Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Långt-röd fluorescerande åldrande-associerad β-galaktosidassond för identifiering och anrikning av åldrande tumörceller genom flödescytometri

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176

Summary

Ett protokoll för fluorescerande, flödescytometrisk kvantifiering av åldrande cancerceller inducerade av kemoterapiläkemedel i cellodling eller i murina tumörmodeller presenteras. Valfria procedurer inkluderar samimmunfärgning, provfixering för att underlätta analys av stora satser eller tidpunkter och anrikning av livskraftiga åldrande celler genom flödescytometrisk sortering.

Abstract

Cellulär åldrande är ett tillstånd av proliferativ arrestering inducerad av biologisk skada som normalt uppstår under år i åldrande celler men kan också dyka upp snabbt i tumörceller som ett svar på skador som induceras av olika cancerbehandlingar. Tumörcells åldrande anses i allmänhet vara oönskat, eftersom åldrande celler blir resistenta mot döden och blockerar tumörremission samtidigt som tumörmalignitet och behandlingsresistens förvärras. Därför är identifieringen av åldrande tumörceller av pågående intresse för cancerforskarsamhället. Olika åldrandeanalyser finns, många baserade på aktiviteten hos den välkända åldrande markören, senescence-associerad beta-galaktosidas (SA-β-Gal).

Vanligtvis utförs SA-β-Gal-analysen med användning av ett kromogent substrat (X-Gal) på fasta celler, med långsam och subjektiv uppräkning av "blå" senescenta celler genom ljusmikroskopi. Förbättrade analyser med cellpermeant, fluorescerande SA-β-Gal-substrat, inklusive C12-FDG (grön) och DDAO-Galactoside (DDAOG; långt röd), har möjliggjort analys av levande celler och möjliggjort användning av fluorescerande analysplattformar med hög genomströmning, inklusive flödescytometrar. C12-FDG är en väldokumenterad sond för SA-β-Gal, men dess gröna fluorescerande emission överlappar med inneboende cellulär autofluorescens (AF) som uppstår under åldrande på grund av ackumulering av lipofuscinaggregat. Genom att använda den fjärrröda SA-β-Gal-sonden DDAOG kan grön cellulär autofluorescens användas som en sekundär parameter för att bekräfta åldrande, vilket ger tillförlitlighet till analysen. De återstående fluorescenskanalerna kan användas för cellviabilitetsfärgning eller valfri fluorescerande immunmärkning.

Med hjälp av flödescytometri demonstrerar vi användningen av DDAOG och lipofuscin autofluorescens som en dubbelparameteranalys för identifiering av åldrande tumörceller. Kvantifiering av andelen livskraftiga senescenta celler utförs. Om så önskas kan ett valfritt immunmärkningssteg inkluderas för att utvärdera cellyteantigener av intresse. Identifierade senescenta celler kan också flödescytometriskt sorteras och samlas in för nedströmsanalys. Uppsamlade åldrande celler kan omedelbart lyseras (t.ex. för immunanalyser eller "omics-analys") eller odlas ytterligare.

Introduction

Senescenta celler ackumuleras normalt i organismer under år under normalt biologiskt åldrande men kan också utvecklas snabbt i tumörceller som ett svar på skador som induceras av olika cancerbehandlingar, inklusive strålning och kemoterapi. Även om de inte längre sprider sig kan terapiinducerade senescenta (TIS) tumörceller bidra till behandlingsresistens och driva återfall 1,2,3. Faktorer som utsöndras av TIS-celler kan förvärra tumörmalignitet genom att främja immunflykt eller metastasering 4,5. TIS-celler utvecklar komplexa, kontextspecifika fenotyper, förändrade metaboliska profiler och unika immunsvar 6,7,8. Därför är identifiering och karakterisering av TIS-tumörceller inducerade av olika cancerbehandlingsmetoder ett ämne av pågående intresse för cancerforskningssamhället.

För att detektera TIS-tumörceller används konventionella åldrandeanalyser i stor utsträckning, främst baserat på att detektera ökad aktivitet hos åldrandemarkörenzymet, den lysosomala beta-galaktosidasen GLB19. Detektion vid ett nästan neutralt (snarare än surt) lysosomalt pH möjliggör specifik detektion av åldrande-associerat beta-galaktosidas (SA-β-Gal)10. En standard SA-β-Gal-analys som har använts i flera decennier använder X-Gal (5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid), ett blått kromogent beta-galaktosidassubstrat, för att detektera SA-β-Gal i fasta celler med ljusmikroskopi11. X-Gal-analysen möjliggör kvalitativ visuell bekräftelse av TIS med hjälp av allmänt tillgängliga reagenser och laboratorieutrustning. Ett grundläggande överfört ljusmikroskop är den enda instrumentering som krävs för att utvärdera närvaron av det blå kromogenet. X-Gal-färgningsproceduren kan dock sakna känslighet, vilket ibland kräver mer än 24 timmar för att färgen ska utvecklas. Färgning följs av låg genomströmning, subjektiv poängsättning av enskilda senescenta celler baserat på att räkna cellerna som uppvisar en viss intensitetsnivå av den blå kromogenen under ett ljusmikroskop. Eftersom X-Gal är cellogenomtränglig kräver denna analys lösningsmedelsfixerade celler, som inte kan återvinnas för nedströmsanalys. När man arbetar med begränsade prover från djur eller patienter kan detta vara en stor nackdel.

Förbättrade SA-β-Gal-analyser med cellpermeant, fluorescerande enzymsubstrat, inklusive C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, grön) och DDAOG (9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-en-7-yl) β-D-Galactopyranoside, långt röd) har tidigare förekommit i litteraturen12,13,14,15. DDAOG:s kemiska sondstruktur och optiska egenskaper visas i kompletterande figur S1. Dessa cellpermeanta sonder möjliggör analys av levande (snarare än fasta) celler, och fluorescerande snarare än kromogena sonder underlättar användningen av snabba fluorescerande analysplattformar med hög genomströmning, inklusive screeninginstrument med högt innehåll och flödescytometrar. Sorteringsflödescytometrar möjliggör återhämtning av berikade populationer av levande åldrande celler från cellkulturer eller tumörer för nedströmsanalys (t.ex. western blotting, ELISA eller 'omics). Fluorescensanalys ger också en kvantitativ signal, vilket möjliggör mer exakt bestämning av andelen åldrande celler i ett givet prov. Ytterligare fluorescerande sonder, inklusive viabilitetssonder och fluoroformärkta antikroppar, kan lätt läggas till för multiplexerad analys av mål utöver SA-β-Gal.

I likhet med DDAOG är C12-FDG en fluorescerande sond för SA-β-Gal, men dess gröna fluorescerande utsläpp överlappar med inneboende cellulär AF, som uppstår under åldrande på grund av ackumulering av lipofuscinaggregat i celler16. Genom att använda den fjärrröda DDAOG-sonden kan grön cellulär AF användas som en sekundär parameter för att bekräfta åldrande17. Detta förbättrar analysens tillförlitlighet genom att använda en andra markör utöver SA-β-Gal, som ofta kan vara opålitlig som en enda markör för åldrande18. Eftersom detektion av endogen AF i åldrande celler är ett etikettfritt tillvägagångssätt är det ett snabbt och enkelt sätt att utöka specificiteten hos vår DDAOG-baserade analys.

I detta protokoll demonstrerar vi användningen av DDAOG och AF som en snabb, dubbelparameterflödescytometrianalys för identifiering av livskraftiga TIS-tumörceller från in vitro-kulturer eller isolerade från läkemedelsbehandlade tumörer etablerade hos möss (Figur 1). Protokollet använder fluoroforer som är kompatibla med ett brett spektrum av vanliga kommersiella flödescytometrianalysatorer och sorterare (tabell 1). Kvantifiering av procentandelen livskraftiga senescenta celler med hjälp av standardflödescytometrianalys är aktiverad. Om så önskas kan ett valfritt immunmärkningssteg utföras för att utvärdera cellyteantigener av intresse samtidigt med åldrande. Identifierade senescenta celler kan också berikas med hjälp av standard fluorescensaktiverad cellsorteringsmetodik (FACS).

Figure 1
Bild 1: Experimentellt arbetsflöde. Ett schema som sammanfattar viktiga punkter i DDAOG-analysen. (A) Ett TIS-inducerande läkemedel tillsätts till däggdjursodlade celler eller administreras till tumörbärande möss. Tid tillåts sedan för uppkomsten av TIS: för celler, 4 dagar efter behandling; för möss, totalt 22 dagar, med tre behandlingar var 5: e dag plus 7 dagars återhämtning. Celler skördas eller tumörer dissocieras i suspension. B) Proverna behandlas med Baf för att justera lysosomalt pH för detektion av SA-β-Gal i 30 minuter. Sedan läggs DDAOG-sonden till i 60 minuter för att detektera SA-β-Gal. Proverna tvättas 2x i PBS, och en viabilitetsfläck tillsätts kort (15 min). Eventuellt kan prover färgas med fluorescerande antikroppar i öppna fluorescenskanaler och/eller fixeras för senare analys. (C) Proverna analyseras med hjälp av en standardflödescytometer. Livskraftiga celler visualiseras i punktdiagram som visar röd DDAOG (indikerar SA-β-Gal) kontra grön autofluorescens (lipofuscin). En grind för att bestämma procentandelen TIS-celler upprättas baserat på obehandlade kontrollprover (visas inte). Om en sorteringscytometer (FACS) används kan TIS-celler samlas in och placeras tillbaka i odling för ytterligare in vitro-analyser eller lyseras och bearbetas för molekylärbiologiska analyser. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; TIS = terapiinducerad åldrande; FL-Ab = fluoroforkonjugerad antikropp; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = åldrande-associerad beta-galaktosidas; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Fluorofor Upptäcker Ex/Em (nm) Cytometerlaser (nm) Cytometerdetektor / bandpassfilter (nm)
DDAOG SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
AF Lipofuscin < 600 488 525 / 50
CV450 Livsduglighet 408/450 405 450 / 50
PE Antikropps-/ytmarkör 565/578 561 582 / 15

Tabell 1: Optiska specifikationer för fluoroforer och cytometer. Cytometerspecifikationer som används i detta protokoll listas för ett instrument med totalt 4 lasrar och 15 emissionsdetektorer. DDAOG detekterad vid 645/660 nm är formen av sonden klyvd av SA-β-Gal1. Uncleaved DDAOG kan uppvisa låg fluorescens vid 460/610 nm men avlägsnas genom tvättsteg i protokollet. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; AF = autofluorescens; PE = phycoerythrin; SA-β-Gal = åldrande-associerad beta-galaktosidas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Allt djurarbete som beskrivs godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Chicago.

1. Beredning och lagring av stamlösningar

OBS: Om celler kommer att flödessorteras bör alla lösningar beredas med sterila tekniker och filtreras genom en 0,22 μm filteranordning.

  1. Bered en stamlösning av DDAO-Galactoside vid 5 mg/ml i DMSO. Alikvot vid 50 μl per rör (eller önskad volym). Förvaras vid −20 °C i mörker i upp till 1 år.
  2. Bered en stamlösning av Bafilomycin A1 vid 1 mM i DMSO. Alikvot vid 50 μl per rör (eller önskad volym). Förvaras vid −20 °C i upp till 6 månader.
  3. Förbered en stamlösning av Calcein Violet 450 AM vid 1 mM i DMSO. Alikvot vid 50 μl per rör (eller önskad volym). Förvaras vid −20 °C i mörker i upp till 1 år.
  4. För behandling av odlade celler in vitro, bered 10 mM koncentrerade stamlösningar av åldrandeinducerande medel i lämpligt lösningsmedel och sterilisera med 0,2 μm sprutfilter. Förvaras vid −20 °C eller enligt tillverkarens anvisningar.
    OBS: För leverans av åldrandeinducerande kemoterapimedel in vivo (till möss med etablerade tumörer) ska medlen vara av USP-kvalitet och spädas till saltlösning från koncentrerad buljong strax före injektionen.
  5. Bered komplett odlingsmedium för den eller de cellinjer som används.
    OBS: Förbered till exempel medium för B16-F10- eller A549-celler med DMEM 1x + 10% FBS + 1x glutaminsubstitut + 1x penicillin / streptomycin. Media måste hållas sterila. Andra cellinjespecifika medieformuleringar kan användas. Vissa komponenter som glutation kan i vissa fall störa uppkomsten av åldrande. Empirisk testning av olika medieformuleringar bör utföras om uppkomsten av åldrande är lägre än förväntat eller inte observerats med kontrollkemoterapimedel.
  6. Förbered färgnings- och tvättbuffertar.
    1. Förbered 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS för användning vid färgningsprocedurer. Lös upp 2 g BSA i 200 ml PBS och rör om i 10 minuter, eller tills det är helt upplöst, vid rumstemperatur.
    2. Förbered 0,5% BSA i 1x PBS som tvättbuffert. Späd 100 ml av 1% BSA beredd i steg 1.6.1 till 100 ml 1x PBS för 0,5% BSA.
    3. Förvara buffertar vid 4 °C i upp till 1 månad.
  7. Förbered 4% paraformaldehyd i 1x PBS. Använd kommersiellt tillgängliga, förseglade paraformaldehydampuller (t.ex. 16% v / v) för bekvämlighet och stabilitet: 2,5 ml 16% PFA + 7,5 ml 1x PBS (= 10 ml 4% PFA). Justera den förberedda volymen beroende på den totala volymen som behövs per experiment.
    OBS: Förbered vid behov endast för cellfixering; Förbered dig färskt varje gång.
  8. Förbered FACS-sorteringsbuffert: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Sterilfilter genom en 0,22 μm filtreringsanordning och förvara vid 4 °C i upp till 1 månad.
    OBS: Förbered vid behov endast för FACS-sortering. Flödessorterande buffertformuleringar kan variera mellan FACS-instrument. Ovanstående formulering är kompatibel med det instrument som används i denna studie (se Materialförteckning). Se tillverkarens riktlinjer.
  9. Förbered tumördissociationslösning: 20 μg / ml liberas TL + 100 μg / ml DNAse I i RPMI-1640-media (utan FBS eller andra kosttillskott). Stamlösningar är användbara för att hålla liberas TL (beredd och lagrad enligt tillverkarens anvisningar) och DNAse I (100 mg / ml i dubbeldestillerat vatten [ddH2O], lagrat vid −20 ° C).
    OBS: Förbered dig vid behov om du endast använder tumörer; Förbered dig färskt varje gång.

2. Induktion av åldrande med kemoterapiläkemedel i odlade cancerceller

OBS: Alla cellmanipulationssteg i detta avsnitt bör utföras i ett biosäkerhetsskåp med sterila metoder. Detta avsnitt är skrivet för vidhäftande celltyper. Suspensionsceller kan användas med lämpliga modifieringar som noterats.

  1. Odla cancercellinjer enligt standardprotokollet från leverantören eller laboratoriet som tillhandahöll de specifika cellinjer som användes.
    OBS: Celler med låg passage (p < 10) föredras i allmänhet eftersom det kommer att finnas lägre nivåer av replikativ åldrande, dvs. lägre bakgrund, i obehandlade cellprover.
  2. En dag före åldrande induktion av läkemedel, skörda celler med trypsin-EDTA 0,25% (eller som rekommenderat). Neutralisera trypsin genom att tillsätta en lika stor volym komplett odlingsmedium och överför cellsuspensionen till ett sterilt koniskt rör.
    OBS: Detta steg behövs inte för suspensionsceller.
  3. Räkna cellerna med standardhemacytometermetoden och registrera celler / ml. Plåtceller vid 1 × 10 3-10 × 103 celler/cm2 i vanliga 6-brunnar plastodlingsskålar.
    OBS: Optimal pläteringstäthet är beroende av cellernas spridningshastighet och bör bestämmas av användaren. Cellerna bör vara i logfastillväxt vid cirka 10%-20% sammanflöde vid behandlingstillfället (dvs. efter 18-24 timmars inkubation efter plätering). Startdensiteten (celler/ml) för suspensionsceller bör bestämmas av användaren. Sexbrunnsplattor ger vanligtvis tillräckligt med åldrande celler per brunn för ett standardflödescytometrianalysprov. Vid flödessortering bör en mycket större ytarea (t.ex. flera P150-plattor) användas för att möjliggöra återvinning av tillräckligt antal åldrande celler för nedströmsanalyser (≥1 × 106).
  4. Inkubera pläterade celler över natten (18-24 timmar) i en 37 °C inkubator med 5%CO2 och en fuktighetspanna.
  5. Behandla de pläterade cellerna med åldrande-inducerande kemoterapi läkemedel (er). Inkludera minst en positiv kontroll, t.ex. etoposid (ETO) eller bleomycin (BLM). Förbered dubbla brunnar per läkemedel. Inkludera en uppsättning som behandlas med endast fordon som kontroll.
    OBS: En doskurva för varje experimentellt medel bör testas av användaren för att bestämma den optimala koncentrationen för åldrandeinduktion i den eller de cellinjer som används.
  6. Inkubera celler i 4 dagar i en 37 °C inkubator med 5% CO2 och en fuktighetspanna för att möjliggöra uppkomsten av åldrande. Undersök dagligen för förväntade morfologiförändringar med hjälp av ett ljusmikroskop.
    OBS: Inkubationstider från 3-5 dagar kan vara acceptabla beroende på graden av åldrande debut. Media kan ändras och medlet appliceras igen (eller inte), efter önskemål, för att främja hälsosamma tillväxtförhållanden samtidigt som man uppnår en acceptabel procentandel av åldrande celler.
  7. Efter början av åldrandet, skörda cellerna genom att tillsätta trypsin-EDTA 0,25% i 5 min vid 37 ° C. När celler dissocieras i suspension, neutralisera trypsin med en lika stor volym komplett medium.
    OBS: Detta steg behövs inte för celler som växer i suspension. Om ytmarkörfärgning kommer att utföras, undvik användning av trypsin-EDTA eftersom det tillfälligt kan förstöra ytantigener på celler. Dissociera istället monolagret försiktigt med hjälp av en steril plastcellskrapa (eller ett alternativt dissociationsreagens utformat för att bevara ytantigener).
  8. Räkna cellerna i varje prov med hjälp av en hemacytometer. Beräkna cellerna/ml för varje prov.
    OBS: Trypanblått kan läggas till för att utvärdera andelen döda celler vid denna tidpunkt (dvs. på grund av läkemedelsbehandling), men celldöd kommer också att bestämmas med ett fluorescerande viabilitetsfärgämne under DDAOG-färgningsarbetsflödet.
  9. Alikvot ≥0,5 × 106 celler per prov i 1,7 ml mikrocentrifugrör.
    OBS: Antalet celler per prov bör standardiseras för alla prover.
  10. Centrifugera rören i 5 minuter vid 1 000 × g i en mikrocentrifug vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
    OBS: Om en kyld mikrocentrifug inte är tillgänglig kan det vara acceptabelt att utföra centrifugeringar vid omgivningstemperatur för vissa fjädrande celltyper.
  11. Fortsätt till DDAOG-färgning i avsnitt 4.

3. Induktion av åldrande genom kemoterapiläkemedel i tumörer etablerade hos möss

OBS: Om tumörceller kommer att FACS-sorteras, säkerställa sterilitet vid varje steg genom att arbeta i ett biosäkerhetsskåp och arbeta med sterila instrument, procedurer och reagenser.

  1. Skapa mustumörmodeller genom att injicera cancerceller subkutant, enligt standardmetoder (t.ex. Appelbe et al.19).
    OBS: Antalet cancerceller som ska injiceras, injektionsstället och lämplig musstam bör optimeras för varje protokoll. Här injicerades B16-F10-celler subkutant vid 1 × 106 celler i 0,1 ml saltlösning (1 × 107 celler/ml).
    1. Kontrollera att livskraften hos celler som använder trypan blå är >90% innan du utför injektioner. Bedöva mössen med isofluran.
    2. Bedöva 6-7 veckor gamla kvinnliga C57 / BL6-möss med en blandning av 3% isofluran och luft och behåll under dessa förhållanden i en induktionskammare placerad i ett sterilt biosäkerhetsskåp. Bekräfta anestesi genom att försiktigt klämma musens fot. Applicera steril veterinärsalva på båda ögonen för att förhindra torkning av hornhinnan under proceduren. Under proceduren, behåll musens kroppstemperatur med en värmelampa.
    3. Arbeta inuti ett sterilt biosäkerhetsskåp, ta bort musen från induktionskammaren och placera den i kontakt med en näskotte som ger en 3% isofluranförsörjning. Raka flankområdet på injektionsstället med en ren elektrisk rakhyvel. Blanda den beredda cellsuspensionen en kort stund genom att manuellt invertera röret strax före injektionen och injicera cellsuspensionen subkutant i den rakade flanken/-sidorna med en steril 0,5 ml spruta försedd med en steril 27 G-nål. Ta bort musen från huven och överför den till återhämtningsburet.
    4. I återhämtningsburet, övervaka mössens vitala tecken kontinuerligt tills de har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternal recumbency, visa rätningsreflexen och kan säkert röra sig i buret. Lämna inte möss obevakade eller returnera djur som har genomgått tumörcellinokulering till sällskap med andra djur tills de är helt återställda. Övervaka alla inokulerade möss dagligen för viktminskning, minskad aktivitet/rörlighet, och neurologiska symtom; avliva möss som uppvisar svåra symtom i någon kategori. För möss som uppvisar smärtsymptom efter inokulering, administrera buprenorfin (0,1-0,2 mg/kg) en gång subkutant.
      OBS: Möss som uppvisar ihållande smärta efter buprenorfin ska avlivas.
  2. Börja 5-7 dagar efter cancer cell inokulering, mäta tumörtillväxt med bromsok var 2-3 dagar. Initiera prosenescerande behandling när tumören har nått 50 mm 3 ± 10 mm3 i volym.
    OBS: I detta arbete administrerades doser av USP-grad doxorubicinhydroklorid (DOX) eller PEGylated liposomalt doxorubicin (PLD) vid 10 mg / kg i 0,9% natriumkloridinjektion (USP). Läkemedel injicerades intraperitonealt 3x, en gång var 5: e dag, med början när tumörer nådde 50 mm 3 ± 10 mm3. Möss återhämtade sig i 7 dagar efter den slutliga behandlingen för att möjliggöra uppkomsten av TIS i tumörer. Senescence induktionsdoser och villkor för andra behandlingar och / eller tumörmodeller bör optimeras.
  3. Vid 7 dagar efter den slutliga läkemedelsbehandlingen, offra mössen genom CO2-överdosering och cervikal dislokation eller andra godkända metoder i enlighet med riktlinjerna för laboratoriedjurarbete. Skär ut tumörerna och samla dem i sterila rör eller 6-brunnsplattor fyllda med sterilt RPMI-tillväxtmedium (för att bevara livskraften under bearbetningen).
    OBS: Om du utför en histologisk undersökning (t.ex. X-Gal eller immunhistokemi) kan tumörer delas här, med en halv snap-fryst i O.C.T. inbäddningsmedium och kryosektion med standardprocedurer för fryst vävnadshistologi. Den återstående tumörhalvan bör ge rikligt med material för dissociation och DDAOG-färgning.
  4. Överför en tumör till en P100-plastskål som innehåller 5 ml RPMI-medium. Hacka tumören i bitar med en skalpell.
  5. Överför 5 ml av suspensionen av tumörstycken innehållande suspenderade celler och skräp till ett 15 ml koniskt rör. Använd den bredare spetsen på en 25 ml serologisk pipett för att överföra denna suspension om det finns stora skräp. Skölj skålen med en extra volym steril RPMI för att samla material. Kepsen och placera det koniska röret på is.
  6. Upprepa steg 3,45-3,5 för de återstående tumörerna. Använd en separat platta och skalpell för varje tumör för att undvika korskontaminering, eller skölj väl med PBS mellan tumörerna. Använd 5 ml färskt medium för att mala varje tumör.
  7. Förbered tumördissociationslösningen: 20 μg / ml liberas TL + 100 μg / ml DNAse I i RPMI-1640-media (utan FBS).
    OBS: Många effektiva formuleringar för tumördissociationslösningar finns och kan innehålla en mängd olika enzymer och andra komponenter från olika tillverkare. Optimala koncentrationer av komponenter kan variera kraftigt mellan tumörtyper. Om röda blodkroppar är mycket närvarande i tumören kan röda blodkroppar lysas ytterligare; Om döda celler är ett problem kan ett kit för borttagning av döda celler användas. Det rekommenderas starkt för användaren att självständigt bestämma optimala tumördissociationsförhållanden som ger hög livskraft och låg närvaro av förorenande celler, bindväv och skräp.
  8. Centrifugera alla tumörprover i koniska rör i 5 min vid 1 000 × g (4 °C). Ta bort supernatanten.
  9. Tillsätt 1-5 ml tumördissociationslösning till varje tumörprov, beroende på volymen tumörmaterial. Se till att det finns 1-2 ml överskott av tumörmaterialpelleten i röret. Vortex med måttlig hastighet att blanda.
  10. Placera proverna i en 37 °C inkubator med snabb rotation i 45 minuter. Vortex kort var 15: e minut.
  11. Filtrera varje prov genom en 100 μm cellsil i ett 50 ml koniskt rör. Om proverna är för viskösa för att passera genom filtret, tillsätt 10 ml RPMI-1640-medium för att späda ut. Skölj filtren med RPMI-medium för att samla upp restcellerna.
  12. Använd en hemacytometer för att räkna cellerna / ml för varje prov.
  13. Alikvotera två eller flera replikat av 5 × 106 celler per tumörprov.
  14. Centrifugera i 5 minuter vid 1 000 × g (4 °C). Ta bort supernatanten.
  15. (Valfritt) Kryokonservera tumörproverna för senare DDAOG-färgning om så önskas.
    1. Återsuspendera den dissocierade tumörcellpelleten i kryokonserveringsmedium: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, beredd under sterila förhållanden vid 5 × 106 celler / ml.
    2. Alikvot 1 ml cellsuspension i varje kryovial.
    3. Frys kryovialerna i 24 timmar i en isopropanolcellsfrysningsbehållare vid −80 °C. Överför sedan till kryolagring av flytande kväve för långvarig lagring (>1 vecka).
    4. När färgning önskas, tina kryovialerna på is och fortsätt till DDAOG-färgning i avsnitt 4.
      OBS: Vissa tumörer kanske inte förblir livskraftiga genom kryokonservering, och motståndskraft mot denna process bör utvärderas av användaren för tumörmodellen av intresse.
  16. Fortsätt till avsnitt 4 för DDAOG-färgning.

4. DDAOG-färgning av SA-β-Gal i cell- eller tumörprover

  1. Späd 1 mM Bafilomycin A1 stam vid 1:1 000x till DMEM-medium (utan FBS) för en slutlig koncentration på 1 μM.
  2. Tillsätt beredd Baf-DMEM-lösning till cellpelletsproverna (från steg 2.11 eller steg 3.16) i en koncentration av 1 × 106 celler/ml.
    Om du till exempel använder 0,5 × 106 celler per prov lägger du till 0,5 ml Baf-DMEM. För tumörer kan 5 × 106 celler färgas i 5 ml Baf-DMEM.
  3. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C (utan CO2) på en rotator/skakapparat inställd på långsam hastighet.
    OBS: Undvik CO 2-inkubatorer för färgningsprocessen, som kan surgöra lösningar och därmed störa Baf- och DDAOG-färgning.
  4. Utan tvätt, tillsätt DDAOG-stamlösningen (5 mg/ml) vid 1:500x (10 μg/ml slutlig) till varje prov. Pipett att blanda. Byt ut på en rotator/skakapparat vid 37 °C (utan CO2) i 60 minuter. Skydda mot direkt ljus.
  5. Centrifugera rören i 5 minuter vid 1 000 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
  6. Tvätta med 1 ml iskall 0,5% BSA per rör och pipett att blanda. Centrifugera rören i 5 minuter vid 1 000 x g vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg 2x för att tvätta cellerna noggrant. Ta bort supernatanten och fortsätt.
    OBS: Det är viktigt att utföra tvättstegen i steg 4.6 för att ta bort orenad DDAOG, som kan uppvisa oönskad fluorescensemission (460/610 nm).
    OBS: Om immunfärgning för cellytmarkörer, fortsätt till avsnitt 5 nedan.
  7. (Valfritt) Fixering och lagring av DDAOG-färgade celler för senare analys
    1. Tillsätt 0,5 ml iskall 4% paraformaldehyd droppvis till varje tvättat prov. Pipett att blanda.
    2. Inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
    3. Tvätta cellerna 2x med 1 ml PBS.
    4. Förvara proverna i upp till 1 vecka vid 4 °C före flödescytometrianalys.
      OBS: För fasta prover, hoppa över steg 4.8.
  8. Späd Calcein Violet 450 AM lager (1 mM) vid 1: 1,000x till 1% BSA-PBS (1 μM final). Tillsätt 300 μl (för odlade cellprover) eller 1 000 μl (för tumörprover) till de tvättade cellpelletsen från steg 4.6. Inkubera i 15 min på is i mörkret.
  9. Fortsätt till flödescytometriinställningen (avsnitt 6).

5. (Valfritt) Immunfärgning för cellytemarkörer i kombination med DDAOG

OBS: Som med alla flödescytometriexperiment bör enkelfärgade kontrollprover med endast DDAOG och fluorescerande antikroppar förberedas för att bestämma överhörning (om någon) över fluorescenskanaler. Om överhörning observeras bör standardflödescytometrikompensation utföras20.

  1. Återsuspendera cellpelletsen som erhållits i steg 4.6 i 100 μL färgningsbuffert (1% BSA i 1x PBS).
  2. Tillsätt det Fc-receptorblockerande reagens som är lämpligt för cellarten (mus eller människa) vid tillverkarens rekommenderade titrering. Inkubera i 10 minuter vid 24 °C.
  3. Tillsätt fluoroforkonjugerade antikroppar vid den titrering som rekommenderas av tillverkaren (eller bestäms av användaren). Inkubera i 20 min på is, skyddad från ljus.
  4. Centrifugera rören i 5 minuter vid 1 000 × g vid 4 °C. Ta bort supernatanten.
  5. Tvätta med 1 ml iskall tvättbuffert (0,5% BSA-PBS) per rör och pipett för blandning. Centrifugera rören i 5 minuter vid 1 000 × g vid 4 °C och avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg 2x för att tvätta cellerna noggrant.
  6. Späd 1 mM Calcein Violet 450 AM vid 1: 1,000x till 1% BSA-PBS. Tillsätt 300 μl till de tvättade cellpelletsen från steg 5.5. Inkubera i 15 min på is i mörkret.
  7. Fortsätt till flödescytometrianalys (avsnitt 6-7).

6. Flödescytometerinställning och datainsamling

  1. Överför cellproverna till rör som är kompatibla med flödescytometriinstrumentet. Placera rören på is och håll dem skyddade mot ljus.
    OBS: Om aggregat observeras i cellsuspensionerna, passera suspensionen genom 70-100 μm cellsilar före analys. Använd inte 40 μm silar eftersom de kan utesluta några av de större senescenta cellerna.
  2. I den refererade programvaran (se materialförteckningen) öppnar du följande diagram: 1) FSC-A vs SSC-A punktdiagram, 2) violett kanalhistogram, 3) fjärrröd kanal (t.ex. APC-A) kontra grön kanal (t.ex. FITC-A) punktdiagram.
    OBS: Dubblett uteslutningsdiagram och enkanaliga histogram kan också användas men är inte strikt nödvändiga.
  3. Initiera insamling av cytometerdata.
    1. Placera kontrollprovet endast för fordonet färgat med DDAOG på insugningsporten. Vid låg intagshastighet börjar du skaffa provdata.
    2. Justera FSC- och SSC-spänningar så att >90% av händelserna finns i diagrammet. Om cellerna inte passar bra på diagrammet sänker du områdesskalningsinställningen till 0,33-0,5 enheter.
    3. Ta bort provet endast för fordonet utan att registrera data.
    4. (Valfritt) Tillsätt en droppe regnbågskalibreringsmikrosfärer till ett cytometerrör med 1 ml PBS. Placera röret på cytometerns intagsport. Börja hämta exempeldata.
    5. Justera violetta, gröna och fjärrröda kanalspänningar så att regnbågsmikrosfärens topptopp ligger i intervallet 104-10 5 enheter relativ fluorescens i varje kanal och alla toppar är väl separerade i varje kanal. Spela in 10 000 evenemang. Ta bort röret.
  4. Placera det positiva kontrollprovet (t.ex. BLM, ETO) färgat med DDAOG på insugningsporten. Med låg hastighet, skaffa provdata. Observera händelserna i FSC-, SSC-, violetta, gröna och fjärrröda kanaler för att säkerställa att över 90% av händelserna finns i alla tomter. Leta efter en ökning av AF- och DDAOG-signal jämfört med endast fordonskontroll.
  5. Om du använder en sorteringscytometer, initiera sortering i detta steg.
    1. För registreringsändamål registrerar du 10 000 celler för kontrollprovet och varje sorterat prov.
    2. Sortera önskad mängd celler (≥1 × 106 är vanligtvis lämplig) i ett instrumentanpassat uppsamlingsrör med 3-5 ml odlingsmedium.
    3. Efter sortering, fortsätt till nedströms kultur eller analys.
    4. Gå vidare till avsnitt 7 för rutinanalys av sorterade prover.
  6. Om du använder fluorescerande antikroppar, optimera kanalspänningarna här med hjälp av de ofärgade, enkelfärgade och dubbelfärgade proverna som framställts i avsnitt 5.
    OBS: För den kalibrerade flödescytometern som används häri sjönk optimala kanalspänningar vanligtvis mellan 250 och 600 (mellanområdet), men de optimala spänningarna och kanalspänningsområdena varierar mellan instrumenten. Undvik att använda spänningar vid mycket låga eller höga intervall, vilket kan undertrycka signal eller förstärka brus.
  7. När du har slutfört steg 6.1-6.5 och gjort justeringar av cytometerinställningarna vid behov, registrera data för alla prover. Se till att inställningarna förblir enhetliga för alla exempelinspelningar. Registrera ≥10 000 händelser per odlat cellprov eller ≥100 000 händelser per tumörcellsprov.
    OBS: Även om gating och analys kan utföras med hjälp av datainsamlingsprogramvara (t.ex. FACSDiva), beskrivs ett komplett gating- och analysarbetsflöde som ska genomföras efter förvärvet med separat analysprogramvara (FlowJo) i avsnitt 7 nedan. Analys efter förvärv föredras för att minska tiden vid cytometerarbetsstationen och dra nytta av ytterligare verktyg som ingår i den dedikerade analysprogramvaran.
  8. Spara exempeldata i .fcs-filformat. Exportera filerna till en arbetsstationsdator utrustad med programvara för flödescytometrianalys (t.ex. FlowJo). Fortsätt till avsnitt 7.

7. Analys av flödescytometridata

OBS: Arbetsflödet som presenteras använder FlowJo-programvaran. Programvara för analys av alternativa flödescytometridata kan användas om de viktigaste stegen som beskrivs i detta avsnitt följs på liknande sätt.

  1. Använd FlowJo-programvaran för att öppna .fcs-datafiler från steg 6.7.
  2. Öppna layoutfönstret.
  3. Dra och släpp alla prover i layoutfönstret.
  4. Gate livskraftiga celler.
    1. Dubbelklicka först på exempeldata för kontrollen endast för fordonet för att öppna dess datafönster.
    2. Visualisera data som ett histogram för violett kanal. Identifiera de livskraftiga cellerna färgade av CV450 baserat på deras ljusare fluorescens än de döda cellerna.
    3. Rita en grind med hjälp av histogramverktyget med en grind för att endast inkludera livskraftiga celler. Namnge porten livskraftig.
    4. Dra sedan den livskraftiga grinden till de andra cellproverna från exempellayoutfönstret för att tillämpa grinden enhetligt.
    5. I layoutfönstret visualiserar du alla prover som histogram för violett kanal (livskraft). Kontrollera att livskraftig cellgating är lämplig över prover innan du fortsätter; Om inte, gör justeringar efter behov.
      OBS: Viabilitetsfärgning kan uppvisa variationer mellan behandlingar eller tumörer.
  5. Gate senescenta celler.
    1. Dubbelklicka på de gated viable celldata för att endast fordonets kontroll ska öppna dess datafönster.
    2. Visualisera data som ett punktdiagram för fjärrröd kanal (DDAOG) jämfört med grön kanal (AF).
    3. Rita en grind med rektangelgrindsverktyget för att inkludera <5 % av cellerna som är DDAOG+ och AF+ (övre högra kvadranten). Namnge porten senescent.
    4. Dra sedan den åldrande grinden från exempellayoutfönstret till de livskraftiga delmängderna av de andra cellproverna för att tillämpa grinden enhetligt.
    5. I layoutfönstret drar och släpper du alla livskraftiga cellundergrupper som är gated i avsnitt 7.4. Visualisera alla livskraftiga prover som fjärrröda (t.ex. APC-A) kontra gröna kanaldiagram (t.ex. FITC-A).
    6. Se till att den senescenta grinden som ritas i steg 7.5.3 är synlig på alla ytor och att grinden för endast fordonets kontroll uppvisar ≤5%-10% senescenta celler.
  6. När procentandelen senescenta celler har bestämts med hjälp av stegen ovan, presentera de resulterande data med hjälp av FlowJo-diagrammen, sammanfattade i en datatabell och / eller statistiskt analyserade med standardprogramvara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flera experiment utfördes för att visa jämförbarheten av DDAOG med X-Gal och C12-FDG för detektion av åldrande av SA-β-Gal. Först användes X-Gal för att fläcka senescenta B16-F10 melanomceller inducerade av ETO (Figur 2A). En intensiv blå färg utvecklades i en delmängd av ETO-behandlade celler, medan andra celler uppvisade mindre intensiv blå färgning. Morfologin förstorades i de flesta ETO-behandlade celler. Färgning av ETO-behandlade celler med fluorescerande SA-β-Gal-substrat C12-FDG (grönt) eller DDAOG (långt rött) visade jämförbara färgningsmönster och intensitetsvariationer med X-Gal (figur 2B). Grön C 12-FDG-emission överlappade dock med cellulär AF (figur 2C), som är känd för att ackumuleras i åldrande celler17. Däremot var AF försumbar i det långt röda utsläppsområdet för DDAOG.

Istället för att använda ett fluorescensmikroskop för att poängsätta och räkna senescenta celler, var det mer lämpligt att dra nytta av den höga genomströmningskapaciteten hos en flödescytometer för att förvärva data för tusentals celler per prov på kort tid (<5 min per prov). Först implementerades en serie standardparametrar för flödescytometri för att säkerställa optimal datainsamling (figur 3). Efter ett typiskt tillvägagångssätt ställdes ljusspridningsparametrar in för att visualisera volymen (framåtspridning, FSC) och granularitet (sidospridning, SSC) för celler (figur 3A). Här noterade vi trenden med ökad volym ETO-behandlade celler, vilket överensstämde med den förstorade morfologin som vanligtvis observeras för senescenta celler med mikroskopi. En minskning av standardinställningarna för skalning av området (till 0,33-0,50 enheter beroende på celltyp och behandling) var nödvändig för att visualisera fler av de större cellerna på diagrammet. För vissa cellinjer/behandlingar var ökad granularitet (SSC) också tydlig (data visades inte). Sammantaget användes spridningsutvärdering som ett kvalitetskontrollsteg för att verifiera att cellspridningsdata verkade som förväntat, överdriven cellskräp var inte närvarande och celler bearbetades genom cytometern vid lämpliga flödeshastigheter (~ 100-1000 celler / s). Som ett kvalitetskontrollsteg som endast användes för instrumentinställning utfördes ingen gating eller analys här.

Ett andra (valfritt) steg i flödescytometriinställningen var att kort analysera ett prov av kommersiellt tillgängliga "regnbågska" kalibreringspartiklar för att säkerställa att de fluorescerande detektionsspänningarna ställdes in i acceptabla intervall (figur 3B). Den ljusaste toppen sattes mellan 1 × 104 enheter och 1 × 105 enheter relativ fluorescerande intensitet i varje kanal, med tydligt definierade toppar med lägre intensitet, tillräcklig separation mellan varje topp och ingen överlappning av närliggande toppar. Ett kontrollprov på 10 000 mikrosfärer registrerades med hjälp av dessa spänningsinställningar. Mikrosfärerna användes sedan på detta sätt i varje cytometrisession för att förbättra enhetligheten i datainsamlingen under protokollets gång.

Därefter visualiserades prover av endast vehikel- eller ETO-behandlade celler i varje fluorescerande kanal och grindar sattes. Cellviabilitetsportar ställdes in baserat på signalen för CV450-viabilitetsfläcken i den violetta kanalen (figur 3C). Vehikelbehandlade celler uppvisade 88% viabilitet, och ETO-behandlade celler uppvisade 75% viabilitet (i det slutliga cellprovet; ytterligare döda celler avlägsnades sannolikt initialt i kasserade odlingsmedier och sönderdelades mekaniskt under färgningsprocessen). Därefter visualiserades livskraftiga gated cells i de gröna (figur 3D) och fjärrröda (figur 3E) utsläppskanalerna. Portar för grön AF HI och fjärrröd DDAOGHI sattes till <5% av endast fordonsceller, och dessa grindar applicerades sedan på ETO-behandlade celler. Med hjälp av detta tillvägagångssätt bestämdes att 46% av ETO-behandlade celler var AF HI och 33% var DDAOGHI; Dessa värden låg inom det förväntade intervallet baserat på litteratur och från resultat från många replikatexperiment i vårt laboratorium. När cytometerinställningen var klar kördes alla cellprover i experimentet med identiska datainsamlingsinställningar. Data för 10 000 händelser per prov erhölls.

Representativa analysdata visas i figur 4. B16-F10 murina melanomceller eller A549 humana lungadenokarcinomceller användes som cancercellinjemodeller. Varje cellinje behandlades med ett kemoterapimedel som är känt för att inducera åldrande (ETO eller BLM) i 4 dagar för att inducera åldrande eller endast vehikel. Vidare tillsattes det kända senolytiska medlet ABT-26321 till inducerade senescenta celler i 2 dagar för att demonstrera DDAOG-sondens specificitet. ABT-263 endast prover framställdes som ytterligare kontroller. Här visualiseras data som 2D-punktdiagram med DDAOG (670 nm-emission) kontra AF (525 nm). Arbetsflödet från figur 3 användes för cytometerinställning, och en TIS-grind ställdes in så att <5% av cellerna endast i fordonet fick poäng som TIS. Resultat med B16-F10-celler (figur 4A) visade att ETO-inducerad TIS i 35% av livskraftiga B16-F10-celler (liknande de jämförbara data som visas i figur 2D,E) och det senolytiska medlet nästan helt eliminerade TIS-celler (<2%). I A549-celler (figur 4B) inducerade BLM TIS i 66% av livskraftiga celler och ABT-263 minskade andelen till 15%. ABT-263 ensam var inte giftigt för obehandlade, prolifererande celler.

Vi syftade vidare till att visa att fluorescerande antikroppsfärgning var kompatibel med DDAOG-senescence-analysen för att underlätta screening av TIS-associerade eller nya ytmarkörer. Här behandlades B16-F10 musmelanomceller igen med TIS-inducerande ETO (eller vehikel) i 4 dagar. Därefter färgades celler båda med DDAOG för att utvärdera TIS och med en fluorescerande antikropp för att detektera den TIS-associerade ytmarkören DPP422 (figur 5). Anti-DPP4 konjugerat med R-fykoerytrin (PE) användes, och vi bekräftade försumbar överlappning av PE med DDAOG och AF på den använda flödescytometern (kompletterande figur S2). Ett histogram med PE-kanaldata (figur 5A) för >5 000 livskraftiga celler visade att 42 % av ETO-behandlade celler var DPP4+ (med hjälp av det vehikelprov som endast användes för att ställa in positivitetsgrinden). Visualisering av 2D-punktdiagram för samma prover (figur 5B,C) indikerade att 44% av ETO-behandlade celler var dubbelpositiva för DDAOG (dvs. senescent) och DPP4 jämfört med 4% av vehikelceller. Dessa data visar att levande cellfärgning med ytmarkörantikroppar är möjlig i kombination med DDAOG-åldrandeanalysen.

Potentiella problem med någon levande cellfärgningsmetod inkluderar celldöd som inträffar under långa analyssessioner (>1 h) och hur man mest effektivt fläckar och analyserar prover över många olika tidpunkter (med upp till dagars mellanrum). Lösningsmedelsbaserad fixering av färgade celler tar itu med båda dessa problem, eftersom prover kan fixas så snart de är färgade och sedan förvaras i kylskåpet tills de analyseras i en temperaturstabil sats. Således testade vi om levande celler färgade med DDAOG kunde fixeras med 100% metanol eller 4% paraformaldehyd (PFA) och lagras i upp till 1 vecka vid 4 ° C. Oönskat minskade metanolfixeringen DDAOG-signalen och minskade signifikant AF (data visas inte); Därför bör användning av metanol som fixeringslösningsmedel undvikas. Fixering med PFA var dock mycket mer framgångsrik, vilket ses i figur 6 för celler fixerade i 4% PFA i 10 minuter efter färgning med DDAOG. Jämfört med ofixerade kontrollprover (figur 6A; obehandlade, 5% och BLM, 67% DDAOGHI AFHI) UPPVISADE FASTA PROVER (FIGUR 6B) något högre bakgrund i obehandlade celler (9%) och även en högre andel celler som poängsattes som senescent i BLM-behandlade celler (80%). Denna effekt sågs också i fasta prover som förvarades över natten (figur 6C; obehandlad, 12% och BLM, 72%) och lagrades i 1 vecka vid 4 °C (figur 6D; 14% och 70%). Trots de små ökningar av fluorescensen som orsakades av PFA-fixering var induktionen av åldrande av BLM fortfarande tydlig i alla fasta prover jämfört med det matchade obehandlade provet. Vidare förblev cellerna intakta i lagring med endast liten försämring vid dag 7, och ingen problematisk aggregering observerades. Vi drar slutsatsen att bekvämligheten med att kunna fixa och lagra cellprover för senare batchanalys kommer att motivera att tolerera den något högre bakgrunden som orsakas av PFA-fixering, särskilt i experiment med många prover eller tidpunkter.

En vanlig utmaning inom cellbaserad åldrandeforskning är den heterogena uppkomsten av åldrande i cellpopulationer. Här visar vi att DDAOG kan användas för FACS av livskraftiga åldrande celler och att insamlade celler överlever i odling för nedströms in vitro-analyser (figur 7). För att sortera celler efter FACS behandlas och färgas celler, enligt beskrivningen, och sorteras efter en FACS-kompatibel flödescytometer med hjälp av DDAOG kontra AF-gatet-strategin som visas här (figur 7A). Eftersom en viabilitetssond inte används här på grund av långsiktiga toxicitetsproblem, rekommenderar vi att strikt spridningsgrind utförs före den slutliga senescentcellen gating (kompletterande figur S3) för att eliminera falskt positivt skräp från de uppsamlade cellerna. Dessa är standard FACS-grindprocedurer som bör vara bekanta för en måttligt erfaren användare och kan snabbt etableras med hjälp av programvara vid instrumentet (<10 min).

Efter att ha sorterat ett prov av BLM-behandlade A549-celler returnerade vi cellerna till odling i vanliga multiwell-rätter i 5 dagar (n = 6 replikat) vid 10 × 103 celler / cm2. Osorterade kontroller pläterades med samma densitet, odlades vid sidan av, och obehandlade och BLM-behandlade celler inkluderades. Celler observerades dagligen; För sorterade celler observerades ingen signifikant celldöd eller återgång till proliferation. Sorterade celler förblev glesa (dvs. inte förökade) under 5 dagar i odling, medan obehandlade och BLM-behandlade celler blev sammanflytande som visas. På dag 5 fixerades celler i PFA och färgades för morfologi och proliferationsmarkörer (figur 7B). Den karakteristiska förstorade morfologin hos sorterade celler avslöjades genom fluorescerande falloidinfärgning av trådformigt aktin, med DAPI-färgning för att visa förstorade kärnor. Sorterade celler var mycket stora i diameter (>10 μm) med ett karakteristiskt rundat utseende. Som förväntat avslöjade Ki67-antikroppsfärgning en fullständig förlust av proliferationsmarkören i det sorterade provet jämfört med en partiell förlust i det osorterade BLM-behandlade provet, och normala nivåer av Ki67 sågs i många celler i det obehandlade osorterade provet. Minst tre bilder togs per brunn med hjälp av enhetliga bildinställningar över prover. Representativa bilder visas (figur 7B).

Slutligen bedömde vi om senescenta celler som uppstår i tumörer etablerade hos möss som behandlats med kemoterapeutiska läkemedel kunde identifieras med hjälp av DDAOG. B16-F10 melanomtumörer inducerades i flanken av C57/BL6-möss, som sedan behandlades tre gånger (i.p. var 5: e dag) med endast saltlösning (figur 8A), DOX (figur 8B) eller PLD (figur 8C). Efter den tredje behandlingen återhämtade sig mössen i 7 dagar för att möjliggöra uppkomsten av åldrande och offrades sedan och tumörer skärs ut. Tumörerna halverades, med hälften som användes för att förbereda frysta vävnadsglas för X-Gal-färgning (figur 8) och hälften dissocierades i encellssuspensioner och färgades med DDAOG (figur 8 och kompletterande figur S4). X-Gal-färgning i vävnader var ganska svag trots en lång färgningstid (72 h), men blå färgning var tydlig i DOX- och PLD-tumörer vid noggrann inspektion, särskilt i tumörer som också fick positiva resultat för åldrande genom DDAOG-flödesanalys (figur 8B, C). Minst tre bilder togs per vävnadsglas och representativa bilder visas.

Jämfört med X-Gal var DDAOG ett mer känsligt och exakt sätt att kvantifiera åldrande i tumörer (figur 8). För DDAOG-tumöranalys användes den saltlösningsbehandlade tumören med den högsta fluorescensbakgrunden för att ställa in åldrandeporten på <5%, så att de andra saltlösningsbehandlade tumörerna inte fick över 5% åldrande. Denna åldrande grind applicerades sedan på gated livskraftiga celler från alla tumörer. Båda kemoterapimedlen inducerade åldrande i vissa tumörer (två av fem tumörer för DOX, tre av fem för PLD), med procentandelar av senescenta tumörceller som varierar från 3% till 36% per tumör. Cytometridatadiagram för alla 15 tumörer visas i kompletterande figur S4, och en sammanfattning av tumörcytometridata visas i figur 8D (n = 5; (*) p < 0,05 jämfört med kontrollgruppen endast för saltlösning genom F-varianstestet). Vi drar slutsatsen att DDAOG kontra AF-flödescytometri är en acceptabel metod för screening av tumörer och kemoterapimedel för induktion av åldrande in vivo.

Figure 2
Figur 2: DDAOG är en känslig och specifik fläck för SA-β-Gal. (A) Konventionell färgning för SA-β-Gal med X-Gal som visar obehandlade (vänster) eller ETO-behandlade (höger) B16-F10 murina melanomceller. Senescence inducerad av ETO: celler uppvisar förstorad morfologi och blå färgning på grund av klyvning av X-Gal genom förhöjd SA-β-Gal. Skalstänger = 10 μm. (B) Fluorescerande färgning för SA-β-Gal i ETO-behandlade celler med antingen C12-FDG (515 nm emission, grön) eller DDAOG (660 nm, röd). Färgningsfördelningen är liknande för båda sonderna, vilket indikerar att DDAOG detekterar SA-β-Gal på ett liknande sätt som C12-FDG. (C) Utvärdering av AF i ofärgade, ETO-behandlade celler i antingen den gröna (525 nm emission, vänster) eller fjärrröda (660 nm, höger) utsläppskanalen. AF från lipofuscin är högt i den gröna utsläppskanalen och försumbar i den fjärran röda kanalen. Exponeringstid = 2 000 ms för varje bild. Skalstänger = 10 μm. Denna siffra är omtryckt från Flor och Kron23. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; X-Gal = 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid; UNT = obehandlad; ETO = etoposid; AF = autofluorescens; C12-FDG = 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid; SA-β-Gal = åldrande-associerad beta-galaktosidas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Inställning av datainsamling för flödescytometer. (A) Representativ spridning av celler i spridningsdiagram. FSC-A är en avläsning av cellvolymen, och SSC-A indikerar cellulär granularitet. Vänster panel, endast vehikelbehandling av A549-celler. Höger panel, ETO-behandling för att inducera åldrande. Observera trenden mot förstorad cellvolym av ETO-behandlade celler, i överensstämmelse med den förstorade morfologin som framgår av mikroskopi. (B) Valfri användning av 5-topp kommersiella "regnbåge" fluorescerande kalibreringsmikrosfärer för att ställa in detektorspänningar för cytometern. I varje fluorescenskanal som används bör den maximala toppen ställas in ≤1 x 105 relativa fluorescerande enheter genom att justera cytometerdetektorns spänning medan proverna körs. Vänster panel, BV421 (violett) kanal; centrum, FITC (grön) kanal; höger, APC (röd) kanal. De fem fluorescerande topparna bör uppvisa distinkt avstånd som visas. (CE) Representativa enkanals fluorescensdata för (C) viabilitetsfärgning med violett CV450-färgämne; D) Grön autofluorescens av celler. (E) Fjärrröd signal från DDAOG, detekterar SA-β-Gal. Mörkare färghistogram, behandling endast av fordon; ljusare färghistogram, ETO-behandling. Föräldraportar anges ovanför varje tomt. Förkortningar: FSC-A = framåtspridningstopparean; SSC-A = sidospridningstopparearea; ETO = etoposid; BV421-A = Lysande violett 421 kanals toppområde; FITC-A = fluorescein isotiocyanatkanals topparea; APC-A = allophycocyanin kanal topparea; AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; VEH = fordon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa data för analys av flödescytometri senescence . (A) B16-F10 murina melanomceller behandlade med (övre vänstra) vehikel, (uppe till höger) ETO, (nedre vänstra) endast ABT-263 (1 μM) eller (nere till höger) ETO plus ABT-263. (B) A549 humana lungadenokarcinomceller behandlade med endast (övre vänstra) vehikel, (uppe till höger) BLM, (nedre vänstra) endast ABT-263 eller (nere till höger) BLM plus ABT-263. (A,B) Rektangulära grindar i övre högra kvadranter i alla diagram definierar senescenta celler (DDAOGHI AFHI). Procentandelen senescenta celler (av totalt livskraftiga celler per prov) anges i varje diagram. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; ETO = etoposid; BLM = bleomycin; VEH = fordon; TIS = terapiinducerad åldrande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Samfärgning av en exempelmarkör för cellytan med åldrandeanalys. (A) Immunodetektion av åldrandemarkör DPP4 på ytan av livskraftiga B16-F10-odlade celler; mörkorange, endast fordon; ljusorange, ETO. (B,C) Mitt- och högerpaneler: celler som färgas tillsammans med DDAOG och anti-DPP4:PE. DDAOGHI DPP4HI-celler finns i rektangulära grindar som visas på diagrammen, och procentandelen dubbelpositiva celler per prov indikeras. Visas: livskraftiga gated celler. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; ETO = etoposid; VEH = fordon; DPP4 = dipeptidylpeptidas 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Poststaining fixering och lagring av DDAOG-färgade cellprover för senare analys. (A) Kontroll, ofixerade prover av levande A549-celler antingen obehandlade (vänster) eller behandlade med BLM (höger) för att inducera åldrande, och färgas sedan och analyseras omedelbart med DDAOG-protokollet (utan fixering, dag 0). (B) Prover som beretts enligt (A) och sedan omedelbart fixerats i 4% paraformaldehyd och analyserats (dag 0). C) Prover som beretts enligt A, omedelbart fixerats i 4 % paraformaldehyd och förvarats över natten vid 4 °C före analys. D) Prover som beretts enligt A, omedelbart fixerats och förvarats i 7 dagar före analysen. Rektangulära grindar i de övre högra kvadranterna i alla tomter definierar senescenta celler (DDAOGHI AFHI). Procentandelen senescenta celler anges på varje diagram. Förkortningar: TIS = terapiinducerad åldrande; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; BLM = bleomycin; AF = autofluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Flödescytometrisk sortering och validering av berikade senescenta cellpopulationer. (A) Flödescytometriska sorteringsdata som visar (vänster) den obehandlade, DDAOG-färgade kontrollen som används för att ställa in grinden för senescent cellsortering (<5% senescenta celler i gated region) och (höger) det BLM-behandlade, DDAOG-färgade provet som sorterades med hjälp av sorteringsgrinden som visas. (B) Fluorescensmikroskopibilder för (vänster kolumn) celler färgade med Phalloidin-Alexa Fluor 647 (orange pseudofärg) för att detektera F-aktin och DAPI (blå) för att motverka kärnor, som visar förstorad morfologi av senescenta celler, eller (höger kolumn) celler färgade med kanin Ki67-antikropp och anti-kanin Alexa Fluor 594 för att upptäcka förlust av proliferation i åldrande celler. Översta raden, obehandlade och osorterade celler. Mittrad, BLM-behandlade och osorterade celler. Nedre raden, BLM-behandlade och sorterade celler. Skalstänger = 10 μm. Förkortningar: TIS = terapiinducerad åldrande; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; BLM = bleomycin; UNT = obehandlad; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Kvantifiering av åldrande i tumörer från möss behandlade med kemoterapiläkemedel. B16-F10 melanomtumörer etablerades i flankerna av C67BL/6-möss, som sedan behandlades med tre doser av (A) saltlösning, (B) DOX eller (C) PLD var 5: e dag plus 1 vecka för att möjliggöra uppkomsten av åldrande. Tumörer skars ut och halverades; frysta vävnadsglas framställdes från ena halvan för X-Gal-färgning (övre raden), och den andra halvan dissocierades för DDAOG-färgning (nedre raden). I X-Gal-färgade bilder är blå celler SA-β-Gal HI-senescenta celler, medan bruna regioner beror på melanin i tumörer. Representativa resultat visas för DOX och PLD från två tumörer per grupp som uppvisade åldrande. Alla saltlösningstumörer uppvisade försumbar åldrande. (D) Kvantifiering av åldrande i läkemedelsbehandlade tumörer från möss. (*) p < 0,05 med F-varianstest, n = 5 möss per grupp. Felstaplar, medelvärde ± SEM. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-en); DDAOG = DDAO-Galaktosid; DOX = doxorubicin; PLD = PEGylerat liposomalt doxorubicin; X-Gal = 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid; AF = autofluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande figur S1: DDAOG-sondens kemiska struktur. DDAOG är ett konjugat av 7-hydroxi-9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on) och betagalaktosid. När den klyvs av beta-galaktosidas uppvisar den hydrolyserade klyvningsprodukten ett 50 nm långt rött fluorescensemssionsskifte, vilket möjliggör dess specifika detektion med excitation över 600 nm. Förkortningar: DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Spektral skanning av DDAOG-överhörning med andra fluorescerande kanaler i flödescytometern. För att identifiera tillgängliga kanaler för detektion av fluorescerande antikroppar utfördes en spektralskanning på en 4-laser, 15-kanals flödescytometer med användning av A549-celler behandlade med BLM och färgade med DDAOG (röd) eller ofärgad (svart). Data i varje kanal i flödescytometern förvärvades för 10 000 celler. (A) Emissionskanaler för 405 nm-lasern: från vänster till höger, BV421, BV510, BV605, BV660 och BV711. Överhörningen som observerats i kanalerna BV605, BV660 och BV711 gör dem olämpliga för samfärgning med DDAOG utan kompensation. BV421 och BV510 är lämpliga för samfärgning (observera att BV421 vanligtvis används för viabilitetsfärgning). B) Emissionskanaler för 488 nm-lasern: FITC och PerCP-Cy5. Hög överhörning observerades för PerCP-Cy5-kanalen. FITC är lämplig för samfärgning; Observera dock att FITC-kanalen vanligtvis används i DDAOG-analysen för utvärdering av grön utsläpps-AF. C) Emissionskanaler för 561 nm-lasern: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 och PE-Cy7. PE- och PE-Dazzle 594-kanalerna är lämpliga för detektion av antikroppar märkta med dessa fluoroforer (PE demonstreras för detektion av DPP4 i denna studie). D) Emissionskanaler för 640 nm-lasern: APC, APC-H700 och APC-Cy7. DDAOG-signalen för de åldrande cellerna är synlig i APC-kanalen (47,8% senescent). Signalen överlappar varandra i APC-H700- och APC-Cy7-kanalerna, vilket gör dem olämpliga för samfärgning utan signifikant spektralkompensation. Förkortningar: BLM = bleomycin; BV = Lysande violett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PerCP = peridinin-klorofyllprotein; PE = phycoerythrin; DZ594 = Bländning 594; APC = allophyocyanin; AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactoside. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Cell gating-strategi för FACS-sortering av åldrande celler. Att passera en suspension av celler genom en känslig FACS-cytometer kan kräva ytterligare gating för att säkerställa renheten i sorteringen och optimal instrumentfunktionalitet. Ett exempel på strategi visas här. Andra strategier är möjliga beroende på tillverkarens rekommendationer för FACS-cytometern som används. Vänster kolumn, cellkontroll som endast behandlats av fordon. Höger kolumn, A549-celler behandlade med BLM för att inducera åldrande att sorteras. (A) FSC-A (cellvolym) kontra SSC-A (cellgranularitet) gating av intakta celler. Den intakta grinden eliminerar cellskräp från det sorterade provet. B) FSC-A i förhållande till FSC-H-renhetsgating. tar bort dubbletter och skräp. C) SSC-A i förhållande till SSC-H-renhetsgating. tar bort dubbletter och skräp. D) Gating för den population som är av intresse med hjälp av APC-A-kanalen (637 nm excitation, 670 nm ± 30 nm emission, som används för DDAOG) kontra FITC-A-kanal (488 nm excitation, 530 nm ± 30 nm emission, som används för AF). tar bort eventuella färgningsartefakter. (E) Senescent cell gating för slutlig sortering. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; BLM = bleomycin; FSC-A = spridningstopparean framåt; SSC-A = sidospridningstopparearea; FSC-H = framåtriktad spridningstopphöjd; SSC-H = sidospridningstopphöjd. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S4: DDAOG senescence flödescytometri färgning av tumörer. Flödescytometridata för ≥ 50 000 livskraftiga tumörceller. Senescent cellport, övre högra kvadranten i varje tomt. Andelen senescenta (av livskraftiga) tumörceller visas inom porten. Tumörbehandlingar inkluderade (A) endast saltlösning; b) DOX, och (C) PLD. Möss behandlades tre gånger, en gång var 5: e dag, med 7 dagar för återhämtning för att möjliggöra uppkomsten av åldrande före offer. Fem tumörer per tillstånd analyserades. Förkortningar: AF = autofluorescens; DDAO = 9H-(1,3-diklor-9,9-dimetylakridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galaktosid; DOX = doxorubicin; PLD = PEGylerat liposomalt doxorubicin. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under det senaste decenniet eller så har flödescytometri blivit en vanligare analysplattform inom cancerforskning på grund av tumörimmunologins framväxande popularitet, utvecklingen av billigare flödescytometrar och förbättringen av delade instrumenteringsanläggningar vid akademiska institutioner. Flerfärgade analyser är nu standard, eftersom de flesta nyare instrument är utrustade med violetta, blågröna och röda till långt röda optiska arrays. Således är detta DDAOG-protokoll sannolikt kompatibelt med ett brett spektrum av flödescytometrar. Naturligtvis bör alla flödescytometer utvärderas av användaren. Särskild försiktighet bör iakttas vid tillsats av ytterligare fluoroforer (t.ex. fluorescerande, konjugerade antikroppar) till DDAOG-analysen. En utvärdering av fluoroforöverhörning mellan kanaler bör utföras med hjälp av enkelfärgade kontroller visualiserade i alla andra relevanta kanaler. Om överlappning observeras kan spektralkompensation utföras20 för korrigering enligt typiska metoder.

Resultaten som visas häri är främst avsedda att visa att DDAOG-flödescytometrianalysen kan ge snabba, kvantitativa, lätttolkade resultat för TIS inducerad av kemoterapiläkemedel i celler eller tumörer. De medel som används här, inklusive ETO 23,24, DOX 7,25 och BLM 26,27, har dokumenterats för att inducera TIS i olika cancercellinjer 24. För att demonstrera DDAOG-sondens specificitet demonstrerades det kända senolytiska medlet ABT-26321 för att selektivt eliminera senescenta celler i odling. Detta dokument visar användningen av en murin (B16-F10) och en human (A549) odlad cancercellinje, liksom B16-F10-tumörer etablerade hos möss. Alla celler som uttrycker β-Gal och behåller livskraften genom ett standardflödescytometriprovpreparat kan emellertid användas. Vissa celltyper kan vara mer ömtåliga eller mindre benägna att TIS, och detta bör utvärderas innan du påbörjar en stor skärm eller studie. Om celler sönderfaller under beredning, livskraften är dålig eller TIS är mycket lägre än förväntat med hjälp av positiva agentkontroller, kanske celltypen inte är en idealisk modell för studier av åldrande. De medel och cellinjer som visas här kan användas av andra grupper som kontroller vid ytterligare screening av potentiella TIS-inducerande medel eller nya senolytika, vilket fortfarande är ett aktivt mål i fältet.

Toxicitet inducerad av kemoterapi läkemedel kan variera mellan celltyper och påverka analysresultat. Om den primära observerade effekten av det medel och/eller den koncentration som används är akut celldöd, kan den totala åldrandet vara minimalt. In vivo ska hög tumörnekros eller systemisk toxicitet hos djur undvikas genom att sänka doseringen av medlet. Nyckeln till analysframgång är testning av en rad olika agentkoncentrationer, med noggrann inspektion av viabilitetsanalysdata (t.ex. enligt CV450 inom DDAOG-analysen). In vitro, om många döda celler lossnar från plattan under behandlingen, inklusive odlingsmediet i det analyserade provet, är det viktigt att utvärdera celldöd totalt. CV450 är inte den enda livskraftsfläcken som är kompatibel med denna analys; Andra violetta/blåutgivande fluoroforer får användas. Fixerbara viabilitetssonder kan också användas om användaren planerar att fixera de färgade proverna med PFA, förutsatt att sondfluorescensen inte väsentligt överlappar DDAOG eller AF (eller användaren utför spektral kompensation för att korrigera för överlappning). I vissa fall där agenttoxiciteten är låg och cellerna är robusta kan det vara tillräckligt att isolera intakta celler med ljusspridning (FSC vs. SSC) för att isolera "livskraftiga" celler för analys.

Ett viktigt steg i detta in vitro-protokoll är att platta celler i det lägre intervallet av stocktillväxttäthet (vanligtvis 2 × 10 3-5 × 103 celler / cm2) för att möjliggöra snabb initial spridning, vilket underlättar upptaget av kemoterapiläkemedlet av de flesta celler. När det har behandlats är det också viktigt att ge tid för uppkomsten av TIS: in vitro, 4 dagar ± 1 dag i närvaro av läkemedlet; in vivo, 7 dagars återhämtning efter den sista kemoterapibehandlingen. Efter färgning med DDAOG enligt beskrivningen bör kvantitativ analys av cytometriska data utföras som visas, dvs. gating DDAOG kontra AF-celler i varje prov för att bestämma procentandelen senescenta celler (av total livskraftig). Valfria steg inkluderar användning av fluorescerande "regnbåge" -kalibreringsmikrosfärer för att standardisera flödescytometri, PFA-fixering av färgade prover, co-immunostaining för ytmarkörer och flödessortering för att berika senescenta celler för nedströmsanalyser. Men vart och ett av dessa valfria steg ger viktiga fördelar i vissa applikationer. Kalibreringsmikrosfärerna standardiserar cytometriinställningen över flera sessioner och gör det möjligt för användaren att initialt ställa in spänningar i ett användbart intervall för åldrande och viabilitetsdetektering, med minimala justeringar därefter. PFA-fixering av prover stabiliserar cellerna och möjliggör batchanalys av stora uppsättningar celler vid ett senare tillfälle. Co-immunostaining för ytmarkörer kan användas för att screena för nya åldrande-relaterade proteiner och immuninteraktioner. I framtida studier planerar vi att validera samfärgningen av intracellulära åldrandemarkörer med DDAOG.

Sortering av TIS-celler med FACS möjliggör anrikning av livskraftiga TIS-celler från heterogena populationer, vilket kan förvirra avläsningar för nedströmsanalyser som western blotting, proteomik eller transkriptomik. Efter sortering observerades ingen signifikant toxicitet av DDAOG i TIS-celler som placerats tillbaka i odling i upp till 5 dagar. Det bör dock beaktas att sorterade celler har behandlats med Baf, internaliserad DDAOG (som klyvs av SA-β-Gal till DDAO, ett akridinfärgämne) och utsatts för mekanisk stress som passerar genom FACS-instrumentet. Därför kan vissa biologiska förändringar som inte är relaterade till åldrande vara närvarande i de sorterade cellerna. I denna studie behöll emellertid de sorterade cellerna starka egenskaper hos åldrande och gav karakteristiska proteomik- och transkriptomikresultat28 jämfört med osorterade kontroller. Trots den något uppenbara nyttan av att använda FACS för att samla in och analysera åldrande celler från tumörer har denna procedur sällan använts i litteraturen. Vissa grupper har använt p16Ink4a luciferas eller fluorescerande reportrar för att identifiera åldrande celler i musvävnader, med fluorescerande reportrar som möjliggör FACS-sortering i vissa studier29,30. Resultaten är i allmänhet överens om att, oavsett induktionsmedel eller tumörtyp, är TIS i tumörer en partiell till sällsynt förekomst och når sällan 100% av tumörcellerna31. FACS-sortering av celler med DDAOG-metoden möjliggör lätt insamling av sällsynta TIS-celler från tumörer, utan att behöva uttrycka transgena konstruktioner.

För närvarande utförs de flesta senescensforskning i musmodeller ex vivo med en kombination av X-Gal och immunhistokemimarkörer32,33. Ändå kan bedömning av TIS ex vivo med tumörvävnader vara en lång process, särskilt när X-Gal används. Denna procedur kräver tumörkryokonservering, kryosektion på glas, X-Gal-färgning, montering av täckglas, torkning, avbildning och poängsättning av "blå" celler - ett flerdagarstillvägagångssätt åtminstone. Immunhistokemi är inte mycket snabbare eller enklare, och olika vävnadssektioner måste användas och poängsättas för varje markör plus X-Gal i varje tumör, såvida inte den multiplexerade analysen optimeras, vilket ger mer tid i front-end av processen. Vävnadssektioner tar endast ett tunt tvärsnitt av tumören, medan senescenta celler (som många celltyper) kan fördelas ojämnt i 3D-utrymme över tumörer29. Det är angeläget i fältet att gå bort från långsamma, föråldrade histologimetoder mot en snabbare och lättare kvantifierbar åldrandeanalys för tumörer. Med hjälp av DDAOG-flödescytometri kunde en uppsättning av 15 tumörer dissocieras och färgas för att erhålla avgörande, kvantitativa åldrande data på mindre än 1 dag av praktisk tid efter tumörskörd. Hälften av tumören bearbetades för varje prov, vilket förbättrade provtagningen av 3D-utrymme per tumör. Denna DDAOG-flödescytometrimetod är betydligt snabbare och mer tillförlitlig än vävnadsglidbaserade metoder för utvärdering av TIS i tumörer.

Med sina många fördelar jämfört med X-Gal och andra metoder förespråkar vi att DDAOG-protokollet ska bli den nya guldstandarden senescence assay. Den använder både den konventionellt accepterade åldrandemarkören, SA-β-Gal, och etikettfri detektion av åldersassocierad AF som en andra markör. Dessa fluoroforer är kompatibla med de flesta standardflödescytometrar. Analysen inkluderar en viabilitetsfläck för att utesluta döda celler och skräp med hjälp av prover som lätt erhållits från läkemedelsbehandlade odlade cellinjer eller tumörer. Levande cellprover kan valfritt lösningsmedelsfixeras eller kryokonserveras för att underlätta batchanalys av stora studier, t.ex. med hjälp av tidpunkter för att utvärdera uppkomsten av TIS över tid med flera medel Färgningsprocessen tar mindre än en halv dag av laboratoriearbete att slutföra, och datainsamlingen är vanligtvis <5 minuter per prov. Dataanalys är lika snabb och enkel och producerar kvantitativa data om andelen TIS-celler per prov utan tråkig cellpoäng och räkning. Prover kan FACS-sorteras för att återställa berikade populationer av TIS-celler, vilket minskar brus från cellulär heterogenitet i nedströmsanalyser. Vi tror att DDAOG-analysen i många fall kan ersätta X-Gal, vilket underlättar screening av TIS-inducerande medel och senolytika in vitro och in vivo, vilket leder till snabbare och mer tillförlitliga upptäckter inom åldrandeforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera för denna studie.

Acknowledgments

Vi tackar Cytometry and Antibody Core Facility vid University of Chicago för stöd för flödescytometriinstrumentation. Animal Research Center vid University of Chicago tillhandahöll djurbostäder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

Tags

Cancerforskning nummer 187 Åldrande cancer kemoterapi flödescytometri fluorescerande sond multiplex
Långt-röd fluorescerande åldrande-associerad β-galaktosidassond för identifiering och anrikning av åldrande tumörceller genom flödescytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter