Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176

Summary

Een protocol voor fluorescerende, flowcytometrische kwantificering van senescente kankercellen geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in celkweek of in muizentumormodellen wordt gepresenteerd. Optionele procedures omvatten co-immunostaining, monsterfixatie om grote batch- of tijdpuntanalyse te vergemakkelijken en de verrijking van levensvatbare senescente cellen door flowcytometrische sortering.

Abstract

Cellulaire senescentie is een toestand van proliferatieve arrestatie veroorzaakt door biologische schade die normaal gesproken in de loop van de jaren oploopt in ouder wordende cellen, maar ook snel kan ontstaan in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen. Tumorcelsenescentie wordt over het algemeen als ongewenst beschouwd, omdat senescente cellen resistent worden tegen de dood en tumorremissie blokkeren terwijl tumormaligniteit en behandelingsresistentie worden verergerd. Daarom is de identificatie van senescente tumorcellen van voortdurend belang voor de kankeronderzoeksgemeenschap. Er bestaan verschillende senescentietests, waarvan vele gebaseerd zijn op de activiteit van de bekende senescentiemarker, senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal).

Typisch wordt de SA-β-Gal-test uitgevoerd met behulp van een chromogeen substraat (X-Gal) op vaste cellen, met de langzame en subjectieve opsomming van "blauwe" senescente cellen door lichtmicroscopie. Verbeterde testen met behulp van celpermeant, fluorescerende SA-β-Gal substraten, waaronder C12-FDG (groen) en DDAO-Galactoside (DDAOG; verrood), hebben de analyse van levende cellen mogelijk gemaakt en het gebruik van high-throughput fluorescerende analyseplatforms mogelijk gemaakt, inclusief flowcytometers. C12-FDG is een goed gedocumenteerde sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire autofluorescentie (AF) die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscineaggregaten. Door gebruik te maken van de verrode SA-β-Gal probe DDAOG, kan groene cellulaire autofluorescentie worden gebruikt als een secundaire parameter om senescentie te bevestigen, waardoor betrouwbaarheid aan de test wordt toegevoegd. De resterende fluorescentiekanalen kunnen worden gebruikt voor kleuring van de levensvatbaarheid van cellen of optionele fluorescerende immunolabeling.

Met behulp van flowcytometrie demonstreren we het gebruik van DDAOG en lipofuscine autofluorescentie als een dual-parameter assay voor de identificatie van senescente tumorcellen. Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen wordt uitgevoerd. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden opgenomen om antigenen van het celoppervlak van belang te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook flowcytometrisch worden gesorteerd en verzameld voor downstream-analyse. Verzamelde senescente cellen kunnen onmiddellijk worden gelyseerd (bijvoorbeeld voor immunoassays of 'omics-analyse' ) of verder worden gekweekt.

Introduction

Senescente cellen hopen zich normaal gesproken op in organismen gedurende de jaren tijdens normale biologische veroudering, maar kunnen zich ook snel ontwikkelen in tumorcellen als reactie op schade veroorzaakt door verschillende kankerbehandelingen, waaronder bestraling en chemotherapie. Hoewel ze niet langer prolifereren, kunnen door therapie geïnduceerde senescente (TIS) tumorcellen bijdragen aan de behandelingsresistentie en recidief veroorzaken 1,2,3. Factoren die door TIS-cellen worden uitgescheiden, kunnen de tumormaligniteit verergeren door immuunontwijking of metastasete bevorderen 4,5. TIS-cellen ontwikkelen complexe, contextspecifieke fenotypen, veranderde metabole profielen en unieke immuunresponsen 6,7,8. Daarom is de identificatie en karakterisering van TIS-tumorcellen geïnduceerd door verschillende kankerbehandelingsbenaderingen een onderwerp van voortdurende interesse voor de kankeronderzoeksgemeenschap.

Om TIS-tumorcellen te detecteren, worden conventionele senescentietests op grote schaal gebruikt, voornamelijk gebaseerd op het detecteren van verhoogde activiteit van het senescentiemarkerenzym, het lysosomale bèta-galactosidase GLB19. Detectie bij een bijna neutrale (in plaats van zure) lysosomale pH maakt specifieke detectie van senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-Gal)10 mogelijk. Een standaard SA-β-Gal-test die al tientallen jaren wordt gebruikt, gebruikt X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een blauw chromogeen bèta-galactosidase-substraat, om SA-β-Gal in vaste cellen te detecteren door lichtmicroscopie11. De X-Gal-test maakt de kwalitatieve visuele bevestiging van TIS mogelijk met behulp van algemeen beschikbare reagentia en laboratoriumapparatuur. Een basistransmissielichtmicroscoop is de enige instrumentatie die nodig is om de aanwezigheid van het blauwe chromogeen te evalueren. De X-Gal-kleuringsprocedure kan echter niet gevoelig zijn en soms meer dan 24 uur nodig hebben om de kleur te ontwikkelen. Kleuring wordt gevolgd door een subjectieve score met lage doorvoer van individuele senescente cellen op basis van het tellen van de cellen die een bepaald intensiteitsniveau van het blauwe chromogeen vertonen onder een lichtmicroscoop. Omdat X-Gal celdoordringbaar is, vereist deze test oplosmiddelvaste cellen, die niet kunnen worden teruggewonnen voor downstream-analyse. Bij het werken met beperkte monsters van dieren of patiënten kan dit een groot nadeel zijn.

Verbeterde SA-β-Gal-assays met behulp van celpermeant, fluorescerend enzymsubstraten, waaronder C12-FDG (5-dodecanoylaminofluoresceïne Di-β-D-Galactopyranoside, groen) en DDAOG (9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, verrood) zijn eerder in de literatuur verschenen 12,13,14,15. De chemische sondestructuur en optische eigenschappen van DDAOG zijn weergegeven in aanvullende figuur S1. Deze celpermeant sondes maken de analyse van levende (in plaats van vaste) cellen mogelijk, en fluorescerende in plaats van chromogene sondes vergemakkelijken het gebruik van snelle fluorescentieanalyseplatforms met hoge doorvoer, waaronder screeningsinstrumenten met hoge inhoud en flowcytometers. Sorteerstroomcytometers maken het herstel mogelijk van verrijkte populaties van levende senescente cellen uit celculturen of tumoren voor downstream-analyse (bijv. Western blotting, ELISA of 'omics'). Fluorescentieanalyse biedt ook een kwantitatief signaal, waardoor het percentage senescente cellen in een bepaald monster nauwkeuriger kan worden bepaald. Extra fluorescerende sondes, waaronder levensvatbaarheidsondes en fluorofoor-gelabelde antilichamen, kunnen gemakkelijk worden toegevoegd voor multiplexanalyse van doelen buiten SA-β-Gal.

Net als DDAOG is C12-FDG een fluorescerende sonde voor SA-β-Gal, maar de groene fluorescerende emissie overlapt met intrinsieke cellulaire AF, die ontstaat tijdens senescentie als gevolg van de accumulatie van lipofuscine-aggregaten in cellen16. Door gebruik te maken van de verrode DDAOG-sonde kan groene cellulaire AF worden gebruikt als secundaire parameter om senescentie te bevestigen17. Dit verbetert de betrouwbaarheid van de test door een tweede marker te gebruiken naast SA-β-Gal, die vaak onbetrouwbaar kan zijn als een enkele marker voor senescentie18. Omdat de detectie van endogene AF in senescente cellen een labelvrije benadering is, is het een snelle en eenvoudige manier om de specificiteit van onze op DDAOG gebaseerde test uit te breiden.

In dit protocol demonstreren we het gebruik van DDAOG en AF als een snelle, dual-parameter flowcytometrietest voor de identificatie van levensvatbare TIS-tumorcellen uit in vitro culturen of geïsoleerd uit met geneesmiddelen behandelde tumoren die bij muizen zijn vastgesteld (figuur 1). Het protocol maakt gebruik van fluoroforen die compatibel zijn met een breed scala aan standaard commerciële flowcytometrie-analysers en sorteerders (tabel 1). Kwantificering van het percentage levensvatbare senescente cellen met behulp van standaard flowcytometrieanalyse is mogelijk. Indien gewenst kan een optionele immunolabelingstap worden uitgevoerd om antigenen van het celoppervlak gelijktijdig met senescentie te evalueren. Geïdentificeerde senescente cellen kunnen ook worden verrijkt met behulp van de standaard fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) methodologie.

Figure 1
Figuur 1: Experimentele workflow. Een schematische samenvatting van de belangrijkste punten van de DDAOG-test. (A) Een TIS-inducerend geneesmiddel wordt toegevoegd aan gekweekte cellen van zoogdieren of toegediend aan tumordragende muizen. Er wordt dan tijd toegestaan voor het begin van TIS: voor cellen, 4 dagen na de behandeling; voor muizen, 22 dagen in totaal, met drie behandelingen om de 5 dagen plus 7 dagen herstel. Cellen worden geoogst of tumoren worden gedissocieerd in suspensie. (B) Monsters worden behandeld met Baf om de lysosomale pH aan te passen voor detectie van SA-β-Gal gedurende 30 minuten; vervolgens wordt de DDAOG-sonde gedurende 60 minuten toegevoegd om SA-β-Gal te detecteren. Monsters worden 2x gewassen in PBS en een levensvatbaarheidsvlek wordt kort toegevoegd (15 min). Optioneel kunnen monsters worden gekleurd met fluorescerende antilichamen in open fluorescentiekanalen en / of worden gefixeerd voor latere analyse. (C) Monsters worden geanalyseerd met behulp van een standaard flowcytometer. Levensvatbare cellen worden gevisualiseerd in dot plots met rode DDAOG (wat wijst op SA-β-Gal) versus groene autofluorescentie (lipofuscine). Een poort om het percentage TIS-cellen te bepalen wordt vastgesteld op basis van onbehandelde controlemonsters (niet weergegeven). Als een sorteercytometer (FACS) wordt gebruikt, kunnen TIS-cellen worden verzameld en teruggeplaatst in cultuur voor verdere in vitro assays of worden gelyseerd en verwerkt voor moleculaire biologie-assays. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; TIS = therapie-geïnduceerde senescentie; FL-Ab = fluorofoor-geconjugeerd antilichaam; Baf = Bafilomycine A1; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase; PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluorofoor Detecteert Ex /Em (nm) Cytometerlaser (nm) Cytometer detector / bandpass filter (nm)
DDAOG SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
Af Lipofuscine < 600 488 525 / 50
Cv450 Levensvatbaarheid 408/450 405 450 / 50
PE Antilichaam/oppervlaktemarker 565/578 561 582 / 15

Tabel 1: Fluoroforen en cytometer optische specificaties. Cytometerspecificaties die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld voor een instrument met in totaal 4 lasers en 15 emissiedetectoren. DDAOG gedetecteerd bij 645/660 nm is de vorm van de sonde gesplitst door SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan een lage fluorescentie vertonen bij 460/610 nm, maar wordt verwijderd door wasstappen in het protocol. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; AF = autofluorescentie; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al het beschreven dierwerk werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Universiteit van Chicago.

1. Bereiding en opslag van voorraadoplossingen

OPMERKING: Als cellen stroomsorteerd worden, moeten alle oplossingen worden bereid met behulp van steriele technieken en gefilterd door een filterapparaat van 0,22 μm.

  1. Bereid een stamoplossing van DDAO-Galactoside op 5 mg/ml dmso. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C in het donker gedurende maximaal 1 jaar.
  2. Bereid een stamoplossing van Bafilomycine A1 op 1 mM in DMSO. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  3. Bereid een stamoplossing van Calcein Violet 450 AM op 1 mM in DMSO. Aliquot bij 50 μL per buis (of gewenst volume). Bewaren bij −20 °C in het donker gedurende maximaal 1 jaar.
  4. Bereid voor de behandeling van gekweekte cellen in vitro 10 mM geconcentreerde stamoplossingen van senescentie-inducerende stof(fen) in het juiste oplosmiddel en steriliseer met spuitfilters van 0,2 μm. Bewaren bij −20 °C of zoals voorgeschreven door de fabrikant.
    OPMERKING: Voor toediening van senescentie-inducerende chemotherapiemiddelen in vivo (aan muizen met gevestigde tumoren), moeten de middelen USP-kwaliteit zijn en worden verdund tot zoutoplossing uit geconcentreerde bouillon vlak voor injectie.
  5. Bereid een volledig kweekmedium voor op de cellijn(en) die worden gebruikt.
    OPMERKING: Bereid bijvoorbeeld medium voor B16-F10- of A549-cellen met DMEM 1x + 10% FBS + 1x glutaminevervanger + 1x penicilline / streptomycine. Media moeten steriel worden gehouden. Andere cellijnspecifieke mediaformuleringen kunnen worden gebruikt. Bepaalde componenten zoals glutathion kunnen in sommige gevallen interfereren met het begin van senescentie. Empirische tests van verschillende mediaformuleringen moeten worden uitgevoerd als het begin van senescentie lager is dan verwacht of niet wordt waargenomen met controlechemotherapiemiddelen.
  6. Maak vlekken en wasbuffers.
    1. Bereid 1% runderserumalbumine (BSA) in 1x PBS voor gebruik bij kleuringsprocedures. Los 2 g BSA op in 200 ml PBS en roer gedurende 10 minuten, of totdat het volledig is opgelost, bij kamertemperatuur.
    2. Bereid 0,5% BSA in 1x PBS als wasbuffer. Verdun 100 ml van de 1% BSA bereid in stap 1.6.1 in 100 ml 1x PBS voor 0,5% BSA.
    3. Bewaar buffers bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
  7. Bereid 4% paraformaldehyde in 1x PBS. Gebruik in de handel verkrijgbare, verzegelde paraformaldehyde ampullen (bijv. 16% v/v) voor gemak en stabiliteit: 2,5 ml van 16% PFA + 7,5 ml van 1x PBS (= 10 ml van 4% PFA). Pas het voorbereide volume aan, afhankelijk van het totale volume dat per experiment nodig is.
    OPMERKING: Bereid indien nodig alleen voor celfixatie voor; bereid elke keer vers.
  8. Bereid FACS-sorteerbuffer voor: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Steriel filter door een filtratieapparaat van 0,22 μm en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
    OPMERKING: Bereid indien nodig alleen voor FACS-sortering voor. Stromsorteerbufferformuleringen kunnen variëren tussen FACS-instrumenten. De bovenstaande formulering is compatibel met het instrument dat in deze studie wordt gebruikt (zie materiaaltabel). Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant.
  9. Bereid tumordissociatieoplossing: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640 media (zonder FBS of andere supplementen). Voorraadoplossingen zijn nuttig om Liberase TL (bereid en opgeslagen volgens de aanwijzingen van de fabrikant) en DNAse I (100 mg/ml in dubbel gedestilleerd water [ddH2O], bewaard bij −20 °C) bij de hand te houden.
    OPMERKING: Bereid u voor als u alleen tumoren gebruikt; bereid elke keer vers.

2. Inductie van senescentie door chemotherapiegeneesmiddelen in gekweekte kankercellen

OPMERKING: Alle celmanipulatiestappen in deze sectie moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van steriele praktijken. Deze sectie is geschreven voor adherente celtypen. Suspensiecellen kunnen worden gebruikt met de nodige wijzigingen zoals aangegeven.

  1. Kweek kankercellijn(en) volgens het standaardprotocol van de leverancier of het laboratorium dat de specifieke cellijn(en) heeft geleverd.
    OPMERKING: Cellen met een lage doorgang (p < 10) hebben over het algemeen de voorkeur omdat er lagere niveaus van replicatieve senescentie zijn, d.w.z. een lagere achtergrond, in onbehandelde celmonsters.
  2. Een dag voorafgaand aan senescentie-inductie door geneesmiddelen, oogst cellen met trypsine-EDTA 0,25% (of zoals aanbevolen). Neutraliseer trypsine door een gelijk volume compleet kweekmedium toe te voegen en breng de celsuspensie over naar een steriele conische buis.
    OPMERKING: Deze stap is niet nodig voor suspensiecellen.
  3. Tel de cellen met behulp van de standaard hemacytometermethode en registreer cellen / ml. Plaatcellen op 1 × 10 3-10 × 103 cellen/cm2 in standaard 6-well plastic kweekschalen.
    OPMERKING: Optimale platingdichtheid is afhankelijk van de proliferatiesnelheid van cellen en moet door de gebruiker worden bepaald. Cellen moeten zich in logfasegroei bevinden met ongeveer 10% -20% confluency op het moment van de behandeling (d.w.z. na 18-24 uur incubatie na plating). De startdichtheid (cellen/ml) van suspensiecellen moet door de gebruiker worden bepaald. Zesputtenplaten leveren doorgaans voldoende senescente cellen per put op voor één standaard flowcytometrie-analysemonster. Bij stroomsortering moet een veel groter oppervlak (bv. meerdere P150-platen) worden gebruikt om het herstel van voldoende aantallen senescente cellen voor downstream-assays mogelijk te maken (≥1 × 106).
  4. Incubeer vergulde cellen 's nachts (18-24 uur) in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en een vochtigheidspan.
  5. Behandel de vergulde cellen met senescentie-inducerende chemotherapiegeneesmiddel(en). Neem ten minste één positieve controle op, bijvoorbeeld etoposide (ETO) of bleomycine (BLM). Bereid dubbele putten per medicijn voor. Voeg één set toe die is behandeld met alleen het voertuig als besturing.
    OPMERKING: Een dosiscurve voor elk experimenteel middel moet door de gebruiker worden getest om de optimale concentratie voor senescentie-inductie in de gebruikte cellijn(en) te bepalen.
  6. Incubeer cellen gedurende 4 dagen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en een vochtigheidspan om het begin van senescentie mogelijk te maken. Onderzoek dagelijks op verwachte morfologische veranderingen met behulp van een lichtmicroscoop.
    OPMERKING: Incubatietijden van 3-5 dagen kunnen acceptabel zijn, afhankelijk van de snelheid waarmee senescentie begint. Media kunnen worden veranderd en het middel kan opnieuw worden aangebracht (of niet), naar wens, om gezonde groeiomstandigheden te bevorderen en tegelijkertijd een aanvaardbaar percentage senescente cellen te bereiken.
  7. Na het begin van de senescentie, oogst de cellen door trypsine-EDTA 0,25% toe te voegen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Wanneer cellen worden gedissocieerd in suspensie, neutraliseer trypsine met een gelijk volume van het volledige medium.
    OPMERKING: Deze stap is niet nodig voor cellen die in suspensie groeien. Als oppervlaktemarkerkleuring wordt uitgevoerd, vermijd dan het gebruik van trypsine-EDTA, omdat dit tijdelijk oppervlakteantigenen op cellen kan vernietigen. Dissociëer in plaats daarvan de monolaag voorzichtig met behulp van een steriele plastic celschraper (of een alternatief dissociatiereagens dat is ontworpen om oppervlakteantigenen te behouden).
  8. Tel de cellen in elk monster met behulp van een hemacytometer. Bereken de cellen/ml voor elk monster.
    OPMERKING: Trypan blue kan worden toegevoegd om het percentage dode cellen op dit punt te evalueren (d.w.z. als gevolg van medicamenteuze behandeling), maar celdood zal ook worden bepaald met een fluorescerende levensvatbaarheidskleurstof tijdens DDAOG-kleuringsworkflow.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 cellen per monster in microcentrifugebuizen van 1,7 ml.
    OPMERKING: Het aantal cellen per monster moet worden gestandaardiseerd voor alle monsters.
  10. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g in een microcentrifuge bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
    OPMERKING: Als een gekoelde microcentrifuge niet beschikbaar is, kan het acceptabel zijn om centrifugeeringen uit te voeren bij omgevingstemperatuur voor bepaalde veerkrachtige celtypen.
  11. Ga verder met DDAOG-kleuring in sectie 4.

3. Inductie van senescentie door chemotherapiegeneesmiddelen bij tumoren bij muizen

OPMERKING: Als tumorcellen FACS-gesorteerd zullen zijn, zorg dan voor steriliteit bij elke stap door in een bioveiligheidskast te werken en te werken met steriele instrumenten, procedures en reagentia.

  1. Maak muistumormodellen door kankercellen subcutaan te injecteren, volgens standaardmethoden (bijv. Appelbe et al.19).
    OPMERKING: Het aantal kankercellen dat moet worden geïnjecteerd, de injectieplaats en de juiste muizenstam moeten voor elk protocol worden geoptimaliseerd. Hier werden B16-F10-cellen subcutaan geïnjecteerd op 1 × 106 cellen in 0,1 ml zoutoplossing (1 × 107 cellen / ml).
    1. Controleer of de levensvatbaarheid van cellen die trypan blue gebruiken >90% is voordat injecties worden uitgevoerd. Verdoof de muizen met isofluraan.
    2. Verdoof 6-7 weken oude vrouwelijke C57/BL6 muizen met een mix van 3% isofluraan en lucht en onderhoud onder deze omstandigheden in een inductiekamer in een steriele bioveiligheidskast. Bevestig de anesthesie door zachtjes in de voet van de muis te knijpen. Breng steriele veterinaire zalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen. Houd tijdens de procedure de lichaamstemperatuur van de muis op peil met behulp van een verwarmingslamp.
    3. Werk in een steriele bioveiligheidskast en verwijder de muis uit de inductiekamer en plaats hem in contact met een neuskegel die een isofluraantoevoer van 3% biedt. Scheer het flankgebied op de injectieplaats met een schoon elektrisch scheermes. Meng de bereide celsuspensie kort door de buis vlak voor de injectie handmatig om te keren en injecteer de celsuspensie subcutaan in de geschoren flank(en) met behulp van een steriele spuit van 0,5 ml met een steriele naald van 27 G. Haal de muis van de kap en breng deze over naar de herstelkooi.
    4. Controleer in de herstelkooi continu de vitale functies van de muizen totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om sternale lighouding te behouden, de rechtzettingsreflex te demonstreren en veilig in de kooi te kunnen bewegen. Laat muizen niet onbeheerd achter en breng geen dieren terug die tumorcelinenting hebben ondergaan naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig zijn hersteld. Controleer alle geënte muizen dagelijks op gewichtsverlies, verminderde activiteit / mobiliteit en neurologische symptomen; euthanaseer muizen die ernstige symptomen vertonen in elke categorie. Voor muizen die pijnsymptomen vertonen na inenting, dient u buprenorfine (0,1-0,2 mg /kg) eenmaal subcutaan toe.
      OPMERKING: Muizen die aanhoudende pijn vertonen na buprenorfine moeten worden geëuthanaseerd.
  2. Begin 5-7 dagen na de inenting van kankercellen en meet de tumorgroei met remklauwen om de 2-3 dagen. Start een prosenescente behandeling wanneer de tumor 50 mm3 ± 10 mm3 in volume heeft bereikt.
    OPMERKING: In dit werk werden doses USP-kwaliteit doxorubicinehydrochloride (DOX) of PEGylated liposomale doxorubicine (PLD) van 10 mg / kg toegediend in 0,9% natriumchloride-injectie (USP). Geneesmiddelen werden intraperitoneaal 3x geïnjecteerd, eenmaal per 5 dagen, beginnend wanneer tumoren 50 mm3 ± 10 mm3 bereikten. Muizen herstelden gedurende 7 dagen na de laatste behandeling om het begin van TIS in tumoren mogelijk te maken. Senescentie-inductiedoseringen en voorwaarden voor andere behandelingen en / of tumormodellen moeten worden geoptimaliseerd.
  3. Na 7 dagen na de laatste medicamenteuze behandeling offeren de muizen op door een overdosis CO2 en cervicale dislocatie of andere goedgekeurde methoden in overeenstemming met de richtlijnen voor het werk van proefdieren. Snijd de tumoren weg en verzamel ze in steriele buizen of 6-well platen gevuld met steriel RPMI-groeimedium (om de levensvatbaarheid tijdens de verwerking te behouden).
    OPMERKING: Bij het uitvoeren van een histologisch onderzoek (bijv. X-Gal of immunohistochemie), kunnen tumoren hier worden doorsneden, waarbij een halve snap-frozen in O.C.T. insluitmedium en gecryopiceerd met behulp van standaardprocedures voor bevroren weefselhistologie. De resterende tumorhelft moet overvloedig materiaal opleveren voor dissociatie en DDAOG-kleuring.
  4. Breng één tumor over naar een P100 plastic schaal met 5 ml RPMI-medium. Gehakt de tumor in stukjes met behulp van een scalpel.
  5. Breng 5 ml van de suspensie van tumorstukken met gesuspendeerde cellen en puin over in een conische buis van 15 ml. Gebruik de bredere punt van een serologische pipet van 25 ml voor het overbrengen van deze suspensie als er veel vuil aanwezig is. Spoel de schaal af met een extra volume steriel RPMI om materialen te verzamelen. Sluit af en plaats de conische buis op ijs.
  6. Herhaal stap 3.45-3.5 voor de resterende tumoren. Gebruik een aparte plaat en scalpel voor elke tumor om kruisbesmetting te voorkomen, of spoel goed met PBS tussen tumoren. Gebruik 5 ml vers medium voor het fijnhakken van elke tumor.
  7. Bereid de tumordissociatieoplossing: 20 μg/ml Liberase TL + 100 μg/ml DNAse I in RPMI-1640 media (zonder FBS).
    OPMERKING: Er bestaan veel effectieve formuleringen voor tumordissociatieoplossingen en kunnen een verscheidenheid aan enzymen en andere componenten van verschillende fabrikanten bevatten. Optimale concentraties van componenten kunnen sterk variëren tussen tumortypen. Als rode bloedcellen sterk aanwezig zijn in de tumor, kan rode bloedcellysis aanvullend worden uitgevoerd; als dode cellen een probleem zijn, kan een dode celverwijderingskit worden gebruikt. Het wordt ten zeerste aanbevolen voor de gebruiker om onafhankelijk optimale tumordissociatiecondities te bepalen die een hoge levensvatbaarheid en lage aanwezigheid van verontreinigende cellen, bindmateriaal en puin bieden.
  8. Centrifugeer alle tumormonsters in conische buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g (4 °C). Verwijder het supernatant.
  9. Voeg 1-5 ml tumordissociatieoplossing toe aan elk tumormonster, afhankelijk van het volume tumormateriaal. Zorg ervoor dat er 1-2 ml meer is dan de tumormateriaalkorrel in de buis. Vortex met een gematigde snelheid om te mengen.
  10. Plaats de monsters in een incubator van 37 °C met snelle rotatie gedurende 45 minuten. Vortex kort om de 15 min.
  11. Filtreer elk monster door een celzeef van 100 μm in een conische buis van 50 ml. Als de monsters te stroperig zijn om door het filter te gaan, voeg dan 10 ml RPMI-1640 medium toe om te verdunnen. Spoel de filters af met RPMI-medium om de restcellen op te vangen.
  12. Gebruik een hemacytometer om de cellen/ml voor elk monster te tellen.
  13. Aliquot twee of meer replicaties van 5 × 106 cellen per tumormonster.
  14. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1.000 × g (4 °C). Verwijder het supernatant.
  15. (Optioneel) Cryopreserveer de tumormonsters voor latere DDAOG-kleuring indien gewenst.
    1. Resuspensie van de gedissocieerde tumorcelpellet in cryopreservatiemedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, bereid onder steriele omstandigheden bij 5 × 106 cellen / ml.
    2. Aliquot 1 ml celsuspensie in elk cryoviaal.
    3. Vries de cryovialen gedurende 24 uur in een isopropanolcelbevriezingscontainer bij −80 °C; breng vervolgens over naar cryoopslag van vloeibare stikstof voor opslag op langere termijn (>1 week).
    4. Wanneer kleuring gewenst is, ontdooit u de cryovialen op ijs en gaat u over tot DDAOG-kleuring in sectie 4.
      OPMERKING: Sommige tumoren blijven mogelijk niet levensvatbaar door cryopreservatie en de veerkracht tegen dit proces moet door de gebruiker worden geëvalueerd voor het tumormodel van belang.
  16. Ga verder met sectie 4 voor DDAOG-kleuring.

4. DDAOG-kleuring van SA-β-Gal in cel- of tumormonsters

  1. Verdun 1 mM Bafilomycine A1-bouillon op 1:1.000x in DMEM-medium (zonder FBS) voor een eindconcentratie van 1 μM.
  2. Voeg bereide Baf-DMEM-oplossing toe aan de celpelletmonsters (uit stap 2.11 of stap 3.16) voor een concentratie van 1 × 106 cellen/ml.
    OPMERKING: Als u bijvoorbeeld 0,5 × 106 cellen per monster gebruikt, voegt u 0,5 ml Baf-DMEM toe. Voor tumoren kunnen 5 × 106 cellen worden gekleurd in 5 ml Baf-DMEM.
  3. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C (zonder CO2) op een rotator/shaker die met een lage snelheid is ingesteld.
    OPMERKING: Vermijd CO2-incubatoren voor het kleuringsproces, die oplossingen kunnen verzuren en daardoor Baf- en DDAOG-kleuring kunnen verstoren.
  4. Voeg zonder wassen de DDAOG-stamoplossing (5 mg/ml) van 1:500x (10 μg/ml final) toe aan elk monster. Pipet om te mengen. Vervang op een rotator/shaker bij 37 °C (zonder CO2) gedurende 60 min. Bescherm tegen direct licht.
  5. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
  6. Was met 1 ml ijskoude 0,5% BSA per tube en pipet om te mengen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2x om de cellen grondig te wassen. Verwijder het supernatant en ga verder.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de wasstappen in stap 4.6 uit te voeren om ongespoelde DDAOG te verwijderen, die ongewenste fluorescentie-emissie (460/610 nm) kan vertonen.
    OPMERKING: Als immunostaining voor celoppervlakmarkers is, ga dan verder met rubriek 5 hieronder.
  7. (Optioneel) Fixatie en opslag van DDAOG-gekleurde cellen voor latere analyse
    1. Voeg 0,5 ml ijskoude 4% paraformaldehyde druppelsgewijs toe aan elk gewassen monster. Pipet om te mengen.
    2. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Was de cellen 2x met 1 ml PBS.
    4. Bewaar de monsters gedurende maximaal 1 week bij 4 °C voorafgaand aan de flowcytometrieanalyse.
      OPMERKING: Voor vaste monsters slaat u stap 4.8 over.
  8. Verdun Calcein Violet 450 AM stock (1 mM) op 1:1.000x tot 1% BSA-PBS (1 μM final). Voeg 300 μL (voor gekweekte celmonsters) of 1.000 μL (voor tumormonsters) toe aan de gewassen celpellets uit stap 4.6. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker.
  9. Ga verder met het instellen van flowcytometrie (sectie 6).

