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Biochemistry

Estudio de las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64179
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

Summary

El presente protocolo destaca la aplicación de la técnica Western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2. El protocolo describe la investigación de la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa Thr906/1007 a través de Western blotting. Además, los métodos adicionales para confirmar la actividad de KCC2 se destacan brevemente en este texto.

Abstract

El cotransportador de cloruro de potasio 2 (KCC2) es un miembro de la familia de portadores de solutos 12 (SLC12) de los cotransportadores de cloruro catiónico (CCC), que se encuentra exclusivamente en la neurona y es esencial para el buen funcionamiento de la homeostasis de Cl- y, en consecuencia, la inhibición GABAérgica funcional. La falla en la regulación adecuada de KCC2 es perjudicial y se ha asociado con la prevalencia de varias enfermedades neurológicas, incluida la epilepsia. Se ha avanzado considerablemente en la comprensión de los mecanismos implicados en la regulación del KCC2, acreditados para el desarrollo de técnicas que permitan a los investigadores estudiar sus funciones y actividades; ya sea a través de investigaciones directas (evaluación de la fosforilación de sitios reguladores de quinasas) o indirectas (observación y monitoreo de la actividad GABA). Aquí, el protocolo destaca cómo investigar la fosforilación de KCC2 en sitios reguladores de quinasa - Thr906 y Thr1007 - utilizando la técnica de Western Blotting. Existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2, como el ion rubidio y el ensayo de captación de iones talio. Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular. Algunas de estas técnicas adicionales se discutirán brevemente en este manuscrito.

Introduction

El cotransportador de cloruro de potasio 2 (KCC2) es un miembro de la familia de portadores de solutos 12 (SLC12) de los cotransportadores catión-cloruro (CCC), que se encuentra exclusivamente en la neurona y es esencial para el buen funcionamiento de la homeostasis del Cl- y, en consecuencia, de la inhibición GABAérgica funcional 1,2,3,4. El mantenimiento de una baja concentración intraneuronal de Cl- ([Cl-]i) a 4-6 mM por KCC2 facilita la hiperpolarización del ácido γ-aminobutírico (GABA)/glicina y la inhibición sináptica en el cerebro y la médula espinal5. El fracaso en la regulación adecuada de KCC2 se ha asociado con la prevalencia de varias enfermedades neurológicas, incluyendo la epilepsia4. Además, la disminución de la extrusión de Cl− mediada por KCC2 y la alteración de las corrientes hiperpolarizantes mediadas por GABAA y/o receptores de glicina han sido implicadas en la epilepsia, el dolor neuropático y la espasticidad 6,7. El KCC2 neuronal se modula negativamente a través de la fosforilación de residuos reguladores clave dentro de su dominio intracelular C-terminal porel complejo de señalización de quinasa 1 con no-lisina (WNK)-STE20/SPS1 relacionado con prolina/alanina (SPAK)/oxidativo sensible al estrés (OSR), que facilita el mantenimiento de la actividad GABA despolarizada en neuronas inmaduras 2,8,9 . El WNK-SPAK/OSR1 fosforila los residuos de treonina 906 y 1007 (Thr906/Thr1007) y posteriormente regula a la baja la expresión génica del ARNm de KCC2, lo que lleva a un consiguiente deterioro de su función fisiológica 8,10. Más importante aún, sin embargo, ya es un hecho que se sabe que el complejo quinasa WNK-SPAK / OSR1 fosforila e inhibe la expresión de KCC2 1,2,4,11,12, y que la inhibición de las vías de señalización del complejo quinasa para fosforilar Thr906 / Thr1007 se ha relacionado con el aumento de la expresión del gen ARNm KCC2 13,14,15 . Es importante señalar que la regulación de la expresión neuronal de los cotransportadores KCC2 y Na+-K+-2Cl- 1 (NKCC1) a través de la fosforilación de proteínas funciona concomitantemente y en patrones inversos 1,4,16.

Ha habido avances consistentes y considerables en cuanto a la comprensión de los mecanismos involucrados en la regulación de KCC2, acreditados para el desarrollo de técnicas que permitan a los investigadores estudiar sus funciones y actividades; ya sea a través de investigaciones directas (evaluación de la fosforilación de sitios reguladores de quinasas) o indirectas (observación y monitoreo de la actividad GABA). El protocolo presentado aquí destaca la aplicación de técnicas de western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K+-Cl- KCC2 mediante la investigación de la fosforilación del cotransportador en los sitios reguladores de quinasas Thr906/1007.

