIS诱导的ETO(或载体)处理4天。然后,用DDAOG染色细胞以评估TIS,并用荧光抗体染色以检测TIS相关的表面标志物DPP422图5)。使用与R-藻红蛋白(PE)偶联的抗DPP4,我们确认PE与DDAOG和AF在使用的流式细胞仪上的重叠可以忽略不计(补充图S2)。>5,000个活细胞的PE通道数据直方图(图5A)显示,42%的ETO处理细胞是DPP4+(使用仅载体样本设置阳性门)。可视化相同样品的2D点图(图5B,C)表明44%的ETO处理细胞对DDAOG(即衰老)和DPP4呈双阳性,而仅载体细胞为4%。这些数据表明,与DDAOG衰老测定相结合,可以用表面标志物抗体进行活细胞染色。

任何活细胞染色方法的潜在问题包括在长时间的分析过程中(>1小时)发生的细胞死亡,以及如何在许多不同的时间点(最多相隔几天)最有效地染色和分析样品。基于溶剂的染色细胞固定解决了这两个问题,因为样品可以在染色后立即固定,然后储存在冰箱中,直到在一个温度稳定的批次中进行分析。因此,我们测试了用DDAOG染色的活细胞是否可以用100%甲醇或4%多聚甲醛(PFA)固定并在4°C下储存长达1周。 不希望的是,甲醇固定降低了DDAOG信号并显着降低了AF(数据未显示);因此,应避免使用甲醇作为固定溶剂。然而,用PFA固定要成功得多,如图6所示,在用DDAOG染色后,细胞固定在4%PFA中10分钟。与未固定的对照样品(图6A;未处理,5%和BLM,67%DDAOGHI AFHI)相比,固定样品(图6B)在未处理的细胞中表现出略高的背景(9%),并且在BLM处理的细胞中得分为衰老的细胞百分比也更高(80%)。在储存过夜的固定样品中也观察到这种效应(图6C;未处理,12%和BLM,72%)并在4°C下储存1周(图6D;14%和70%)。尽管PFA固定引起的荧光略有增加,但与匹配的未处理样品相比,BLM诱导衰老在所有固定样品中仍然很明显。此外,细胞在储存中保持完整,到第7天仅略有恶化,并且没有观察到有问题的聚集。我们得出的结论是,能够固定和储存细胞样品以供以后的批量分析的便利性将证明可以容忍PFA固定引起的略高背景,特别是在具有许多样品或时间点的实验中。

基于细胞的衰老研究的一个共同挑战是细胞群中衰老的异质性发作。在这里,我们表明DDAOG可用于活衰老细胞的FACS,并且收集的细胞在培养物中存活以进行下游 体外 测定(图7)。为了通过FACS对细胞进行分选,如上所述对细胞进行处理和染色,并使用此处所示的DDAOG与AF门控策略通过具有FACS功能的流式细胞仪进行分类(图7A)。由于长期毒性问题,这里不使用活性探针,我们建议在最终衰老细胞门控之前进行严格的散射门控(补充图S3),以消除收集的细胞中的假阳性碎片。这些是标准的FACS门控程序,中等经验的用户应该熟悉这些程序,并且可以使用仪器上的软件快速建立(<10分钟)。

在分选BLM处理的A549细胞样品后,我们将细胞以10×103 细胞/ cm2在标准多孔培养皿中培养5天(n = 6重复)。将未分选的对照以相同的密度接种,并排生长,并包括未处理和BLM处理的细胞。每天观察细胞;对于分选的细胞,没有观察到显着的细胞死亡或恢复增殖。分选的细胞在培养5天内保持稀疏(即不增殖),而未处理和BLM处理的细胞如图所示汇合。在第5天,将细胞固定在PFA中并染色以检测形态和增殖标志物(图7B)。通过丝状肌动蛋白的荧光鬼笔环肽染色揭示分选细胞的特征性扩大形态,DAPI染色显示增大的细胞核。分选的细胞直径非常大(>10μm),具有特征性的圆形外观。正如预期的那样,Ki67抗体染色显示分选样品中的增殖标志物完全丢失,而未分类BLM处理的样品中部分丢失,并且在未处理的未分类样品中的许多细胞中观察到正常水平的Ki67。使用跨样品的统一成像设置,每孔至少拍摄三张图像。显示了代表性图像(图7B)。