5. (Optioneel) Immunostaining voor celoppervlakmarkers in combinatie met DDAOG

OPMERKING: Zoals bij elk flowcytometrie-experiment, moeten enkelgekleurde controlemonsters met alleen DDAOG en alleen fluorescerend antilichaam worden voorbereid om kruisverwijzing (indien aanwezig) over fluorescentiekanalen te bepalen. Als overspraak wordt waargenomen, moet standaard flowcytometriecompensatie worden uitgevoerd20.

  1. Resuspendatie van de celpellets verkregen in stap 4.6 in 100 μL kleuringsbuffer (1% BSA in 1x PBS).
  2. Voeg het fc-receptorblokkerende reagens toe dat geschikt is voor de celsoort (muis of mens) bij de door de fabrikant aanbevolen titratie. Incubeer gedurende 10 min bij 24 °C.
  3. Voeg fluorofoor-geconjugeerde antilichamen toe bij de titratie die door de fabrikant wordt aanbevolen (of door de gebruiker wordt bepaald). Incubeer gedurende 20 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
  4. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant.
  5. Was met 1 ml ijskoude wasbuffer (0,5% BSA-PBS) per tube en pipet om te mengen. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze stap 2x om de cellen grondig te wassen.
  6. Verdun 1 mM Calcein Violet 450 AM op 1:1.000x in 1% BSA-PBS. Voeg 300 μL toe aan de gewassen celpellets uit stap 5.5. Incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker.
  7. Ga verder met de flowcytometrieanalyse (rubrieken 6-7).

6. Flowcytometer instellen en data-acquisitie

  1. Breng de celmonsters over naar buizen die compatibel zijn met het flowcytometrie-instrument. Plaats de buizen op ijs en houd ze beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Als aggregaten worden waargenomen in de celsuspensies, passeer de suspensie dan door 70-100 μm celstammen voorafgaand aan de analyse. Gebruik geen 40 μm strainers omdat deze enkele van de grotere senescente cellen kunnen uitsluiten.
  2. Open in de software waarnaar verwezen wordt (zie de tabel met materialen) de volgende plots: 1) FSC-A vs SSC-A dot plot, 2) violet kanaal histogram, 3) verrood kanaal (bijv. APC-A) versus groen kanaal (bijv. FITC-A) dot plot.
    OPMERKING: Doublet-uitsluitingsplots en enkelkanaals histogrammen kunnen ook worden gebruikt, maar zijn niet strikt vereist.
  3. Start cytometer data acquisitie.
    1. Plaats het met DDAOG gekleurde controlemonster voor alleen het voertuig op de inlaatpoort. Begin bij een lage innamesnelheid met het verkrijgen van monstergegevens.
    2. Pas FSC- en SSC-spanningen aan zodat >90% van de gebeurtenissen zich in het perceel bevinden. Als cellen niet goed op de plot passen, verlaagt u de instelling voor het schalen van het gebied naar 0,33-0,5 eenheden.
    3. Verwijder het monster dat alleen voor voertuigen beschikbaar is zonder gegevens op te nemen.
    4. (Optioneel) Voeg een druppel regenboogkalibratiemicrosferen toe aan een cytometerbuis met 1 ml PBS. Plaats de buis op de inlaatpoort van de cytometer. Begin met het verzamelen van voorbeeldgegevens.
    5. Pas violette, groene en verrode kanaalspanningen aan zodat de bovenste piek van de regenboogmicrosfeer in het bereik van 10 4-10 5 eenheden relatieve fluorescentie in elk kanaal ligt en alle pieken in elk kanaal goed gescheiden zijn. Record 10.000 evenementen. Verwijder de buis.
  4. Plaats het positieve controlemonster (bijv. BLM, ETO) gekleurd met DDAOG op de inlaatpoort. Verzamel met een lage snelheid voorbeeldgegevens. Observeer de gebeurtenissen in FSC-, SSC-, violette, groene en verrode kanalen om ervoor te zorgen dat meer dan 90% van de gebeurtenissen zich in alle percelen bevindt. Zoek naar een toename van AF- en DDAOG-signaal versus alleen-voertuigbesturing.
  5. Als u een sorteercytometer gebruikt, begint u met sorteren bij deze stap.
    1. Registreer voor archiveringsdoeleinden 10.000 cellen voor het controlemonster en elk gesorteerd monster.
    2. Sorteer de gewenste hoeveelheid cellen (≥1 × 106 is meestal geschikt) in een instrument-geschikte verzamelbuis met 3-5 ml kweekmedium.
    3. Ga na het sorteren verder met downstream cultuur of analyse.
    4. Ga naar sectie 7 voor de routineanalyse van gesorteerde monsters.
  6. Als u fluorescerende antilichamen gebruikt, optimaliseer dan hier de kanaalspanningen met behulp van de niet-gekleurde, enkelgekleurde en dubbelgekleurde monsters die in rubriek 5 zijn voorbereid.
    OPMERKING: Voor de gekalibreerde flowcytometer die hierin wordt gebruikt, daalden de optimale kanaalspanningen meestal tussen 250 en 600 (middenbereik), maar de optimale spanningen en kanaalspanningsbereiken zullen variëren tussen instrumenten. Vermijd het gebruik van spanningen op zeer lage of hoge bereiken, die het signaal kunnen onderdrukken of ruis kunnen versterken.
  7. Nadat u stap 6.1-6.5 hebt voltooid en indien nodig de cytometerinstellingen hebt aangepast, registreert u gegevens voor alle monsters. Zorg ervoor dat de instellingen uniform blijven voor alle voorbeeldopnamen. Registreer ≥10.000 gebeurtenissen per gekweekt celmonster of ≥100.000 gebeurtenissen per tumorcelmonster.
    OPMERKING: Hoewel gating en analyse kunnen worden uitgevoerd met behulp van data-acquisitiesoftware (bijv. FACSDiva), wordt een volledige gating- en analyseworkflow die na acquisitie moet worden uitgevoerd met behulp van afzonderlijke analysesoftware (FlowJo) beschreven in sectie 7 hieronder. Post-acquisitie analyse heeft de voorkeur om de tijd op het cytometerwerkstation te verkorten en te profiteren van extra tools die zijn opgenomen in de speciale analysesoftware.
  8. Sla voorbeeldgegevens op in FCS-bestandsindeling. Exporteer de bestanden naar een werkstationcomputer die is uitgerust met flowcytometrie-analysesoftware (bijv. FlowJo). Ga verder met sectie 7.

7. Flowcytometrie data-analyse

OPMERKING: De gepresenteerde workflow maakt gebruik van FlowJo-software. Alternatieve flowcytometriegegevensanalysesoftware kan worden gebruikt als de belangrijkste stappen die in deze sectie worden beschreven, op dezelfde manier worden gevolgd.

  1. Gebruik de FlowJo-software om .fcs-gegevensbestanden te openen vanaf stap 6.7.
  2. Open het lay-outvenster.
  3. Sleep alle voorbeelden naar het lay-outvenster.
  4. Poort levensvatbare cellen.
    1. Dubbelklik eerst op de voorbeeldgegevens voor het besturingselement alleen voor voertuigen om het gegevensvenster te openen.
    2. Visualiseer de gegevens als een violet kanaal histogram. Identificeer de levensvatbare cellen gekleurd door CV450 op basis van hun helderdere fluorescentie dan de dode cellen.
    3. Teken een poort met het histogramgereedschap met één poort om alleen levensvatbare cellen op te nemen. Noem de poort levensvatbaar.
    4. Sleep vervolgens vanuit het voorbeeldindelingsvenster de levensvatbare poort naar de andere celmonsters om de poort uniform toe te passen.
    5. Visualiseer in het lay-outvenster alle voorbeelden als violette kanaal (levensvatbaarheid) histogrammen. Controleer of levensvatbare celgatering geschikt is voor monsters voordat u verdergaat; zo niet, breng dan indien nodig aanpassingen aan.
      OPMERKING: Levensvatbaarheidskleuring kan variaties vertonen tussen behandelingen of tumoren.
  5. Poort senescente cellen.
    1. Dubbelklik op de gated viable cell data voor de vehicle-only control om het datavenster te openen.
    2. Visualiseer de gegevens als een dot plot voor far-red channel (DDAOG) versus green channel (AF).
    3. Teken een poort met het gereedschap rechthoekige gating om <5% cellen op te nemen die DDAOG+ en AF+ (kwadrant rechtsboven) zijn. Noem de poort senescent.
    4. Sleep vervolgens vanuit het voorbeeldindelingsvenster de senescente poort naar de levensvatbare subsets van de andere celmonsters om de poort uniform toe te passen.
    5. Sleep in het lay-outvenster alle levensvatbare celsubsets die zijn afgeschermd in sectie 7.4. Visualiseer alle levensvatbare monsters als ver-rood (bijv. APC-A) versus groene kanaal (bijv. FITC-A) dot plots.
    6. Zorg ervoor dat de in stap 7.5.3 getekende senescente poort zichtbaar is op alle percelen en dat de poort voor de besturing alleen voor voertuigen ≤5% -10% senescente cellen vertoont.
  6. Zodra het percentage senescente cellen is bepaald met behulp van de bovenstaande stappen, presenteert u de resulterende gegevens met behulp van de FlowJo-plots, samengevat in een gegevenstabel en / of statistisch geanalyseerd met behulp van standaardsoftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Verschillende experimenten werden uitgevoerd om de vergelijkbaarheid van DDAOG met X-Gal en C12-FDG aan te tonen voor de detectie van senescentie door SA-β-Gal. Eerst werd X-Gal gebruikt om senescente B16-F10 melanoomcellen geïnduceerd door ETO te kleuren (figuur 2A). Een intense blauwe kleur ontwikkelde zich in een subset van met ETO behandelde cellen, terwijl andere cellen minder intense blauwe kleuring vertoonden. Morfologie werd vergroot in de meeste met ETO behandelde cellen. Kleuring van ETO-behandelde cellen met fluorescerend SA-β-Gal substraat C 12-FDG (groen) of DDAOG (verrood) vertoonde vergelijkbare kleuringspatronen en intensiteitsvariaties als X-Gal (figuur 2B). Groene C 12-FDG-emissie overlapte echter met cellulaire AF (figuur 2C), waarvan bekend is dat het zich ophoopt in senescente cellen17. Af daarentegen was verwaarloosbaar in het verrode emissiebereik van DDAOG.

In plaats van een fluorescentiemicroscoop te gebruiken om senescente cellen te scoren en te tellen, was het handiger om te profiteren van de high-throughput mogelijkheden van een flowcytometer om gegevens te verkrijgen voor duizenden cellen per monster in een korte tijd (<5 min per monster). Eerst werd een reeks standaard flowcytometrie-instellingsparameters geïmplementeerd om optimale gegevensverzameling te garanderen (figuur 3). Volgens een typische benadering werden lichtverstrooiingsparameters ingesteld om het volume (voorwaartse verstrooiing, FSC) en granulariteit (zijdelingse verstrooiing, SSC) van cellen (figuur 3A) te visualiseren. Hier merkten we de trend op van een verhoogd volume van met ETO behandelde cellen, die overeenkwamen met de vergrote morfologie die typisch wordt waargenomen voor senescente cellen met behulp van microscopie. Een verlaging van de standaardinstellingen voor gebiedsschaal (tot 0,33-0,50 eenheden, afhankelijk van het celtype en de behandeling) was nodig om meer van de grotere cellen op de plot te visualiseren. Voor sommige cellijnen/behandelingen was verhoogde granulariteit (SSC) ook duidelijk (gegevens niet getoond). Over het algemeen werd scatterevaluatie gebruikt als een kwaliteitscontrolestap om te verifiëren dat celverstrooiingsgegevens er zoals verwacht uitzagen, dat er geen overmatig celafval aanwezig was en cellen door de cytometer werden verwerkt met de juiste stroomsnelheden (~ 100-1000 cellen / s). Als een kwaliteitscontrolestap die alleen wordt gebruikt voor het instellen van instrumenten, is hier geen gating of analyse uitgevoerd.

Een tweede (optionele) stap in de flowcytometrie-opstelling was om kort een monster van in de handel verkrijgbare "regenboog" kalibratiedeeltjes te analyseren om ervoor te zorgen dat de fluorescerende detectiespanningen in acceptabele bereiken werden ingesteld (figuur 3B). De helderste piek werd ingesteld tussen 1 × 104 eenheden en 1 × 105 eenheden relatieve fluorescerende intensiteit in elk kanaal, met duidelijk gedefinieerde pieken met een lagere intensiteit, voldoende scheiding tussen elke piek en geen overlapping van naburige pieken. Een controlemonster van 10.000 microsferen werd geregistreerd met behulp van deze spanningsinstellingen. De microsferen werden vervolgens op deze manier gebruikt in elke cytometriesessie om de uniformiteit van gegevensverzameling in de loop van het protocol te verbeteren.

Vervolgens werden monsters van alleen-voertuig- of ETO-behandelde cellen gevisualiseerd in elk fluorescerend kanaal en werden poorten ingesteld. De levensvatbaarheidspoorten van de cel werden ingesteld op basis van het signaal van cv450-levensvatbaarheidsvlek in het violette kanaal (figuur 3C). Alleen voor voertuigen behandelde cellen vertoonden 88% levensvatbaarheid en met ETO behandelde cellen vertoonden 75% levensvatbaarheid (in het uiteindelijke celmonster; extra dode cellen werden waarschijnlijk aanvankelijk verwijderd in afgedankte kweekmedia en mechanisch gedesintegreerd tijdens het kleuringsproces). Vervolgens werden levensvatbare gated cellen gevisualiseerd in de groene (figuur 3D) en verrode (figuur 3E) emissiekanalen. Poorten voor groene AFHI en verrode DDAOGHI werden ingesteld op <5% van de cellen met alleen voertuigen, en deze poorten werden vervolgens toegepast op ETO-behandelde cellen. Met behulp van deze aanpak werd vastgesteld dat 46% van de met ETO behandelde cellen AFHI waren en 33% DDAOGHI; deze waarden lagen in het verwachte bereik op basis van literatuur en resultaten van talrijke replicatie-experimenten in ons laboratorium. Zodra de cytometer was ingesteld, werden alle celmonsters in het experiment uitgevoerd met identieke gegevensverzamelingsinstellingen. Gegevens voor 10.000 gebeurtenissen per steekproef werden verkregen.

Representatieve testgegevens zijn weergegeven in figuur 4. B16-F10 muizenmelanoomcellen of A549 menselijke longadenocarcinoomcellen werden gebruikt als de kankercellijnmodellen. Elke cellijn werd behandeld met een chemotherapiemiddel waarvan bekend is dat het senescentie (ETO of BLM) induceert gedurende 4 dagen om senescentie of alleen voor voertuigen te induceren. Verder werd het bekende senolytische middel ABT-26321 gedurende 2 dagen toegevoegd aan geïnduceerde senescente cellen om de specificiteit van de DDAOG-sonde aan te tonen. ABT-263 alleen monsters werden bereid als extra controles. Hier worden gegevens gevisualiseerd als 2D dot plots met DDAOG (670 nm emissie) versus AF (525 nm). De workflow van figuur 3 werd gebruikt voor het instellen van cytometers en een TIS-poort werd zo ingesteld dat <5% van de cellen met alleen voertuigen scoorde als TIS. Resultaten met B16-F10-cellen (figuur 4A) toonden aan dat ETO TIS induceerde in 35% van de levensvatbare B16-F10-cellen (vergelijkbaar met de vergelijkbare gegevens in figuur 2D, E) en het senolytische middel elimineerde bijna volledig TIS-cellen (<2%). In A549-cellen (figuur 4B) induceerde BLM TIS in 66% van de levensvatbare cellen en ABT-263 verlaagde het percentage tot 15%. ABT-263 alleen was niet giftig voor onbehandelde, prolifererende cellen.

We wilden verder aantonen dat fluorescerende antilichaam co-kleuring compatibel was met de DDAOG-senescentietest om de screening van TIS-geassocieerde of nieuwe oppervlaktemarkers te vergemakkelijken. Hier werden B16-F10 muis melanoomcellen opnieuw behandeld met TIS-inducerende ETO (of voertuig) gedurende 4 dagen. Vervolgens werden cellen zowel gekleurd met DDAOG om TIS te evalueren als met een fluorescerend antilichaam om de TIS-geassocieerde oppervlaktemarker DPP422 te detecteren (figuur 5). Anti-DPP4 geconjugeerd aan R-phycoerythrin (PE) werd gebruikt en we bevestigden een verwaarloosbare overlap van PE met DDAOG en AF op de gebruikte flowcytometer (aanvullende figuur S2). Een histogram van PE-kanaalgegevens (figuur 5A) voor >5.000 levensvatbare cellen toonde aan dat 42% van de met ETO behandelde cellen DPP4+ waren (met behulp van het voertuig-only monster om de positiviteitspoort in te stellen). Het visualiseren van 2D-dot plots voor dezelfde monsters (figuur 5B, C) gaf aan dat 44% van de met ETO behandelde cellen dubbelpositief waren voor DDAOG (d.w.z. senescent) en DPP4 versus 4% van de cellen met alleen voertuigen. Deze gegevens tonen aan dat live-cell kleuring met oppervlaktemarkerantistoffen mogelijk is in combinatie met de DDAOG-senescentietest.

Mogelijke problemen met een levende celkleuringsmethode zijn celdood die optreedt tijdens langdurige analysesessies (>1 uur) en hoe monsters het meest efficiënt kunnen worden gekleurd en geanalyseerd op veel verschillende tijdstippen (tot dagen uit elkaar). Solventgebaseerde fixatie van gekleurde cellen pakt beide problemen aan, omdat monsters kunnen worden opgelost zodra ze zijn gekleurd en vervolgens in de koelkast kunnen worden bewaard tot analyse in één temperatuurstabiele batch. Daarom hebben we getest of levende cellen gekleurd met DDAOG konden worden gefixeerd met 100% methanol of 4% paraformaldehyde (PFA) en maximaal 1 week bij 4 °C konden worden bewaard. Ongewenst verminderde methanolfixatie het DDAOG-signaal en verminderde de AF aanzienlijk (gegevens niet getoond); daarom moet het gebruik van methanol als fixatieoplosmiddel worden vermeden. Fixatie met PFA was echter veel succesvoller, zoals te zien is in figuur 6 voor cellen die gedurende 10 minuten na kleuring met DDAOG in 4% PFA waren gefixeerd. Vergeleken met niet-gefixeerde controlemonsters (figuur 6A; onbehandeld, 5% en BLM, 67% DDAOGHI AFHI), vertoonden vaste monsters (figuur 6B) een iets hogere achtergrond in onbehandelde cellen (9%) en ook een hoger percentage cellen dat als senescent scoorde in met BLM behandelde cellen (80%). Dit effect werd ook waargenomen in vaste monsters die 's nachts werden opgeslagen (figuur 6C; onbehandeld, 12% en BLM, 72%) en gedurende 1 week bewaard bij 4 °C (figuur 6D; 14% en 70%). Ondanks de lichte toename van fluorescentie veroorzaakt door PFA-fixatie, was de inductie van senescentie door BLM nog steeds duidelijk in alle vaste monsters versus het gematchte onbehandelde monster. Verder bleven cellen intact in opslag met slechts een lichte verslechtering op dag 7, en er werd geen problematische aggregatie waargenomen. We concluderen dat het gemak van het kunnen fixeren en opslaan van celmonsters voor latere batchanalyse het tolereren van de iets hogere achtergrond veroorzaakt door PFA-fixatie zal rechtvaardigen, vooral in experimenten met veel monsters of tijdspunten.