Western blot es un método utilizado para detectar proteínas específicas de interés de una muestra de tejido o célula. Este método primero separa las proteínas por tamaño a través de la electroforesis. Luego, las proteínas se transfieren electroforéticamente a un soporte sólido (generalmente una membrana) antes de que la proteína objetivo se marque con un anticuerpo específico. Los anticuerpos se conjugan a diferentes etiquetas o anticuerpos conjugados con fluoróforos que se detectan mediante métodos colorimétricos, quimioluminiscencia o fluorescencia. Esto permite detectar una proteína diana específica a partir de una mezcla de proteínas. Esta técnica se ha utilizado para caracterizar sitios fosfoespecíficos de KCCs1 y se ha utilizado para identificar inhibidores de quinasa que inhiben la fosforilación de KCC3 Thr991/Thr104817. Al seguir este protocolo, se puede detectar específicamente KCC2 total y fosforilado a partir de lisados celulares/tisulares. En principio, la detección de anticuerpos conjugados con proteínas mediante esta técnica es muy instrumental, ya que ayuda a mejorar la comprensión de las actividades cooperativas en los fosfositios de KCC2, lo que arroja luz sobre los mecanismos moleculares implicados en sus regulaciones fisiológicas. El análisis cuantitativo de la expresión total de proteínas es representativo de la función y actividad de KCC2. Existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2, como el ion rubidio y el ensayo de captación de iones talio. Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular.

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Protocol

NOTA: El protocolo describe el método Western blotting para detectar proteínas específicas de interés.

1. Cultivo celular y transfección

  1. Calentar todos los reactivos en el baño de perlas (37 °C) antes del procedimiento de cultivo celular. Prepare el medio de cultivo, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1% de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido no esencial, 100 mM de piruvato de sodio y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina.
  2. Descongelar células embrionarias humanas 293 de rata KCC2b (HEK293rnKCC2b)18 transfectadas de forma estable completamente en el baño de perlas (37 °C). Transfiera las células del tubo criovial a un tubo centrífugo que contenga 5 ml de medios frescos. Gire la celda a 1200 ×g durante 3-5 min.
  3. Use una pipeta aspiradora (fijada a una bomba de vacío) para aspirar el sobrenadante y agregue 10 ml de medios frescos para volver a suspender las células. Transfiera la suspensión celular a una placa de plato de 10 cm.
  4. Coloque el plato en la incubadora y déjelo crecer durante 48 h a 37 ° С en una atmósfera humidificada de 5% deCO2 . Controle el período de incubación para garantizar un crecimiento celular saludable. Dividir aún más las células cuando han alcanzado más del 90% de confluencia después del período de incubación.
  5. Aspire el medio viejo fuera del plato de células y enjuague suavemente las células con 2 ml de solución salina tampón fosfato (PBS). Añadir 2 ml de tripsina e incubar durante unos 1-2 min a temperatura ambiente.
  6. Use 2 ml de medio completo para lavar suavemente las células tripsinizadas en el plato. Agregue 9 ml de medios frescos a los platos nuevos y agregue 1 ml de solución del plato viejo a cada uno de los nuevos. Transfiera las placas de células divididas a la incubadora durante 48 h para alcanzar ≥ confluencia del 90%.
  7. Trate las células con dimetilsulfóxido (DMSO) como control, estaurosporina 8 μM o 0.5 mM N-etilmaleimida (NEM) durante 15 minutos antes de cosechar las células en tampón de lisis.

2. Preparación de lisados celulares y carga de muestras

  1. Aspirar los medios en la placa de cultivo (de los procedimientos de transfección). Coloque el cultivo celular en hielo y lave las células con PBS helado.
  2. Aspirar el PBS, luego agregar 1.0 ml de tampón de lisis helada que contiene 50 mM de tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 50 mM de fluoruro de sodio, 5 mM pirofosfato de sodio, 10 mM de sodio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sodio, 1% (p/v) Tritón X-100, 0,27 M de sacarosa, 1 mM de benzamina, 0.1% (v/v) 2-mercaptoetanol y 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) al plato.
    NOTA: El volumen del tampón de lisis durante la recolección celular varía según el tamaño de los platos, por ejemplo, 1 ml de tampón de lisis es adecuado por 1 x 107 células /plato de 100 mm/matraz de150 cm 2, mientras que 0,5 ml es adecuado por matraz de 5 x 106 células/plato de 60 mm/matraz de 75 cm2 .
  3. Use un raspador de células de plástico frío para raspar las células del fondo del plato, luego use suavemente una pipeta para transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga que ya esté en hielo. Agitar constantemente el tubo durante 30 min a 4 °C.
  4. Girar los lisados celulares en una centrífuga fría (4 °C) a 16.000 x g durante 20 min, retirar el tubo suavemente de la centrífuga y colocarlo sobre hielo. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco preenfriado y deseche el pellet.
    NOTA: Puede ser necesario variar la fuerza de centrifugación y el tiempo dependiendo del tipo de célula. Sin embargo, las pautas generales fomentan la centrifugación a 16,000 x g durante 20 min. Sin embargo, esto debe determinarse para cada experimento. Por ejemplo, las células delicadas como los leucocitos necesitan una velocidad de centrifugación muy ligera.