最后,我们评估了是否可以使用DDAOG鉴定在用化疗药物治疗的小鼠中建立的肿瘤中产生的衰老细胞。在C57 / BL6小鼠的侧腹诱导B16-F10黑色素瘤肿瘤,然后仅用盐水(图8A),DOX(图8B)或PLD(图8C)治疗三次(ip,每5天一次)。第三次治疗后,小鼠恢复7天以允许衰老开始,然后处死并切除肿瘤。肿瘤减半,一半用于制备用于X-Gal染色的冷冻组织载玻片(图8),一半解离成单细胞悬浮液并用DDAOG染色(图8补充图S4)。尽管染色持续时间长(72小时),组织中的X-Gal染色相当弱,但仔细检查后DOX和PLD肿瘤中的蓝色染色很明显,特别是在通过DDAOG流式测定也对衰老评分呈阳性的肿瘤中(图8B,C)。每个组织载玻片至少拍摄三张图像,并显示代表性图像。

与X-Gal相比,DDAOG是量化肿瘤衰老的更灵敏和准确的方法(图8)。对于DDAOG肿瘤分析,使用荧光背景最高的盐水处理的肿瘤将衰老门设置为<5%,使得其他盐水处理的肿瘤的衰老得分不超过5%。然后将该衰老门批量应用于来自所有肿瘤的门控活细胞。两种化疗药物都诱导了一些肿瘤的衰老(DOX的五个肿瘤中的两个,PLD的五个肿瘤中的三个),每个肿瘤的衰老肿瘤细胞的百分比从3%到36%不等。所有15种肿瘤的细胞术数据图显示在 补充图S4中,肿瘤细胞术数据的摘要显示在 图8D 中(n = 5;(*) p < 0.05 与仅盐水对照组相比,通过 F 方差检验)。我们得出结论,DDAOG与AF流式细胞术是筛选肿瘤和化疗药物以诱导 体内衰老的可接受方法。

