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Cancer Research

Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64176
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

Summary

Viene presentato un protocollo per la quantificazione fluorescente citometrica a flusso di cellule tumorali senescenti indotte da farmaci chemioterapici in colture cellulari o in modelli tumorali murini. Le procedure opzionali includono la co-immunocolorazione, la fissazione del campione per facilitare l'analisi di grandi lotti o punti temporali e l'arricchimento di cellule senescenti vitali mediante selezione citometrica a flusso.

Abstract

La senescenza cellulare è uno stato di arresto proliferativo indotto da un danno biologico che normalmente si accumula nel corso degli anni nelle cellule che invecchiano, ma può anche emergere rapidamente nelle cellule tumorali come risposta al danno indotto da vari trattamenti antitumorali. La senescenza delle cellule tumorali è generalmente considerata indesiderabile, poiché le cellule senescenti diventano resistenti alla morte e bloccano la remissione del tumore, esacerbando la malignità del tumore e la resistenza al trattamento. Pertanto, l'identificazione di cellule tumorali senescenti è di continuo interesse per la comunità di ricerca sul cancro. Esistono vari saggi di senescenza, molti basati sull'attività del noto marcatore di senescenza, la beta-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal).

Tipicamente, il saggio SA-β-Gal viene eseguito utilizzando un substrato cromogenico (X-Gal) su cellule fisse, con l'enumerazione lenta e soggettiva delle cellule senescenti "blu" mediante microscopia ottica. Saggi migliorati che utilizzano substrati fluorescenti SA-β-Gal permeanti alle cellule, tra cui C12-FDG (verde) e DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), hanno permesso l'analisi di cellule viventi e consentito l'uso di piattaforme di analisi fluorescenti ad alto rendimento, compresi i citometri a flusso. C12-FDG è una sonda ben documentata per SA-β-Gal, ma la sua emissione fluorescente verde si sovrappone all'autofluorescenza cellulare intrinseca (AF) che si verifica durante la senescenza a causa dell'accumulo di aggregati lipofuscinici. Utilizzando la sonda SA-β-Gal DDAOG, l'autofluorescenza cellulare verde può essere utilizzata come parametro secondario per confermare la senescenza, aggiungendo affidabilità al test. I restanti canali di fluorescenza possono essere utilizzati per la colorazione della vitalità cellulare o per l'immunomarcatura fluorescente opzionale.

Utilizzando la citometria a flusso, dimostriamo l'uso di DDAOG e autofluorescenza lipofuscina come saggio a doppio parametro per l'identificazione di cellule tumorali senescenti. Viene eseguita la quantificazione della percentuale di cellule senescenti vitali. Se lo si desidera, può essere inclusa una fase di immunomarcatura opzionale per valutare gli antigeni di superficie cellulare di interesse. Le cellule senescenti identificate possono anche essere selezionate citometricamente a flusso e raccolte per l'analisi a valle. Le cellule senescenti raccolte possono essere immediatamente lisate (ad esempio, per saggi immunologici o analisi omiche) o ulteriormente coltivate.

Introduction

Le cellule senescenti normalmente si accumulano negli organismi nel corso degli anni durante il normale invecchiamento biologico, ma possono anche svilupparsi rapidamente nelle cellule tumorali come risposta ai danni indotti da vari trattamenti antitumorali, tra cui radiazioni e chemioterapia. Sebbene non siano più proliferanti, le cellule tumorali senescenti indotte dalla terapia (TIS) possono contribuire alla resistenza al trattamento e guidare la recidiva 1,2,3. I fattori secreti dalle cellule TIS possono esacerbare la malignità tumorale promuovendo l'evasione immunitaria o le metastasi 4,5. Le cellule TIS sviluppano fenotipi complessi e specifici del contesto, profili metabolici alterati e risposte immunitarie uniche 6,7,8. Pertanto, l'identificazione e la caratterizzazione delle cellule tumorali TIS indotte da vari approcci terapeutici del cancro è un argomento di continuo interesse per la comunità di ricerca sul cancro.

Per rilevare le cellule tumorali TIS, i saggi di senescenza convenzionali sono ampiamente utilizzati, principalmente basati sulla rilevazione di una maggiore attività dell'enzima marcatore di senescenza, la beta-galattosidasi lisosomiale GLB19. Il rilevamento a un pH lisosomiale quasi neutro (piuttosto che acido) consente il rilevamento specifico della beta-galattosidasi associata alla senescenza (SA-β-Gal)10. Un saggio standard SA-β-Gal che è stato utilizzato per diversi decenni utilizza X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside), un substrato cromogenico blu della beta-galattosidasi, per rilevare SA-β-Gal in cellule fisse mediante microscopia ottica11. Il test X-Gal consente la conferma visiva qualitativa di TIS utilizzando reagenti comunemente disponibili e apparecchiature di laboratorio. Un microscopio a luce trasmessa di base è l'unica strumentazione necessaria per valutare la presenza del cromogeno blu. Tuttavia, la procedura di colorazione X-Gal può mancare di sensibilità, a volte richiedendo più di 24 ore per lo sviluppo del colore. La colorazione è seguita da un punteggio soggettivo a basso rendimento delle singole cellule senescenti basato sul conteggio delle cellule che mostrano un certo livello di intensità del cromogeno blu al microscopio ottico. Poiché X-Gal è impermeabile alle cellule, questo test richiede celle fissate con solvente, che non possono essere recuperate per l'analisi a valle. Quando si lavora con campioni limitati di animali o pazienti, questo può essere un grosso svantaggio.

Saggi migliorati di SA-β-Gal utilizzando substrati enzimatici fluorescenti permeanti alle cellule, tra cui C 12-FDG (5-dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside, verde) e DDAOG (9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-one-7-yl) β-D-Galactopyranoside, far-red) sono stati precedentemente pubblicati in letteratura12,13,14,15. La struttura chimica della sonda e le caratteristiche ottiche del DDAOG sono mostrate nella figura supplementare S1. Queste sonde cellulari consentono l'analisi di cellule viventi (piuttosto che fisse) e le sonde fluorescenti piuttosto che cromogeniche facilitano l'uso di piattaforme di analisi fluorescenti rapide ad alto rendimento, compresi strumenti di screening ad alto contenuto e citometri a flusso. I citometri a flusso di selezione consentono il recupero di popolazioni arricchite di cellule senescenti viventi da colture cellulari o tumori per l'analisi a valle (ad esempio, western blotting, ELISA o 'omics). L'analisi della fluorescenza fornisce anche un segnale quantitativo, consentendo una determinazione più accurata della percentuale di cellule senescenti all'interno di un determinato campione. Ulteriori sonde fluorescenti, tra cui sonde di vitalità e anticorpi marcati con fluorofori, possono essere facilmente aggiunte per l'analisi multiplex di bersagli oltre SA-β-Gal.

Simile a DDAOG, C12-FDG è una sonda fluorescente per SA-β-Gal, ma la sua emissione fluorescente verde si sovrappone alla FA cellulare intrinseca, che si verifica durante la senescenza a causa dell'accumulo di aggregati di lipofuscina nelle cellule16. Utilizzando la sonda DDAOG rosso, la fibrillazione atriale cellulare verde può essere utilizzata come parametro secondario per confermare la senescenza17. Ciò migliora l'affidabilità del test utilizzando un secondo marcatore in aggiunta a SA-β-Gal, che spesso può essere inaffidabile come singolo marcatore per la senescenza18. Poiché la rilevazione della fibrillazione atriale endogena nelle cellule senescenti è un approccio label-free, è un modo rapido e semplice per espandere la specificità del nostro test basato su DDAOG.

In questo protocollo, dimostriamo l'uso di DDAOG e AF come test di citometria a flusso rapido e a doppio parametro per l'identificazione di cellule tumorali TIS vitali da colture in vitro o isolate da tumori trattati con farmaci stabiliti nei topi (Figura 1). Il protocollo utilizza fluorofori compatibili con un'ampia gamma di analizzatori e selezionatori di citometria a flusso commerciali standard (Tabella 1). È abilitata la quantificazione della percentuale di cellule senescenti vitali utilizzando l'analisi citometrica a flusso standard. Se lo si desidera, può essere eseguita una fase di immunomarcatura opzionale per valutare gli antigeni della superficie cellulare di interesse in concomitanza con la senescenza. Le cellule senescenti identificate possono anche essere arricchite utilizzando la metodologia standard di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro sperimentale. Uno schema che riassume i punti chiave del test DDAOG. (A) Un farmaco che induce TIS viene aggiunto a cellule coltivate di mammiferi o somministrato a topi portatori di tumore. Il tempo è quindi concesso per l'insorgenza della TIS: per le cellule, 4 giorni dopo il trattamento; per i topi, 22 giorni totali, con tre trattamenti ogni 5 giorni più 7 giorni di recupero. Le cellule vengono raccolte o i tumori vengono dissociati in sospensione. (B) I campioni sono trattati con Baf per regolare il pH lisosomiale per la rilevazione di SA-β-Gal per 30 minuti; quindi, la sonda DDAOG viene aggiunta per 60 minuti per rilevare SA-β-Gal. I campioni vengono lavati 2 volte in PBS e viene aggiunta brevemente una macchia di vitalità (15 min). Opzionalmente, i campioni possono essere colorati con anticorpi fluorescenti in canali di fluorescenza aperti e/o fissati per analisi successive. (C) I campioni vengono analizzati utilizzando un citometro a flusso standard. Le cellule vitali sono visualizzate in grafici a punti che mostrano DDAOG rosso (che indica SA-β-Gal) rispetto all'autofluorescenza verde (lipofuscina). Un gate per determinare la percentuale di cellule TIS viene stabilito sulla base di campioni di controllo non trattati (non mostrati). Se viene utilizzato un citometro di selezione (FACS), le cellule TIS possono essere raccolte e rimesse in coltura per ulteriori test in vitro o lisate ed elaborate per saggi di biologia molecolare. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; TIS = senescenza indotta dalla terapia; FL-Ab = anticorpo coniugato con fluorofori; Baf = Bafilomicina A1; SA-β-Gal = beta-galattosidasi associata alla senescenza; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Fluoroforo Rileva Ex/Em (nm) Laser citometrico (nm) Rilevatore citometrico / filtro passa banda (nm)
DDAOG SA-β-Gal 645/6601 640 670 / 30
AF Lipofuscina < 600 488 525 / 50
CV450 Vitalità 408/450 405 450 / 50
PE Marcatore anticorpo/superficie 565/578 561 582 / 15

Tabella 1: Specifiche ottiche dei fluorofori e dei citometri. Le specifiche del citometro utilizzate in questo protocollo sono elencate per uno strumento con un totale di 4 laser e 15 rilevatori di emissioni. DDAOG rilevato a 645/660 nm è la forma della sonda scissa da SA-β-Gal1. DDAOG non scisso può presentare fluorescenza di basso livello a 460/610 nm, ma viene rimosso mediante fasi di lavaggio nel protocollo. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; AF = autofluorescenza; PE = ficoeritrina; SA-β-Gal = beta-galattosidasi associata alla senescenza.