Een veel voorkomende uitdaging in celgebaseerd senescentieonderzoek is het heterogene begin van senescentie in celpopulaties. Hier laten we zien dat DDAOG kan worden gebruikt voor FACS van levensvatbare senescente cellen en dat verzamelde cellen overleven in cultuur voor downstream in vitro assays (figuur 7). Om cellen op FACS te sorteren, worden cellen behandeld en gekleurd, zoals beschreven, en gesorteerd door een FACS-compatibele flowcytometer met behulp van de DDAOG versus AF gating-strategie die hier wordt weergegeven (figuur 7A). Aangezien hier geen levensvatbaarheidsonde wordt gebruikt vanwege toxiciteitsproblemen op lange termijn, raden we aan om strikte verstrooiingsgating uit te voeren voorafgaand aan de laatste senescente celgating (aanvullende figuur S3) om vals-positief puin uit de verzamelde cellen te verwijderen. Dit zijn standaard FACS gating procedures die bekend moeten zijn bij een matig ervaren gebruiker en snel kunnen worden vastgesteld met behulp van software op het instrument (<10 min).

Na het sorteren van een monster van BLM-behandelde A549-cellen, hebben we de cellen teruggebracht naar kweek in standaard multiwell-schotels gedurende 5 dagen (n = 6 replicaties) op 10 × 103 cellen / cm2. Ongesorteerde controles werden met dezelfde dichtheid verguld, naast elkaar gegroeid en onbehandelde en met BLM behandelde cellen werden opgenomen. Cellen werden dagelijks geobserveerd; voor gesorteerde cellen werd geen significante celdood of terugkeer naar proliferatie waargenomen. Gesorteerde cellen bleven schaars (d.w.z. niet prolifererend) in de loop van 5 dagen in cultuur, terwijl onbehandelde en met BLM behandelde cellen confluent werden zoals getoond. Op dag 5 werden cellen gefixeerd in PFA en gekleurd voor morfologie en proliferatiemarkers (figuur 7B). De karakteristieke vergrote morfologie van gesorteerde cellen werd onthuld door fluorescerende falloïdinekleuring van filamenteus actine, met DAPI-kleuring om vergrote kernen te laten zien. Gesorteerde cellen waren zeer groot in diameter (>10 μm) met een karakteristiek afgerond uiterlijk. Zoals verwacht onthulde Ki67-antilichaamkleuring een volledig verlies van de proliferatiemarker in het gesorteerde monster versus een gedeeltelijk verlies in het ongesorteerde BLM-behandelde monster, en normale niveaus van Ki67 werden gezien in veel cellen in het onbehandelde ongesorteerde monster. Ten minste drie beelden werden per put gemaakt met behulp van uniforme beeldinstellingen over monsters. Representatieve beelden worden getoond (figuur 7B).

Ten slotte beoordeelden we of senescente cellen die ontstaan in tumoren die zijn vastgesteld bij muizen die zijn behandeld met chemotherapeutische geneesmiddelen, kunnen worden geïdentificeerd met behulp van DDAOG. B16-F10 melanoomtumoren werden geïnduceerd in de flank van C57/BL6-muizen, die vervolgens drie keer (i.p., elke 5 dagen) werden behandeld met alleen zoutoplossing (figuur 8A), DOX (figuur 8B) of PLD (figuur 8C). Na de derde behandeling herstelden de muizen gedurende 7 dagen om het begin van senescentie mogelijk te maken en werden vervolgens geofferd en tumoren weggesneden. Tumoren werden gehalveerd, waarbij de helft werd gebruikt om bevroren weefselglaasjes voor X-Gal-kleuring voor te bereiden (figuur 8) en de helft werd gedissocieerd in eencellige suspensies en gekleurd met DDAOG (figuur 8 en aanvullende figuur S4). X-Gal-kleuring in weefsels was vrij zwak ondanks een lange kleuringsduur (72 h), maar blauwe kleuring was duidelijk in DOX- en PLD-tumoren bij nadere inspectie, met name in tumoren die ook positief scoorden voor senescentie door DDAOG-flowtest (figuur 8B, C). Per weefseldia zijn minstens drie foto's gemaakt en er worden representatieve beelden getoond.

In vergelijking met X-Gal was DDAOG een gevoeligere en nauwkeurigere manier om senescentie in tumoren te kwantificeren (figuur 8). Voor DDAOG-tumoranalyse werd de met zoutoplossing behandelde tumor met de hoogste fluorescentieachtergrond gebruikt om de senescentiepoort op <5% in te stellen, zodat de andere met zoutoplossing behandelde tumoren niet hoger scoorden dan 5% senescentie. Deze senescentiepoort werd vervolgens batchgewijs toegepast op gated viable cellen van alle tumoren. Beide chemotherapiemiddelen induceerden senescentie in sommige tumoren (twee van de vijf tumoren voor DOX, drie van vijf voor PLD), met percentages senescente tumorcellen variërend van 3% tot 36% per tumor. Cytometriegegevensplots voor alle 15 tumoren worden weergegeven in aanvullende figuur S4 en een samenvatting van tumorcytometriegegevens wordt weergegeven in figuur 8D (n = 5; (*) p < 0,05 vs. zoutoplossing-only controlegroep door de F-variantietest). We concluderen dat DDAOG versus AF flowcytometrie een aanvaardbare methode is voor het screenen van tumoren en chemotherapiemiddelen voor de inductie van senescentie in vivo.