Figure 2
图 2:DDAOG 是 SA-β-Gal 的敏感和特异性染色剂 。 (A) 使用 X-Gal 对 SA-β-Gal 进行常规染色,显示未经处理(左)或 ETO 处理(右)的 B16-F10 鼠黑色素瘤细胞。ETO诱导的衰老:由于SA-β-Gal升高对X-Gal的切割,细胞表现出扩大的形态和蓝色染色。比例尺= 10μm。 (B)使用C12-FDG(515nm发射,绿色)或DDAOG(660nm,红色)对ETO处理的细胞中的SA-β-Gal进行荧光染色。两种探针的染色分布相似,表明DDAOG检测SA-β-Gal的方式与C12-FDG相似。(C) 在绿色(525 nm 发射,左)或远红(660 nm,右)发射通道中评估未染色的 ETO 处理细胞中的 AF。来自脂褐素的AF在绿色发射通道中很高,而在远红色通道中可以忽略不计。每张图像的曝光时间 = 2,000 毫秒。比例尺 = 10 μm。这个数字转载自Flor和Kron23。缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;X-Gal = 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷;UNT = 未经处理;ETO = 依托泊苷;AF = 自发荧光;C12-FDG = 5-十二烷基氨基荧光素二-β-D-吡喃半乳糖苷;SA-β-Gal = 衰老相关的 β-半乳糖苷酶。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
3:流式细胞仪数据采集设置。 (A)细胞的代表性散点图分布。FSC-A是细胞体积的读数,SSC-A表示细胞粒度。左图,仅载体处理 A549 细胞。右图,ETO治疗诱导衰老。注意ETO处理的细胞体积增大的趋势,与显微镜下明显的增大形态一致。(B)可选使用5峰市售“彩虹”荧光校准微球来设置细胞仪的检测器电压。在所使用的每个荧光通道中,通过在样品运行时调节细胞仪检测器电压,应将最大峰设置为≤1 x 105相对荧光单位。左面板,BV421(紫色)通道;中间,FITC(绿色)通道;右,APC(红色)通道。如图所示,五个荧光峰应表现出不同的间距。()使用紫色CV450染料进行(C)活性染色的代表性单通道荧光数据;()细胞的绿色自发荧光;(E)来自DDAOG的远红信号,检测SA-β-Gal。颜色较深的直方图,仅车辆处理;颜色较浅的直方图,ETO处理。父门在每个图的上方标明。缩写:FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧散射峰面积;ETO = 依托泊苷;BV421-A = 亮紫 421 通道峰面积;FITC-A = 异硫氰酸荧光素通道峰面积;APC-A = 别藻蓝蛋白通道峰面积;AF = 自发荧光;DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;VEH = 车辆。请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图4:流式细胞术衰老测定的代表性数据。 (A)仅用(左上)载体,(右上)ETO,(左下)仅ABT-263(1μM)或(右下)ETO加ABT-263处理的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞。(B)仅用(左上)载体,(右上)BLM,(左下)仅ABT-263或(右下)BLM加ABT-263治疗的人肺腺癌细胞。(一,二)所有图的右上象限中的矩形门定义了衰老细胞(DDAOG HI AFHI)。每个图上都标明衰老细胞(每个样品的总活细胞)的百分比。缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;ETO = 依托泊苷;BLM = 博来霉素;VEH = 车辆;TIS = 治疗诱导的衰老。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图5:示例细胞表面标志物与衰老测定的共染色。A)活的B16-F10培养细胞表面衰老标志物DPP4的免疫检测;深橙色,仅限车辆;浅橙色,ETO。(乙,丙)中间和右图:与DDAOG和抗DPP4:PE共染色的细胞。DDAOGHI DPP4 HI 细胞包含在图上所示的矩形门内,并指示每个样品的双阳性细胞的百分比。显示:活门控细胞。缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;ETO = 依托泊苷;VEH = 车辆;DPP4 = 二肽基肽酶 4。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 6
图 6:DDAOG 染色细胞样品的染色后固定和储存以供以后分析。A)对照,未处理(左)或用BLM(右)处理的活A549细胞的未固定样品以诱导衰老,然后染色并立即使用DDAOG方案进行分析(无固定,第0天)。(B)按(A)中制备的样品,然后立即固定在4%多聚甲醛中并进行分析(第0天)。(C)如(A)中制备的样品,立即固定在4%多聚甲醛中,并在分析前在4°C下储存过夜。(D)按(A)中制备的样品,立即固定,并在分析前保存7天。所有图的右上象限中的矩形门定义了衰老细胞(DDAOG HI AFHI)。每个图上都标明了衰老细胞的百分比。缩写:TIS = 治疗诱导的衰老;DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;BLM = 博来霉素;AF = 自发荧光。请点击此处查看此图的大图。

Figure 7
图 7:富集衰老细胞群 的流式细胞术分选和验证。 (A) 流式细胞术分选数据,显示(左)用于设置衰老细胞分选门的未处理的 DDAOG 染色对照<(门控区域中的 5% 衰老细胞)和(右)使用分选门分选的 BLM 处理的 DDAOG 染色样品,如图所示。(B)用鬼笔环肽-Alexa Fluor 647(橙色伪色)染色的(左列)细胞的荧光显微镜图像,以检测F-肌动蛋白和DAPI(蓝色)以复染细胞核,显示衰老细胞的扩大形态,或(右列)用兔Ki67抗体和抗兔Alexa Fluor 594染色的细胞以检测衰老细胞中的增殖损失。顶行、未经处理和未分类的单元格。中心行,BLM 处理和未分类的单元格。下行,BLM处理和分选的细胞。比例尺 = 10 μm。缩写:TIS = 治疗诱导的衰老;DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;BLM = 博来霉素;UNT = 未经处理;DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 8
图8:用化疗药物治疗的小鼠肿瘤衰老的定量。 在C67BL / 6小鼠的侧腹中建立B16-F10黑色素瘤肿瘤,然后每5天加1周用三剂(A)盐水,(B)DOX或(C)PLD处理,以允许衰老开始。肿瘤被切除并减半;冷冻组织载玻片从一半制备用于X-Gal染色(上排),另一半解离用于DDAOG染色(下排)。在X-Gal染色图像中,蓝色细胞是SA-β-Gal HI 衰老细胞,而棕色区域是由于肿瘤中的黑色素。显示了每组表现出衰老的两个肿瘤的DOX和PLD的代表性结果。所有仅含盐水的肿瘤都表现出可忽略不计的衰老。(D)小鼠药物治疗肿瘤衰老的定量。(*) p < 0.05 通过 F 方差检验,每组 n = 5 只小鼠。误差线,平均± SEM。 缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;DOX = 多柔比星;PLD = 聚乙二醇化脂质体阿霉素;X-Gal = 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷;AF = 自发荧光。 请点击此处查看此图的大图。