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Protocol

Tutto il lavoro sugli animali descritto è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Chicago.

1. Preparazione e stoccaggio delle soluzioni stock

NOTA: Se le celle saranno selezionate in flusso, tutte le soluzioni devono essere preparate utilizzando tecniche sterili e filtrate attraverso un dispositivo filtrante da 0,22 μm.

  1. Preparare una soluzione madre di DDAO-Galactoside a 5 mg/ml in DMSO. Aliquote a 50 μL per provetta (o volume desiderato). Conservare a -20 °C al buio per un massimo di 1 anno.
  2. Preparare una soluzione madre di Bafilomicina A1 a 1 mM in DMSO. Aliquote a 50 μL per provetta (o volume desiderato). Conservare a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
  3. Preparare una soluzione madre di Calcein Violet 450 AM a 1 mM in DMSO. Aliquote a 50 μL per provetta (o volume desiderato). Conservare a -20 °C al buio per un massimo di 1 anno.
  4. Per il trattamento di cellule in coltura in vitro, preparare 10 mM di soluzioni madre concentrate di agenti che inducono la senescenza nel solvente appropriato e sterilizzare utilizzando filtri a siringa da 0,2 μm. Conservare a -20 °C o secondo le indicazioni del produttore.
    NOTA: Per la somministrazione di agenti chemioterapici che inducono senescenza in vivo (a topi con tumori accertati), gli agenti devono essere di grado USP e diluiti in soluzione salina da stock concentrato appena prima dell'iniezione.
  5. Preparare un terreno di coltura completo per le linee cellulari utilizzate.
    NOTA: Ad esempio, preparare il terreno per le cellule B16-F10 o A549 con DMEM 1x + 10% FBS + 1x sostituto della glutammina + 1x penicillina / streptomicina. I supporti devono essere mantenuti sterili. Possono essere utilizzate altre formulazioni di terreni specifici per linea cellulare. Alcuni componenti come il glutatione possono, in alcuni casi, interferire con l'inizio della senescenza. Il test empirico di varie formulazioni di terreni deve essere condotto se l'insorgenza della senescenza è inferiore al previsto o non osservata con agenti chemioterapici di controllo.
  6. Preparare tamponi di colorazione e lavaggio.
    1. Preparare l'albumina sierica bovina all'1% (BSA) in 1x PBS per l'uso nelle procedure di colorazione. Sciogliere 2 g di BSA in 200 ml di PBS e mescolare per 10 minuti, o fino a completa dissoluzione, a temperatura ambiente.
    2. Preparare lo 0,5% di BSA in 1x PBS come tampone di lavaggio. Diluire 100 mL dell'1% di BSA preparato nella fase 1.6.1 in 100 mL di 1x PBS per lo 0,5% di BSA.
    3. Conservare i tamponi a 4 °C per un massimo di 1 mese.
  7. Preparare il 4% di paraformaldeide in 1x PBS. Utilizzare fiale di paraformaldeide sigillate disponibili in commercio (ad esempio, 16% v / v) per comodità e stabilità: 2,5 ml di 16% PFA + 7,5 ml di 1x PBS (= 10 ml di 4% PFA). Regolare il volume preparato in base al volume totale necessario per esperimento.
    NOTA: Preparare se necessario solo per la fissazione cellulare; Preparare fresco ogni volta.
  8. Preparare il tampone di selezione FACS: 1x PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% BSA (pH 7,2). Filtrare sterile attraverso un dispositivo di filtrazione da 0,22 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese.
    NOTA: preparare se necessario solo per lo smistamento FACS. Le formulazioni tampone di smistamento del flusso possono variare tra gli strumenti FACS. La formulazione di cui sopra è compatibile con lo strumento utilizzato in questo studio (vedi Tabella dei materiali). Consultare le linee guida del produttore.
  9. Preparare la soluzione di dissociazione tumorale: 20 μg/mL Liberase TL + 100 μg/mL DNAse I in supporti RPMI-1640 (senza FBS o altri integratori). Le soluzioni madre sono utili per tenere a portata di mano Liberase TL (preparato e conservato secondo le indicazioni del produttore) e DNAse I (100 mg/ml in acqua bidistillata [ddH2O], conservato a -20 °C).
    NOTA: Preparare se necessario se si utilizzano solo tumori; Preparare fresco ogni volta.

2. Induzione della senescenza da parte di farmaci chemioterapici in cellule tumorali in coltura

NOTA: tutte le fasi di manipolazione cellulare in questa sezione devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza utilizzando pratiche sterili. Questa sezione è scritta per i tipi di cellule aderenti. Le celle di sospensione possono essere utilizzate con le opportune modifiche, come indicato.

  1. Coltivare linee cellulari tumorali secondo il protocollo standard del fornitore o del laboratorio che ha fornito le linee cellulari specifiche utilizzate.
    NOTA: Le cellule a basso passaggio (p < 10) sono generalmente preferite in quanto vi saranno livelli più bassi di senescenza replicativa, cioè uno sfondo inferiore, nei campioni di cellule non trattate.
  2. Un giorno prima dell'induzione della senescenza da parte di farmaci, raccogliere cellule con tripsina-EDTA 0,25% (o come raccomandato). Neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico sterile.
    NOTA: questo passaggio non è necessario per le celle di sospensione.
  3. Contare le cellule utilizzando il metodo ematocitometrico standard e registrare le cellule / ml. Celle a piastre a 1 × 10 3-10 × 103 celle/cm2 in piatti di coltura standard in plastica a 6 pozzetti.
    NOTA: La densità di placcatura ottimale dipende dal tasso di proliferazione delle cellule e deve essere determinata dall'utente. Le cellule devono essere in fase logaritmica di crescita a circa il 10%-20% di confluenza al momento del trattamento (cioè, dopo 18-24 ore di incubazione dopo la placcatura). La densità iniziale (celle/ml) delle celle di sospensione deve essere determinata dall'utente. Le piastre a sei pozzetti producono in genere abbastanza cellule senescenti per pozzetto per un campione standard di analisi della citometria a flusso. In caso di selezione a flusso, dovrebbe essere utilizzata un'area superficiale molto più ampia (ad esempio, più piastre P150) per consentire il recupero di un numero sufficiente di cellule senescenti per i saggi a valle (≥1 × 106).
  4. Incubare le cellule placcate durante la notte (18-24 ore) in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e un vaso di umidità.
  5. Trattare le cellule placcate con farmaci chemioterapici che inducono senescenza. Includere almeno un controllo positivo, ad esempio etoposide (ETO) o bleomicina (BLM). Preparare pozzetti duplicati per farmaco. Includi un set trattato con solo veicolo come controllo.
    NOTA: Una curva di dose per ciascun agente sperimentale deve essere testata dall'utilizzatore per determinare la concentrazione ottimale per l'induzione della senescenza nelle linee cellulari utilizzate.
  6. Incubare le cellule per 4 giorni in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 e un vaso di umidità per consentire l'inizio della senescenza. Esaminare quotidianamente i cambiamenti morfologici previsti utilizzando un microscopio ottico.
    NOTA: I tempi di incubazione da 3-5 giorni possono essere accettabili a seconda del tasso di insorgenza della senescenza. I mezzi possono essere cambiati e l'agente riapplicato (o meno), come desiderato, per promuovere condizioni di crescita sane raggiungendo una percentuale accettabile di cellule senescenti.
  7. Dopo l'inizio della senescenza, raccogliere le cellule aggiungendo tripsina-EDTA 0,25% per 5 minuti a 37 °C. Quando le cellule sono dissociate in sospensione, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di mezzo completo.
    NOTA: Questo passaggio non è necessario per le cellule che crescono in sospensione. Se verrà condotta la colorazione dei marcatori superficiali, evitare l'uso di tripsina-EDTA in quanto può distruggere temporaneamente gli antigeni di superficie sulle cellule. Invece, dissociare delicatamente il monostrato usando un raschietto per cellule di plastica sterile (o un reagente di dissociazione alternativo progettato per preservare gli antigeni di superficie).
  8. Contare le cellule in ogni campione utilizzando un ematocitometro. Calcolare le celle/ml per ogni campione.
    NOTA: Il blu di Trypan può essere aggiunto per valutare la percentuale di cellule morte a questo punto (cioè a causa del trattamento farmacologico), ma la morte cellulare sarà determinata anche con un colorante fluorescente di vitalità durante il flusso di colorazione DDAOG.
  9. Aliquot ≥0,5 × 106 cellule per campione in provette da microcentrifuga da 1,7 ml.
    NOTA: il numero di celle per campione deve essere standardizzato in tutti i campioni.
  10. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 1.000 × g in una microcentrifuga a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
    NOTA: Se una microcentrifuga refrigerata non è disponibile, può essere accettabile eseguire centrifugazioni a temperatura ambiente per alcuni tipi di celle resilienti.
  11. Procedere alla colorazione DDAOG nella sezione 4.

3. Induzione della senescenza da parte di farmaci chemioterapici in tumori stabiliti nei topi

NOTA: Se le cellule tumorali saranno classificate FACS, garantire la sterilità in ogni fase lavorando in un armadio di biosicurezza e lavorando con strumenti, procedure e reagenti sterili.