3. Preparación de inmunoprecipitantes a partir de lisados celulares

  1. Pipetear 300 μL de proteína-G-sefarosa en un tubo de microcentrífuga. Girar la solución a 500 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante.
  2. Añadir 500 μL de PBS y vorátice bien la solución. Girar la solución a 500 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso.
  3. Mezclar 1 mg de anticuerpos anti-KCC2 Thr906 y anti-KCC2 Thr1007 con 200 μL de perlas de proteína G-sefarosa y completar el volumen a 500 μL con PBS. Agitar sobre una plataforma vibratoria o rueda giratoria durante 2 h a 4 °C. Lavar 2x con PBS.
  4. Realice la cuantificación de proteínas en los lisados celulares completos y agregue 1 mg del lisado celular a las perlas lavadas. Incubar suavemente en un rotador de extremo a extremo durante 2 h a 4 °C. Gire las perlas y lávelas 3 veces con PBS que contenga 150 mM de cloruro de sodio (NaCl).
  5. Lavar los inmunoprecipitantes (perlas) 3x con 200 μL de PBS. Resuspender el pellet final en 100 μL de 1x tampón de muestra de dodecil sulfato de litio (LDS).
  6. Agitar los tubos en un agitador de rotor a temperatura ambiente durante 5 min e incubarlos en un bloque de calentamiento a 75 °C durante 10 min. Centrifugar la muestra de carga a 11.000 x g durante 2 min y utilizar el sobrenadante para la carga en gel.

4. Realización del western blot

  1. Ensamble el aparato de fundición y vierta el gel separador recién preparado al 8% (consulte la Tabla 1 para la receta / preparación) para fundir el gel dejando aproximadamente 2 cm de espacio desde la parte superior del vidrio de fundición. Agregue 200 μL de isopropanol absoluto a la configuración y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
    NOTA: La receta de gel de poliacrilamida para la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende del tamaño de la proteína de interés (Tabla 2). Por lo tanto, tome nota del tamaño de la proteína antes de determinar el porcentaje de gel deseado.
  2. Use una pipeta para eliminar el isopropanol y enjuague cuidadosamente el gel con aproximadamente 200 μL de agua destilada. Agregue gel de apilamiento al 6% recién preparado (consulte la Tabla 1 para la receta / preparación) para llenar el espacio de aproximadamente 2 cm en la configuración de fundición. Encaje suavemente en el peine del pozo y deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
  3. Fije el gel fundido en el tanque de electroforesis.
  4. Disuelva 30.3 g de Tris base, 144.1 g de glicina y 10 g de SDS en 1000 ml de agua destilada para preparar 10x tampón de transferencia. Prepare 1x tampón de funcionamiento agregando 10 ml de SDS al 10% y 100 ml de tampón de transferencia 10x a 890 ml de agua destilada.
  5. Vierta 1x búfer de funcionamiento en el tanque. Cargue 5 μL de marcador de peso molecular en el primer pocillo y una cantidad igual de proteína en cada pocillo del gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependiendo del tamaño del peine utilizado). Llene los pozos vacíos con 1x LDS y ejecute el gel durante aproximadamente 90-120 minutos a 120 V.
  6. Disuelva 58.2 g de Tris base y 29.3 g de glicina en 1000 ml de agua destilada para preparar 10x tampón de transferencia. Active la membrana de nitrocelulosa con 1x tampón de transferencia que contiene 20% de metanol. Enjuague el gel y la membrana con el tampón de transferencia y extiéndalos suavemente sobre la pila de preparación.
    NOTA: No es necesario ajustar el pH de los tampones de funcionamiento y transferencia, ya que deben estar en el pH óptimo requerido. Además, es recomendable preparar estos tampones y almacenarlos a temperatura ambiente antes del experimento para ahorrar tiempo.
  7. Organice el sándwich que se transferirá en este orden: electrodo negativo (marco / extremo negro) - espuma sándwich - papel de filtro - gel SDS-PAGE enjuagado - membrana de nitrocelulosa enjuagada - papel de filtro - espuma sándwich - electrodo positivo (marco rojo). Apile el sándwich ensamblado en el tanque de transferencia y funcione a 90 V durante 90 minutos o 30 V durante 360 minutos.

5. Tinción de anticuerpos y desarrollo de imágenes

  1. Retire la membrana y déjela secar. Bloquear la membrana durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo hecho de leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Incubar las membranas con diluciones apropiadas del anticuerpo primario 8,15,19 y beta-actina (control de carga) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Lave la membrana en tres lavados de 1x TBS-T durante 5 minutos cada uno.
    NOTA: La incubación de la membrana separada con controles de carga como beta-actina, alfa-tubulina o anticuerpos gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa es para normalizar los otros resultados de Western blot durante la cuantificación posterior. La dilución recomendada para cada anticuerpo primario está disponible en el manual del fabricante.
  3. Incubar la membrana lavada con anticuerpo secundario diluido 5000 veces en tampón de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente. Nuevamente, lave la membrana 3x en 1x TBS-T durante 5 minutos cada uno.
    NOTA: Se recomienda encarecidamente que el anticuerpo secundario se eleve contra la especie en la que se eleva el anticuerpo primario. Por ejemplo, si el anticuerpo primario de KCC2 total es anti-KCC2 de ratón, entonces se debe usar el anticuerpo secundario para anti-ratón.
  4. Coloque la membrana lavada en el tablero de imágenes. Mezcle volúmenes iguales de cada reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y extienda suavemente la solución mezclada sobre la membrana para desarrollar señales.

6. Adquisición de imágenes mediante un sistema de imágenes y cuantificación de datos

  1. Transfiera la placa de imágenes al compartimento apropiado en el sistema de imágenes para obtener imágenes. Abra el software de imágenes en la computadora para el procesamiento de imágenes.
  2. En la barra de herramientas, haga clic en Nuevo protocolo y elija Canal único. Haga clic en Seleccionar en el cuadro de diálogo de imágenes/aplicación de gel, desplácese hasta Mancha y seleccione Chemi Hi Sensitivity o Chemi Hi Resolution. Luego haga clic en Configuración de acumulación de señal para establecer la duración y el número de imágenes a adquirir.
  3. Haga clic en Colocar gel en Configuración de protocolo y ajuste el gel en el sistema de imágenes si es necesario. Haga clic en Ejecutar protocolo para adquirir las imágenes.
  4. Haga clic con el botón secundario en una de las imágenes adquiridas en el cuadro catálogo de imágenes para guardar las imágenes en el equipo. Navegue hasta la imagen deseada y haga clic en Seleccionar imagen y continuar en el cuadro de diálogo Ejecutar.
  5. Haga clic en el icono Transformación de imagen para ajustar el contraste y la saturación de píxeles de la imagen . Haga clic en el icono Captura de pantalla en la barra de herramientas general para guardar la imagen en la computadora dependiendo del formato de imagen deseado.
  6. Mida las densidades de banda utilizando el software ImageJ y analice utilizando herramientas estadísticas apropiadas.

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Representative Results

Aquí, el resultado representativo presentado en la Figura 1 investigó el impacto de la estaurosporina y NEM en la fosforilación mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 y NKCC1 en líneas celulares HEK293 que expresan de manera estable KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizando la técnica de western blotting. Los detalles completos sobre los resultados representativos se discuten en Zhang et al.15. Similar a NEM, la estaurosporina es un inhibidor amplio de la cinasa que puede mejorar la actividad de transporte de KCC2 e inhibir la actividad de NKCC115,20. El tratamiento de las células HEK293 con estaurosporina y NEM causó una disminución de la fosforilación en los sitios objetivo SPAK - Thr233 situado en el dominio de la quinasa del bucle T y el sitio de fosforilación del bucle S Ser373 de hsSPAK. Por lo tanto, ambos compuestos redujeron los niveles de fosforilación de los fosfositios SPAK antes mencionados. Además, la estaurosporina redujo la fosforilación de Ser940 en HEKrnKCC2b, pero NEM aumentó significativamente su fosforilación. Además, la estaurosporina disminuye la fosforilación en el sitio Thr505, mientras que NEM causó un aumento leve pero insignificante en la fosforilación en el mismo sitio. Los efectos diferenciales de ambos compuestos sobre la fosforilación de la proteína quinasa C (PKC) en el sitio Thr505 y KCC2b en el sitio Ser940 se correlacionan bien. El resultado representativo también mostró que ambos agentes alteraron la expresión de rnKCC2b total, hsNKCC1 o hsSPAK. NEM (pero no el tratamiento con estaurosporina) causó un aumento significativo en la expresión de la cantidad total de KCC2, mientras que la expresión de NKCC1 total y SPAK no cambió significativamente cuando se trató con ambos compuestos. Además, los dos compuestos causaron una disminución de la fosforilación de SPAK en los sitios Thr233 y Ser373, y esto se correlacionó con la fosforilación abreviada de los sitios Thr906 / Thr1007 y Thr203/207/212 en rnKCC2b y hsNKCC1, respectivamente. Además, la estaurosporina y NEM redujeron y aumentaron la fosforilación de PKC en el sitio Ser940 en rnKCC2b, respectivamente, lo que se correlacionó con la reducción e incremento en la fosforilación de PKC-δ en el sitio Thr505 tras el tratamiento con estaurosporina y NEM, respectivamente (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Análisis cuantitativos de fosfositiosrn KCC2b y hsNKCC1 tras el tratamiento con estaurosporina y NEM en células HEK rn KCC2b. (A) Las células KCC2b HEK rn transfectadas de manera estable se trataron con DMSO (control), estaurosporina 8 μM o NEM 0,5 mM durante 15 min. Los lisados celulares fueron recolectados y sometidos a inmunoprecipitación (IP) e inmunoblot (IB) con anticuerpos indicados. Abreviaturas: D = dimérico KCC2; M = KCC2 monomérico. (B) Cuantificación de inmunoblot de célulasHEK rn KCC2b transfectadas de forma estable. Las intensidades de banda se cuantificaron con el software ImageJ. p < 0,001; **p < 0,01; Prueba de Wilcoxon-Mann Whitney (n = 6). Esta cifra ha sido modificada de Zhang et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

8 mL de Gel Separador al 8% 5 mL de Gel Apilable al 6%
Materiales necesarios Volumen (μL) Materiales necesarios Volumen (μL)
DestiladoH2O 4200 DestiladoH2O 2900
40% Acrilamida 1600 40% Acrilamida 750
1,5 m Tris pH 8,8 2000 0,5 m Tris pH 6,8 1250
10% SDS 80 10% SDS 50
10% APS 80 10% APS 50
TEMED 8 TEMED 5
Elaboración del gel separador:
1) Comience con 4.2 mL deddH2O
2) Agregue 1.6 ml de solución de acrilamida/bis-acrilamida al 40%
3) Añadir 2 mL de 1,5 M Tris pH 8,8 y mezclar
4) Mezclar en 80 μL de SDS al 10%
5) Cuando esté listo para usar, agregue 8 μL de TEMED y mezcle
6) Agregue 80 μL de APS al 10% * y mezcle
Hacer el gel de apilamiento:
1) Comience con 2.9 mL deddH2O
2) Añadir 0,75 ml de solución de acrilamida/bis-acrilamida al 40%
3) Añadir 1,25 ml de 0,5 M Tris pH 6,8 y mezclar
4) Mezclar en 50 μL de SDS al 10%
5) Cuando esté listo para usar, agregue 5 μL de TEMED y mezcle
6) Agregue 50 μL de APS al 10% * y mezcle
SDS = Dodecil sulfato de sodio
APS = amonio por sulfato
TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetrametiletilendiamina
*Tras la adición de APS, la solución debe verterse inmediatamente en el aparato de fundición porque la solución polimeriza en pocos minutos. Por lo tanto, es aconsejable preparar las soluciones de gel de separación y apilamiento justo cuando se necesitan las soluciones.

Tabla 1: Receta para hacer mezcla de gel de poliacrilamida (separación y apilamiento de soluciones de gel).

Porcentaje de gel (%) Tamaño de la proteína (kDa)
Hasta 20 4 a 40
15 12 a 45
12.5 De 10 a 70
10 De 15 a 100
8 De 50 a 200
4 a 6 > 200

Tabla 2: Porcentaje de gel SDS-PAGE recomendado para diferentes tamaños de proteínas

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Discussion

Se han utilizado muchos métodos para medir las actividades de SLC12 de CCC que se expresan en las neuronas, incluido KCC2. Muchas de estas técnicas han demostrado mejorar el conocimiento científico sobre el análisis de la relevancia funcional de estos transportadores y sus patrones estructura-función en diferentes mutaciones relacionadas con la enfermedad. Críticamente, hay ventajas y advertencias para los diversos métodos21. Sin embargo, el protocolo explicado anteriormente, describió cómo evaluar la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa, Thr906 y Thr1007, utilizando Western blot, que puede ser útil para estudiar las funciones y actividades de KCC2.

La regulación de KCC2 ocurre a través de la fosforilación y desfosforilación en residuos clave de serina/treonina1. Western blot es una técnica eficiente que se puede utilizar para investigar la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa en Thr906 y Thr1007. En principio, los cambios en la fosforilación de KCC2 se detectan utilizando anticuerpos fosfoespecíficos dirigidos contra fosfopéptidos de las muestras de inmunoblot/proteínas de interés. Western blot es un método utilizado para detectar la proteína específica de interés de una muestra de tejido o célula. Este método primero separa las proteínas por tamaño a través de la electroforesis. Luego, las proteínas se transfieren electroforéticamente a un soporte sólido (generalmente una membrana) antes de que la proteína objetivo se marque con un anticuerpo específico. Los anticuerpos se conjugan a diferentes etiquetas o anticuerpos conjugados con fluoróforos que se detectan mediante métodos colorimétricos, quimioluminiscencia o fluorescencia. Esto permite detectar una proteína diana específica a partir de una mezcla de proteínas. Esta técnica se ha utilizado para caracterizar sitios fosfoespecíficos de KCC2 2,8 y se ha utilizado para identificar inhibidores de KCC2 que antagonizan la fosforilación de KCC2 Thr906/Thr100715. Las líneas HEK293 han estado en uso para varios experimentos debido a su ventaja en experimentos de biología molecular. Son rápidos de reproducir, fáciles de mantener y altamente eficientes para la transfección y la producción de proteínas22. Sin embargo, algunas opiniones sostienen que podría no ser el candidato más adecuado para llevar a cabo experimentos de neurobiología porque no es una célula procedente del cerebro y, por lo tanto, su especificidad fisiológica puede ser cuestionable en la investigación en neurociencia. Sin embargo, trabajos previos han demostrado que se observan resultados similares en la expresión de KCC2 en células HEK293 y tejidos / células neuronales reales15,23. Por lo tanto, la relevancia de HEK293 en la investigación en neurociencia no puede descartarse por completo.

En los estudios que impliquen el análisis de la expresión de proteínas mediante la técnica de western blotting, se debe prestar especial atención a la elección de la composición del tampón de lisis, la naturaleza (tipo y concentración) del detergente a utilizar24 y los inhibidores de la proteasa. La composición del tampón debe optimizarse para adaptarse a la proteína diana para facilitar sus procesos de solubilización y extracción, y para permitir su fácil detección por western blot25. El detergente suave a baja concentración generalmente se requiere para las proteínas solubles, mientras que las proteínas de membrana pueden requerir condiciones detergentes más fuertes. Sin embargo, los detergentes fuertes pueden interrumpir las interacciones y los complejos pueden perderse. Tanto los tipos como las concentraciones de los detergentes pueden afectar la naturaleza y la actividad de la proteína, por lo tanto, es necesario atenerse a un rango restringido / tolerado de concentraciones para estos detergentes. La adición de un inhibidor de la proteasa evitará que la proteína diana sea degradada por proteínas endógenas, y la temperatura de trabajo óptima recomendada es de 4 °C para disminuir eficazmente las tasas proteolíticas. A veces, en un intento por lograr señales de inmunotransferencia de alta calidad para anticuerpos que dan señales de inmunotransferencia deficientes, la inmunoprecipitación (IP) se lleva a cabo como un experimento aguas arriba para la transferencia occidental. Esta técnica es ventajosa porque facilita la interacción entre antígenos y sus respectivos anticuerpos en su conformación nativa precediendo a su consecuente separación y cuantificación26. Por lo tanto, la P.I. puede mejorar la calidad de los resultados de los procedimientos de transferencia occidental. Antes de la aplicación de la técnica IP, es importante evaluar la presencia y la eficiencia de la expresión de las proteínas asociadas coinmunoprecipitadas en el lisado mediante el análisis del lisado de células completas o las fracciones de entrada por western blotting. Además, es necesario un conocimiento previo del peso molecular de la proteína a investigar antes de preparar las soluciones de gel porcentuales deseadas para la electroforesis SDS-PAGE, ya que el tamaño de la proteína afecta el efecto de tamizado de la matriz del gel.

Sin embargo, la detección de anticuerpos conjugados con proteínas mediante esta técnica es muy útil, ya que ayuda a mejorar la comprensión de las actividades cooperativas en los fosfositios de KCC2 que pueden proporcionar información sobre la fosforilación del cotransportador y la integridad de la vía de señalización que puede regular los cotransportadores, para una predicción confiable de la actividad del cotransportador. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la técnica de Western blot solo puede producir datos semicuantitativos, lo que significa que la técnica solo destaca la evaluación relativa de las expresiones de proteínas, pero no la cuantificación absoluta. Esto se acredita a las discrepancias en las tasas de carga de muestras y transferencia en carriles separados, que son diferentes en manchas individuales. La señal detectada generada tampoco es lineal y no refleja el rango de concentración de las muestras27. Además, el estado de fosforilación puede no ser un factor confiable para informar la actividad de las proteínas, ya que intervenciones como inhibidores, mutaciones e interacciones de proteínas con su entorno pueden influir directamente en la actividad de las proteínas sin cambiar su nivel de fosforilación28,29,30. Por lo tanto, puede ser más beneficioso usar anticuerpos fosfoespecíficos para complementar otros métodos bioquímicos.

Como se mencionó anteriormente, existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2. La evaluación de KCC2 mediante la medición del flujo radiactivo de 86Rb + a través de la membrana de preparaciones celulares homogéneas es un enfoque popular. Este método utiliza radioisótopos activos como trazadores pasándolos a través de canales iónicos. Brevemente, las células de interés se incuban en soluciones libres de cationes para inhibir KCC2 endógeno, seguido de incubación con inhibidores específicos como la ouabaína, y luego con medio de captación que contiene el inhibidor y 86Rb +. Los contadores de centelleo líquido se utilizan para medir / rastrear actividades secuelas de la lisis celular. Sin embargo, este método es robusto, altamente sensible y selectivo y es menos propenso a las perturbaciones. Sin embargo, sus aplicaciones no se extienden a tejidos con múltiples tipos de células como cultivos cerebrales o neuronales. Además, esta técnica restringe los cambios en la resolución de la concentración de iones a nivel subcelular. Además, existen problemas de seguridad con respecto a la toxicidad potencial y el peligro para la salud de trabajar con radioisótopos de vida media corta (18,65 días) caracterizados con alta emisión de energía (máx. 1,77 MeV; máx. 1,08 MeV)31. Esto podría sugerir masivamente una inadecuación para los estudios de células neuronales donde generalmente se requiere un alto número de células. Estos problemas condujeron al desarrollo del ensayo de eflujo no radiactivo 85Rb+ por Terstappen 1999, como una alternativa al 86Rb+ radiactivo para la determinación de flujos de iones. El enfoque no radiactivo ha exiliado en gran medida los ensayos radiactivos 86Rb+ para el análisis de K+ y canales catiónicos no selectivos en la industria farmacéutica31. El ensayo de eflujo no radiactivo 85Rb+ implica dos procesos principales, el primero es el cultivo celular y la manipulación y el segundo es la determinación del trazador rubidio por espectroscopia de absorción atómica (AAS). Este método es fácil de usar, sin embargo, requiere una serie de experimentos de validación de ensayos y sufre de mala resolución temporal32. Sin embargo, el ensayo de eflujo no radiactivo de 85Rb+ ha demostrado progresivamente ser una técnica fiable para la evaluación de KCC y NKCC33.

El ensayo de flujo de talio (TI+) utiliza TI+ como ion sustituto de K+ debido a su alta afinidad de unión al sitio K+ en KCC2 y NKCC2. La afluencia de TI + en las células podría detectarse utilizando un colorante fluorescente sensible al talio como la cumarina benzotiazol y la fluozin-2. Una vez transportado por el canal, el TI+ puede asociarse con el colorante BTC/fluozin-2 causando un cambio fluorescente que puede ser detectado por el lector de placas de imágenes fluorométricas31. Los colorantes indicadores de TI+ entran en las células como ésteres de acetoxymetilo que luego son escindidos por esterasas citoplasmáticas para liberar las formas fluorogénicas activas. Para activar los KCC, las células se estimulan con una mezcla de K+ y Tl+ en presencia o ausencia de compuestos de ensayo (por ejemplo, inhibidores de KCC2). El talio entra y se une al tinte fluorescente. El aumento de la señal fluorescente es proporcional a la afluencia de Tl+ en la célula específicamente a través del cotransportador, y por lo tanto representa una medida funcional de la actividad del cotransportador. Este método también se ha aplicado bien en la medición de la actividad de KCC2 y NKCC2 en varios tipos de cultivos celulares, por ejemplo, estudios sobre la línea celular HEK293 que expresa de manera estable KCC2 humano34. En un extremo de demérito, hay una variedad de posibles líneas de vías fuera del objetivo que podrían interferir con la afluencia de TI+, por ejemplo, Na+/K+ ATPasa en células HEK293 podría causar una mayor tasa de aciertos positivos o falsos negativos35. Además, al igual que con otros ensayos de flujo, la implementación de dicho enfoque en las células neuronales sigue siendo limitada debido a la mala supervivencia de las células neuronales después de múltiples pasos de lavado. La expresión neuronal de múltiples canales K+ y transportador también puede impedir la evaluación precisa de los flujos K+ específicos de KCC2. Esta técnica presenta limitaciones para el estudio de canales en pequeños compartimentos neuronales como dendritas y espinas dendríticas, y los axones debido a la falta de resolución espacial junto con la baja resolución temporal.

Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular. En general, las mediciones electrofisiológicas de la función SLC12 se basan en el principio de que los receptoresGABA A (GABAAR) son permeables al cloruro36. KCC2 es clave en la modulación de la inhibición GABAérgica. En particular, la actividad de extrusión [Cl-]i de KCC2 subyace a la hiperpolarización de GABAAR6. Los registros intracelulares proporcionan información crucial a través de la extrapolación de la capacidad de extrusión de cloruro de KCC2 a partir de la inversión en el potencial de las corrientes mediadas por GABAAR (EGABA). Un EGABA hiperpolarizado indica un [Cl-]i más bajo y, por lo tanto, un aumento en la actividad de KCC2. La técnica de pinza de parche de gramicidina en electrofisiología es un enfoque estándar de oro para medir la actividad de GABA. Algunos estudios publicados anteriormente han empleado el registro de gramicidina patch-clamp para investigar las funciones y actividades de KCC2 para evaluar/monitorear la homeostasis [Cl-]i han demostrado ser exitosas 8,9,37,38,39,40 . Durante un registro de pinza de parche de gramicidina, se crea un sello hermético en la superficie de la célula / tejido utilizando un electrodo de vidrio con un parche relativo para registrar la actividad intracelular de los canales iónicos en referencia a otro electrodo en un baño que rodea la célula / tejido. Esta técnica se puede realizar midiendo la cantidad de corriente que atraviesa la membrana de una celda a un voltaje fijo en el modo de abrazadera de voltaje o registrando la cantidad de voltaje que se mueve a través de la membrana a una corriente fija en el modo de abrazadera de corriente36. Se pueden aplicar varias variaciones de la técnica básica, que depende en gran medida de la pregunta de investigación. La técnica no crea un registro de parche de células enteras similar a un poro relativamente grande, pero el antibiótico formador de poros (gramicidina) que está contenido en la solución del electrodo se utiliza para formar pequeños poros en la membrana36. En particular, la adición de gramicidina crea poros selectivos de cationes en la membrana, que exhiben una permeabilidad aniónica insignificante. Los protocolos de rampa de voltaje son una alternativa efectiva y confiable para registrar la corriente a un voltaje constante. Las relaciones corriente/voltaje obtenidas con los protocolos de rampa de voltaje parecen dar un mejor registro de las corrientes de membrana mediadas por GABAAR. En este protocolo, se aplica un voltaje constantemente cambiante pero monitoreado (a una velocidad constante) y la corriente se mide constantementesimultáneamente 36,41. Durante este protocolo, la aplicación de pulsos de voltaje (generalmente en dirección hiperpolarizante) se utiliza para activar la corriente de fuga como resultado de respuestas óhmicas. Típicamente, las corrientes de membrana mediadas por R de GABAAse calculan a partir de la corriente de fuga (es decir, los potenciales de inversión de las corrientes agonistas sustraídas por fugas)36. Las asociaciones corriente-voltaje obtenidas de este protocolo ayudan a proporcionar una mejor comprensión de dónde se producen los cambios en las concentraciones de iones durante un escenario experimental que involucra canales de receptoresGABA A. Yelhekar et al.41 utilizaron un modelo computacional para demostrar que las conclusiones sobre concentraciones estables de iones del método de interpolación pueden no ser justificables porque el potencial de inversión estimado del método puede ser incorrecto.

La resistencia media utilizada para la mayoría de las grabaciones es de 5 MΩ. Las pipetas con una resistencia inferior de 3-4 MΩ pueden dar lugar a una resistencia en serie más baja, lo que es preferible para las grabaciones de abrazadera de tensión. Sin embargo, la punta de la pipeta será comparativamente más ancha para pipetas de mayor resistencia y, como consecuencia, plantea un desafío en forma de dificultad en la formación y estabilidad del sello36,42. Por lo tanto, es necesario monitorear la formación de GΩ para obtener registros con una reducción considerable en el nivel de datos ruidosos generados. La robustez de esta técnica para estudiar la función y las actividades de KCC2 según lo juzgado por su idoneidad y fiabilidad en la medición de la actividad de GABA ha sido confirmada por varios estudios. Estudios previos han demostrado que [Cl-]i permanece estable utilizando esta técnica midiendo las respuestas de GABAARs (que son capaces de bloquear la conductancia del cloruro) a sus respectivos agonistas. Por implicación, el acceso eléctrico continuo viene con poca o ninguna modificación de la concentración intracelular de cloruro43,44. Además, esta técnica facilita la elusión de cambios artificiales en el potencial de membrana y E GABA durante la activación deGABA AR (que abre la conductancia de cloruro y bicarbonato)45. Lo anterior proporciona a esta técnica una ventaja por delante de otros tipos de registros de electrofisiología. Sin embargo, las limitaciones de esta técnica incluyen las siguientes: (1) puede ocurrir ruido de grabación frecuente debido a que la punta del electrodo ocupa parte de la membrana que puede reducir la resolución de corriente, y (2) la perforación de la membrana con gramicidina generalmente toma una cantidad de tiempo relativamente más larga.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094), y una beca de doctorado de la Commonwealth.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide Sigma-Aldrich A2917 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per Sulfate Sigma-Aldrich 248614 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAK Dundee University S670B Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 Dundee University S700C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940 Thermo Fisher Scientific PA5-95678 Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007 Dundee University S961C Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906 Dundee University S959C Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse Cell Signalling technology 66002 Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1 Dundee University S841B Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212 Dundee University S763B Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit Cell Signalling technology C29F4 Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep abcam ab6900 Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK Dundee University S669D Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III Sigma-Aldrich T8578 Used as primary antibody for western blotting
Benzamine Merck UK 135828 Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie Thermo Scientific 1856209 Used for lysate protein quantification
Casting apparatus Atto  WSE-1165W Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge Eppendorf 5804 Used in lysate preparation
Centrifuge VWR MicroStar 17R Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk Marvel N/A Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose Sigma-Aldrich D6429 Used for cell culture
ECL reagent Perkin Elmer ORTT755/2655 Used to develop image for western blotting
EDTA Fisher Scientific D/0700/53 Used as component of lysis buffer
EGTA Sigma-Aldrich e4378 Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply BioRad PowerPAC HC To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol ThermoFisher E/0650DF/17 Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated Merck Life Sciences UK F9665 Used for cell culture
Fumehood Walker A7277 Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman GE Healthcare  10426981 Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine Sigma-Aldrich 15527 Used to make buffers
GraphPad Prism Software GraphPad Software, Inc., USA Version 6.0 Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl Acros Organics 10647282 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating block Grant QBT1 Used to heat WB loading samples
HEK293 cells Merck UK 12022001-1VL Cell line for culture experiment
ImageJ Software Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA  ImageJ 1.53e Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system BioRad ChemiDoc MP Used to take western blotting images
Incubator LEEC LEEC precision 190D Used for cell culture
Isopropanol Honeywell 24137 Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution Sigma-Aldrich G7513 Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS) Novex NP0008 Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid  Merck Life Sciences UK M7145 Used for cell culture
Microcentrifuge Eppendorf 5418 Used for preparing lysates for WB
Microplate reader BioRad iMark Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint Microsoft, USA PowerPoint2016 Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker BioRad 1610373 Used for western blotting
N-ethylmaleimide Thermo Fisher Scientific 23030 Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane Fisher Scientific 45004091 Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Used for cell culture
pH Meter Mettler Toledo Seven compact s210 Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626 Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline Sigma-Aldrich D8537 Used for cell culture
PKCδ pThr505 Cell Signalling technology 9374 Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G Generon PG50-00-0002 Used for immunoprecipitation
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653 Used as component of wash buffer
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653 Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L5750 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508 Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich S8636 Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate Merck UK G9422 Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.) Scientific Laboratory Supplies, UK S4400-1MG Used for cell culture experiment
Sucrose Scientifc Laboratory Supplies S0389 Used as component of lysis buffer
TEMED Sigma-Aldrich T7024 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer Chamber BioRad 1658005EDU Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris Sigma-Aldrich T6066 Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787 Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution Merck Life Sciences UK T4049 Used for cell culture
Tween-20 Sigma-Aldrich P3179 Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump Charles Austen Dymax 5 Used for cell culture
Vortex Scientific Industries K-550-GE Used in sample preparation
Vortex mixer Scientific Industries Ltd Vortex-Genie  K-550-GE Used of mixing resolved sample
Water bath Grant Instruments Ltd. (JB Academy) JBA5 Used to incubate solutions

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Bioquímica Número 190
Estudio de las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2 mediante Western Blotting
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Josiah, S. S., Meor Azlan, N. F., Oguro-Ando, A., Zhang, J. Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting. J. Vis. Exp. (190), e64179, doi:10.3791/64179 (2022).

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