补充图S1:DDAOG探头的化学结构。 DDAOG是7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)和β-半乳糖苷的偶联物。当被β-半乳糖苷酶切割时,水解裂解产物表现出50 nm远红荧光发射位移,使其能够在600 nm以上的激发下进行特异性检测。缩写:DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷。 请点击此处下载此文件。

补充图S2:DDAOG串扰与流式细胞仪其他荧光通道的光谱扫描。 为了确定用于检测荧光抗体的可用通道,使用用BLM处理并用DDAOG(红色)或未染色(黑色)染色的A549细胞在4激光,15通道流式细胞仪上进行光谱扫描。采集流式细胞仪每个通道中10,000个细胞的数据。(A) 405 nm 激光器的发射通道:从左到右,BV421、BV510、BV605、BV660 和 BV711。在BV605、BV660和BV711通道中观察到的串扰使它们不适合在没有补偿的情况下与DDAOG共染色。BV421和BV510适用于共染色(请注意,BV421通常用于活性染色)。(B) 488 nm激光器的发射通道:FITC和PerCP-Cy5。观察到PerCP-Cy5通道的高串扰。FITC适用于共染色;但是,请注意,FITC通道通常用于DDAOG测定中,以评估绿色发射AF。(C) 561 nm 激光器的发射通道:PE、PE-Dazzle 594、PE-Cy5、PE-Cy5.5 和 PE-Cy7。PE 和 PE-Dazzle 594 通道适用于检测用这些荧光团标记的抗体(本研究证明了 PE 用于检测 DPP4)。(D) 640 nm激光器的发射通道:APC、APC-H700和APC-Cy7。衰老细胞的DDAOG信号在APC通道中可见(47.8%衰老)。信号与APC-H700和APC-Cy7通道重叠,因此不适合在没有明显光谱补偿的情况下进行共染色。缩写:BLM = 博来霉素;BV = 亮紫色;FITC = 异硫氰酸荧光素;PerCP = 佩里地宁-叶绿素蛋白;PE = 藻红蛋白;DZ594 = 炫目 594;APC = 别藻蓝蛋白;AF = 自发荧光;DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷。 请点击此处下载此文件。

补充图S3:用于衰老细胞FACS分选的细胞门控策略。 将细胞悬浮液通过灵敏的FACS细胞仪可能需要额外的设门,以确保分选的纯度和最佳的仪器功能。此处显示了一个示例策略。根据制造商对所用 FACS 细胞仪的建议,还可以使用其他策略。左列,仅载体处理的细胞对照。右列,用BLM处理A549细胞以诱导衰老进行分选。(A)完整细胞的FSC-A(细胞体积)与SSC-A(细胞粒度)门控。完整的门可消除分选样品中的细胞碎片。(B) FSC-A与FSC-H纯度门控;去除双峰和碎屑。(C) SSC-A 与 SSC-H 纯度门控;去除双峰和碎屑。(D) 使用 APC-A 通道(637 nm 激发,670 nm ± 30 nm 发射,用于 DDAOG)与 FITC-A 通道(488 nm 激发,530 nm ± 30 nm 发射,用于 AF)对感兴趣的群体进行选通;去除可能的染色伪影。(E)用于最终分选的衰老细胞门控。缩写:FACS = 荧光激活细胞分选;BLM = 博来霉素;FSC-A = 前向散射峰面积;SSC-A = 侧散射峰面积;FSC-H = 前向散射峰高度;SSC-H = 侧散射峰高度。请点击此处下载此文件。

补充图S4:肿瘤的DDAOG衰老流式细胞术染色。 ≥50,000 个活肿瘤细胞的流式细胞术数据。衰老细胞门,每个图的右上象限。衰老(活的)肿瘤细胞的百分比显示在门内。肿瘤治疗包括(A)仅生理盐水;(b) DOX;和 (C) PLD。小鼠治疗3次,每5天一次,恢复7天,以便在处死前开始衰老。分析每种情况五个肿瘤。缩写:AF = 自发荧光;DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮);DDAOG = DDAO-半乳糖苷;DOX = 多柔比星;PLD = 聚乙二醇化脂质体阿霉素。 请点击此处下载此文件。

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Discussion

在过去十年左右的时间里,由于肿瘤免疫学的日益普及,低成本流式细胞仪的发展以及学术机构共享仪器设施的改进,流式细胞术已成为癌症研究中更常见的分析平台。多色检测现在是标准配置,因为大多数较新的仪器都配备了紫色、蓝绿色和红色至远红色的光学阵列。因此,该DDAOG方案可能与各种流式细胞仪兼容。当然,任何流式细胞仪都应经过用户评估。在DDAOG测定中添加额外的荧光团(例如荧光,偶联抗体)时应特别小心。应使用在所有其他相关通道中可视化的单染色对照来评估通道之间的荧光基团串扰。如果观察到重叠,则可以按照典型方法执行频谱补偿20 以进行校正。

本文显示的研究结果主要旨在证明DDAOG流式细胞术测定可以对细胞或肿瘤中化疗药物诱导的TIS产生快速,定量,易于解释的结果。这里使用的药物,包括ETO 23,24,DOX725和BLM26,27已被证明可以在各种癌细胞系中诱导TIS24为了证明DDAOG探针的特异性,已知的senolytic试剂ABT-26321被证明可以选择性地消除培养物中的衰老细胞。本文展示了使用一种小鼠(B16-F10)和一种人(A549)培养的癌细胞系,以及在小鼠中建立的B16-F10肿瘤。然而,可以使用任何表达β-Gal并通过标准流式细胞术样品制备保持活力的细胞。某些细胞类型可能更脆弱或不易患TIS,这应该在开始大屏幕或研究之前进行评估。如果细胞在制备过程中崩解,活力差,或者TIS远低于使用阳性药物对照的预期,则细胞类型可能不是衰老研究的理想模型。此处所示的试剂和细胞系可被其他组用作进一步筛选潜在TIS诱导剂或新型senolytics的对照,这仍然是该领域的积极目标。

化疗药物诱导的毒性可能因细胞类型而异,并影响测定结果。如果使用的药物和/或浓度的主要观察到的影响是急性细胞死亡,则整体衰老可能很小。 在体内,通过降低药剂剂量来避免动物肿瘤高坏死或全身毒性。检测成功的关键是测试一系列试剂浓度,仔细检查活性测定数据(例如,在DDAOG测定中由CV450提供)。 在体外,如果在处理过程中许多死细胞从平板上分离,包括分析样品中的培养基,则评估细胞总数死亡很重要。CV450不是与该测定兼容的唯一活性染色剂;可以使用其他发出紫色/蓝色的荧光团。如果用户计划用PFA固定染色样品,也可以使用可固定的活性探针,前提是探针荧光与DDAOG或AF没有显着重叠(或用户进行光谱补偿以校正重叠)。在一些药剂毒性低且细胞稳健的情况下,通过光散射(FSC 与 SSC)对完整细胞进行门控就足以分离出“活”细胞进行分析。

体外 方案中的一个关键步骤是将细胞接种在对数生长密度的较低范围内(通常为2×103-5×103 细胞/cm 2)以允许快速初始增殖,这有利于大多数细胞对化疗药物的摄取。一旦治疗,为TIS的发作留出时间也很重要: 体外,在药物存在的情况下4天±1天; 在体内,最后一次化疗后恢复7天。如上所述用DDAOG染色后,应如图所示对细胞术数据进行定量分析,即在每个样品中对DDAOG与AF细胞进行门控,以确定衰老细胞(占总活力)的百分比。可选步骤包括使用荧光“彩虹”校准微球来标准化流式细胞术、染色样品的 PFA 固定、表面标志物的共免疫染色以及富集用于下游测定的衰老细胞的流动分选。但是,这些可选步骤中的每一个都在某些应用程序中提供了关键优势。校准微球在多个会话中标准化细胞术设置,并允许用户最初将电压设置为衰老和活力检测的有用范围内,此后只需进行最少的调整。样品的PFA固定可稳定细胞,并允许在以后对大量细胞进行批量分析。表面标志物的共免疫染色可用于筛选新型衰老相关蛋白和免疫相互作用。在未来的研究中,我们计划验证细胞内衰老标志物与DDAOG的共染色。

通过FACS对TIS细胞进行分选,可以从异质群体中富集活的TIS细胞,这可能会混淆下游测定(如蛋白质印迹、蛋白质组学或转录组学)的读数。分选后,在放回培养物中长达5天的TIS细胞中未观察到DDAOG的显着毒性。然而,应该考虑到分选的细胞已经用Baf处理,内化的DDAOG(由SA-β-Gal切割成DDAO,一种吖啶染料),并经受通过FACS仪器的机械应力。因此,某些与衰老无关的生物学改变可能存在于分选的细胞中。然而,在这项研究中,与未分类的对照相比,分选的细胞保留了强烈的衰老特征,并提供特征性的蛋白质组学和转录组学结果28 。尽管使用FACS收集和分析肿瘤中的衰老细胞具有明显的效用,但该程序很少在文献中使用。一些小组使用p16Ink4a 荧光素酶或荧光报告基因来识别小鼠组织中的衰老细胞,在一些研究中,荧光报告基因使FACS分选成为可能2930。研究结果普遍同意,无论诱导剂或肿瘤类型如何,肿瘤中的TIS都是部分到罕见的,很少达到100%的肿瘤细胞31。使用DDAOG方法对细胞进行FACS分选很容易从肿瘤中收集稀有的TIS细胞,而无需表达转基因构建体。

目前,小鼠模型中的大多数衰老研究都是使用X-Gal和免疫组织化学标记3233的组合在体外进行的。然而,使用肿瘤组织离体评估TIS可能是一个漫长的过程,特别是当使用X-Gal时。该过程需要肿瘤冷冻保存,在载玻片上冷冻切片,X-Gal染色,盖玻片安装,干燥,成像和评分“蓝色”细胞 - 至少需要多天的方法。免疫组织化学并不快或容易,并且必须为每个标记物加上每个肿瘤中的X-Gal使用不同的组织切片并评分,除非优化多重分析,在过程的前端增加更多时间。组织切片仅对肿瘤的一个薄横截面进行采样,而衰老细胞(如许多细胞类型)可能在整个肿瘤的3D空间中不均匀分布29。该领域迫切需要从缓慢,过时的组织学方法转向更快速,易于量化的肿瘤衰老测定。使用DDAOG流式细胞术,可以在肿瘤收获后不到1天的手动操作时间内解离和染色一组15个肿瘤,以获得确凿的定量衰老数据。每个样本处理一半的肿瘤,改善每个肿瘤的3D空间采样。这种DDAOG流式细胞术方法比基于组织载玻片的方法在评估肿瘤中的TIS方面明显更快、更可靠。

凭借其与X-Gal和其他方法相比的许多优势,我们倡导DDAOG协议成为新的金标准衰老测定。它使用常规接受的衰老标志物 SA-β-Gal 和年龄相关 AF 的无标记检测作为第二个标志物。这些荧光团与大多数标准流式细胞仪兼容。该测定包括活性染色剂,以使用易于从药物治疗的培养细胞系或肿瘤中获得的样品来排除死细胞和碎片。活细胞样品可以选择溶剂固定或冷冻保存,以促进大型研究的批量分析,例如,使用时间点使用多种试剂评估TIS随时间推移的发作 染色过程只需不到半天的实验室工作即可完成,每个样品的数据采集通常为<5分钟。数据分析同样快速直接,无需繁琐的细胞评分和计数即可生成每个样品TIS细胞百分比的定量数据。样品可以进行FACS分选,以回收富集的TIS细胞群,从而减少下游分析中细胞异质性的噪音。我们相信DDAOG测定在许多情况下可以取代X-Gal,促进体外和体内TIS诱导剂和senolytics的筛选,从而在衰老研究领域更快,更可靠地发现。

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Disclosures

作者对本研究没有利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢芝加哥大学的细胞术和抗体核心设施对流式细胞术仪器的支持。芝加哥大学的动物研究中心提供动物住房。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

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References

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癌症研究,第187期,衰老,癌症,化疗,流式细胞术,荧光探针,多重检测
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Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

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