  1. Creare modelli tumorali murini iniettando cellule tumorali per via sottocutanea, secondo metodi standard (ad esempio, Appelbe et al.19).
    NOTA: Il numero di cellule tumorali da iniettare, il sito di iniezione e il ceppo di topo appropriato devono essere ottimizzati per ciascun protocollo. Qui, le cellule B16-F10 sono state iniettate per via sottocutanea a 1 × 106 cellule in 0,1 ml di soluzione salina (1 × 107 cellule / ml).
    1. Verificare che la vitalità delle cellule utilizzando il blu di tripano sia del >90% prima di eseguire le iniezioni. Anestetizzare i topi con isoflurano.
    2. Anestetizzare topi femmina C57/BL6 di 6-7 settimane con una miscela di isoflurano al 3% e aria e mantenerli in queste condizioni in una camera di induzione posta all'interno di un armadio di biosicurezza sterile. Confermare l'anestesia pizzicando delicatamente il piede del topo. Applicare un unguento veterinario sterile su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale durante la procedura. Durante la procedura, mantenere la temperatura corporea del mouse utilizzando una lampada riscaldante.
    3. Lavorando all'interno di un armadio sterile di biosicurezza, rimuovere il mouse dalla camera di induzione e metterlo a contatto con un cono nasale che fornisce un apporto di isoflurano al 3%. Rasare l'area del fianco nel sito di iniezione utilizzando un rasoio elettrico pulito. Mescolare brevemente la sospensione cellulare preparata capovolgendo manualmente il tubo appena prima dell'iniezione e iniettare la sospensione cellulare per via sottocutanea nel fianco rasato utilizzando una siringa sterile da 0,5 mL dotata di un ago sterile da 27 G. Rimuovere il mouse dal cappuccio e trasferirlo nella gabbia di recupero.
    4. Nella gabbia di recupero, monitorare continuamente i segni vitali dei topi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumenza sternale, dimostrare il riflesso raddrizzante e sono in grado di muoversi in sicurezza nella gabbia. Non lasciare topi incustoditi o restituire animali che hanno subito l'inoculazione di cellule tumorali alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi. Monitorare tutti i topi inoculati quotidianamente per perdita di peso, ridotta attività / mobilità e sintomi neurologici; eutanasia topi che presentano sintomi gravi in qualsiasi categoria. Per i topi che presentano sintomi dolorosi dopo l'inoculazione, somministrare buprenorfina (0,1-0,2 mg/kg) una volta per via sottocutanea.
      NOTA: I topi che mostrano dolore persistente dopo buprenorfina dovrebbero essere eutanasiati.
  2. A partire da 5-7 giorni dopo l'inoculazione delle cellule tumorali, misurare la crescita del tumore con pinze ogni 2-3 giorni. Iniziare il trattamento prosenescente quando il tumore ha raggiunto 50 mm 3 ± 10 mm3 di volume.
    NOTA: In questo lavoro, dosi di doxorubicina cloridrato di grado USP (DOX) o doxorubicina liposomiale PEGilata (PLD) a 10 mg/kg sono state somministrate in iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% (USP). I farmaci sono stati iniettati per via intraperitoneale 3 volte, una volta ogni 5 giorni, a partire da quando i tumori hanno raggiunto 50 mm 3 ± 10 mm3. I topi si sono ripresi per 7 giorni dopo il trattamento finale per consentire l'insorgenza della TIS nei tumori. I dosaggi e le condizioni di induzione della senescenza per altri trattamenti e/o modelli tumorali devono essere ottimizzati.
  3. A 7 giorni dopo il trattamento farmacologico finale, sacrificare i topi per sovradosaggio di CO2 e lussazione cervicale o altri metodi approvati in conformità con le linee guida sul lavoro degli animali da laboratorio. Asportare i tumori e raccoglierli in tubi sterili o piastre a 6 pozzetti riempiti con terreno di crescita RPMI sterile (per preservare la vitalità durante la lavorazione).
    NOTA: Se si esegue un esame istologico (ad esempio, X-Gal o immunoistochimica), i tumori possono essere tagliati in due qui, con una metà congelata a scatto in O.C.T. embedding medium e criosezionata utilizzando procedure standard per l'istologia dei tessuti congelati. La restante metà del tumore dovrebbe produrre materiale abbondante per la dissociazione e la colorazione DDAOG.
  4. Trasferire un tumore in un piatto di plastica P100 contenente 5 ml di terreno RPMI. Tritare il tumore in pezzi usando un bisturi.
  5. Trasferire 5 ml della sospensione di pezzi tumorali contenenti cellule sospese e detriti in un tubo conico da 15 ml. Utilizzare la punta più larga di un pipettuccio sierologico da 25 ml per trasferire questa sospensione se sono presenti detriti di grandi dimensioni. Risciacquare il piatto con un volume aggiuntivo di RPMI sterile per raccogliere materiali. Tappare e posizionare il tubo conico sul ghiaccio.
  6. Ripetere i passaggi 3,45-3,5 per i tumori rimanenti. Utilizzare una piastra separata e bisturi per ogni tumore per evitare la contaminazione incrociata, o risciacquare bene con PBS tra i tumori. Utilizzare 5 ml di terreno fresco per tritare ogni tumore.
  7. Preparare la soluzione di dissociazione tumorale: 20 μg/mL Liberase TL + 100 μg/mL DNAse I in supporti RPMI-1640 (senza FBS).
    NOTA: Esistono molte formulazioni efficaci per soluzioni di dissociazione tumorale e possono includere una varietà di enzimi e altri componenti di diversi produttori. Le concentrazioni ottimali di componenti possono variare notevolmente tra i tipi di tumore. Se i globuli rossi sono altamente presenti nel tumore, la lisi dei globuli rossi può essere condotta in aggiunta; Se le cellule morte sono un problema, è possibile utilizzare un kit di rimozione delle cellule morte. Si raccomanda vivamente all'utente di determinare in modo indipendente le condizioni ottimali di dissociazione del tumore che forniscono un'elevata vitalità e una bassa presenza di cellule contaminanti, materiale connettivo e detriti.
  8. Centrifugare tutti i campioni tumorali in provette coniche per 5 minuti a 1.000 × g (4 °C). Rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 1-5 ml di soluzione di dissociazione tumorale a ciascun campione tumorale, a seconda del volume del materiale tumorale. Assicurarsi che ci siano 1-2 ml in eccesso del pellet di materiale tumorale nel tubo. Vortice a velocità moderata per mescolare.
  10. Collocare i campioni in un incubatore a 37 °C con rotazione rapida per 45 minuti. Vortice brevemente ogni 15 minuti.
  11. Filtrare ogni campione attraverso un filtro cellulare da 100 μm in un tubo conico da 50 ml. Se i campioni sono troppo viscosi per passare attraverso il filtro, aggiungere 10 ml di terreno RPMI-1640 per diluire. Risciacquare i filtri con mezzo RPMI per raccogliere le celle residue.
  12. Utilizzare un ematocitometro per contare le cellule/ml per ogni campione.
  13. Aliquote due o più repliche di 5 × 106 cellule per campione tumorale.
  14. Centrifugare per 5 minuti a 1.000 × g (4 °C). Rimuovere il surnatante.
  15. (Facoltativo) Crioconservare i campioni tumorali per la successiva colorazione DDAOG, se lo si desidera.
    1. Risospendere il pellet di cellule tumorali dissociate in terreno di crioconservazione: 50% FBS, 40% RPMI-1640, 10% DMSO, preparato in condizioni sterili a 5 × 106 cellule/ml.
    2. Aliquot 1 mL di sospensione cellulare in ciascun crioviale.
    3. Congelare i crioviali per 24 ore in un contenitore di congelamento a celle isopropanoli a -80 °C; Quindi, trasferire al criostoccaggio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine (>1 settimana).
    4. Quando si desidera colorare, scongelare i crioviali sul ghiaccio e procedere alla colorazione DDAOG nella sezione 4.
      NOTA: Alcuni tumori potrebbero non rimanere vitali attraverso la crioconservazione e la resilienza a questo processo dovrebbe essere valutata dall'utente per il modello tumorale di interesse.
  16. Procedere alla sezione 4 per la colorazione DDAOG.

4. Colorazione DDAOG di SA-β-Gal in campioni cellulari o tumorali

  1. Diluire 1 mM di Bafilomicina A1 a 1:1.000x in mezzo DMEM (senza FBS) per una concentrazione finale di 1 μM.
  2. Aggiungere la soluzione Baf-DMEM preparata ai campioni di pellet cellulare (dal punto 2.11 o dal punto 3.16) per una concentrazione di 1 × 106 cellule/ml.
    NOTA: Ad esempio, se si utilizzano 0,5 × 106 cellule per campione, aggiungere 0,5 ml di Baf-DMEM. Per i tumori, 5 × 106 cellule possono essere colorate in 5 ml di Baf-DMEM.
  3. Incubare per 30 minuti a 37 °C (senza CO2) su un rotatore/agitatore impostato a bassa velocità.
    NOTA: Evitare incubatori di CO2 per il processo di colorazione, che possono acidificare le soluzioni e quindi interferire con la colorazione di Baf e DDAOG.
  4. Senza lavare, aggiungere la soluzione madre DDAOG (5 mg/ml) a 1:500x (10 μg/mL finale) a ciascun campione. Pipetta da miscelare. Sostituire su un rotatore/agitatore a 37 °C (senza CO2) per 60 minuti. Proteggere dalla luce diretta.
  5. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 1.000 x g a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  6. Lavare con 1 mL di BSA ghiacciato allo 0,5% per tubo e pipetta da miscelare. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 1.000 x g a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio 2x per lavare accuratamente le celle. Rimuovere il surnatante e procedere.
    NOTA: è importante eseguire le fasi di lavaggio al punto 4.6 per rimuovere il DDAOG non scisso, che può presentare un'emissione di fluorescenza indesiderata (460/610 nm).
    NOTA: In caso di immunocolorazione per marcatori di superficie cellulare, procedere al paragrafo 5 di seguito.
  7. (Facoltativo) Fissazione e conservazione delle cellule colorate DDAOG per analisi successive
    1. Aggiungere 0,5 ml di paraformaldeide ghiacciata al 4% a goccia per ogni campione lavato. Pipetta da miscelare.
    2. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Lavare le celle 2x con 1 mL di PBS.
    4. Conservare i campioni per un massimo di 1 settimana a 4 °C prima dell'analisi citometrica a flusso.
      NOTA: per i campioni fissi, saltare il passaggio 4.8.
  8. Diluire il brodo Calcein Violet 450 AM (1 mM) a 1:1.000x in BSA-PBS all'1% (1 μM finale). Aggiungere 300 μL (per campioni di cellule coltivate) o 1.000 μL (per campioni tumorali) ai pellet di cellule lavate dal punto 4.6. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio al buio.
  9. Procedere alla configurazione della citometria a flusso (paragrafo 6).

5. (Opzionale) Immunocolorazione per marcatori di superficie cellulare in combinazione con DDAOG

NOTA: Come con qualsiasi esperimento di citometria a flusso, i campioni di controllo a colorazione singola con solo DDAOG e solo anticorpo fluorescente devono essere preparati per determinare la diafonia (se presente) attraverso i canali di fluorescenza. Se si osserva una diafonia, deve essere eseguita la compensazione standard della citometria a flusso20.

  1. Risospendere i pellet cellulari ottenuti al punto 4.6 in 100 μL di tampone colorante (1% BSA in 1x PBS).
  2. Aggiungere il reagente bloccante del recettore Fc appropriato per la specie cellulare (topo o uomo) alla titolazione raccomandata dal produttore. Incubare per 10 minuti a 24 °C.
  3. Aggiungere anticorpi coniugati con fluorofori alla titolazione raccomandata dal produttore (o determinata dall'utente). Incubare per 20 minuti su ghiaccio, al riparo dalla luce.
  4. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 1.000 × g a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  5. Lavare con 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato (0,5% BSA-PBS) per provetta e pipetta da miscelare. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 1.000 × g a 4 °C e rimuovere il surnatante. Ripetere questo passaggio 2x per lavare accuratamente le celle.
  6. Diluire 1 mM Calcein Violet 450 AM a 1:1.000x in 1% BSA-PBS. Aggiungere 300 μL ai pellet di celle lavate dal punto 5.5. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio al buio.
  7. Procedere all'analisi citometrica a flusso (paragrafi 6-7).

6. Configurazione del citometro a flusso e acquisizione dati

  1. Trasferire i campioni di cellule in provette compatibili con lo strumento di citometria a flusso. Posizionare i tubi sul ghiaccio e tenerli protetti dalla luce.
    NOTA: Se si osservano aggregati nelle sospensioni cellulari, passare la sospensione attraverso i filtri cellulari da 70-100 μm prima dell'analisi. Non utilizzare filtri da 40 μm perché possono escludere alcune delle cellule senescenti più grandi.
  2. Nel software di riferimento (vedere la tabella dei materiali), aprire i seguenti grafici: 1) FSC-A vs SSC-A dot plot, 2) istogramma del canale viola, 3) canale rosso lontano (ad esempio, APC-A) rispetto al dot plot del canale verde (ad esempio, FITC-A).
    NOTA: è possibile utilizzare anche grafici di esclusione del doppietto e istogrammi a canale singolo, ma non sono strettamente necessari.
  3. Avviare l'acquisizione dei dati del citometro.
    1. Posizionare il campione di controllo solo veicolo colorato con DDAOG sulla porta di aspirazione. A bassa velocità di aspirazione, iniziare ad acquisire dati campione.
    2. Regolare le tensioni FSC e SSC in modo che il >90% degli eventi sia contenuto all'interno del grafico. Se le celle non si adattano bene al grafico, abbassare l'impostazione di ridimensionamento dell'area a 0,33-0,5 unità.
    3. Rimuovere il campione solo veicolo senza registrare i dati.
    4. (Facoltativo) Aggiungere una goccia di microsfere di calibrazione arcobaleno a un tubo citometrico con 1 mL di PBS. Posizionare il tubo sulla porta di aspirazione del citometro. Iniziare ad acquisire dati di esempio.
    5. Regolare le tensioni dei canali viola, verdi e rossi in modo che il picco superiore della microsfera arcobaleno sia nell'intervallo di 104-10 5 unità di fluorescenza relativa in ciascun canale e tutti i picchi siano ben separati in ciascun canale. Record di 10.000 eventi. Rimuovere il tubo.
  4. Posizionare il campione di controllo positivo (ad esempio, BLM, ETO) colorato con DDAOG sulla porta di aspirazione. A bassa velocità, acquisire dati di esempio. Osserva gli eventi nei canali FSC, SSC, viola, verde e rosso per assicurarti che oltre il 90% degli eventi sia contenuto all'interno di tutti i grafici. Cerca un aumento del segnale AF e DDAOG rispetto al controllo del solo veicolo.
  5. Se si utilizza un citometro di ordinamento, avviare l'ordinamento in questo passaggio.
    1. Ai fini della conservazione dei registri, registrare 10.000 celle per il campione di controllo e ogni campione ordinato.
    2. Ordinare la quantità desiderata di cellule (≥1 × 106 è in genere adatto) in una provetta di raccolta appropriata allo strumento con 3-5 ml di terreno di coltura.
    3. Dopo l'ordinamento, procedere alla coltura o all'analisi a valle.
    4. Passare alla sezione 7 per l'analisi di routine dei campioni ordinati.
  6. Se si utilizzano anticorpi fluorescenti, ottimizzare le tensioni del canale utilizzando i campioni non colorati, monocolorati e a doppia colorazione preparati nella sezione 5.
    NOTA: Per il citometro a flusso calibrato utilizzato nel presente documento, le tensioni ottimali del canale in genere sono scese tra 250 e 600 (fascia media), ma le tensioni ottimali e gli intervalli di tensione del canale variano tra gli strumenti. Evitare l'uso di tensioni a intervalli molto bassi o alti, che potrebbero sopprimere il segnale o amplificare il rumore.
  7. Dopo aver completato i passaggi 6.1-6.5 e aver apportato le modifiche necessarie alle impostazioni del citometro, registrare i dati per tutti i campioni. Assicurarsi che le impostazioni rimangano uniformi per tutte le registrazioni di esempio. Registrare ≥10.000 eventi per campione di cellule in coltura o ≥100.000 eventi per campione di cellule tumorali.
    NOTA: Sebbene il gating e l'analisi possano essere eseguiti utilizzando software di acquisizione dati (ad esempio, FACSDiva), un flusso di lavoro completo di gating e analisi da condurre dopo l'acquisizione utilizzando un software di analisi separato (FlowJo) è descritto nella sezione 7 di seguito. L'analisi post-acquisizione è preferibile per ridurre i tempi presso la postazione di lavoro del citometro e sfruttare gli strumenti aggiuntivi inclusi nel software di analisi dedicato.
  8. Salvare i dati di esempio nel formato di file con estensione fcs. Esportare i file su un computer workstation dotato di software di analisi della citometria a flusso (ad esempio, FlowJo). Procedere alla sezione 7.

7. Analisi dei dati di citometria a flusso

NOTA: Il flusso di lavoro presentato utilizza il software FlowJo. È possibile utilizzare software alternativi di analisi dei dati di citometria a flusso se i passaggi chiave descritti in questa sezione sono seguiti in modo simile.

  1. Utilizzando il software FlowJo, aprire i file di dati .fcs dal passaggio 6.7.
  2. Aprire la finestra del layout.
  3. Trascinare e rilasciare tutti gli esempi nella finestra del layout.
  4. Cancelli le cellule vitali.
    1. Per prima cosa fare doppio clic sui dati di esempio per il controllo solo veicolo per aprire la finestra dei dati.
    2. Visualizza i dati come istogramma del canale viola. Identificare le cellule vitali colorate da CV450 in base alla loro fluorescenza più luminosa rispetto alle cellule morte.
    3. Disegna un cancello usando lo strumento istogramma a porta singola per includere solo le celle vitali. Assegna il nome al cancello praticabile.
    4. Quindi, dalla finestra del layout di esempio, trascinare la porta praticabile sugli altri campioni di cella per applicare la porta in modo uniforme.
    5. Nella finestra del layout, visualizzare tutti i campioni come istogrammi del canale viola (vitalità). Verificare che il gating cellulare vitale sia appropriato tra i campioni prima di procedere; In caso contrario, apportare le modifiche necessarie.
      NOTA: La colorazione di vitalità può presentare variazioni tra trattamenti o tumori.
  5. Cancelliamo le cellule senescenti.
    1. Fare doppio clic sui dati della cella praticabile gated per il controllo solo veicolo per aprire la finestra dei dati.
    2. Visualizza i dati come un dot plot per il canale rosso lontano (DDAOG) rispetto al canale verde (AF).
    3. Disegna un cancello usando lo strumento di gating rettangolare per includere il <5% delle celle che sono DDAOG+ e AF+ (quadrante in alto a destra). Nomina il cancello senescente.
    4. Quindi, dalla finestra del layout di esempio, trascinare la porta senescente sui sottoinsiemi vitali degli altri campioni di cella per applicare la porta in modo uniforme.
    5. Nella finestra del layout, trascinare e rilasciare tutti i sottoinsiemi di celle vitali inclusi nella sezione 7.4. Visualizza tutti i campioni vitali come grafici a punti rosso (ad esempio, APC-A) rispetto al canale verde (ad esempio, FITC-A).
    6. Assicurarsi che il cancello senescente disegnato al punto 7.5.3 sia visibile su tutti i grafici e che il cancello per il controllo del solo veicolo presenti celle senescenti del ≤5%-10%.
  6. Una volta determinata la percentuale di cellule senescenti utilizzando i passaggi precedenti, presentare i dati risultanti utilizzando i grafici FlowJo, riassunti in una tabella dati e / o analizzati statisticamente utilizzando software standard.

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Representative Results

Sono stati condotti diversi esperimenti per dimostrare la comparabilità di DDAOG con X-Gal e C12-FDG per la rilevazione della senescenza da parte di SA-β-Gal. In primo luogo, X-Gal è stato utilizzato per colorare le cellule di melanoma senescenti B16-F10 indotte da ETO (Figura 2A). Un colore blu intenso si è sviluppato in un sottogruppo di cellule trattate con ETO, mentre altre cellule hanno mostrato una colorazione blu meno intensa. La morfologia è stata ingrandita nella maggior parte delle cellule trattate con ETO. La colorazione delle cellule trattate con ETO con substrato fluorescente SA-β-Gal C12-FDG (verde) o DDAOG (rosso lontano) ha dimostrato modelli di colorazione e variazioni di intensità comparabili a X-Gal (Figura 2B). Tuttavia, l'emissione verde di C12-FDG si sovrapponeva alla fibrillazione atriale cellulare (Figura 2C), che è nota per accumularsi nelle cellule senescenti17. Al contrario, l'AF era trascurabile nell'intervallo di emissioni rosso lontano di DDAOG.

Invece di utilizzare un microscopio a fluorescenza per valutare e contare le cellule senescenti, era più opportuno sfruttare le capacità ad alta produttività di un citometro a flusso per acquisire dati per migliaia di cellule per campione in breve tempo (<5 minuti per campione). In primo luogo, sono stati implementati una serie di parametri standard di impostazione della citometria a flusso per garantire un'acquisizione ottimale dei dati (Figura 3). Seguendo un approccio tipico, i parametri di diffusione della luce sono stati impostati per visualizzare il volume (diffusione diretta, FSC) e la granularità (dispersione laterale, SSC) delle celle (Figura 3A). Qui, abbiamo notato la tendenza all'aumento del volume delle cellule trattate con ETO, che concordava con la morfologia allargata tipicamente osservata per le cellule senescenti usando la microscopia. È stata necessaria una riduzione delle impostazioni di ridimensionamento dell'area predefinita (a 0,33-0,50 unità a seconda del tipo di cella e del trattamento) per visualizzare più celle più grandi sul grafico. Per alcune linee cellulari/trattamenti, è stato evidente anche un aumento della granularità (SSC) (dati non mostrati). Nel complesso, la valutazione della dispersione è stata utilizzata come fase di controllo della qualità per verificare che i dati di dispersione cellulare apparissero come previsto, che non fossero presenti detriti cellulari eccessivi e che le cellule venissero elaborate attraverso il citometro a portate appropriate (~ 100-1000 cellule / s). Come fase di controllo qualità utilizzata solo per la configurazione dello strumento, qui non è stata eseguita alcuna gating o analisi.

Un secondo passo (opzionale) nella configurazione della citometria a flusso è stato quello di analizzare brevemente un campione di particelle di calibrazione "arcobaleno" disponibili in commercio per garantire che le tensioni di rilevamento fluorescente fossero impostate in intervalli accettabili (Figura 3B). Il picco più luminoso è stato fissato tra 1 × 104 unità e 1 × 105 unità di intensità fluorescente relativa in ciascun canale, con picchi di intensità inferiore chiaramente definiti, sufficiente separazione tra ciascun picco e nessuna sovrapposizione di picchi vicini. Un campione di controllo di 10.000 microsfere è stato registrato utilizzando queste impostazioni di tensione. Le microsfere sono state poi utilizzate in questo modo in ogni sessione di citometria per migliorare l'uniformità dell'acquisizione dei dati nel corso del protocollo.

Successivamente, sono stati visualizzati campioni di cellule solo veicolo o trattate con ETO in ciascun canale fluorescente e sono stati impostati i gate. Le porte di vitalità cellulare sono state impostate in base al segnale della colorazione di vitalità CV450 nel canale viola (Figura 3C). Le cellule trattate solo con veicolo hanno mostrato una vitalità dell'88% e le cellule trattate con ETO hanno mostrato una vitalità del 75% (nel campione finale di cellule; ulteriori cellule morte sono state probabilmente inizialmente rimosse in terreni di coltura scartati e disintegrate meccanicamente durante il processo di colorazione). Successivamente, le cellule gated vitali sono state visualizzate nei canali di emissione verde (Figura 3D) e rosso lontano (Figura 3E). I cancelli per AFHI verde e DDAOGHI rosso lontano sono stati impostati al <5% delle celle solo veicolo e queste porte sono state quindi applicate alle celle trattate con ETO. Utilizzando questo approccio, è stato determinato che il 46% delle cellule trattate con ETO erano AFHI e il 33% erano DDAOGHI; Questi valori erano nell'intervallo previsto in base alla letteratura e ai risultati di numerosi esperimenti replicati nel nostro laboratorio. Una volta completata la configurazione del citometro, tutti i campioni di cellule nell'esperimento sono stati eseguiti utilizzando impostazioni di acquisizione dati identiche. Sono stati ottenuti dati per 10.000 eventi per campione.

I dati delle analisi rappresentative sono mostrati nella Figura 4. Le cellule di melanoma murino B16-F10 o le cellule di adenocarcinoma polmonare umano A549 sono state utilizzate come modelli di linea cellulare tumorale. Ogni linea cellulare è stata trattata con un agente chemioterapico noto per indurre senescenza (ETO o BLM) per 4 giorni per indurre senescenza o solo veicolo. Inoltre, il noto agente senolitico ABT-26321 è stato aggiunto alle cellule senescenti indotte per 2 giorni per dimostrare la specificità della sonda DDAOG. Solo i campioni ABT-263 sono stati preparati come controlli aggiuntivi. Qui, i dati vengono visualizzati come grafici a punti 2D con DDAOG (emissione a 670 nm) rispetto a AF (525 nm). Il flusso di lavoro della Figura 3 è stato utilizzato per la configurazione del citometro ed è stato impostato un gate TIS in modo tale che il <5% delle celle solo veicolo abbia ottenuto un punteggio come TIS. I risultati utilizzando cellule B16-F10 (Figura 4A) hanno mostrato che l'ETO ha indotto TIS nel 35% delle cellule B16-F10 vitali (simili ai dati comparabili mostrati in Figura 2D,E) e l'agente senolitico ha eliminato quasi completamente le cellule TIS (<2%). Nelle cellule A549 (Figura 4B), BLM ha indotto TIS nel 66% delle cellule vitali e ABT-263 ha ridotto la percentuale al 15%. ABT-263 da solo non era tossico per le cellule proliferanti non trattate.

Abbiamo inoltre mirato a dimostrare che la co-colorazione con anticorpi fluorescenti era compatibile con il test di senescenza DDAOG per facilitare lo screening di marcatori superficiali associati a TIS o nuovi. Qui, le cellule di melanoma di topo B16-F10 sono state nuovamente trattate con ETO (o veicolo) che induce TIS per 4 giorni. Quindi, le cellule sono state entrambe colorate con DDAOG per valutare TIS e con un anticorpo fluorescente per rilevare il marcatore di superficie associato a TIS DPP422 (Figura 5). È stato utilizzato anti-DPP4 coniugato alla R-ficoeritrina (PE) e abbiamo confermato una sovrapposizione trascurabile di PE con DDAOG e AF sul citometro a flusso utilizzato (Figura supplementare S2). Un istogramma dei dati del canale PE (Figura 5A) per >5.000 cellule vitali ha mostrato che il 42% delle cellule trattate con ETO erano DPP4+ (utilizzando il campione solo veicolo per impostare il gate di positività). La visualizzazione di grafici a punti 2D per gli stessi campioni (Figura 5B, C) ha indicato che il 44% delle cellule trattate con ETO erano doppiamente positive per DDAOG (cioè senescenti) e DPP4 rispetto al 4% delle cellule solo veicolo. Questi dati dimostrano che la colorazione delle cellule vive con anticorpi marcatori di superficie è possibile in combinazione con il test di senescenza DDAOG.

Le potenziali preoccupazioni con qualsiasi metodo di colorazione delle cellule vive includono la morte cellulare che si verifica durante lunghe sessioni di analisi (>1 ora) e come colorare e analizzare in modo più efficiente i campioni in molti punti temporali diversi (fino a giorni di distanza). La fissazione a base di solvente delle celle colorate risolve entrambe queste preoccupazioni, poiché i campioni possono essere fissati non appena vengono colorati e quindi conservati in frigorifero fino all'analisi in un lotto stabile alla temperatura. Pertanto, abbiamo testato se le cellule vive colorate con DDAOG potevano essere fissate con metanolo al 100% o paraformaldeide (PFA) al 4% e conservate fino a 1 settimana a 4 ° C. Indesiderabilmente, la fissazione del metanolo ha diminuito il segnale DDAOG e ridotto significativamente l'AF (dati non mostrati); Pertanto, l'uso del metanolo come solvente di fissazione dovrebbe essere evitato. Tuttavia, la fissazione con PFA ha avuto molto più successo, come si vede nella Figura 6 per le cellule fissate in PFA al 4% per 10 minuti dopo la colorazione con DDAOG. Rispetto ai campioni di controllo non fissati (Figura 6A; non trattati, 5% e BLM, 67% DDAOGHI AFHI), i campioni fissi (Figura 6B) hanno mostrato uno sfondo leggermente più alto nelle cellule non trattate (9%) e anche una percentuale più elevata di cellule che hanno ottenuto un punteggio senescente nelle cellule trattate con BLM (80%). Questo effetto è stato osservato anche in campioni fissi conservati durante la notte (Figura 6C; non trattati, 12% e BLM, 72%) e conservati per 1 settimana a 4 °C (Figura 6D; 14% e 70%). Nonostante i lievi aumenti della fluorescenza causati dalla fissazione del PFA, l'induzione della senescenza da parte di BLM era ancora evidente in tutti i campioni fissi rispetto al campione non trattato abbinato. Inoltre, le cellule sono rimaste intatte in magazzino con solo un leggero deterioramento entro il giorno 7 e non è stata osservata alcuna aggregazione problematica. Concludiamo che la comodità di essere in grado di fissare e conservare campioni di cellule per successive analisi in batch giustificherà la tolleranza dello sfondo leggermente più elevato causato dalla fissazione PFA, in particolare negli esperimenti con molti campioni o punti temporali.

Una sfida comune nella ricerca sulla senescenza basata sulle cellule è l'insorgenza eterogenea della senescenza nelle popolazioni cellulari. Qui, mostriamo che DDAOG può essere utilizzato per FACS di cellule senescenti vitali e che le cellule raccolte sopravvivono in coltura per saggi in vitro a valle (Figura 7). Per ordinare le cellule in base a FACS, le cellule vengono trattate e colorate, come descritto, e ordinate da un citometro a flusso compatibile con FACS utilizzando la strategia DDAOG rispetto a AF gating mostrata qui (Figura 7A). Poiché una sonda di vitalità non viene utilizzata qui a causa di problemi di tossicità a lungo termine, raccomandiamo di eseguire un rigoroso gating di dispersione prima del gating finale delle cellule senescenti (Figura supplementare S3) per eliminare i detriti falsi positivi dalle cellule raccolte. Si tratta di procedure di gating FACS standard che dovrebbero essere familiari a un utente moderatamente esperto e possono essere rapidamente stabilite utilizzando il software sullo strumento (<10 min).

Dopo aver selezionato un campione di cellule A549 trattate con BLM, abbiamo restituito le cellule in coltura in piastre multipozzetto standard per 5 giorni (n = 6 repliche) a 10 × 103 cellule / cm2. I controlli non ordinati sono stati placcati alla stessa densità, cresciuti a fianco, e sono state incluse cellule non trattate e trattate con BLM. Le cellule sono state osservate quotidianamente; Per le cellule selezionate, non è stata osservata una significativa morte cellulare o ritorno alla proliferazione. Le cellule ordinate sono rimaste sparse (cioè non proliferanti) nel corso di 5 giorni in coltura, mentre le cellule non trattate e trattate con BLM sono diventate confluenti come mostrato. Il giorno 5, le cellule sono state fissate in PFA e colorate per i marcatori morfologici e di proliferazione (Figura 7B). La caratteristica morfologia allargata delle cellule selezionate è stata rivelata dalla colorazione fluorescente con falloidina dell'actina filamentosa, con colorazione DAPI per mostrare nuclei allargati. Le celle ordinate avevano un diametro molto grande (>10 μm) con un caratteristico aspetto arrotondato. Come previsto, la colorazione anticorpale Ki67 ha rivelato una perdita completa del marcatore di proliferazione nel campione selezionato rispetto a una perdita parziale nel campione non selezionato trattato con BLM e livelli normali di Ki67 sono stati osservati in molte cellule nel campione non trattato-non selezionato. Sono state scattate almeno tre immagini per pozzetto utilizzando impostazioni di imaging uniformi tra i campioni. Sono mostrate immagini rappresentative (Figura 7B).

Infine, abbiamo valutato se le cellule senescenti derivanti da tumori stabiliti in topi trattati con farmaci chemioterapici potrebbero essere identificate utilizzando DDAOG. I tumori del melanoma B16-F10 sono stati indotti nel fianco dei topi C57 / BL6, che sono stati poi trattati tre volte (i.p., ogni 5 giorni) con solo soluzione salina (Figura 8A), DOX (Figura 8B) o PLD (Figura 8C). Dopo il terzo trattamento, i topi si sono ripresi per 7 giorni per consentire l'inizio della senescenza e sono stati poi sacrificati e i tumori asportati. I tumori sono stati dimezzati, con metà utilizzati per preparare vetrini di tessuto congelato per la colorazione X-Gal (Figura 8) e metà dissociati in sospensioni unicellulari e colorati con DDAOG (Figura 8 e Figura supplementare S4). La colorazione X-Gal nei tessuti era piuttosto debole nonostante una lunga durata della colorazione (72 ore), ma la colorazione blu era evidente nei tumori DOX e PLD a un attento esame, in particolare nei tumori che hanno anche ottenuto un punteggio positivo per la senescenza mediante test di flusso DDAOG (Figura 8B, C). Sono state scattate almeno tre immagini per vetrino di tessuto e vengono mostrate immagini rappresentative.

Rispetto a X-Gal, DDAOG era un modo più sensibile e accurato per quantificare la senescenza nei tumori (Figura 8). Per l'analisi del tumore DDAOG, il tumore trattato con soluzione salina con il più alto background di fluorescenza è stato utilizzato per impostare la porta della senescenza al <5%, in modo tale che gli altri tumori trattati con soluzione salina non abbiano ottenuto un punteggio superiore al 5% di senescenza. Questa porta di senescenza è stata quindi applicata in batch alle cellule vitali controllate da tutti i tumori. Entrambi gli agenti chemioterapici hanno indotto la senescenza in alcuni tumori (due su cinque tumori per DOX, tre su cinque per PLD), con percentuali di cellule tumorali senescenti che variano dal 3% al 36% per tumore. I grafici dei dati di citometria per tutti i 15 tumori sono mostrati nella Figura supplementare S4 e un riassunto dei dati di citometria tumorale è mostrato nella Figura 8D (n = 5; (*) p < 0,05 rispetto al gruppo di controllo solo salino dal test F di varianza). Concludiamo che la citometria a flusso DDAOG versus AF è un metodo accettabile per lo screening dei tumori e degli agenti chemioterapici per l'induzione della senescenza in vivo.

Figure 2
Figura 2: DDAOG è una colorazione sensibile e specifica per SA-β-Gal. (A) Colorazione convenzionale per SA-β-Gal utilizzando X-Gal che mostra cellule di melanoma murino B16-F10 non trattate (a sinistra) o trattate con ETO (a destra). Senescenza indotta da ETO: le cellule mostrano morfologia allargata e colorazione blu a causa della scissione di X-Gal da parte di SA-β-Gal elevati. Barre di scala = 10 μm. (B) Colorazione fluorescente per SA-β-Gal in celle trattate con ETO utilizzando C12-FDG (emissione a 515 nm, verde) o DDAOG (660 nm, rosso). La distribuzione della colorazione è simile per entrambe le sonde, indicando che DDAOG rileva SA-β-Gal in modo simile a C12-FDG. (C) Valutazione della fibrillazione atriale in celle non colorate, trattate con ETO nel canale di emissione verde (emissione di 525 nm, a sinistra) o rosso lontano (660 nm, a destra). La fibrillazione atriale da lipofuscina è alta nel canale di emissione verde e trascurabile nel canale rosso lontano. Tempo di esposizione = 2.000 ms per ogni immagine. Barre della scala = 10 μm. Questa figura è ristampata da Flor e Kron23. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside; UNT = non trattato; ETO = etoposide; AF = autofluorescenza; C12-FDG = 5-dodecanoilamminofluoresceina di-β-D-galattopiranoside; SA-β-Gal = beta-galattosidasi associata alla senescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Configurazione dell'acquisizione dei dati del citometro a flusso. (A) Distribuzione rappresentativa delle celle in grafico a dispersione. FSC-A è una lettura del volume cellulare e SSC-A indica granularità cellulare. Pannello sinistro, trattamento solo veicolo delle celle A549. Pannello destro, trattamento ETO per indurre la senescenza. Si noti la tendenza verso l'allargamento del volume cellulare delle cellule trattate con ETO, in accordo con la morfologia allargata evidente dalla microscopia. (B) Uso facoltativo di microsfere di calibrazione fluorescenti "arcobaleno" commerciali a 5 picchi per impostare le tensioni del rivelatore del citometro. In ciascun canale di fluorescenza utilizzato, il picco massimo deve essere impostato ≤1 x 105 unità fluorescenti relative regolando la tensione del rivelatore citometrico mentre i campioni sono in esecuzione. Pannello sinistro, canale BV421 (viola); centro, canale FITC (verde); a destra, canale APC (rosso). I cinque picchi fluorescenti dovrebbero mostrare una spaziatura distinta come mostrato. (C-E) Dati rappresentativi di fluorescenza a canale singolo per (C) colorazione di vitalità utilizzando colorante viola CV450; (D) autofluorescenza verde delle cellule; (E) segnale rosso lontano da DDAOG, che rileva SA-β-Gal. Istogramma di colore più scuro, trattamento solo veicolo; istogramma a colori più chiari, trattamento ETO. I cancelli dei genitori sono indicati sopra ogni trama. Abbreviazioni: FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; ETO = etoposide; BV421-A = area di picco del canale Brilliant Violet 421; FITC-A = area del picco del canale isotiocianato di fluoresceina; APC-A = area di picco del canale dell'alloficocianina; AF = autofluorescenza; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; VEH = veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Dati rappresentativi per il saggio di senescenza con citometria a flusso. (A) B16-F10 cellule di melanoma murino trattate solo con (in alto a sinistra) solo veicolo, (in alto a destra) ETO, (in basso a sinistra) ABT-263 (1 μM) solo, o (in basso a destra) ETO più ABT-263. (B) A549 cellule di adenocarcinoma polmonare umano trattate solo con (in alto a sinistra) solo veicolo, (in alto a destra) BLM, (in basso a sinistra) solo ABT-263, o (in basso a destra) BLM più ABT-263. (A,B) Porte rettangolari nei quadranti in alto a destra di tutti i grafici definiscono le cellule senescenti (DDAOG HI AFHI). La percentuale di cellule senescenti (sul totale delle cellule vitali per campione) è indicata su ciascun grafico. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; ETO = etoposide; BLM = bleomicina; VEH = veicolo; TIS = senescenza indotta dalla terapia. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Co-colorazione di un marcatore di superficie cellulare di esempio con saggio di senescenza. (A) Immunorilevazione del marcatore di senescenza DPP4 sulla superficie di cellule vitali in coltura B16-F10; arancione scuro, solo veicolo; arancione chiaro, ETO. (B,C) Pannello centrale e destro: celle co-colorate con DDAOG e anti-DPP4:PE. Le celle DDAOG HI DPP4HI sono contenute all'interno di porte rettangolari mostrate sui grafici e viene indicata la percentuale di celle a doppio positivo per campione. Mostrato: cellule vitali-dipendenti. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; ETO = etoposide; VEH = veicolo; DPP4 = dipeptidil peptidasi 4. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Fissazione post-colorazione e conservazione di campioni di cellule colorate con DDAOG per analisi successive. (A) Controllo, campioni non fissati di cellule vive A549 non trattate (a sinistra) o trattate con BLM (a destra) per indurre la senescenza, quindi colorate e immediatamente analizzate utilizzando il protocollo DDAOG (senza fissazione, Giorno 0). (B) Campioni preparati come in (A) e poi immediatamente fissati in paraformaldeide al 4% e analizzati (Giorno 0). C) Campioni preparati come indicato al punto A, immediatamente fissati in paraformaldeide al 4% e conservati per una notte a 4 °C prima dell'analisi. (D) Campioni preparati come in (A), immediatamente fissati e conservati per 7 giorni prima dell'analisi. Porte rettangolari nei quadranti in alto a destra di tutti i grafici definiscono le celle senescenti (DDAOG HI AFHI). La percentuale di cellule senescenti è indicata su ogni trama. Abbreviazioni: TIS = senescenza indotta dalla terapia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; BLM = bleomicina; AF = autofluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Ordinamento citometrico a flusso e convalida di popolazioni cellulari senescenti arricchite. (A) Dati di selezione citometrica a flusso che mostrano (a sinistra) il controllo non trattato, colorato con DDAOG, utilizzato per impostare il gate per la selezione delle cellule senescenti (<5% di cellule senescenti nella regione gate) e (a destra) il campione trattato con BLM, colorato con DDAOG, che è stato ordinato utilizzando il gate di smistamento come mostrato. (B) Immagini al microscopio a fluorescenza per cellule (colonna sinistra) colorate con Phalloidin-Alexa Fluor 647 (pseudocolore arancione) per rilevare F-actina e DAPI (blu) per contrastare i nuclei, dimostrando una morfologia allargata delle cellule senescenti, o (colonna destra) cellule colorate con l'anticorpo Ki67 del coniglio e l'anti-coniglio Alexa Fluor 594 per rilevare la perdita di proliferazione nelle cellule senescenti. Riga superiore, celle non trattate e non ordinate. Fila centrale, cellule trattate con BLM e non ordinate. Riga inferiore, cellule trattate e ordinate con BLM. Barre della scala = 10 μm. Abbreviazioni: TIS = senescenza indotta dalla terapia; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; BLM = bleomicina; UNT = non trattato; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Quantificazione della senescenza nei tumori di topi trattati con farmaci chemioterapici. I tumori del melanoma B16-F10 sono stati stabiliti nei fianchi dei topi C67BL / 6, che sono stati poi trattati con tre dosi di (A) soluzione salina, (B) DOX o (C) PLD ogni 5 giorni più 1 settimana per consentire l'inizio della senescenza. I tumori sono stati asportati e dimezzati; I vetrini di tessuto congelato sono stati preparati da una metà per la colorazione X-Gal (fila superiore) e l'altra metà è stata dissociata per la colorazione DDAOG (fila inferiore). Nelle immagini colorate con X-Gal, le cellule blu sono cellule senescenti SA-β-Gal HI , mentre le regioni marroni sono dovute alla melanina nei tumori. Risultati rappresentativi sono mostrati per DOX e PLD da due tumori per gruppo che hanno mostrato senescenza. Tutti i tumori solo salini hanno mostrato una senescenza trascurabile. (D) Quantificazione della senescenza nei tumori trattati con farmaci da topi. (*) p < 0,05 con F test di varianza, n = 5 topi per gruppo. Barre di errore, media ± SEM. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; DOX = doxorubicina; PLD = doxorubicina liposomiale PEGilato; X-Gal = 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside; AF = autofluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare S1: Struttura chimica della sonda DDAOG. DDAOG è un coniugato di 7-idrossi-9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one) e beta galattoside. Quando viene scisso dalla beta-galattosidasi, il prodotto di scissione idrolizzato mostra uno spostamento di emssione di fluorescenza rosso lontano di 50 nm, consentendo la sua rilevazione specifica con eccitazione superiore a 600 nm. Abbreviazioni: DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Scansione spettrale della diafonia DDAOG con altri canali fluorescenti del citometro a flusso. Per identificare i canali disponibili per la rilevazione di anticorpi fluorescenti, è stata eseguita una scansione spettrale su un citometro a flusso a 4 laser a 15 canali utilizzando cellule A549 trattate con BLM e colorate con DDAOG (rosso) o non colorato (nero). Sono stati acquisiti dati in ogni canale del citometro a flusso per 10.000 cellule. (A) Canali di emissione del laser a 405 nm: da sinistra a destra, BV421, BV510, BV605, BV660 e BV711. La diafonia osservata nei canali BV605, BV660 e BV711 li rende inadatti alla co-colorazione con DDAOG senza compensazione. BV421 e BV510 sono adatti per la co-colorazione (si noti che BV421 viene tipicamente utilizzato per la colorazione di vitalità). (B) Canali di emissione del laser a 488 nm: FITC e PerCP-Cy5. È stata osservata un'elevata diafonia per il canale PerCP-Cy5. FITC è adatto per la co-colorazione; tuttavia, si noti che il canale FITC è tipicamente utilizzato nel test DDAOG per la valutazione dell'AF verde. (C) Canali di emissione del laser a 561 nm: PE, PE-Dazzle 594, PE-Cy5, PE-Cy5.5 e PE-Cy7. I canali PE e PE-Dazzle 594 sono adatti per la rilevazione di anticorpi marcati con questi fluorofori (PE è dimostrato per la rilevazione di DPP4 in questo studio). (D) Canali di emissione del laser a 640 nm: APC, APC-H700 e APC-Cy7. Il segnale DDAOG delle cellule senescenti è visibile nel canale APC (47,8% senescente). Il segnale si sovrappone ai canali APC-H700 e APC-Cy7, rendendoli inadatti alla co-colorazione senza una significativa compensazione spettrale. Abbreviazioni: BLM = bleomicina; BV = Viola brillante; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PerCP = proteina peridinina-clorofilla; PE = ficoeritrina; DZ594 = Dazzle 594; APC = allofiocianina; AF = autofluorescenza; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Strategia di gating cellulare per l'ordinamento FACS delle cellule senescenti. Il passaggio di una sospensione di cellule attraverso un citometro FACS sensibile può richiedere un ulteriore gating per garantire la purezza dello smistamento e la funzionalità ottimale dello strumento. Un esempio di strategia è mostrato qui. Altre strategie sono possibili a seconda delle raccomandazioni del produttore per il citometro FACS utilizzato. Colonna sinistra, controllo cellulare trattato solo veicolo. Colonna destra, cellule A549 trattate con BLM per indurre la senescenza da ordinare. (A) Gating FSC-A (volume cellulare) contro SSC-A (granularità cellulare) di cellule intatte. Il cancello intatto elimina i detriti cellulari dal campione selezionato. (B) FSC-A contro FSC-H purity gating; rimuove doppiette e detriti. (C) SSC-A contro SSC-H purity gating; rimuove doppiette e detriti. (D) Gating per la popolazione di interesse che utilizza il canale APC-A (eccitazione 637 nm, emissione 670 nm ± 30 nm, utilizzato per DDAOG) rispetto al canale FITC-A (eccitazione 488 nm, emissione 530 nm ± 30 nm, utilizzato per AF); rimuove possibili artefatti di colorazione. (E) Gating delle celle senescenti per lo smistamento finale. Abbreviazioni: FACS = selezione cellulare attivata da fluorescenza; BLM = bleomicina; FSC-A = area di picco di dispersione in avanti; SSC-A = area laterale del picco di dispersione; FSC-H = altezza del picco di dispersione in avanti; SSC-H = altezza del picco di dispersione laterale. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S4: Colorazione con citometria a flusso di senescenza DDAOG dei tumori. Dati di citometria a flusso per ≥50.000 cellule tumorali vitali. Porta cellulare senescente, quadrante in alto a destra di ogni appezzamento. La percentuale di cellule tumorali senescenti (vitali) è mostrata all'interno del cancello. I trattamenti tumorali includevano (A) solo soluzione salina; (B) DOX; e (C) PLD. I topi sono stati trattati tre volte, una volta ogni 5 giorni, con 7 giorni per il recupero per consentire l'inizio della senescenza prima del sacrificio. Sono stati analizzati cinque tumori per condizione. Abbreviazioni: AF = autofluorescenza; DDAO = 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridina-2-one); DDAOG = DDAO-galattoside; DOX = doxorubicina; PLD = doxorubicina liposomiale PEGilati. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Nell'ultimo decennio circa, la citometria a flusso è diventata una piattaforma di analisi più comune nella ricerca sul cancro a causa della popolarità emergente dell'immunologia tumorale, dello sviluppo di citometri a flusso a basso costo e del miglioramento delle strutture di strumentazione condivise presso le istituzioni accademiche. I saggi multicolore sono ora standard, poiché la maggior parte degli strumenti più recenti sono dotati di array ottici viola, blu-verde e da rosso a rosso lontano. Pertanto, questo protocollo DDAOG è probabilmente compatibile con una vasta gamma di citometri a flusso. Naturalmente, qualsiasi citometro a flusso dovrebbe essere valutato dall'utente. Particolare attenzione deve essere prestata quando si aggiungono ulteriori fluorofori (ad esempio, anticorpi fluorescenti coniugati) al test DDAOG. Una valutazione della diafonia dei fluorofori tra i canali deve essere condotta utilizzando controlli a colorazione singola visualizzati in tutti gli altri canali pertinenti. Se si osserva sovrapposizione, la compensazione spettrale può essere eseguita20 per la correzione seguendo metodi tipici.

I risultati qui riportati hanno principalmente lo scopo di dimostrare che il test di citometria a flusso DDAOG può produrre risultati rapidi, quantitativi e di facile interpretazione per la TIS indotta da farmaci chemioterapici in cellule o tumori. Gli agenti utilizzati qui, tra cui ETO 23,24, DOX7,25 e BLM26,27, sono stati documentati per indurre TIS in varie linee cellulari tumorali 24. Per dimostrare la specificità della sonda DDAOG, è stato dimostrato che il noto agente senolitico ABT-26321 elimina selettivamente le cellule senescenti in coltura. Questo documento dimostra l'uso di una linea cellulare tumorale in coltura murina (B16-F10) e di una umana (A549), nonché di tumori B16-F10 stabiliti nei topi. Tuttavia, è possibile utilizzare tutte le cellule che esprimono β-Gal e mantengono la vitalità attraverso una preparazione standard del campione di citometria a flusso. Alcuni tipi di cellule possono essere più fragili o meno inclini al TIS, e questo dovrebbe essere valutato prima di intraprendere un grande schermo o studio. Se le cellule si disintegrano nella preparazione, la vitalità è scarsa o la TIS è molto più bassa del previsto utilizzando controlli con agenti positivi, il tipo di cellula potrebbe non essere un modello ideale per gli studi sulla senescenza. Gli agenti e le linee cellulari mostrati qui possono essere utilizzati da altri gruppi come controlli in ulteriori screening di potenziali agenti che inducono TIS o nuovi senolitici, che rimane un obiettivo attivo nel campo.

La tossicità indotta dai farmaci chemioterapici può variare tra i tipi di cellule e influenzare i risultati del test. Se l'effetto primario osservato dell'agente e/o della concentrazione utilizzata è la morte cellulare acuta, la senescenza complessiva può essere minima. In vivo, un'elevata necrosi tumorale o tossicità sistemica negli animali deve essere evitata abbassando il dosaggio dell'agente. La chiave per il successo del test è il test di una gamma di concentrazioni di agenti, con un'attenta ispezione dei dati del saggio di vitalità (ad esempio, come fornito da CV450 all'interno del test DDAOG). In vitro, se molte cellule morte si staccano dalla piastra durante il trattamento, incluso il terreno di coltura nel campione analizzato, è importante valutare la morte cellulare in totale. CV450 non è l'unica macchia di vitalità compatibile con questo test; Possono essere utilizzati altri fluorofori emettitori viola/blu. Le sonde di vitalità fissabili possono essere utilizzate anche se l'utente prevede di fissare i campioni colorati con PFA, a condizione che la fluorescenza della sonda non si sovrapponga in modo significativo a DDAOG o AF (o che l'utente conduca una compensazione spettrale per correggere la sovrapposizione). In alcuni casi in cui la tossicità dell'agente è bassa e le cellule sono robuste, il gating delle cellule intatte mediante diffusione della luce (FSC vs. SSC) può essere sufficiente per isolare le cellule "vitali" per l'analisi.

Un passo fondamentale in questo protocollo in vitro è quello di placcare le cellule nella gamma inferiore di densità di crescita logaritmica (tipicamente 2 × 10 3-5 × 103 cellule / cm2) per consentire una rapida proliferazione iniziale, che facilita l'assorbimento del farmaco chemioterapico da parte della maggior parte delle cellule. Una volta trattato, è anche importante lasciare il tempo per l'insorgenza della TIS: in vitro, 4 giorni ± 1 giorno in presenza del farmaco; in vivo, 7 giorni di recupero dopo il trattamento chemioterapico finale. Dopo la colorazione con DDAOG come descritto, l'analisi quantitativa dei dati citometrici deve essere eseguita come mostrato, cioè il gating DDAOG rispetto alle cellule AF in ciascun campione per determinare la percentuale di cellule senescenti (sul totale vitale). I passaggi opzionali includono l'uso di microsfere di calibrazione fluorescenti "arcobaleno" per standardizzare la citometria a flusso, la fissazione PFA di campioni colorati, la co-immunocolorazione per i marcatori di superficie e la selezione del flusso per arricchire le cellule senescenti per i saggi a valle. Tuttavia, ognuno di questi passaggi facoltativi offre vantaggi chiave in alcune applicazioni. Le microsfere di calibrazione standardizzano la configurazione della citometria su più sessioni e consentono all'utente di impostare inizialmente le tensioni in un intervallo utile per il rilevamento della senescenza e della vitalità, con regolazioni minime in seguito. La fissazione PFA dei campioni stabilizza le cellule e consente l'analisi in batch di grandi insiemi di cellule in un secondo momento. La co-immunocolorazione per i marcatori di superficie può essere utilizzata per lo screening di nuove proteine correlate alla senescenza e interazioni immunitarie. In studi futuri, abbiamo in programma di convalidare la co-colorazione dei marcatori di senescenza intracellulare con DDAOG.

L'ordinamento delle cellule TIS mediante FACS consente l'arricchimento di cellule TIS vitali da popolazioni eterogenee, che possono confondere le letture per saggi a valle come western blotting, proteomica o trascrittomica. Dopo la selezione, non è stata osservata alcuna tossicità significativa di DDAOG nelle cellule TIS rimesse in coltura per un massimo di 5 giorni. Tuttavia, va tenuto in considerazione che le cellule selezionate sono state trattate con Baf, DDAOG internalizzato (che viene scisso da SA-β-Gal a DDAO, un colorante acridinico) e sono state sottoposte a stress meccanico che passa attraverso lo strumento FACS. Pertanto, alcune alterazioni biologiche non correlate alla senescenza possono essere presenti nelle cellule selezionate. Tuttavia, in questo studio, le cellule ordinate hanno mantenuto forti caratteristiche di senescenza e hanno fornito risultati caratteristici di proteomica e trascrittomica28 rispetto ai controlli non ordinati. Nonostante l'utilità piuttosto ovvia dell'uso di FACS per raccogliere e analizzare le cellule senescenti dai tumori, questa procedura è stata raramente utilizzata in letteratura. Alcuni gruppi hanno utilizzato p16Ink4a luciferasi o reporter fluorescenti per identificare le cellule senescenti nei tessuti di topo, con reporter fluorescenti che consentono l'ordinamento FACS in alcuni studi29,30. I risultati concordano generalmente sul fatto che, indipendentemente dall'agente di induzione o dal tipo di tumore, la TIS nei tumori è un evento da parziale a raro, raggiungendo raramente il 100% delle cellule tumorali31. La selezione FACS delle cellule utilizzando il metodo DDAOG consente prontamente la raccolta di rare cellule TIS dai tumori, senza la necessità di esprimere costrutti transgenici.

Attualmente, la maggior parte della ricerca sulla senescenza nei modelli murini è condotta ex vivo utilizzando una combinazione di X-Gal e marcatori immunoistochimici32,33. Tuttavia, valutare TIS ex vivo utilizzando tessuti tumorali può essere un processo lungo, in particolare quando viene utilizzato X-Gal. Questa procedura richiede crioconservazione del tumore, criosezione su vetrini, colorazione X-Gal, montaggio del vetro di copertura, asciugatura, imaging e punteggio delle cellule "blu", un approccio di più giorni almeno. L'immunoistochimica non è molto più veloce o più facile e diverse sezioni di tessuto devono essere utilizzate e valutate per ciascun marcatore più X-Gal in ciascun tumore, a meno che l'analisi multiplex non sia ottimizzata, aggiungendo più tempo alla parte anteriore del processo. Le sezioni di tessuto campionano solo una sottile sezione trasversale del tumore, mentre le cellule senescenti (come molti tipi di cellule) possono essere distribuite in modo non uniforme nello spazio 3D in tutti i tumori29. È urgentemente necessario sul campo allontanarsi da metodi istologici lenti e obsoleti verso un test di senescenza più rapido e facilmente quantificabile per i tumori. Utilizzando la citometria a flusso DDAOG, una serie di 15 tumori potrebbe essere dissociata e colorata per ottenere dati conclusivi e quantitativi sulla senescenza in meno di 1 giorno di tempo pratico dopo la raccolta del tumore. Una metà del tumore è stata elaborata per ogni campione, migliorando il campionamento dello spazio 3D per tumore. Questo approccio di citometria a flusso DDAOG è significativamente più veloce e più affidabile rispetto ai metodi basati su vetrini tissutali per la valutazione della TIS nei tumori.

Con i suoi numerosi vantaggi rispetto a X-Gal e altri metodi, sosteniamo che il protocollo DDAOG diventi il nuovo test di senescenza gold standard. Utilizza sia il marcatore di senescenza convenzionalmente accettato, SA-β-Gal, sia il rilevamento senza etichetta della fibrillazione atriale associata all'età come secondo marcatore. Questi fluorofori sono compatibili con la maggior parte dei citometri a flusso standard. Il test include una colorazione di vitalità per escludere cellule morte e detriti utilizzando campioni prontamente ottenuti da linee cellulari in coltura trattate con farmaci o tumori. I campioni di cellule vive possono opzionalmente essere fissati con solvente o crioconservati per facilitare l'analisi in batch di studi di grandi dimensioni, ad esempio, utilizzando punti temporali per valutare l'insorgenza di TIS nel tempo utilizzando più agenti Il processo di colorazione richiede meno di mezza giornata di lavoro di laboratorio per essere completato e l'acquisizione dei dati è in genere <5 minuti per campione. L'analisi dei dati è altrettanto rapida e diretta, producendo dati quantitativi sulla percentuale di cellule TIS per campione senza noiosi punteggi e conteggi delle cellule. I campioni possono essere selezionati FACS per recuperare popolazioni arricchite di cellule TIS, riducendo il rumore derivante dall'eterogeneità cellulare nelle analisi a valle. Riteniamo che il test DDAOG possa, in molti casi, sostituire X-Gal, facilitando lo screening di agenti induttori TIS e senolitici in vitro e in vivo, portando a scoperte più rapide e affidabili nel campo della ricerca sulla senescenza.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare per questo studio.

Acknowledgments

Ringraziamo la Cytometry and Antibody Core Facility dell'Università di Chicago per il supporto sulla strumentazione di citometria a flusso. L'Animal Research Center dell'Università di Chicago ha fornito alloggi per animali.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bafilomycin A1 Research Products International B40500
Bleomycin sulfate  Cayman 13877
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A1380
Calcein Violet 450 AM viability dye ThermoFisher Scientific 65-0854-39 eBioscience
DPP4 antibody, PE conjugate Biolegend 137803 Clone H194-112
Cell line: A549 human lung adenocarcinoma American Type Culture Collection CCL-185
Cell line: B16-F10 mouse melanoma American Type Culture Collection CRL-6475
Cell scraper Corning 3008
Cell strainers, 100 µm Falcon 352360
DDAO-Galactoside Life Technologies D6488
DMEM medium 1x Life Technologies 11960-069
DMSO Sigma D2438
DNAse I Sigma DN25
Doxorubicin, hydrochloride injection (USP) Pfizer NDC 0069-3032-20
Doxorubicin, PEGylated liposomal (USP) Sun Pharmaceutical NDC 47335-049-40
EDTA 0.5 M Life Technologies 15575-038
Etoposide  Cayman 12092
FBS Omega  FB-11
Fc receptor blocking reagent Biolegend 101320 Anti-mouse CD16/32
Flow cytometer (cell analyzer) Becton Dickinson (BD) Various LSRFortessa
Flow cytometer (cell sorter) Becton Dickinson (BD) Various FACSAria
GlutaMax 100x Life Technologies 35050061
HEPES 1 M Lonza BW17737
Liberase TL Sigma 5401020001 Roche
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin/Streptomycin 100x Life Technologies 15140122
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Corning MT21031CV Dulbecco's PBS (without calcium and magnesium)
Rainbow calibration particles, ultra kit SpheroTech UCRP-38-2K 3.5-3.9 µm, 2E6/mL
RPMI-1640 medium 1x Life Technologies 11875-119
Sodium chloride 0.9% (USP) Baxter Healthcare Corporation 2B1324
Software for cytometer data acquisition, "FACSDiva" Becton Dickinson (BD) n/a Contact BD for license
Software for cytometer data analysis, "FlowJo" TreeStar n/a Contact TreeStar for license
Trypsin-EDTA 0.25% Life Technologies 25200-114

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References

  1. Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
  2. Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: friends or foes. Trends in Cancer. 6 (10), 838-857 (2020).
  3. Prasanna, P. G., et al. Therapy-induced senescence: Opportunities to improve anticancer therapy. Journal of the National Cancer Institute. 113 (10), 1285-1298 (2021).
  4. Velarde, M. C., Demaria, M., Campisi, J. Senescent cells and their secretory phenotype as targets for cancer therapy. Interdisciplinary Topics in Gerontology and Geriatrics. 38, 17-27 (2013).
  5. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: from mechanisms to detection. Molecular Oncology. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  6. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  7. Bojko, A., Czarnecka-Herok, J., Charzynska, A., Dabrowski, M., Sikora, E. Diversity of the senescence phenotype of cancer cells treated with chemotherapeutic agents. Cells. 8 (12), 1501 (2019).
  8. Mikuła-Pietrasik, J., Niklas, A., Uruski, P., Tykarski, A., Książek, K. Mechanisms and significance of therapy-induced and spontaneous senescence of cancer cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (2), 213-229 (2020).
  9. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  10. Itahana, K., Itahana, Y., Dimri, G. P. Colorimetric detection of senescence-associated β galactosidase. Methods in Molecular Biology. 965, 143-156 (2013).
  11. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  12. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  13. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  14. Tung, C. -H., et al. In vivo imaging of β-galactosidase activity using far red fluorescent switch. Cancer Research. 64 (5), 1579-1583 (2004).
  15. Gong, H., et al. beta-Galactosidase activity assay using far-red-shifted fluorescent substrate DDAOG. Analytical Biochemistry. 386 (1), 59-64 (2009).
  16. Terman, A., Brunk, U. T. Lipofuscin: Mechanisms of formation and increase with age. APMIS. 106 (2), 265-276 (1998).
  17. Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging. 5 (1), 37-50 (2013).
  18. Wang, B., Demaria, M. The quest to define and target cellular senescence in cancer. Cancer Research. 81 (24), 6087-6089 (2021).
  19. Appelbe, O. K., Zhang, Q., Pelizzari, C. A., Weichselbaum, R. R., Kron, S. J. Image-guided radiotherapy targets macromolecules through altering the tumor microenvironment. Molecular Pharmaceutics. 13 (10), 3457-3467 (2016).
  20. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P. K., Jain, P. Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 117, 1-38 (2017).
  21. Fan, Y., Cheng, J., Zeng, H., Shao, L. Senescent cell depletion through targeting BCL-family proteins and mitochondria. Frontiers in Physiology. 11, 593630 (2020).
  22. Kim, K. M., et al. Identification of senescent cell surface targetable protein DPP4. Genes and Development. 31 (15), 1529-1534 (2017).
  23. Flor, A. C., Kron, S. J. Lipid-derived reactive aldehydes link oxidative stress to cell senescence. Cell Death Discovery. 7 (9), 2366 (2016).
  24. Jochems, F., et al. The Cancer SENESCopedia: A delineation of cancer cell senescence. Cell reports. 36 (4), 109441 (2021).
  25. Fallah, M., et al. Doxorubicin and liposomal doxorubicin induce senescence by enhancing nuclear factor kappa B and mitochondrial membrane potential. Life Sciences. 232, 116677 (2019).
  26. Kasper, M., Barth, K. Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1. Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).
  27. Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis. Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).
  28. Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence. Cell Death Discovery. 3, 17075 (2017).
  29. Burd, C. E., et al. Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model. Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).
  30. Liu, J. Y., et al. Cells exhibiting strong p16 (INK4a) promoter activation in vivo display features of senescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2603-2611 (2019).
  31. Wang, L., Lankhorst, L., Bernards, R. Exploiting senescence for the treatment of cancer. Nature Reviews Cancer. 22 (6), 340-355 (2022).
  32. Baek, K. -H., Ryeom, S. Detection of oncogene-induced senescence in vivo. Methods in Molecular Biology. 1534, 185-198 (2017).
  33. González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo. The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).

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Ricerca sul cancro Numero 187 Senescenza cancro chemioterapia citometria a flusso sonda fluorescente multiplex
Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso
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Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D.,… More

Flor, A., Pagacz, J., Thompson, D., Kron, S. Far-Red Fluorescent Senescence-Associated β-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (187), e64176, doi:10.3791/64176 (2022).

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