Summary
Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.
Abstract
Les cotransporteurs de chlorure de potassium 2 (KCC2) font partie de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure cationique (CCC), présents exclusivement dans le neurone et sont essentiels au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl- et par conséquent à l’inhibition fonctionnelle du GABAergique. L’échec de la régulation correcte de KCC2 est délétère et a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie. Des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédité pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Ici, le protocole souligne comment étudier la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases - Thr906 et Thr1007 - en utilisant la technique de transfert western. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire. Quelques-unes de ces techniques supplémentaires seront brièvement discutées dans ce manuscrit.
Introduction
Le cotransporteur de chlorure de potassium 2 (KCC2) est un membre de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure de cations (CCC), présents exclusivement dans le neurone et est essentiel au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl- et par conséquent à l’inhibition GABAergique fonctionnelle 1,2,3,4. Le maintien d’une faible concentration intraneuronale de Cl- ([Cl-]i) à 4-6 mM par KCC2 facilite l’hyperpolarisation de l’acide γ-aminobutyrique (GABA)/glycine et l’inhibition synaptique dans le cerveau et la moelle épinière5. L’échec de la régulation correcte de KCC2 a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie4. De plus, une diminution de l’extrusion Cl− médiée par KCC2 et une altération des courants hyperpolarisants médiés par le GABAA et/ou les récepteurs de glycine ont été impliqués dans l’épilepsie, la douleur neuropathique et la spasticité 6,7. Le KCC2 neuronal est modulé négativement par phosphorylation de résidus régulateurs clés dans son domaine intracellulaire C-terminal par le complexe de signalisation kinase proline/alanine-rich (SPAK)/sensible au stress oxydatif (OSR)lié à la proline/SPS1 sans lysine (WNK)-STE20/SPS1, qui facilite le maintien de l’activité dépolarisée du GABA dans les neurones immatures 2,8,9 . Le WNK-SPAK/OSR1 phosphoryle les résidus de thréonine 906 et 1007 (Thr906/Thr1007) et régule par la suite à la baisse l’expression du gène de l’ARNm de KCC2, entraînant une détérioration conséquente de sa fonction physiologique 8,10. Plus important encore, cependant, il est déjà un fait que le complexe kinase WNK-SPAK/OSR1 est connu pour phosphoryler et inhiber l’expression de KCC2 1,2,4,11,12, et que l’inhibition des voies de signalisation du complexe kinase pour phosphoryler Thr906/Thr1007 a été liée à l’expression accrue du gène de l’ARNm KCC2 13,14,15 . Il est important de noter que la régulation de l’expression neuronale KCC2 et Na+-K+-2Cl- cotransporteurs 1 (NKCC1) via la phosphorylation des protéines fonctionne de manière concomitante et inverse 1,4,16.
Des progrès constants et considérables ont été accomplis en ce qui concerne la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédités pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Le protocole présenté ici met en évidence l’application des techniques de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du co-transporteur neuronal K+-Cl- KCC2 en étudiant la phosphorylation du cotransporteur sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007.
Le transfert Western est une méthode utilisée pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt à partir d’un échantillon de tissu ou de cellule. Cette méthode sépare d’abord les protéines par taille par électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées électrophoristiquement sur un support solide (généralement une membrane) avant que la protéine cible ne soit marquée à l’aide d’un anticorps spécifique. Les anticorps sont conjugués à différents marqueurs ou anticorps conjugués au fluorophore qui sont détectés à l’aide de méthodes colorimétriques, de chimiluminescence ou de fluorescence. Cela permet de détecter une protéine cible spécifique à partir d’un mélange de protéines. Cette technique a été utilisée pour caractériser les sites phosphospécifiques des KCC1 et a été utilisée pour identifier les inhibiteurs de kinases qui inhibent la phosphorylation KCC3 Thr991/Thr104817. En suivant ce protocole, on peut détecter spécifiquement KCC2 total et phosphorylé à partir de lysats cellulaires / tissulaires. En principe, la détection d’anticorps conjugués aux protéines par cette technique est très instrumentale car elle permet d’améliorer la compréhension des activités coopératives sur les sites phosphographiques de KCC2, ce qui met en lumière les mécanismes moléculaires impliqués dans leurs régulations physiologiques. L’analyse quantitative de l’expression totale des protéines est représentative de la fonction et de l’activité de KCC2. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire.
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Protocol
REMARQUE : Le protocole décrit la méthode de transfert Western pour détecter des protéines d’intérêt spécifiques.
1. Culture cellulaire et transfection
- Réchauffer tous les réactifs dans le bain de billes (37 °C) avant la procédure de culture cellulaire. Préparer le milieu de culture, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine de 2 mM, 100 fois plus d’acides aminés non essentiels, 100 mM de pyruvate de sodium et 100 unités/ml de pénicilline-streptomycine.
- Décongeler de manière stable les cellules embryonnaires rénales humaines KCC2b du rat KCC2b (HEK293rnKCC2b)18 complètement dans le bain de billes (37 °C). Transférer les cellules du tube cryovial dans un tube centrifuge contenant 5 mL de fluide frais. Faites tourner la cellule à 1200 ×g pendant 3-5 min.
- Utilisez une pipette d’aspiration (fixée à une pompe à vide) pour aspirer le surnageant et ajoutez 10 ml de fluide frais pour remettre les cellules en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans une assiette à plat de 10 cm.
- Placer la capsule dans l’incubateur et laisser pousser pendant 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 . Surveiller la période d’incubation pour assurer une croissance cellulaire saine. Divisez davantage les cellules lorsqu’elles ont atteint plus de 90% de confluence après la période d’incubation.
- Aspirer les vieux milieux hors du plat de cellules et rincer doucement les cellules avec 2 mL de solution saline tampon phosphate (PBS). Ajouter 2 mL de trypsine et incuber pendant environ 1-2 minutes à température ambiante.
- Utilisez 2 mL de média complet pour laver délicatement les cellules trypsinisées dans le plat. Ajouter 9 ml de produits frais aux nouveaux plats et ajouter 1 ml de solution de l’ancien plat à chacun des nouveaux. Transférer les antennes à cellules divisées dans l’incubateur pendant 48 h pour atteindre ≥ confluence de 90%.
- Traiter les cellules avec soit du diméthylsulfoxyde (DMSO) comme témoin, 8 μM de staurosporine, ou 0,5 mM N-éthylmaléimide (NEM) pendant 15 minutes avant de récolter les cellules dans le tampon de lyse.
2. Préparation des lysats cellulaires et chargement des échantillons
- Aspirer les médias sur le plat de culture (à partir des procédures de transfection). Placez la culture cellulaire sur de la glace et lavez les cellules avec du PBS glacé.
- Aspirer le PBS, puis ajouter 1,0 mL de tampon de lyse glacée contenant 50 mM de tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique (EGTA), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 50 mM de fluorure de sodium, 5 mM de pyrophosphate de sodium, 10 mM de sodium-β-glycérophosphate, 1 mM d’orthovanadate de sodium, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M de saccharose, 1 mM de benzamine, 0,1 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol et 2 mM de phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF) dans la boîte.
REMARQUE : Le volume de tampon de lyse pendant la récolte des cellules varie selon la taille des plats, par exemple, 1 mL de tampon de lyse convient par 1 x 107 cellules/boîte de 100 mm/150 cm 2 flacons, tandis que 0,5 mL convient par 5 x 106 cellules/boîte de 60 mm/75 cm2 flacons. - Utilisez un grattoir de cellules en plastique froid pour gratter les cellules du fond de la boîte, puis utilisez doucement une pipette pour transférer la suspension de cellules dans un tube de microcentrifugation déjà sur la glace. Agiter constamment le tube pendant 30 min à 4 °C.
- Faites tourner les lysats cellulaires dans une centrifugeuse froide (4 °C) à 16 000 x g pendant 20 min, retirez doucement le tube de la centrifugeuse et placez-le sur de la glace. Recueillir le surnageant dans un tube frais prérefroidi et jeter le granulé.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de faire varier la force et le temps de centrifugation en fonction du type de cellule. Cependant, les directives générales encouragent la centrifugation à 16 000 x g pendant 20 min. Cependant, cela doit être déterminé pour chaque expérience. Par exemple, les cellules délicates comme les leucocytes ont besoin d’une vitesse de centrifugation très légère.
3. Préparation d’immunoprécipitants à partir de lysats cellulaires
- Pipeter 300 μL de protéine-G-sépharose dans un tube microcentrifugeux. Faire tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jeter le surnageant.
- Ajouter 500 μL de PBS et bien vorter la solution. Faire tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape.
- Mélanger 1 mg d’anticorps anti-KCC2 Thr906 et anti-KCC2 Thr1007 avec 200 μL de billes de protéine G-sépharose et compléter le volume à 500 μL avec PBS. Agiter sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant 2 h à 4 °C. Lavez 2x avec PBS.
- Effectuer la quantification des protéines sur les lysats de cellules entières et ajouter 1 mg du lysat cellulaire aux billes lavées. Incuber doucement dans un rotateur de bout en bout pendant 2 h à 4 °C. Faites tourner les billes et lavez-les 3x avec du PBS contenant 150 mM de chlorure de sodium (NaCl).
- Lavez les immunoprécipitants (billes) 3x avec 200 μL de PBS. Remettez en suspension la pastille finale dans 100 μL de 1x tampon d’échantillon de sulfate de dodécyle de lithium (LDS).
- Agiter les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant 5 min et les incuber dans un bloc chauffant à 75 °C pendant 10 min. Centrifuger l’échantillon de chargement à 11 000 x g pendant 2 min et utiliser le surnageant pour le chargement du gel.
4. Exécution du transfert Western
- Assembler l’appareil de coulée et verser le gel de séparation à 8 % fraîchement préparé (voir le tableau 1 pour la recette/préparation) pour couler le gel en laissant environ 2 cm d’espace à partir du haut du verre de coulée. Ajouter 200 μL d’isopropanol absolu à l’installation et laisser reposer à température ambiante pendant 60 min.
REMARQUE : La recette du gel de polyacrylamide pour l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) dépend de la taille de la protéine d’intérêt (tableau 2). Par conséquent, notez la taille de la protéine avant de déterminer le pourcentage de gel souhaité. - Utilisez une pipette pour enlever l’isopropanol et rincez soigneusement le gel avec environ 200 μL d’eau distillée. Ajouter du gel empilable à 6 % fraîchement préparé (voir le tableau 1 pour la recette/préparation) pour remplir l’espace d’environ 2 cm sur la configuration de coulée. Ajuster délicatement dans le peigne du puits et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.
- Fixez le gel coulé dans le réservoir d’électrophorèse.
- Dissoudre 30,3 g de Tris base, 144,1 g de glycine et 10 g de SDS dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer un tampon de transfert 10x. Préparer 1x tampon courant en ajoutant 10 ml de SDS à 10 % et 100 mL de tampon de transfert 10x à 890 mL d’eau distillée.
- Versez 1x tampon courant dans le réservoir. Charger 5 μL de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE (entre 18 et 30 μL, selon la taille du peigne utilisé). Remplissez les puits vides avec 1x LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90-120 minutes à 120 V.
- Dissoudre 58,2 g de Tris base et 29,3 g de glycine dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer 10x tampon de transfert. Activer la membrane de nitrocellulose avec 1x tampon de transfert contenant 20% de méthanol. Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert et étalez-les délicatement sur la pile de préparation.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH des tampons de fonctionnement et de transfert car ils doivent être au pH optimal requis. Aussi, il est conseillé de préparer ces tampons et de les stocker à température ambiante avant l’expérience pour gagner du temps. - Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre: électrode négative (cadre/extrémité noir) - mousse sandwich - papier filtre - gel FDS-PAGE rincé - membrane nitrocellulose rincée - papier filtre - mousse sandwich - électrode positive (cadre rouge). Empiler le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et fonctionner à 90 V pendant 90 min ou 30 V pendant 360 min.
5. Coloration des anticorps et développement de l’image
- Retirez la membrane et laissez-la sécher. Bloquer la membrane pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un tampon de blocage fabriqué à partir de lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires 8,15,19 et de bêta-actine (contrôle de charge) dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. Lavez la membrane en trois lavages de 1x TBS-T pendant 5 min chacun.
REMARQUE : L’incubation de la membrane séparée avec des contrôles de charge tels que les anticorps bêta-actine, alpha-tubuline ou glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase vise à normaliser les autres résultats du Western blot lors de la quantification ultérieure. La dilution recommandée pour chaque anticorps primaire est disponible dans le manuel du fabricant. - Incuber la membrane lavée avec un anticorps secondaire dilué 5000 fois dans un tampon bloquant pendant 60 min à température ambiante. Encore une fois, lavez la membrane 3x dans 1x TBS-T pendant 5 minutes chacune.
REMARQUE : Il est fortement recommandé que l’anticorps secondaire soit élevé contre l’espèce chez laquelle l’anticorps primaire est élevé. Par exemple, si l’anticorps primaire de KCC2 total est anti-KCC2 de souris, alors l’anticorps secondaire pour l’anti-souris doit être utilisé. - Placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Mélanger des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et étaler doucement la solution mélangée sur la membrane pour développer des signaux.
6. Acquisition d’images à l’aide d’un système d’imagerie et quantification des données
- Transférez la carte d’imagerie dans le compartiment approprié du système d’imagerie pour l’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie sur l’ordinateur pour le traitement de l’image.
- Dans la barre d’outils, cliquez sur Nouveau protocole et choisissez Single Channel (Canal unique). Cliquez sur Sélectionner sous la boîte de dialogue Imagerie sur gel/application, faites défiler jusqu’à Blot et sélectionnez Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Cliquez ensuite sur Configuration de l’accumulation de signaux pour définir la durée et le nombre d’images à acquérir.
- Cliquez sur Position Gel sous la configuration du protocole et ajustez le gel dans le système d’imagerie si nécessaire. Cliquez sur Exécuter le protocole pour acquérir les images.
- Cliquez avec le bouton droit sur l’une des images acquises sous la zone du catalogue d’images pour enregistrer les images sur l’ordinateur. Accédez à l’image souhaitée et cliquez sur Sélectionner une image et continuer dans la boîte de dialogue Exécuter.
- Cliquez sur l’icône Transformation d’image pour ajuster le contraste et la saturation en pixels de l’image . Cliquez sur l’icône Capture d’écran dans la barre d’outils générale pour enregistrer l’image sur l’ordinateur en fonction du format d’image souhaité.
- Mesurez les densités de bandes à l’aide du logiciel ImageJ et analysez-les à l’aide d’outils statistiques appropriés.
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Representative Results
Ici, le résultat représentatif présenté à la figure 1 a étudié l’impact de la staurosporine et de la NEM sur la phosphorylation médiée par WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 et NKCC1 dans les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable KCC2b (HEKrnKCC2b)18 en utilisant la technique de transfert Western. Des détails complets sur les résultats représentatifs sont discutés dans Zhang et al.15. Semblable à NEM, la staurosporine est un inhibiteur de kinase large qui peut améliorer l’activité de transport de KCC2 et inhiber l’activité de NKCC115,20. Le traitement des cellules HEK293 avec de la staurosporine et du NEM a entraîné une diminution de la phosphorylation sur les sites cibles de SPAK - Thr233 situés dans le domaine de la kinase de la boucle T et le site de phosphorylation de la boucle S Ser373 de hsSPAK. Ainsi, les deux composés ont abrégé les niveaux de phosphorylation des phospho-sites SPAK susmentionnés. En outre, la staurosporine a réduit la phosphorylation de Ser940 dans HEKrnKCC2b, mais NEM a considérablement augmenté sa phosphorylation. De plus, la staurosporine diminue la phosphorylation sur le site Thr505, alors que NEM a provoqué une augmentation légère, mais insignifiante, de la phosphorylation sur le même site. Les effets différentiels des deux composés sur la phosphorylation de la protéine kinase C (PKC) sur le site Thr505 et KCC2b sur le site Ser940 sont bien corrélés. Le résultat représentatif a également montré que les deux agents modifiaient l’expression de rnKCC2b, hsNKCC1 ou hsSPAK total. NEM (mais pas le traitement par staurosporine) a entraîné une augmentation significative de l’expression de la quantité totale de KCC2, tandis que l’expression de NKCC1 total et SPAK n’a pas été modifiée de manière significative lorsqu’ils ont été traités avec les deux composés. De plus, les deux composés ont provoqué une diminution de la phosphorylation de SPAK sur les sites Thr233 et Ser373, ce qui est corrélé avec la phosphorylation abrégée des sites Thr906/Thr1007 et Thr203/207/212 dans les sites rnKCC2b et hsNKCC1, respectivement. De plus, la staurosporine et la NEM ont réduit et augmenté la phosphorylation de la PKC sur le site Ser940 dans rnKCC2b, respectivement, ce qui était corrélé à la réduction et à l’augmentation de la phosphorylation de PKC-δ au site Thr505 lors du traitement à la staurosporine et NEM, respectivement (Figure 1).
Figure 1 : Analyses quantitatives des phospho-sites rn KCC2b et hsNKCC1 sur traitement par staurosporine et NEM dans les cellules HEK rn KCC2b. (A) Les cellules HEKrnKCC2b transfectées de manière stable ont été traitées avec du DMSO (témoin), de la staurosporine 8 μM ou 0,5 mM NEM pendant 15 min. Les lysats cellulaires ont été récoltés et soumis à une immunoprécipitation (IP) et à un immunoblot (IB) avec des anticorps indiqués. Abréviations : D = dimérique KCC2; M = monomère KCC2. (B) Quantification immunoblot de cellules HEKrnKCC2b transfectées de manière stable. Les intensités de bande ont été quantifiées avec le logiciel ImageJ. p < 0,001; **p < 0,01; Test de Wilcoxon-Mann Whitney (n = 6). Ce chiffre a été modifié à partir de Zhang et al.15. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| 8 mL de gel séparateur à 8 % | 5 mL de gel empilable à 6 % | ||
| Matériel nécessaire | Volume (μL) | Matériel nécessaire | Volume (μL) |
| Distillé H2O | 4200 | Distillé H2O | 2900 |
| 40% Acrylamide | 1600 | 40% Acrylamide | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% FDS | 80 | 10% FDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMED | 8 | TEMED | 5 |
| Faire le gel de séparation: | |
| 1) | Commencez avec 4,2 mL de ddH2O |
| 2) | Ajouter 1,6 mL de solution acrylamide/bis-acrylamide à 40 % |
| 3) | Ajouter 2 mL de 1,5 M Tris pH 8,8 et mélanger |
| 4) | Mélanger dans 80 μL de FDS à 10% |
| 5) | Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, ajoutez 8 μL de TEMED et mélangez |
| 6) | Ajouter 80 μL d’APS* à 10 % et mélanger |
| Fabrication du gel empilable: | |
| 1) | Commencez avec 2,9 mL de ddH2O |
| 2) | Ajouter 0,75 mL de solution acrylamide/bis-acrylamide à 40 % |
| 3) | Ajouter 1,25 mL de 0,5 M Tris pH 6,8 et mélanger |
| 4) | Mélanger dans 50 μL de FDS à 10% |
| 5) | Lorsque vous êtes prêt à l’emploi, ajoutez 5 μL de TEMED et mélangez |
| 6) | Ajouter 50 μL d’APS* à 10 % et mélanger |
| FDS = Sodium Dodecyl Sulfate | |
| APS = ammonium par sulfate | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tétraméthyléthylènediamine | |
| *Lors de l’ajout d’APS, la solution doit être immédiatement versée dans l’appareil de coulée car la solution polymérise en quelques minutes. Par conséquent, il est conseillé de préparer les solutions de gel de séparation et d’empilement à peu près au moment où les solutions sont nécessaires. | |
Tableau 1 : Recette pour faire un mélange de gel de polyacrylamide (solutions de gel de séparation et d’empilement).
| Pourcentage de gel (%) | Taille des protéines (kDa) |
| Jusqu’à 20 | 4 à 40 |
| 15 | 12 à 45 ans |
| 12.5 | 10 à 70 |
| 10 | 15 à 100 |
| 8 | 50 à 200 |
| 4 à 6 | > 200 |
Tableau 2 : Pourcentage de gel SDS-PAGE recommandé pour différentes tailles de protéines
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Discussion
De nombreuses méthodes ont été utilisées pour mesurer les activités de SLC12 des CCC qui sont exprimées dans les neurones, y compris KCC2. Bon nombre de ces techniques se sont avérées améliorer les connaissances scientifiques sur l’analyse de la pertinence fonctionnelle de ces transporteurs et de leurs schémas structure-fonction dans différentes mutations liées à la maladie. De manière critique, il y a des avantages et des mises en garde aux différentes méthodes21. Cependant, le protocole expliqué ci-dessus décrit comment évaluer la phosphorylation de KCC2 aux sites régulateurs de kinase, Thr906 et Thr1007, en utilisant le transfert Western, ce qui peut être utile pour étudier les fonctions et les activités de KCC2.
La régulation de KCC2 se produit par phosphorylation et déphosphorylation au niveau des résidus clés de sérine/thréonine1. Le transfert Western est une technique efficace qui peut être utilisée pour étudier la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases à Thr906 et Thr1007. En principe, les modifications de la phosphorylation de KCC2 sont détectées à l’aide d’anticorps phospho-spécifiques dirigés contre les phosphopeptides des échantillons/protéines immunoblot d’intérêt. Le transfert Western est une méthode utilisée pour détecter la protéine spécifique d’intérêt à partir d’un échantillon de tissu ou de cellule. Cette méthode sépare d’abord les protéines par taille par électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées électrophoristiquement sur un support solide (généralement une membrane) avant que la protéine cible ne soit marquée à l’aide d’un anticorps spécifique. Les anticorps sont conjugués à différents marqueurs ou anticorps conjugués au fluorophore qui sont détectés à l’aide de méthodes colorimétriques, de chimiluminescence ou de fluorescence. Cela permet de détecter une protéine cible spécifique à partir d’un mélange de protéines. Cette technique a été utilisée pour caractériser les sites phosphospécifiques de KCC2 2,8 et a été utilisée pour identifier les inhibiteurs de KCC2 qui antagonisent la phosphorylation KCC2 Thr906/Thr100715. Les lignées HEK293 ont été utilisées pour plusieurs expériences en raison de leur avantage dans les expériences de biologie moléculaire. Ils sont rapides à reproduire, faciles à entretenir et très efficaces pour la transfection et la production de protéines22. Cependant, certaines opinions soutiennent qu’il pourrait ne pas être le candidat le plus approprié pour mener des expériences de neurobiologie parce qu’il ne s’agit pas d’une cellule provenant du cerveau, et donc sa spécificité physiologique peut être discutable dans la recherche en neurosciences. Cependant, des travaux antérieurs ont montré que des résultats similaires sont observés dans l’expression de KCC2 dans les cellules HEK293 et les tissus / cellules neuronaux réels15,23. Par conséquent, la pertinence de HEK293 dans la recherche en neurosciences ne peut pas être rejetée d’emblée.
Dans les études portant sur l’analyse de l’expression des protéines par la technique du Western blotting, une attention particulière doit être accordée au choix de la composition du tampon de lyse, à la nature (type et concentration) du détergent à utiliser24 et aux inhibiteurs de la protéase. La composition du tampon doit être optimisée pour convenir à la protéine cible afin de faciliter ses processus de solubilisation et d’extraction, et de permettre sa détection facile par transfert Western25. Un détergent doux à faible concentration est généralement nécessaire pour les protéines solubles, tandis que les protéines membranaires peuvent nécessiter des conditions de détergent plus fortes. Cependant, les détergents puissants peuvent perturber les interactions et les complexes peuvent être perdus. Les types et les concentrations de détergents peuvent affecter la nature et l’activité de la protéine, il est donc nécessaire de s’en tenir à une plage de concentrations restreinte / tolérée pour ces détergents. L’ajout d’un inhibiteur de protéase empêchera la protéine cible d’être dégradée par des protéines endogènes, et la température de travail optimale recommandée est de 4 °C pour réduire efficacement les taux protéolytiques. Parfois, dans le but d’obtenir des signaux immunoblot de haute qualité pour les anticorps qui donnent de mauvais signaux immunoblot, l’immunoprécipitation (IP) est réalisée en amont pour le Western blotting. Cette technique est avantageuse car elle facilite l’interaction entre les antigènes et leurs anticorps respectifs dans leur conformation native précédant leur séparation et leur quantification conséquentes26. Par conséquent, la PI peut améliorer la qualité des résultats des procédures de transfert Western. Avant l’application de la technique IP, il est important d’évaluer la présence et l’efficacité de l’expression des protéines partenaires co-immunoprécipitées dans le lysat en analysant soit le lysat de cellules entières, soit les fractions d’entrée par transfert Western. En outre, une connaissance préalable du poids moléculaire de la protéine à étudier est nécessaire avant de préparer les solutions de gel à pourcentage souhaité pour l’électrophorèse SDS-PAGE, car la taille de la protéine a un impact sur l’effet de tamisage de la matrice de gel.
Cependant, la détection d’anticorps conjugués aux protéines par cette technique est très instrumentale car elle aide à améliorer la compréhension des activités coopératives sur les sites phosphographiques de KCC2 qui peuvent fournir des informations sur la phosphorylation du cotransporteur et l’intégrité de la voie de signalisation qui peut réguler les cotransporteurs, pour une prédiction fiable de l’activité du cotransporteur. Cependant, il est important de noter que la technique Western blot ne peut produire que des données semi-quantitatives, ce qui signifie que la technique ne met en évidence que l’évaluation relative des expressions protéiques, mais pas la quantification absolue. Ceci est attribué aux écarts dans les taux de chargement et de transfert des échantillons dans des voies distinctes, qui sont différents sur les taches individuelles. Le signal détecté généré n’est pas non plus linéaire et ne reflète pas la plage de concentration des échantillons27. En outre, le statut de phosphorylation peut ne pas être un facteur fiable pour signaler l’activité des protéines, car des interventions telles que des inhibiteurs, des mutations et des interactions protéiques avec son environnement peuvent influencer directement l’activité protéique sans modifier son niveau de phosphorylation28,29,30. Ainsi, il peut être plus avantageux d’utiliser des anticorps phospho-spécifiques pour compléter d’autres méthodes biochimiques.
Comme mentionné précédemment, il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2. L’évaluation de KCC2 en mesurant le flux radioactif de 86Rb+ à travers la membrane de préparations cellulaires homogènes est une approche populaire. Cette méthode utilise des radio-isotopes actifs comme traceurs en les faisant passer à travers des canaux ioniques. Brièvement, les cellules d’intérêt sont incubées dans des solutions sans cations pour inhiber KCC2 endogène, suivies d’une incubation avec des inhibiteurs spécifiques tels que la ouabaïne, puis avec un milieu d’absorption contenant l’inhibiteur et 86Rb +. Les compteurs de scintillation liquide sont utilisés pour mesurer/tracer les activités consécutives à la lyse cellulaire. Cependant, cette méthode est robuste, très sensible et sélective et est moins sujette aux perturbations. Cependant, ses applications ne s’étendent pas aux tissus avec plusieurs types de cellules comme le cerveau ou les cultures de neurones. De plus, cette technique limite les changements dans la résolution de la concentration ionique au niveau subcellulaire. De plus, il existe des problèmes de sécurité concernant la toxicité potentielle et le danger pour la santé du travail avec des radio-isotopes à demi-vie courte (18,65 jours) caractérisés par une émission d’énergie élevée (max 1,77 MeV; max 1,08 MeV)31. Cela pourrait suggérer massivement une inadéquation aux études sur les cellules neuronales où un nombre élevé de cellules est généralement nécessaire. Ces problèmes ont conduit à la mise au point du test d’efflux non radioactif 85Rb+ par Terstappen 1999, comme alternative au 86Rb+ radioactif pour la détermination des flux ioniques. L’approche non radioactive a largement exilé les tests radioactifs 86Rb+ pour l’analyse des canaux cationiques K+ et non sélectifs dans l’industrie pharmaceutique31. Le test d’efflux non radioactif 85Rb+ implique deux processus principaux, le premier est la culture cellulaire et la manipulation et le second est la détermination du rubidium traceur par spectroscopie d’absorption atomique (AAS). Cette méthode est facile à utiliser, cependant, elle nécessite un certain nombre d’expériences de validation de test et souffre d’une mauvaise résolution temporelle32. Néanmoins, le dosage non radioactif de l’efflux 85Rb+ s’est progressivement révélé être une technique fiable pour l’évaluation des KCC et des NKCC33.
Le test de flux de thallium (TI+) utilise TI+ comme ion de substitution pour K+ en raison de sa forte affinité de liaison au site K+ sur KCC2 et NKCC2. L’afflux de TI+ dans les cellules a pu être détecté à l’aide d’un colorant fluorescent sensible au thallium tel que la coumarine benzothiazole et la fluozine-2. Une fois transporté par le canal, TI+ peut s’associer au colorant BTC/fluozin-2 provoquant un changement fluorescent qui peut être détecté par lecteur de plaque d’imagerie fluorométrique31. Les colorants indicateurs TI+ pénètrent dans les cellules sous forme d’esters acétoxyméthyliques qui sont ensuite clivés par les estérases cytoplasmiques pour libérer les formes fluorogéniques actives. Pour activer les KCC, les cellules sont stimulées avec un mélange de K+ et de Tl+ en présence ou en l’absence de composés d’essai (par exemple, inhibiteurs de KCC2). Le thallium pénètre et se lie au colorant de fluorescence. L’augmentation du signal fluorescent est proportionnelle à l’afflux de Tl+ dans la cellule spécifiquement par le cotransporteur, et représente donc une mesure fonctionnelle de l’activité du cotransporteur. Cette méthode a également été bien appliquée pour mesurer l’activité de KCC2 et NKCC2 dans divers types de cultures cellulaires, par exemple, des études sur la lignée cellulaire HEK293 exprimant de manière stable KCC234 humain. Du côté de l’inaptitude, il existe une variété de lignes de voies hors cible potentielles qui pourraient interférer avec l’afflux de TI+, par exemple, l’ATPase Na+/K+ dans les cellules HEK293 pourrait causer un taux de résultats faussement positifs ou faux négatifs plus élevé35. De plus, comme pour d’autres tests de flux, la mise en œuvre d’une telle approche dans les cellules neuronales reste limitée en raison de la faible survie des cellules neuronales après plusieurs étapes de lavage. L’expression neuronale de plusieurs canaux K+ et transporteurs peut également entraver l’évaluation précise des flux K+ spécifiques de KCC2. Cette technique présente des limites pour l’étude des canaux dans les petits compartiments neuronaux tels que les dendrites et les épines dendritiques, et les axones dus à un manque de résolution spatiale couplé à une faible résolution temporelle.
D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire. En général, les mesures électrophysiologiques de la fonction SLC12 reposent sur le principe que les récepteurs GABA A (GABAAR) sont perméables au chlorure36. KCC2 est la clé dans la modulation de l’inhibition GABAergique. En particulier, l’activité d’extrusion [Cl-]i de KCC2 sous-tend l’hyperpolarisation du GABAAR6. Les enregistrements intracellulaires fournissent des informations cruciales grâce à l’extrapolation de la capacité d’extrusion de chlorure de KCC2 à partir de l’inversion du potentiel des courants médiés par le GABAAR (EGABA). UnE GABA hyperpolarisé indique une baisse de [Cl-]i et donc une augmentation de l’activité de KCC2. La technique de patch-clamp de gramicidine en électrophysiologie est une approche de référence pour mesurer l’activité du GABA. Certaines études publiées précédemment ont utilisé l’enregistrement patch-clamp à la gramicidine pour étudier les fonctions et les activités de KCC2 pour évaluer/surveiller l’homéostasie [Cl-]i ont en effet fait leurs preuves 8,9,37,38,39,40 . Au cours d’un enregistrement patch-clamp gramicidine, un joint étanche sur la surface de la cellule / tissu est créé à l’aide d’une électrode de verre avec un patch relatif pour enregistrer l’activité intracellulaire des canaux ioniques en référence à une autre électrode dans un bain entourant la cellule / tissu. Cette technique peut être réalisée en mesurant la quantité de courant qui traverse la membrane d’une cellule à une tension fixe en mode tension-pince ou en enregistrant la quantité de tension se déplaçant à travers la membrane à un courant fixe dans le mode de serragede courant 36. Plusieurs variantes de la technique de base peuvent être appliquées, qui dépendent en grande partie de la question de recherche. La technique ne crée pas un enregistrement de patch cellulaire entier ressemblant à un pore relativement grand, mais l’antibiotique formant des pores (gramicidine) contenu dans la solution d’électrode est utilisé pour former de petits pores dans la membrane36. En particulier, l’ajout de gramicidine crée des pores sélectifs en cations dans la membrane, qui présentent une perméabilité anionique insignifiante. Les protocoles de rampe de tension sont une alternative efficace et fiable à l’enregistrement du courant à une tension constante. Les relations courant/tension obtenues avec les protocoles de rampe de tension semblent donner un meilleur enregistrement des courants membranaires médiés par GABAAR. Dans ce protocole, une tension constamment changeante mais surveillée (à un taux constant) est appliquée et le courant est constamment mesuré simultanément36,41. Au cours de ce protocole, l’application d’impulsions de tension (généralement dans le sens hyperpolarisant) est utilisée pour activer le courant de fuite à la suite de réponses ohmiques. En règle générale, les courants membranaires médiés par le GABAAR sont calculés à partir du courant de fuite (c’est-à-dire les potentiels d’inversion des courants agonistes soustraits des fuites)36. Les associations courant-tension obtenues à partir de ce protocole aident à mieux comprendre où les changements se produisent dans les concentrations ioniques au cours d’un scénario expérimental impliquant des canaux récepteurs GABAA. Yelhekar et coll.41 ont utilisé un modèle informatique pour montrer que les conclusions sur les concentrations d’ions stables tirées de la méthode d’interpolation peuvent ne pas être justifiables parce que le potentiel d’inversion estimé de la méthode peut être incorrect.
La résistance moyenne utilisée pour la plupart des enregistrements est de 5 MΩ. Les pipettes avec une résistance inférieure de 3-4 MΩ peuvent entraîner une résistance série inférieure, ce qui est préférable pour les enregistrements par pince de tension. Cependant, la pointe de la pipette sera comparativement plus large pour les pipettes à plus grande résistance et, par conséquent, elle pose un défi sous la forme de difficultés de formation et de stabilitédes joints 36,42. Par conséquent, il est nécessaire de surveiller la formation de GΩ pour obtenir des enregistrements avec une réduction considérable du niveau de données bruyantes générées. La robustesse de cette technique pour étudier la fonction et les activités de KCC2, à en juger par sa pertinence et sa fiabilité dans la mesure de l’activité du GABA, a été confirmée par plusieurs études. Des études antérieures ont montré que le [Cl-]i reste stable en utilisant cette technique en mesurant les réponses du GABAARs (qui sont capables de griller la conductance du chlorure) à leurs agonistes respectifs. Par implication, l’accès électrique continu s’accompagne de peu ou pas de modification de la concentration intracellulaire de chlorure43,44. De plus, cette technique facilite le contournement des modifications artificielles du potentiel membranaire et du E GABA lors de l’activation duGABA AR (qui ouvre la conductance du chlorure et du bicarbonate)45. Ce qui précède donne à cette technique un avantage sur les autres types d’enregistrements électrophysiologiques. Cependant, les limites de cette technique sont les suivantes: (1) un bruit d’enregistrement fréquent peut se produire en raison de la pointe de l’électrode occupant une partie de la membrane, ce qui peut réduire la résolution de courant, et (2) la perforation de la membrane avec la gramicidine prend généralement un temps relativement plus long.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Royal Society UK (subvention no. IEC\NSFC\201094) et une bourse de doctorat du Commonwealth.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
