Summary
Den nuværende protokol fremhæver anvendelsen af western blotting teknik til at studere funktioner og aktiviteter af neuronal K-Cl co-transporter KCC2. Protokollen beskriver undersøgelsen af KCC2-phosphorylering på kinaseregulerende steder Thr906/1007 via western blotting. Yderligere metoder til bekræftelse af KCC2-aktivitet er også kort fremhævet i denne tekst.
Abstract
Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC'er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning. Manglende korrekt regulering af KCC2 er skadelig og har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi. Der er sket betydelige fremskridt med hensyn til at forstå de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Her fremhæver protokollen, hvordan man undersøger KCC2-fosforylering på kinaseregulerende steder - Thr906 og Thr1007 - ved hjælp af western blotting-teknik. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase. Et par af disse yderligere teknikker vil kort blive diskuteret i dette manuskript.
Introduction
Kaliumchlorid cotransporters 2 (KCC2) er medlem af den opløste bærerfamilie 12 (SLC12) af kation-chlorid-cotransportere (CCC'er), der udelukkende findes i neuronen og er afgørende for, at Cl-homeostase fungerer korrekt og følgelig funktionel GABAergisk hæmning 1,2,3,4. Vedligeholdelsen af lav intraneuronal Cl-koncentration ([Cl-]i) ved 4-6 mM ved KCC2 letter γ-aminosmørsyre (GABA)/glycinhyperpolarisering og synaptisk hæmning i hjernen og rygmarven5. Manglende korrekt regulering af KCC2 har været forbundet med forekomsten af flere neurologiske sygdomme, herunder epilepsi4. Desuden har nedsat KCC2-medieret Cl-ekstrudering og nedsat hyperpolariserende GABAA og / eller glycinreceptormedierede strømme været impliceret i epilepsi, neuropatisk smerte og spasticitet 6,7. Neuronal KCC2 moduleres negativt via phosphorylering af vigtige regulatoriske rester inden for dets C-terminale intracellulære domæne af det med-ingen-lysin (WNK)-STE20 / SPS1-relaterede prolin / alaninrige (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinasesignalkompleks1, hvilket letter vedligeholdelsen af depolariseret GABA-aktivitet i umodne neuroner 2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1 phosphorylerer threoninrester 906 og 1007 (Thr906 / Thr1007) og nedregulerer efterfølgende mRNA-genekspression af KCC2, hvilket fører til en deraf følgende forringelse af dets fysiologiske funktion 8,10. Endnu vigtigere er det imidlertid allerede en kendsgerning, at WNK-SPAK / OSR1 kinasekomplekset er kendt for phosphorylat og hæmmer KCC2-ekspression 1,2,4,11,12, og at inhiberingen af kinasekompleksets signalveje til phosphorylat Thr906 / Thr1007 har været forbundet med den øgede ekspression af KCC2 mRNA-genet 13,14,15 . Det er vigtigt at bemærke, at reguleringen af neuronal KCC2 og Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) ekspression via proteinfosforylering virker samtidigt og i omvendte mønstre 1,4,16.
Der er sket konsekvente og betydelige fremskridt med hensyn til forståelsen af de mekanismer, der er involveret i reguleringen af KCC2, og som er akkrediteret til udvikling af teknikker, der gør det muligt for forskere at studere dets funktioner og aktiviteter; enten via direkte (vurdering af kinaseregulerende steder phosphorylering) eller indirekte (observation og overvågning af GABA-aktivitet) undersøgelser. Protokollen, der præsenteres her, fremhæver anvendelsen af western blotting-teknikker til at studere funktionerne og aktiviteterne hos neuronal K +-Cl-co-transporter KCC2 ved at undersøge phosphorylering af cotransporteren på kinaseregulerende steder Thr906/1007.
Western blot er en metode, der bruges til at detektere specifikke proteiner af interesse fra en prøve af væv eller celle. Denne metode adskiller først proteinerne efter størrelse gennem elektroforese. Proteinerne overføres derefter elektroforetisk til en fast støtte (normalt en membran), før målproteinet markeres ved hjælp af et specifikt antistof. Antistofferne er konjugeret til forskellige tags eller fluorophorekonjugerede antistoffer, der detekteres ved hjælp af enten kolorimetriske, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Dette gør det muligt at detektere et specifikt målprotein fra en blanding af proteiner. Denne teknik er blevet brugt til at karakterisere fosfospecifikke steder i KCCs1 og er blevet brugt til at identificere kinasehæmmere, der hæmmer KCC3 Thr991 / Thr1048 phosphorylation17. Ved at følge denne protokol kan man specifikt detektere total og phosphoryleret KCC2 fra celle / væv lysater. I princippet er påvisning af proteinkonjugerede antistoffer ved hjælp af denne teknik meget instrumentel, da det hjælper med at forbedre forståelsen af samarbejdsaktiviteter på phospho-stederne i KCC2, hvilket kaster lys over de molekylære mekanismer, der er involveret i deres fysiologiske reguleringer. Den kvantitative analyse af det samlede proteinekspression er repræsentativt for KCC2's funktion og aktivitet. Der er andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet, såsom rubidiumion og thalliumionoptagelsesanalyse. Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Protokollen beskriver western blotting-metoden til påvisning af specifikke proteiner af interesse.
1. Cellekultur og transfektion
- Varm alle reagenserne i perlebadet (37 °C) op inden celledyrkningsproceduren. Forbered kulturmedium, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% hver af 2mM L-glutamin, 100x ikke-essentiel aminosyre, 100 mM natriumpyruvat og 100 enheder / ml penicillin-streptomycin.
- Optøning af stabilt transficeret rotte KCC2b human embryonal nyre 293 celler (HEK293rnKCC2b)18 helt i perlebadet (37 °C). Overfør cellerne fra kryovialrøret til et centrifugerør indeholdende 5 ml friske medier. Drej cellen ved 1200 ×g i 3-5 min.
- Brug en aspiratorpipette (fastgjort til en vakuumpumpe) til at opsuge supernatanten og tilsæt 10 ml friske medier for at genophænge cellerne. Overfør cellesuspensionen til en 10 cm opvaskeplade.
- Placer skålen i inkubatoren og lad den vokse i 48 timer ved 37 °є i en befugtet 5% CO2 atmosfære. Overvåg inkubationsperioden for at sikre sund cellevækst. Yderligere opdele cellerne, når de har nået over 90% sammenløb efter inkubationsperioden.
- Aspirer de gamle medier ud af celleskålen og skyl forsigtigt celler med 2 ml fosfatbuffersaltvand (PBS). Tilsæt 2 ml trypsin og inkuber i ca. 1-2 min ved stuetemperatur.
- Brug 2 ml komplette medier til forsigtigt at vaske de trypsiniserede celler i skålen. Tilsæt 9 ml friske medier til nye retter og tilsæt 1 ml opløsning fra den gamle skål til hver af de nye. Overfør de delte celleskåle tilbage til inkubatoren i 48 timer for at opnå ≥ 90% sammenløb.
- Behandl cellerne med enten dimethylsulfoxid (DMSO) som kontrol, 8 μM staurosporin eller 0,5 mM N-ethylmaleimid (NEM) i 15 minutter, før cellerne høstes i lysisbuffer.
2. Forberedelse af cellelysater og indlæsningsprøver
- Aspirer medierne på kulturskålen (fra transfektionsprocedurer). Placer cellekulturen på is og vask cellerne med iskold PBS.
- PBS aspireres, og tilsæt derefter 1,0 ml iskold lysisbuffer indeholdende 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM ethylenglycol-bis (β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraeddikesyre (EGTA), 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 50 mM natriumfluorid, 5 mM natriumpyrophosphat, 10 mM natrium-β-glycerophosphat, 1 mM natriumortovanadat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M saccharose, 1 mM benzamin, 0,1% (v/v) 2-mercaptoethanol og 2 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) til skålen.
BEMÆRK: Mængden af lysisbuffer under cellehøst varierer med skålstørrelser, for eksempel er 1 ml lysisbuffer egnet pr. 1 x 107 celler / 100 mm skål / 150 cm 2 kolbe, mens 0,5 ml er egnet pr. 5 x 106 celler / 60 mm skål / 75 cm2 kolbe. - Brug en kold plastcelleskraber til at skrabe cellerne af bunden af fadet, og brug derefter forsigtigt en pipette til at overføre cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør, der allerede er på is. Rør omrøres konstant i 30 minutter ved 4 °C.
- Drej cellelysaterne i en kold centrifuge (4 °C) ved 16.000 x g i 20 minutter, fjern røret forsigtigt fra centrifugen, og læg det på is. Saml supernatanten i et forkølet frisk rør og kassér pelleten.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at variere centrifugeringskraften og tiden afhængigt af celletypen. De generelle retningslinjer tilskynder dog til centrifugering ved 16.000 x g i 20 min. Dette skal dog bestemmes for hvert eksperiment. For eksempel har sarte celler som leukocytter brug for en meget let centrifugeringshastighed.
3. Fremstilling af immunoprecipitanter fra cellelysater
- Pipetter 300 μL protein-G-sepharose i et mikrocentrifugerør. Drej opløsningen ved 500 x g i 2 minutter, og kassér supernatanten.
- Tilsæt 500 μL PBS og hvirvel opløsningen godt. Drej opløsningen ved 500 x g i 2 minutter, og kassér supernatanten. Gentag dette trin.
- Bland 1 mg anti-KCC2 Thr906 og anti-KCC2 Thr1007 antistoffer med 200 μL protein G-sepharose perler og fyld volumen til 500 μL med PBS. Ryst på en vibrerende platform eller roterende hjul i 2 timer ved 4 °C. Vask 2x med PBS.
- Udfør proteinkvantificering på helcellelysaterne og tilsæt 1 mg cellelysatet til de vaskede perler. Der inkuberes forsigtigt i en ende-til-ende rotator i 2 timer ved 4 °C. Drej perlerne ned og vask dem 3x med PBS indeholdende 150 mM natriumchlorid (NaCl).
- Vask immunoprecipitanter (perler) 3x med 200 μL PBS. Den endelige pellet genudsættes i 100 μL 1x lithiumdodecylsulfat (LDS) prøvebuffer.
- Ryst rørene i en rotorryster ved stuetemperatur i 5 min., og inkuber dem i en varmeblok ved 75 °C i 10 min. Belastningsprøven centrifugeres ved 11.000 x g i 2 minutter, og supernatanten anvendes til gelpålæsning.
4. Udførelse af western blot
- Støbeapparatet samles, og der hældes frisklavet 8% separerende gel (se opskrift/tilberedning i tabel 1 ) for at støbe gelen, så der er ca. 2 cm plads fra toppen af støbeglasset. Tilsæt 200 μL absolut isopropanol til opsætningen, og lad den stå ved stuetemperatur i 60 min.
BEMÆRK: Polyacrylamidgelopskriften til natriumdodecylsulfat-polyacrylmidgelelektroforese (SDS-PAGE) afhænger af størrelsen af det protein, der er af interesse (tabel 2). Noter derfor proteinstørrelsen, inden du bestemmer den ønskede gelprocent. - Brug en pipette til at fjerne isopropanolen og skyl gelen forsigtigt med ca. 200 μL destilleret vand. Tilsæt frisklavet 6% stablingsgel (se tabel 1 for opskrift/tilberedning) for at udfylde den ca. 2 cm store plads på støbeopsætningen. Sæt forsigtigt i brøndkammen og lad stå ved stuetemperatur i 30 min.
- Fastgør den støbte gel i elektroforesetanken.
- Opløs 30,3 g Tris-base, 144,1 g glycin og 10 g SDS i 1000 ml destilleret vand for at forberede 10x overførselsbuffer. Forbered 1x løbende buffer ved at tilføje 10 ml 10% SDS og 100 ml 10x overførselsbuffer til 890 ml destilleret vand.
- Hæld 1x løbende buffer i tanken. Der lægges 5 μL molekylvægtsmarkør i det første hul og en lige stor mængde protein i hver brønd i SDS-PAGE-gelen (mellem 18-30 μL, afhængigt af den anvendte kamstørrelse). Fyld tomme brønde med 1x LDS og kør gelen i ca. 90-120 min ved 120 V.
- 58,2 g Tris-base og 29,3 g glycin opløses i 1000 ml destilleret vand for at forberede 10x overførselsbuffer. Aktiver nitrocellulosemembran med 1x overførselsbuffer indeholdende 20% methanol. Skyl gelen og membranen med overførselsbufferen og spred dem forsigtigt ud på forberedelsesstakken.
BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at justere pH-værdien i løbe- og overførselsbufferne, da de skal være ved den optimale pH, der kræves. Det tilrådes også at forberede disse buffere og opbevare dem ved stuetemperatur før eksperimentet for at spare tid. - Arranger sandwichen, der skal overføres i denne rækkefølge: negativ elektrode (sort ramme / ende) - sandwichskum - filterpapir - skyllet SDS-PAGE gel - skyllet nitrocellulosemembran - filterpapir - sandwichskum - positiv elektrode (rød ramme). Stak den samlede sandwich i overførselstanken og kør ved 90 V i 90 min eller 30 V i 360 min.
5. Antistoffarvning og billedudvikling
- Fjern membranen og lad den tørre. Membranen blokeres i 1 time ved stuetemperatur ved hjælp af en blokerende buffer fremstillet af 5% skummetmælk i Tris-bufferet saltvand indeholdende 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Membranerne inkuberes med passende fortyndinger af primært antistof 8,15,19 og beta-actin (belastningskontrol) i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C. Vask membranen i tre vaske med 1x TBS-T i 5 minutter hver.
BEMÆRK: Inkubationen af den separate membran med belastningskontroller såsom beta-actin, alfa-tubulin eller glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase-antistoffer er at normalisere de andre vestlige blottingresultater under efterfølgende kvantificering. Den anbefalede fortynding for hvert primært antistof er tilgængelig i producentens manual. - Inkuber den vaskede membran med sekundært antistof fortyndet 5000 gange i blokerende buffer i 60 minutter ved stuetemperatur. Vask igen membranen 3x i 1x TBS-T i 5 minutter hver.
BEMÆRK: Det anbefales stærkt, at det sekundære antistof skal hæves mod den art, hvor det primære antistof er rejst. For eksempel, hvis det primære antistof i total KCC2 er mus anti-KCC2, skal det sekundære antistof til anti-mus anvendes. - Placer den vaskede membran på billedbrættet. Bland lige store mængder af hvert forbedret kemiluminescens (ECL) reagens og spred forsigtigt den blandede opløsning på membranen for at udvikle signaler.
6. Billedoptagelse ved hjælp af et billedbehandlingssystem og datakvantificering
- Overfør billedbehandlingskortet til det relevante rum på billedbehandlingssystemet til billeddannelse. Åbn billedbehandlingssoftwaren på computeren til billedbehandling.
- Klik på Ny protokol på værktøjslinjen, og vælg Enkelt kanal. Klik på Vælg under dialogboksen gelbilleddannelse/program, rul til Blot, og vælg enten Chemi Hi-følsomhed eller Chemi Hi-opløsning. Klik derefter på Opsætning af signalakkumulering for at indstille varigheden og antallet af billeder, der skal erhverves.
- Klik på Placer gel under protokolopsætning, og juster gelen i billeddannelsessystemet, hvis det er nødvendigt. Klik på Kør protokol for at hente billederne.
- Højreklik på et af de erhvervede billeder under billedkatalogboksen for at gemme billederne på computeren. Naviger til det ønskede billede, og klik på Vælg billede og fortsæt under dialogboksen Kør.
- Klik på ikonet Billedtransformation for at justere kontrasten og pixelmætningen af billedet. Klik på Skærmbillede ikon på den generelle værktøjslinje for at gemme billedet på computeren afhængigt af det ønskede billedformat.
- Mål båndtæthederne ved hjælp af ImageJ-software, og analyser ved hjælp af passende statistiske værktøjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her undersøgte det repræsentative resultat, der blev præsenteret i figur 1, virkningen af staurosporin og NEM på WNK-SPAK / OSR1 medieret phosphorylering af KCC2 og NKCC1 i HEK293 cellelinjer, der stabilt udtrykker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 ved hjælp af western blotting-teknikken. Omfattende detaljer om de repræsentative resultater diskuteres i Zhang et al.15. I lighed med NAM er staurosporin en bred kinasehæmmer, der kan forbedre KCC2-transportaktiviteten og hæmme NKCC1-aktivitet15,20. Behandlingen af HEK293-celler med staurosporin og NEM forårsagede nedsat phosphorylering på SPAK-målsteder - Thr233 beliggende i T-loop-kinasedomænet og S-loop-phosphoryleringsstedet Ser373 i hsSPAK. Således forkortede begge forbindelser fosforyleringsniveauerne for de førnævnte SPAK-phospho-steder. Staurosporin reducerede også phosphoryleringen af Ser940 i HEKrnKCC2b, men NEM øgede sin phosphorylering betydeligt. Desuden nedsætter staurosporin phosphorylering på Thr505-stedet, mens NEM forårsagede en lille, men ubetydelig stigning i fosforylering på samme sted. De differentielle virkninger af begge forbindelser på phosphorylering af proteinkinase C (PKC) på Thr505-stedet og KCC2b på Ser940-stedet korrelerer godt. Det repræsentative resultat viste også, at begge midler ændrede ekspressionen af total rnKCC2b, hsNKCC1 eller hsSPAK. NEM (men ikke staurosporinbehandling) forårsagede en signifikant stigning i ekspressionen af den samlede KCC2-mængde, mens ekspressionen af total NKCC1 og SPAK ikke blev signifikant ændret, når den blev behandlet med begge forbindelser. Desuden forårsagede de to forbindelser en nedsat phosphorylering af SPAK på Thr233- og Ser373-lokaliteter, og dette korrelerede med den forkortede phosphorylering af Thr906/Thr1007- og Thr203/207/212-lokaliteter i henholdsvis rnKCC2b og hsNKCC1. Derudover reducerede og øgede staurosporin og NEM phosphoryleringen af PKC på Ser940-stedet i henholdsvis rnKCC2b, hvilket korrelerede med reduktionen og forøgelsen i phosphorylering af PKC-δ på Thr505-stedet ved henholdsvis staurosporin- og NEM-behandling (figur 1).
Figur 1: Kvantitative analyser af rn KCC2b og hsNKCC1 phospho-sites ved staurosporin- og NEM-behandling i HEK rn KCC2b-celler. (A) Stabilt transficerede HEK rnKCC2b-celler blev behandlet med DMSO (kontrol), 8 μM staurosporin eller 0,5 mM NEM i 15 min. Cellelysater blev høstet og udsat for immunoprecipitation (IP) og immunoblot (IB) med indikerede antistoffer. Forkortelser: D = dimeric KCC2; M = monomer KCC2. (B) Immunoblot kvantificering af stabilt transficerede HEKrnKCC2b-celler. Bandintensiteter blev kvantificeret med ImageJ-software. p < 0,001; **p < 0,01; Wilcoxon-Mann Whitney-test (n = 6). Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al.15. Klik her for at se en større version af denne figur.
| 8 ml 8% adskillende gel | 5 ml 6% stablingsgel | ||
| Nødvendige materialer | Volumen (μL) | Nødvendige materialer | Volumen (μL) |
| Destilleret H2O | 4200 | Destilleret H2O | 2900 |
| 40% acrylamid | 1600 | 40% acrylamid | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDS | 80 | 10% SDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Gør den adskillende gel: | |
| 1) | Begynd med 4,2 ml ddH2O |
| 2) | Tilsæt 1,6 ml 40% acrylamid / bis-acrylamid opløsning |
| 3) | Tilsæt 2 ml 1,5 M Tris pH 8,8 og bland |
| 4) | Bland 80 μL 10% SDS i |
| 5) | Når du er klar til brug, tilsættes 8 μL TEMED og blandes |
| 6) | Tilsæt 80 μL 10 % APS* og bland |
| Gør stablingsgelen: | |
| 1) | Begynd med 2,9 ml ddH2O |
| 2) | Der tilsættes 0,75 ml 40 % acrylamid /bis-acrylamid opløsning |
| 3) | Tilsæt 1,25 ml 0,5 M Tris pH 6,8 og bland |
| 4) | Bland 50 μL 10% SDS i |
| 5) | Når du er klar til brug, tilsættes 5 μL TEMED og blandes |
| 6) | Tilsæt 50 μL 10 % APS* og bland |
| SDS = Natriumdodecylsulfat | |
| APS = ammonium pr. sulfat | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetramethylethylendiamin | |
| *Ved tilsætning af APS skal opløsningen straks hældes i støbeapparatet, fordi opløsningen polymeriserer inden for få minutter. Derfor er det tilrådeligt at forberede adskillelses- og stablingsgelopløsningerne næsten, når opløsningerne er nødvendige. | |
Tabel 1: Opskrift på fremstilling af polyacrylamidgelblanding (adskillelse og stabling af gelopløsninger).
| Gelprocent (%) | Protein størrelse (kDa) |
| Op til 20 | 4 til 40 |
| 15 | 12 til 45 |
| 12.5 | 10 til 70 |
| 10 | 15 til 100 |
| 8 | 50 til 200 |
| 4 til 6 | > 200 |
Tabel 2: Anbefalet SDS-PAGE gelprocent for forskellige størrelser af proteiner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mange metoder er blevet brugt til at måle aktiviteterne i SLC12 af CCC'er, der udtrykkes i neuronerne, herunder KCC2. Mange af disse teknikker har vist sig at forbedre den videnskabelige viden om analysen af disse transportørers funktionelle relevans og deres strukturfunktionsmønstre i forskellige sygdomsrelaterede mutationer. Kritisk er der fordele og forbehold ved de forskellige metoder21. Protokollen forklaret ovenfor skitserede imidlertid, hvordan man vurderer KCC2-phosphorylering på kinaseregulerende steder, Thr906 og Thr1007, ved hjælp af western blot, som kan være nyttigt til at studere KCC2's funktioner og aktiviteter.
Reguleringen af KCC2 sker gennem phosphorylering og dephosphorylering ved vigtige serin/threoninrester1. Western blotting er en effektiv teknik, der kan bruges til at undersøge KCC2 phosphorylering på kinaseregulerende steder ved Thr906 og Thr1007. I princippet påvises ændringer i phosphoryleringen af KCC2 ved anvendelse af phosphospecifikke antistoffer rettet mod phosphopeptider fra immunoblotprøver/proteiner af interesse. Western blot er en metode, der bruges til at detektere det specifikke protein af interesse fra en prøve af væv eller celle. Denne metode adskiller først proteinerne efter størrelse gennem elektroforese. Proteinerne overføres derefter elektroforetisk til en fast støtte (normalt en membran), før målproteinet markeres ved hjælp af et specifikt antistof. Antistofferne er konjugeret til forskellige tags eller fluorophorekonjugerede antistoffer, der detekteres ved hjælp af enten kolorimetriske, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Dette gør det muligt at detektere et specifikt målprotein fra en blanding af proteiner. Denne teknik er blevet brugt til at karakterisere fosfospecifikke steder af KCC2 2,8 og er blevet brugt til at identificere hæmmere af KCC2, der modvirker KCC2 Thr906 / Thr1007 phosphorylation15. HEK293-linjer har været i brug til flere eksperimenter på grund af deres fordel i molekylærbiologiske eksperimenter. De er hurtige at reproducere, nemme at vedligeholde og yderst effektive til transfektion og proteinproduktion22. Nogle meninger hævder imidlertid, at det måske ikke er den mest egnede kandidat til at udføre neurobiologiske eksperimenter, fordi det ikke er en celle, der stammer fra hjernen, og derfor kan dens fysiologiske specificitet være tvivlsom i neurovidenskabelig forskning. Tidligere undersøgelser har imidlertid vist, at lignende resultater observeres i ekspressionen af KCC2 i HEK293-celler og faktiske neuronale væv / celler 15,23. Derfor kan relevansen af HEK293 i neurovidenskabelig forskning ikke kasseres direkte.
I undersøgelser, der involverer analyse af proteinekspression ved western blotting-teknik, bør der lægges særlig vægt på valget af lysisbuffersammensætning, arten (type og koncentration) af det vaskemiddel, der skal anvendes24, og proteasehæmmerne. Bufferens sammensætning skal optimeres, så den passer til målproteinet for at lette dets opløseligheds- og ekstraktionsprocesser og for at muliggøre dets lette detektion ved western blot25. Mildt vaskemiddel ved lav koncentration er normalt påkrævet for opløselige proteiner, mens membranproteiner kan kræve stærkere vaskemiddelforhold. Imidlertid kan stærke vaskemidler forstyrre interaktioner, og komplekser kan gå tabt. Begge typer og koncentrationer af vaskemidlerne kan påvirke proteinets art og aktivitet, og der er derfor behov for at holde sig til et begrænset/tolereret koncentrationsområde for disse vaskemidler. Tilsætningen af proteasehæmmer vil forhindre, at målproteinet nedbrydes af endogene proteiner, og den optimale anbefalede arbejdstemperatur er 4 °C for effektivt at nedsætte proteolytiske hastigheder. Nogle gange, i et forsøg på at opnå immunoblot-signaler af høj kvalitet for antistoffer, der giver dårlige immunoblot-signaler, udføres immunoprecipitation (IP) som et opstrøms eksperiment til western blotting. Denne teknik er fordelagtig, fordi den letter interaktionen mellem antigener og deres respektive antistoffer i deres oprindelige konformation forud for deres deraf følgende adskillelse og kvantificering26. Derfor kan IP forbedre kvaliteten af output fra western blotting-procedurer. Før anvendelsen af IP-teknikken er det vigtigt at vurdere tilstedeværelsen og effektiviteten af ekspression af de co-immunopræcipiterede partnerproteiner i lysatet ved at analysere enten helcellelysatet eller inputfraktionerne ved western blotting. Desuden er forudgående kendskab til molekylvægten af det protein, der skal undersøges, nødvendigt, før der fremstilles de ønskede procentvise gelopløsninger til SDS-PAGE-elektroforese, da proteinets størrelse påvirker gelmatrixens sigteeffekt.
Påvisning af proteinkonjugerede antistoffer ved hjælp af denne teknik er dog yderst instrumentel, da det hjælper med at forbedre forståelsen af samarbejdsaktiviteter på phospho-lokaliteterne i KCC2, som kan give information om cotransporterfosforylering og integriteten af den signalvej, der kan regulere cotransporterne, for en pålidelig forudsigelse af cotransporteraktivitet. Det er dog vigtigt at bemærke, at western blot-teknikken kun er i stand til at producere semikvantitative data, hvilket betyder, at teknikken kun fremhæver den relative vurdering af proteinekspressioner, men ikke absolut kvantificering. Dette er akkrediteret til uoverensstemmelser i hastigheden af prøvebelastning og overførsel i separate baner, som er forskellige på individuelle blots. Det detekterede signal, der genereres, er heller ikke lineært og afspejler ikke koncentrationsområdet for prøver27. Desuden er fosforyleringsstatus muligvis ikke en pålidelig faktor til rapportering af proteinaktivitet, da interventioner såsom hæmmere, mutationer og proteininteraktioner med dets miljø direkte kan påvirke proteinaktiviteten uden at ændre dets fosforyleringsniveau28,29,30. Det kan således være mere fordelagtigt at bruge fosfospecifikke antistoffer til at supplere andre biokemiske metoder.
Som tidligere nævnt er der andre klassiske metoder, der bruges til direkte at måle KCC2-aktivitet. Vurderingen af KCC2 ved måling af radioaktiv 86Rb + flux gennem membranen i homogene cellepræparater er en populær tilgang. Denne metode bruger aktive radioisotoper som sporstoffer ved at føre dem gennem ioniske kanaler. Kort fortalt inkuberes cellerne af interesse i kationfrie opløsninger for at hæmme endogen KCC2, efterfulgt af inkubation med specifikke hæmmere såsom ouabain og derefter med optagelsesmedium indeholdende inhibitoren og 86Rb +. Flydende scintillationstællere bruges til at måle / spore aktiviteter efter cellelyse. Denne metode er dog robust, meget følsom og selektiv og er mindre tilbøjelig til forstyrrelser. Imidlertid strækker dets anvendelser sig ikke til væv med flere celletyper som hjerne- eller neuronkulturer. Desuden begrænser denne teknik ændringer i opløsningen af ionkoncentration på subcellulært niveau. Desuden er der sikkerhedsproblemer med hensyn til den potentielle toksicitet og sundhedsfare ved at arbejde med radioisotoper med kort halveringstid (18,65 dage) karakteriseret ved høj energiemission (maks. 1,77 MeV; maks. 1,08 MeV)31. Dette kan massivt tyde på en uegnethed til neuronale celleundersøgelser, hvor der normalt kræves et stort antal celler. Disse spørgsmål førte til udviklingen af det ikke-radioaktive 85Rb+ efflux-assay af Terstappen 1999 som et alternativ til det radioaktive 86Rb+ til bestemmelse af ionfluxer. Den ikke-radioaktive tilgang har i høj grad forvist de radioaktive 86Rb+ assays til analyse af K+ og ikke-selektive kationkanaler i medicinalindustrien31. Ikke-radioaktivt 85Rb + efflux-assay involverer to hovedprocesser, den første er cellekultur og manipulation, og den anden er bestemmelsen af sporstoffet rubidium ved atomabsorptionsspektroskopi (AAS). Denne metode er let at bruge, men den kræver en række assayvalideringseksperimenter og lider af dårlig tidsmæssig opløsning32. Ikke desto mindre har ikke-radioaktivt 85Rb+ efflux-assay gradvist vist sig at være en pålidelig teknik til vurdering af KCC'er og NKCC'er33.
Thallium (TI+) fluxassay bruger TI+ som surrogation for K+ på grund af dets høje bindingsaffinitet til K+ stedet på KCC2 og NKCC2. TI + tilstrømning til celler kunne detekteres ved hjælp af et thalliumfølsomt fluorescerende farvestof, såsom benzothiazolcoumarin og fluozin-2. Når det er transporteret af kanalen, kan TI + associeres med BTC / fluozin-2-farvestoffet, der forårsager en fluorescerende ændring, der kan detekteres af fluorometrisk billedpladelæser31. TI + indikatorfarvestoffer kommer ind i celler som acetoxymethylestere, som derefter spaltes af cytoplasmatiske esteraser for at frigive de aktive fluorogene former. For at aktivere KCC'erne stimuleres cellerne med en blanding af K + og TL + i nærvær eller fravær af testforbindelser (f.eks. KCC2-hæmmere). Thallium kommer ind og binder til fluorescensfarvestoffet. Stigningen i fluorescerende signal er proportional med tilstrømningen af Tl+ til cellen specifikt gennem cotransporteren og repræsenterer derfor en funktionel måling af cotransporteraktiviteten. Denne metode er også blevet anvendt godt til måling af KCC2- og NKCC2-aktivitet i forskellige typer cellekulturer, for eksempel undersøgelser af HEK293-cellelinje, der stabilt udtrykker human KCC234. I en demerit-ende er der en række potentielle off-target-vejelinjer, der kan forstyrre TI + -tilstrømning, for eksempel kan Na + / K + ATPase i HEK293-celler forårsage en højere falsk positiv eller falsk negativ hitrate35. Desuden, som med andre fluxassays, forbliver implementeringen af en sådan tilgang i neuronale celler begrænset på grund af den dårlige overlevelse af neuronale celler efter flere vasketrin. Den neuronale ekspression af flere K + -kanaler og transportør kan også hindre den nøjagtige vurdering af KCC2-specifikke K + -fluxer. Denne teknik præsenterer begrænsninger for undersøgelse af kanaler i små neuronale rum, såsom dendritter og dendritiske rygsøjler, og axonerne skyldes manglende rumlig opløsning kombineret med lav tidsmæssig opløsning.
Yderligere teknikker såsom patch-clamp-elektrofysiologi bruges til at måle GABA-aktivitet; derfor indirekte afspejler aktiveret og / eller inaktiveret KCC2 som informeret ved vurderingen af intracellulær chloridionhomeostase. Generelt er elektrofysiologiske målinger af SLC12-funktionen afhængige af princippet om, at GABA A-receptorerne (GABAA R) er gennemtrængelige for chlorid36. KCC2 er nøglen til modulering af GABAergic hæmning. Især [Cl-]i ekstruderingsaktiviteten af KCC2 ligger til grund for hyperpolariseringen af GABAAR6. Intracellulære optagelser giver afgørende indsigt gennem ekstrapolering af kloridekstruderingskapacitet af KCC2 fra vendingen i potentialet for GABAAR-medierede strømme (EGABA). En hyperpolariseret EGABA indikerer lavere [Cl-]i og dermed en stigning i aktiviteten af KCC2. Gramicidin patch-clamp teknik i elektrofysiologi er en guld standard tilgang til måling af GABA aktivitet. Nogle tidligere offentliggjorte undersøgelser har anvendt gramicidin patch-clamp optagelse til at undersøge KCC2's funktioner og aktiviteter til at vurdere / overvåge [Cl-] i homeostase har faktisk vist sig at være vellykket 8,9,37,38,39,40 . Under en gramicidin-patch-clamp-optagelse skabes en tæt tætning på celle- / vævsoverfladen ved hjælp af en glaselektrode med et relativt plaster til at registrere den intracellulære aktivitet af ionkanaler med henvisning til en anden elektrode i et bad, der omgiver cellen / vævet. Denne teknik kan udføres ved at måle mængden af strøm, der krydser en celles membran ved en fast spænding i spændingsklemmetilstand eller ved at registrere mængden af spænding, der bevæger sig over membranen ved en fast strøm i den aktuelle klemmetilstand36. Flere variationer af den grundlæggende teknik kan anvendes, hvilket i høj grad afhænger af forskningsspørgsmålet. Teknikken skaber ikke en relativt stor porelignende helcelleplasteroptagelse, men det poredannende antibiotikum (gramicidin), der er indeholdt i elektrodeopløsningen, bruges til at danne små porer i membranen36. Især skaber tilsætningen af gramicidin kationselektive porer i membranen, som udviser ubetydelig anionpermeabilitet. Spændingsrampeprotokoller er et effektivt og pålideligt alternativ til optagelse af strømmen ved en stabil spænding. Strømmen / spændingsrelationerne opnået med spændingsrampeprotokoller ser ud til at give en bedre registrering af GABAAR-medierede membranstrømme. I denne protokol påføres en konstant skiftende, men overvåget spænding (med en stabil hastighed), og strømmen måles konstantsamtidigt 36,41. Under denne protokol bruges anvendelsen af spændingsimpulser (normalt i hyperpolariserende retning) til at aktivere lækstrømmen som et resultat af ohmske reaktioner. Typisk beregnes GABAAR-medierede membranstrømme ud fra lækstrømmen (dvs. reverseringspotentialerne for de lækage-subtraherede agoniststrømme)36. De strømspændingsforeninger, der opnås ved denne protokol, hjælper med at give en bedre forståelse af, hvor ændringerne forekommer i ionkoncentrationer under et eksperimentelt scenario, der involverer GABA A-receptorkanaler. Yelhekar et al.41 anvendte en beregningsmodel til at vise, at konklusioner om stabile ionkoncentrationer fra interpolationsmetoden muligvis ikke er berettigede, fordi det estimerede reverseringspotentiale fra metoden kan være forkert.
Den gennemsnitlige modstand, der bruges til de fleste optagelser, er 5 MΩ. Pipetter med lavere modstand på 3-4 MΩ kan resultere i lavere seriemodstand, hvilket er at foretrække til spændingsklemmeoptagelser. Pipettens spids vil dog være sammenligneligt bredere for pipetter med højere modstand, og som følge heraf udgør den en udfordring i form af vanskeligheder med tætningsdannelse og stabilitet36,42. Derfor er det nødvendigt at overvåge GΩ-formationen for at opnå optagelser med en betydelig reduktion i niveauet af genererede støjende data. Robustheden af denne teknik til at studere KCC2's funktion og aktiviteter som bedømt ud fra dens egnethed og pålidelighed ved måling af GABA-aktivitet er blevet bekræftet af flere undersøgelser. Tidligere undersøgelser har vist, at [Cl-]i forbliver stabil ved hjælp af denne teknik ved at måle responserne fra GABAARs (som er i stand til at gate chlorid konduktans) til deres respektive agonister. Underforstået kommer kontinuerlig elektrisk adgang med ringe eller ingen ændring af intracellulær chloridkoncentration43,44. Desuden letter denne teknik omgåelse af kunstige ændringer i membranpotentiale og E GABA underGABA AR-aktivering (som åbner klorid og bicarbonatkonduktans)45. Ovennævnte giver denne teknik en fordel foran andre typer elektrofysiologiske optagelser. Begrænsningerne ved denne teknik omfatter imidlertid følgende: (1) hyppig optagestøj kan forekomme på grund af spidsen af elektroden, der optager en del af membranen, hvilket kan reducere den aktuelle opløsning, og (2) perforering af membranen med gramicidin tager normalt relativt længere tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) og et Commonwealth Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