Figure 2
Figuur 2: DDAOG is een gevoelige en specifieke vlek voor SA-β-Gal. (A) Conventionele kleuring voor SA-β-Gal met X-Gal met onbehandelde (links) of ETO-behandelde (rechts) B16-F10 muizenmelanoomcellen. Senescentie geïnduceerd door ETO: cellen vertonen vergrote morfologie en blauwe kleuring als gevolg van splitsing van X-Gal door verhoogde SA-β-Gal. Schaalstaven = 10 μm. (B) Fluorescerende kleuring voor SA-β-Gal in ETO-behandelde cellen met behulp van C12-FDG (515 nm emissie, groen) of DDAOG (660 nm, rood). De kleuringsverdeling is vergelijkbaar voor beide sondes, wat aangeeft dat DDAOG SA-β-Gal detecteert op een vergelijkbare manier als C 12-FDG. (C) Evaluatie van AF in niet-gekleurde, met ETO behandelde cellen in het groene (525 nm emissie, links) of het verrode (660 nm, rechts) emissiekanaal. AF van lipofuscine is hoog in het groene emissiekanaal en verwaarloosbaar in het verrode kanaal. Belichtingstijd = 2.000 ms voor elk beeld. Schaalstaven = 10 μm. Deze figuur is herdrukt uit Flor en Kron23. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; X-Gal = 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside; UNT = onbehandeld; ETO = etoposide; AF = autofluorescentie; C12-FDG = 5-dodecanoylaminofluoresceïne di-β-D-galactopyranoside; SA-β-Gal = senescentie-geassocieerde bèta-galactosidase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Flowcytometer data acquisitie setup. (A) Representatieve scatter plot verdeling van cellen. FSC-A is een uitlezing van het celvolume en SSC-A geeft cellulaire granulariteit aan. Linkerpaneel, voertuig-only behandeling van A549-cellen. Rechterpaneel, ETO-behandeling om senescentie te induceren. Let op de trend naar een groter celvolume van met ETO behandelde cellen, in overeenstemming met de vergrote morfologie die blijkt uit microscopie. (B) Optioneel gebruik van 5-piek commerciële "regenboog" fluorescerende kalibratiemicrosferen om detectorspanningen van de cytometer in te stellen. In elk gebruikt fluorescentiekanaal moet de maximale piek worden ingesteld ≤1 x 105 relatieve fluorescentie-eenheden door de detectorspanning van de cytometer aan te passen terwijl de monsters draaien. Linkerpaneel, BV421 (violet) kanaal; midden, FITC (groen) kanaal; rechts, APC (rood) kanaal. De vijf fluorescerende pieken moeten een duidelijke afstand vertonen zoals getoond. (C-E) Representatieve eenkanaals fluorescentiegegevens voor (C) levensvatbaarheidskleuring met violette CV450-kleurstof; D) groene autofluorescentie van cellen; (E) verrood signaal van DDAOG, dat SA-β-Gal detecteert. Donkerder kleuren histogram, voertuig-only behandeling; lichtere kleur histogram, ETO-behandeling. Boven elk perceel zijn ouderpoorten aangegeven. Afkortingen: FSC-A = forward scatter-peak area; SSC-A = zijwaarts strooipuntgebied; ETO = etoposide; BV421-A = Brilliant Violet 421 kanaal piekgebied; FITC-A = piekgebied van het fluoresceïne-isothiocyanaatkanaal; APC-A = allophycocyanine kanaal piekgebied; AF = autofluorescentie; DDAO = 9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; VEH = voertuig. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve gegevens voor flowcytometrie senescentietest. (A) B16-F10 muizenmelanoomcellen behandeld met (linksboven) voertuig alleen, (rechtsboven) ETO, (linksonder) ABT-263 (1 μM) of (rechtsonder) ETO plus ABT-263. (B) A549 menselijke longadenocarcinoomcellen behandeld met (alleen linksboven) voertuig, (rechtsboven) BLM, (linksonder) alleen ABT-263, of (rechtsonder) BLM plus ABT-263. (A,B) Rechthoekige poorten in kwadranten rechtsboven van alle plots definiëren senescente cellen (DDAOGHI AFHI). Het percentage senescente cellen (van totaal levensvatbare cellen per monster) wordt op elk waarnemingspunt aangegeven. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposide; BLM = bleomycine; VEH = voertuig; TIS = therapie-geïnduceerde senescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Co-kleuring van een voorbeeldceloppervlakmarker met senescentietest. (A) Immunodetectie van senescentiemarker DPP4 op het oppervlak van levensvatbare B16-F10 gekweekte cellen; donkeroranje, alleen voor voertuigen; lichtoranje, ETO. (B,C) Midden- en rechterpaneel: cellen die samen met DDAOG en anti-DPP4:PE zijn gekleurd. DDAOGHI DPP4HI-cellen bevinden zich in rechthoekige poorten die op de percelen worden weergegeven en het percentage dubbelpositieve cellen per monster wordt aangegeven. Getoond: viable-gated cellen. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; ETO = etoposide; VEH = voertuig; DPP4 = dipeptidyl peptidase 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Posttaining fixatie en opslag van DDAOG-gekleurde celmonsters voor latere analyse. (A) Controle, niet-gefixeerde monsters van levende A549-cellen, ofwel onbehandeld (links) of behandeld met BLM (rechts) om senescentie te induceren, en vervolgens gekleurd en onmiddellijk geanalyseerd met behulp van het DDAOG-protocol (zonder fixatie, dag 0). (B) Monsters bereid als onder A) en vervolgens onmiddellijk gefixeerd in 4% paraformaldehyde en geanalyseerd (dag 0). C) Monsters bereid als onder A, onmiddellijk gefixeerd in 4% paraformaldehyde, en gedurende de analyse een nacht bij 4 °C bewaard. D) Monsters bereid als onder A), onmiddellijk gefixeerd en gedurende 7 dagen voorafgaand aan de analyse bewaard. Rechthoekige poorten in de kwadranten rechtsboven van alle plots definiëren senescente cellen (DDAOGHI AFHI). Het percentage senescente cellen wordt op elke waarnemingslijn aangegeven. Afkortingen: TIS = therapie-geïnduceerde senescentie; DDAO = 9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomycine; AF = autofluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Flowcytometrische sortering en validatie van verrijkte senescente celpopulaties. (A) Flowcytometrische sorteergegevens die (links) de onbehandelde, DDAOG-gekleurde controle tonen die wordt gebruikt om de poort in te stellen voor senescente celsortering (<5% senescente cellen in gated gebied) en (rechts) het met BLM behandelde, DDAOG-gekleurde monster dat werd gesorteerd met behulp van de sorteerpoort zoals weergegeven. (B) Fluorescentiemicroscopiebeelden voor (linkerkolom) cellen gekleurd met Phalloidin-Alexa Fluor 647 (oranje pseudokleur) om F-actine en DAPI (blauw) te detecteren om kernen te bestrijden, wat een vergrote morfologie van senescente cellen aantoont, of (rechterkolom) cellen gekleurd met konijn Ki67-antilichaam en anti-konijn Alexa Fluor 594 om verlies van proliferatie in senescente cellen te detecteren. Bovenste rij, onbehandelde en ongesorteerde cellen. Middelste rij, BLM-behandelde en ongesorteerde cellen. Onderste rij, BLM-behandelde en gesorteerde cellen. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: TIS = therapie-geïnduceerde senescentie; DDAO = 9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; BLM = bleomycine; UNT = onbehandeld; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Kwantificering van senescentie in tumoren van muizen behandeld met chemotherapiegeneesmiddelen. B16-F10 melanoomtumoren werden vastgesteld in de flanken van C67BL/6-muizen, die vervolgens werden behandeld met drie doses (A) zoutoplossing, (B) DOX of (C) PLD om de 5 dagen plus 1 week om het begin van senescentie mogelijk te maken. Tumoren werden weggesneden en gehalveerd; bevroren weefselglaasjes werden van de ene helft voorbereid voor X-Gal-kleuring (bovenste rij) en de andere helft werd gedissocieerd voor DDAOG-kleuring (onderste rij). In X-Gal-gekleurde beelden zijn blauwe cellen SA-β-Gal HI senescente cellen, terwijl bruine gebieden te wijten zijn aan melanine in tumoren. Representatieve resultaten worden getoond voor DOX en PLD van twee tumoren per groep die senescentie vertoonden. Alle tumoren met alleen zoutoplossing vertoonden verwaarloosbare senescentie. (D) Kwantificering van senescentie in met geneesmiddelen behandelde tumoren van muizen. (*) p < 0,05 door F variantietest, n = 5 muizen per groep. Foutstaven, gemiddelde ± SEM. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorubicine; PLD = PEGylated liposomale doxorubicine; X-Gal = 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside; AF = autofluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Chemische structuur van de DDAOG-sonde. DDAOG is een conjugaat van 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one) en bètagalactoside. Wanneer het gehydrolyseerde splitsingsproduct wordt gesplitst door bèta-galactosidase, vertoont het een verrode fluorescentie-emssieverschuiving van 50 nm, waardoor de specifieke detectie met excitatie boven 600 nm mogelijk is. Afkortingen: DDAO = 9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Spectrale scan van DDAOG-overspraak met andere fluorescerende kanalen van de flowcytometer. Om beschikbare kanalen voor de detectie van fluorescerende antilichamen te identificeren, werd een spectrale scan uitgevoerd op een 4-laser, 15-kanaals flowcytometer met behulp van A549-cellen behandeld met BLM en gekleurd met DDAOG (rood) of ongekleurd (zwart). Gegevens in elk kanaal van de flowcytometer werden verzameld voor 10.000 cellen. (A) Emissiekanalen van de 405 nm laser: van links naar rechts, BV421, BV510, BV605, BV660 en BV711. De kruisverwijzing waargenomen in BV605, BV660 en BV711 kanalen maakt ze ongeschikt voor co-kleuring met DDAOG zonder compensatie. BV421 en BV510 zijn geschikt voor co-staining (merk op dat BV421 meestal wordt gebruikt voor levensvatbaarheidskleuring). (B) Emissiekanalen van de 488 nm laser: FITC en PerCP-Cy5. Hoge overspraak werd waargenomen voor het PerCP-Cy5 kanaal. FITC is geschikt voor co-staining; Merk echter op dat het FITC-kanaal meestal wordt gebruikt in de DDAOG-test voor de evaluatie van groene emissie-AF. (C) Emissiekanalen van de 561 nm laser: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 en PE-Cy7. De PE- en PE-Dazzle 594-kanalen zijn geschikt voor de detectie van antilichamen die met deze fluoroforen zijn gelabeld (PE wordt in deze studie aangetoond voor de detectie van DPP4). (D) Emissiekanalen van de 640 nm laser: APC, APC-H700 en APC-Cy7. Het DDAOG-signaal van de senescente cellen is zichtbaar in het APC-kanaal (47,8% senescent). Het signaal overlapt in de APC-H700- en APC-Cy7-kanalen, waardoor ze ongeschikt zijn voor co-kleuring zonder significante spectrale compensatie. Afkortingen: BLM = bleomycine; BV = Briljant Violet; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; PerCP = peridinine-chlorofyl-eiwit; PE = phycoerythrin; DZ594 = Verblinding 594; APC = allofyocyanine; AF = autofluorescentie; DDAO = 9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Cel gating strategie voor FACS sortering van senescente cellen. Het passeren van een suspensie van cellen door een gevoelige FACS-cytometer kan extra gating vereisen om de zuiverheid van het sorteren en de optimale instrumentfunctionaliteit te garanderen. Een voorbeeldstrategie wordt hier getoond. Andere strategieën zijn mogelijk, afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant voor de FACS-cytometer die wordt gebruikt. Linkerkolom, alleen voor voertuigen behandelde celcontrole. Rechterkolom, A549-cellen behandeld met BLM om senescentie te induceren om te worden gesorteerd. (A) FSC-A (celvolume) versus SSC-A (celkorreligheid) gating van intacte cellen. De intacte poort elimineert celresten uit het gesorteerde monster. (B) FSC-A versus FSC-H zuiverheid gating; verwijdert doubletten en puin. C) SSC-A versus SSC-H zuiverheid gating; verwijdert doubletten en puin. (D) Gating voor de populatie van belang met behulp van het APC-A-kanaal (637 nm excitatie, 670 nm ± 30 nm emissie, gebruikt voor DDAOG) versus FITC-A kanaal (488 nm excitatie, 530 nm ± 30 nm emissie, gebruikt voor AF); verwijdert mogelijke kleuringsartefacten. (E) Senescent cell gating voor de eindsortering. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; BLM = bleomycine; FSC-A = voorwaarts strooippuntgebied; SSC-A = zijwaarts strooipuntgebied; FSC-H = voorwaartse strooiphoogte; SSC-H = zijwaartse strooi-piekhoogte. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: DDAOG senescentie flow cytometrie kleuring van tumoren. Flowcytometriegegevens voor ≥50.000 levensvatbare tumorcellen. Senescente celpoort, kwadrant rechtsboven van elk perceel. Het percentage senescente (van levensvatbare) tumorcellen wordt binnen de poort weergegeven. Tumorbehandelingen omvatten (A) alleen zoutoplossing; B) DOX; en (C) PLD. Muizen werden drie keer behandeld, eenmaal per 5 dagen, met 7 dagen voor herstel om het begin van senescentie vóór het offer mogelijk te maken. Vijf tumoren per aandoening werden geanalyseerd. Afkortingen: AF = autofluorescentie; DDAO = 9H-(1,3-dichloor-9,9-dimethylacridin-2-one); DDAOG = DDAO-Galactoside; DOX = doxorubicine; PLD = PEGylated liposomale doxorubicine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de afgelopen tien jaar is flowcytometrie een gebruikelijker testplatform geworden in kankeronderzoek vanwege de opkomende populariteit van tumorimmunologie, de ontwikkeling van goedkopere flowcytometers en de verbetering van gedeelde instrumentatiefaciliteiten bij academische instellingen. Multicolor assays zijn nu standaard, omdat de meeste nieuwere instrumenten zijn uitgerust met violette, blauwgroene en rode tot verrode optische arrays. Dit DDAOG-protocol is dus waarschijnlijk compatibel met een breed scala aan flowcytometers. Natuurlijk moet elke flowcytometer door de gebruiker worden geëvalueerd. Bijzondere voorzichtigheid is geboden bij het toevoegen van extra fluoroforen (bijv. fluorescerende, geconjugeerde antilichamen) aan de DDAOG-test. Een evaluatie van fluorofooroverspraak tussen kanalen moet worden uitgevoerd met behulp van enkelgekleurde controles die in alle andere relevante kanalen worden gevisualiseerd. Als overlap wordt waargenomen, kan spectrale compensatie worden uitgevoerd20 voor correctie volgens typische methoden.

De bevindingen die hierin worden getoond, zijn in de eerste plaats bedoeld om aan te tonen dat de DDAOG-flowcytometrietest snelle, kwantitatieve, gemakkelijk te interpreteren resultaten kan opleveren voor TIS geïnduceerd door chemotherapiegeneesmiddelen in cellen of tumoren. De hier gebruikte middelen, waaronder ETO23,24, DOX 7,25 en BLM26,27, zijn gedocumenteerd om TIS te induceren in verschillende kankercellijnen24. Om de specificiteit van de DDAOG-sonde aan te tonen, werd aangetoond dat het bekende senolytische middelABT-263 21 selectief senescente cellen in cultuur elimineert. Dit artikel demonstreert het gebruik van één murine (B16-F10) en één menselijke (A549) gekweekte kankercellijn, evenals B16-F10-tumoren bij muizen. Alle cellen die β-Gal tot expressie brengen en levensvatbaarheid behouden door middel van een standaard flowcytometriemonstervoorbereiding, kunnen echter worden gebruikt. Bepaalde celtypen kunnen kwetsbaarder of minder vatbaar voor TIS zijn, en dit moet worden geëvalueerd voordat aan een groot scherm of onderzoek wordt begonnen. Als cellen tijdens de voorbereiding desintegreren, de levensvatbaarheid slecht is of de TIS veel lager is dan verwacht met behulp van positieve agentcontroles, is het celtype mogelijk geen ideaal model voor studies naar senescentie. De hier getoonde middelen en cellijnen kunnen door andere groepen worden gebruikt als controles bij verdere screening van potentiële TIS-inducerende middelen of nieuwe senolytica, wat een actief doel in het veld blijft.

Toxiciteit geïnduceerd door chemotherapie geneesmiddelen kan variëren tussen celtypen en beïnvloeden assay resultaten. Als het primaire waargenomen effect van het gebruikte middel en/of de gebruikte concentratie acute celdood is, kan de algehele senescentie minimaal zijn. In vivo moet hoge tumornecrose of systemische toxiciteit bij dieren worden vermeden door de dosering van het middel te verlagen. De sleutel tot het succes van de test is het testen van een reeks agentconcentraties, met zorgvuldige inspectie van levensvatbaarheidstestgegevens (bijv. zoals verstrekt door CV450 binnen de DDAOG-test). In vitro, als veel dode cellen tijdens de behandeling loskomen van de plaat, inclusief het kweekmedium in het geanalyseerde monster, is het belangrijk om de celdood in totaal te evalueren. CV450 is niet de enige levensvatbaarheidsvlek die compatibel is met deze test; andere violet/blauw uitstotende fluoroforen mogen worden gebruikt. Fixeerbare levensvatbaarheidssondes kunnen ook worden gebruikt als de gebruiker van plan is de gekleurde monsters met PFA te fixeren, op voorwaarde dat de sondefluorescentie niet significant overlapt met DDAOG of AF (of de gebruiker spectrale compensatie uitvoert om te corrigeren voor overlap). In sommige gevallen waar de toxiciteit van agentia laag is en cellen robuust zijn, kan het gating intacte cellen door lichtverstrooiing (FSC versus SSC) voldoende zijn om "levensvatbare" cellen te isoleren voor analyse.

Een belangrijke stap in dit in vitro protocol is om cellen in het lagere bereik van loggroeidichtheid (typisch 2 × 103-5 × 103 cellen / cm2) te plaatsen om een snelle initiële proliferatie mogelijk te maken, wat de opname van het chemotherapiegeneesmiddel door de meeste cellen vergemakkelijkt. Eenmaal behandeld, is het ook belangrijk om tijd te nemen voor het begin van TIS: in vitro, 4 dagen ± 1 dag in aanwezigheid van het medicijn; in vivo, 7 dagen herstel na de laatste chemotherapiebehandeling. Na kleuring met DDAOG zoals beschreven, moet kwantitatieve analyse van cytometrische gegevens worden uitgevoerd zoals getoond, d.w.z. gating DDAOG versus AF-cellen in elk monster om het percentage senescente cellen (van totaal levensvatbaar) te bepalen. Optionele stappen omvatten het gebruik van fluorescerende "regenboog" kalibratiemicrosferen om flowcytometrie te standaardiseren, PFA-fixatie van gekleurde monsters, co-immunostaining voor oppervlaktemarkers en flowsortering om senescente cellen te verrijken voor downstream-assays. Elk van deze optionele stappen biedt echter belangrijke voordelen in bepaalde toepassingen. De kalibratiemicrosferen standaardiseren de cytometrie-opstelling over meerdere sessies en stellen de gebruiker in staat om in eerste instantie spanningen in te stellen in een nuttig bereik voor senescentie- en levensvatbaarheidsdetectie, met minimale aanpassingen daarna. PFA-fixatie van monsters stabiliseert de cellen en maakt batchanalyse van grote sets cellen op een later tijdstip mogelijk. Co-immunostaining voor oppervlaktemarkers kan worden gebruikt om te screenen op nieuwe senescentie-gerelateerde eiwitten en immuuninteracties. In toekomstige studies zijn we van plan om de co-kleuring van intracellulaire senescentiemarkers met DDAOG te valideren.

Het sorteren van TIS-cellen door FACS maakt de verrijking mogelijk van levensvatbare TIS-cellen uit heterogene populaties, wat uitlezingen voor downstream-assays zoals western blotting, proteomics of transcriptomics kan verstoren. Na sortering werd geen significante toxiciteit van DDAOG waargenomen in TIS-cellen die gedurende maximaal 5 dagen terug in cultuur werden geplaatst. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat gesorteerde cellen zijn behandeld met Baf, geïnternaliseerde DDAOG (die door SA-β-Gal is gesplitst tot DDAO, een acridinekleurstof) en zijn blootgesteld aan mechanische stress die door het FACS-instrument gaat. Daarom kunnen bepaalde biologische veranderingen die geen verband houden met senescentie aanwezig zijn in de gesorteerde cellen. In deze studie behielden de gesorteerde cellen echter sterke kenmerken van senescentie en leverden karakteristieke proteomics en transcriptomics-resultaten28 in vergelijking met ongesorteerde controles. Ondanks het enigszins voor de hand liggende nut van het gebruik van FACS om senescente cellen van tumoren te verzamelen en te analyseren, is deze procedure zelden gebruikt in de literatuur. Sommige groepen hebben p16Ink4a luciferase of fluorescerende melders gebruikt om senescente cellen in muizenweefsels te identificeren, waarbij fluorescerende melders FACS-sortering in sommige onderzoeken mogelijk maken29,30. Bevindingen zijn het er over het algemeen over eens dat, ongeacht het inductiemiddel of tumortype, TIS in tumoren een gedeeltelijke tot zeldzame gebeurtenis is, zelden 100% van de tumorcellen bereikt31. FACS-sortering van cellen met behulp van de DDAOG-methode maakt het gemakkelijk mogelijk om zeldzame TIS-cellen uit tumoren te verzamelen, zonder de noodzaak om transgene constructen tot expressie te brengen.

Momenteel wordt het meeste senescentieonderzoek in muismodellen ex vivo uitgevoerd met behulp van een combinatie van X-Gal en immunohistochemische markers32,33. Toch kan het ex vivo beoordelen van TIS met behulp van tumorweefsels een langdurig proces zijn, vooral wanneer X-Gal wordt gebruikt. Deze procedure vereist cryopreservatie van tumoren, cryosectie op dia's, X-Gal-kleuring, montage van afdekglas, drogen, beeldvorming en het scoren van "blauwe" cellen - minimaal een meerdaagse aanpak. Immunohistochemie is niet veel sneller of gemakkelijker, en verschillende weefselsecties moeten worden gebruikt en gescoord voor elke marker plus X-Gal in elke tumor, tenzij de multiplexanalyse is geoptimaliseerd, waardoor meer tijd aan de voorkant van het proces wordt toegevoegd. Weefselsecties bemonsteren slechts één dunne doorsnede van de tumor, terwijl senescente cellen (zoals veel celtypen) ongelijk verdeeld kunnen zijn in de 3D-ruimte over tumoren29. Het is dringend nodig in het veld om af te stappen van langzame, verouderde histologische methoden naar een snellere en gemakkelijk kwantificeerbare senescentietest voor tumoren. Met behulp van DDAOG-flowcytometrie kon een set van 15 tumoren worden gedissocieerd en gekleurd om sluitende, kwantitatieve senescentiegegevens te verkrijgen in minder dan 1 dag hands-on tijd na tumoroogst. De helft van de tumor werd voor elk monster verwerkt, waardoor de bemonstering van 3D-ruimte per tumor werd verbeterd. Deze DDAOG flowcytometriebenadering is aanzienlijk sneller en betrouwbaarder dan op weefselglijden gebaseerde methoden voor de evaluatie van TIS in tumoren.

Met zijn vele voordelen ten opzichte van X-Gal en andere methoden, pleiten we ervoor dat het DDAOG-protocol de nieuwe gouden standaard senescentietest wordt. Het maakt gebruik van zowel de conventioneel geaccepteerde senescentiemarker, SA-β-Gal, als labelvrije detectie van leeftijdsgebonden AF als tweede marker. Deze fluoroforen zijn compatibel met de meeste standaard flowcytometers. De test bevat een levensvatbaarheidsvlek om dode cellen en puin uit te sluiten met behulp van monsters die gemakkelijk zijn verkregen uit met geneesmiddelen behandelde gekweekte cellijnen of tumoren. Levende celmonsters kunnen optioneel oplosmiddelvast of gecryopreserveerd zijn om de batchanalyse van grote studies te vergemakkelijken, bijvoorbeeld met behulp van tijdspunten om het begin van TIS in de loop van de tijd te evalueren met behulp van meerdere middelen Het kleuringsproces duurt minder dan een halve dag laboratoriumwerk om te voltooien, en gegevensverzameling is meestal <5 min per monster. Gegevensanalyse is even snel en eenvoudig en produceert kwantitatieve gegevens over het percentage TIS-cellen per monster zonder vervelende celscores en -tellingen. Monsters kunnen FACS-gesorteerd worden om verrijkte populaties van TIS-cellen te herstellen, wat ruis van cellulaire heterogeniteit in downstream-analyses vermindert. Wij geloven dat de DDAOG-test in veel gevallen X-Gal kan vervangen, waardoor de screening van TIS-inducerende middelen en senolytica in vitro en in vivo wordt vergemakkelijkt, wat leidt tot snellere en betrouwbaardere ontdekkingen op het gebied van senescentieonderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden voor deze studie.

Acknowledgments

We bedanken de Cytometry and Antibody Core Facility van de Universiteit van Chicago voor de ondersteuning bij flowcytometrie-instrumentatie. Het Animal Research Center van de Universiteit van Chicago zorgde voor dierenhuisvesting.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 187 Senescentie kanker chemotherapie flowcytometrie fluorescerende sonde multiplex
Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter