Summary
Detta protokoll belyser tillämpningen av western blotting-teknik för att studera funktioner och aktiviteter hos neuronal K-Cl-co-transporter KCC2. Protokollet beskriver undersökningen av KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen Thr906/1007 via western blotting. Dessutom markeras ytterligare metoder för att bekräfta KCC2-aktivitet kort i den här texten.
Abstract
Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning. Misslyckande med korrekt reglering av KCC2 är skadligt och har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi. Det har gjorts betydande framsteg när det gäller att förstå de mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Här belyser protokollet hur man undersöker KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen - Thr906 och Thr1007 - med hjälp av western blotting-teknik. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas. Några av dessa ytterligare tekniker kommer att diskuteras kort i detta manuskript.
Introduction
Kaliumkloridkotransporterer 2 (KCC2) är en medlem av den lösta bärarfamiljen 12 (SLC12) av katjonklorid-cotransporters (CCC), som uteslutande finns i neuronen och är avgörande för att Cl-homeostas ska fungera korrekt och följaktligen funktionell GABAergisk hämning 1,2,3,4. Upprätthållandet av låg intraneuronal Cl- koncentration ([Cl-]i) vid 4-6 mM av KCC2 underlättar γ-aminosmörsyra (GABA)/glycinhyperpolarisering och synaptisk hämning i hjärnan och ryggmärgen5. Misslyckande i korrekt reglering av KCC2 har associerats med förekomsten av flera neurologiska sjukdomar, inklusive epilepsi4. Dessutom har minskad KCC2-medierad Cl−-extrudering och nedsatt hyperpolariserande GABAA- och/eller glycinreceptormedierade strömmar varit inblandade i epilepsi, neuropatisk smärta och spasticitet 6,7. Neuronal KCC2 moduleras negativt via fosforylering av viktiga regulatoriska rester inom dess C-terminala intracellulära domän av med-ingen-lysin (WNK) -STE20 / SPS1-relaterad prolin / alaninrik (SPAK) / Oxidativ stressresponsiv (OSR) kinassignalkomplex1, vilket underlättar upprätthållandet av depolariserad GABA-aktivitet i omogna neuroner 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1-fosforylerar treoninrester 906 och 1007 (Thr906/Thr1007) och nedreglerar därefter mRNA-genuttrycket av KCC2, vilket leder till en därav följande försämring av dess fysiologiska funktion 8,10. Ännu viktigare är dock att det redan är ett faktum att WNK-SPAK / OSR1-kinaskomplexet är känt för att fosforylera och hämma KCC2-uttryck 1,2,4,11,12, och att hämningen av kinaskomplexets signalvägar till fosforylat Thr906 / Thr1007 har kopplats till det ökade uttrycket av KCC2 mRNA-genen13,14,15 . Det är viktigt att notera att regleringen av neuronala KCC2- och Na+-K+-2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) uttryck via proteinfosforylering fungerar samtidigt och i omvända mönster 1,4,16.
Det har gjorts konsekventa och betydande framsteg när det gäller förståelsen av mekanismer som är involverade i regleringen av KCC2, ackrediterade för utveckling av tekniker som gör det möjligt för forskare att studera dess funktioner och aktiviteter. antingen via direkta (bedömning av kinasreglerande platser fosforylering) eller indirekta (observera och övervaka GABA-aktivitet) undersökningar. Protokollet som presenteras här belyser tillämpningen av västerländska blottningstekniker för att studera funktionerna och aktiviteterna hos neuronal K +-Cl- co-transporter KCC2 genom att undersöka fosforyleringen av cotransporter vid kinasregleringsställen Thr906/1007.
Western blot är en metod som används för att detektera specifika proteiner av intresse från ett prov av vävnad eller cell. Denna metod separerar först proteinerna efter storlek genom elektrofores. Proteinerna överförs sedan elektroforetiskt till ett fast stöd (vanligtvis ett membran) innan målproteinet markeras med hjälp av en specifik antikropp. Antikropparna konjugeras till olika taggar eller fluoroforkonjugerade antikroppar som detekteras med antingen kolorimetriska, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Detta gör det möjligt att detektera ett specifikt målprotein från en blandning av proteiner. Denna teknik har använts för att karakterisera fosfospecifika ställen för KCCs1 och har använts för att identifiera kinashämmare som hämmar KCC3 Thr991/Thr1048 fosforylering17. Genom att följa detta protokoll kan man specifikt detektera total och fosforylerad KCC2 från cell/ vävnadslysater. I princip är detektionen av proteinkonjugerade antikroppar med denna teknik mycket instrumentell eftersom den bidrar till att förbättra förståelsen för samarbetsaktiviteter vid fosfo-platserna i KCC2, vilket belyser de molekylära mekanismerna som är involverade i deras fysiologiska regler. Den kvantitativa analysen av det totala proteinuttrycket är representativ för KCC2: s funktion och aktivitet. Det finns andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet, såsom rubidiumjon och talliumjonupptagsanalys. Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Protokollet beskriver den västra blottningsmetoden för att detektera specifika proteiner av intresse.
1. Cellodling och transfektion
- Värm alla reagenser i pärlbadet (37 °C) före cellodlingsproceduren. Förbered odlingsmedium, Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), kompletterat med 10% fetalt bovint serum, 1% vardera av 2mM L-glutamin, 100x icke-essentiell aminosyra, 100 mM natriumpyruvat och 100 enheter / ml penicillin-streptomycin.
- Tina stabilt transfekterad råtta KCC2b human embryonal njure 293 celler (HEK293rnKCC2b)18 helt i pärlbadet (37 °C). Överför cellerna från kryovialröret till ett centrifugrör som innehåller 5 ml färskt medium. Snurra cellen på 1200 ×g i 3-5 min.
- Använd en aspiratorpipett (fäst vid en vakuumpump) för att aspirera supernatanten och tillsätt 10 ml färskt medium för att åter suspendera cellerna. Överför cellsuspensionen till en 10 cm skålplatta.
- Placera skålen i inkubatorn och låt den växa i 48 timmar vid 37 °є i en fuktad 5% CO2-atmosfär . Övervaka inkubationsperioden för att säkerställa en sund celltillväxt. Dela upp cellerna ytterligare när de har uppnått över 90% sammanflöde efter inkubationsperioden.
- Aspirera ut det gamla mediet från cellskålen och skölj försiktigt cellerna med 2 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS). Tillsätt 2 ml trypsin och inkubera i ca 1-2 min vid rumstemperatur.
- Använd 2 ml komplett media för att försiktigt tvätta de trypsiniserade cellerna i skålen. Tillsätt 9 ml färskt media till nya rätter och tillsätt 1 ml lösning från den gamla skålen till var och en av de nya. Överför de delade cellskålarna tillbaka till inkubatorn i 48 timmar för att uppnå ≥ 90% sammanflöde.
- Behandla cellerna med antingen dimetylsulfoxid (DMSO) som kontroll, 8 μM staurosporin eller 0,5 mM N-etylmaleimid (NEM) i 15 minuter innan cellerna skördas i lysbuffert.
2. Beredning av celllysater och laddningsprover
- Aspirera media på kulturskålen (från transfektionsprocedurer). Placera cellkulturen på is och tvätta cellerna med iskall PBS.
- Aspirera PBS, tillsätt sedan 1,0 ml iskall lysbuffert innehållande 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM etylenglykol-bis(β-aminoetyleter)-N,N,N′,n′-tetraättiksyra (EGTA), 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 50 mM natriumfluorid, 5 mM natriumpyrofosfat, 10 mM natrium-β-glycerofosfat, 1 mM natriumortovonadat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M sackaros, 1 mM bensamin, 0,1% (v / v) 2-merkaptoetanol och 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) till skålen.
OBS: Volymen lysbuffert under cellskörd varierar med skålstorlekar, till exempel är 1 ml lysbuffert lämplig per 1 x 107 celler / 100 mm skål / 150 cm 2 kolv, medan 0,5 ml är lämplig per 5 x 106 celler / 60 mm skål / 75 cm2 kolv. - Använd en kall plastcellskrapa för att skrapa cellerna från botten av skålen och använd sedan försiktigt en pipett för att överföra cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör som redan är på is. Rör hela tiden om röret i 30 minuter vid 4 °C.
- Snurra celllysaterna i en kall centrifug (4 °C) vid 16 000 x g i 20 minuter, ta försiktigt bort röret från centrifugen och lägg det på is. Samla supernatanten i ett förkylt färskt rör och kassera pelleten.
OBS: Det kan vara nödvändigt att variera centrifugeringskraften och tiden beroende på celltyp. Allmänna riktlinjer uppmuntrar dock centrifugering vid 16 000 x g i 20 minuter. Detta måste dock bestämmas för varje experiment. Till exempel behöver känsliga celler som leukocyter en mycket lätt centrifugeringshastighet.
3. Framställning av immunoprecipitanter från celllysater
- Pipettera 300 μL protein-G-sefaros i ett mikrocentrifugrör. Snurra lösningen vid 500 x g i 2 minuter och kassera supernatanten.
- Tillsätt 500 μL PBS och virvla lösningen väl. Snurra lösningen vid 500 x g i 2 minuter och kassera supernatanten. Upprepa detta steg.
- Blanda 1 mg anti-KCC2 Thr906 och anti-KCC2 Thr1007 antikroppar med 200 μL protein G-sefarospärlor och fyll upp volymen till 500 μL med PBS. Skaka på en vibrerande plattform eller ett roterande hjul i 2 timmar vid 4 °C. Tvätta 2x med PBS.
- Utför proteinkvantifiering på hela celllysaterna och tillsätt 1 mg celllysat till de tvättade pärlorna. Inkubera försiktigt i en end-to-end-rotator i 2 timmar vid 4 °C. Snurra ner pärlorna och tvätta dem 3x med PBS som innehåller 150 mM natriumklorid (NaCl).
- Tvätta immunoprecipitanter (pärlor) 3x med 200 μL PBS. Återsuspendera slutpelleten i 100 μl 1x litiumdodecylsulfat (LDS) provbuffert.
- Skaka rören i en rotorskakare vid rumstemperatur i 5 minuter och inkubera dem i ett värmeblock vid 75 °C i 10 minuter. Centrifugera lastprovet vid 11 000 x g i 2 minuter och använd supernatanten för gelbelastning.
4. Utföra den västra fläcken
- Montera gjutapparaten och häll nyberedd 8% separerande gel (se tabell 1 för recept/beredning) för att gjuta gelén så att cirka 2 cm utrymme får plats från toppen av gjutglaset. Tillsätt 200 μl absolut isopropanol till installationen och låt den stå vid rumstemperatur i 60 minuter.
OBS: Polyakrylamidgelreceptet för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) beror på storleken på proteinet av intresse (tabell 2). Notera därför proteinstorleken innan du bestämmer önskad gelprocent. - Använd en pipett för att ta bort isopropanolen och skölj försiktigt gelén med cirka 200 μl destillerat vatten. Tillsätt nyberedd 6% staplingsgel (se tabell 1 för recept / beredning) för att fylla upp det cirka 2 cm utrymmet på gjutningsinställningen. Sätt försiktigt i brunnskammen och låt stå i rumstemperatur i 30 min.
- Fäst den gjutna gelén i elektroforestanken.
- Lös upp 30,3 g Tris-bas, 144,1 g glycin och 10 g SDS i 1000 ml destillerat vatten för att förbereda 10x överföringsbuffert. Förbered 1x löpande buffert genom att tillsätta 10 ml 10% SDS och 100 ml 10x överföringsbuffert till 890 ml destillerat vatten.
- Häll 1x löpande buffert i tanken. Ladda 5 μL molekylviktsmarkör i den första brunnen och en lika stor mängd protein i varje brunn i SDS-PAGE-gelén (mellan 18-30 μL, beroende på vilken kamstorlek som används). Fyll upp tomma brunnar med 1x LDS och kör gelén i ca 90-120 min vid 120 V.
- Lös upp 58,2 g Tris-bas och 29,3 g glycin i 1000 ml destillerat vatten för att framställa 10x överföringsbuffert. Aktivera nitrocellulosamembran med 1x överföringsbuffert innehållande 20% metanol. Skölj gelén och membranet med överföringsbufferten och sprid dem försiktigt ut på beredningsstapeln.
OBS: Det finns inget behov av att justera pH-värdet för kör- och överföringsbuffertarna eftersom de borde ha det optimala pH som krävs. Det är också lämpligt att förbereda dessa buffertar och förvara dem vid rumstemperatur före experimentet för att spara tid. - Ordna smörgåsen som ska överföras i denna ordning: negativ elektrod (svart ram / ände) - smörgåsskum - filterpapper - sköljd SDS-PAGE-gel - sköljt nitrocellulosamembran - filterpapper - smörgåsskum - positiv elektrod (röd ram). Stapla den monterade smörgåsen i överföringstanken och kör vid 90 V i 90 min eller 30 V i 360 min.
5. Antikroppsfärgning och bildutveckling
- Ta bort membranet och låt det torka. Blockera membranet i 1 h vid rumstemperatur med en blockerande buffert gjord av 5% skummjölk i Tris-buffrad saltlösning innehållande 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
- Inkubera membranen med lämpliga utspädningar av primärantikroppen 8,15,19 och beta-aktin (belastningskontroll) i blockerande buffert i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C. Tvätta membranet i tre tvättar om 1x TBS-T i 5 min vardera.
OBS: Inkubationen av det separata membranet med laddningskontroller såsom beta-aktin, alfa-tubulin eller glyceraldehyd 3-fosfatdehydrogenasantikroppar är att normalisera de andra western blotting-resultaten under efterföljande kvantifiering. Den rekommenderade utspädningen för varje primär antikropp finns i tillverkarens handbok. - Inkubera det tvättade membranet med sekundär antikropp utspädd 5000 gånger i blockerande buffert i 60 min vid rumstemperatur. Återigen, tvätta membranet 3x i 1x TBS-T i 5 min vardera.
OBS: Det rekommenderas starkt att den sekundära antikroppen måste höjas mot den art där den primära antikroppen är uppvuxen. Till exempel, om den primära antikroppen av total KCC2 är musanti-KCC2, måste den sekundära antikroppen för anti-mus användas. - Placera det tvättade membranet på bildkortet. Blanda lika stora volymer av varje förstärkt kemiluminescens (ECL) reagens och sprid försiktigt den blandade lösningen på membranet för att utveckla signaler.
6. Bildförvärv med hjälp av ett bildsystem och datakvantifiering
- Överför bildkortet till lämpligt fack på bildsystemet för avbildning. Öppna bildprogramvaran på datorn för bildbehandling.
- I verktygsfältet klickar du på Nytt protokoll och väljer En kanal. Klicka på Välj under dialogrutan gelavbildning / applikation, bläddra till Blot och välj antingen Chemi Hi Sensitivity eller Chemi Hi Resolution. Klicka sedan på Signal Accumulation Setup för att ställa in varaktighet och antal bilder som ska förvärvas.
- Klicka på Position Gel under protokollinställning och justera gelén i bildsystemet om det behövs. Klicka på Kör protokoll för att hämta bilderna.
- Högerklicka på en av de förvärvade bilderna under bildkatalogrutan för att spara bilderna på datorn. Navigera till önskad bild och klicka på Välj bild och fortsätt under dialogrutan Kör.
- Klicka på ikonen Bildtransformering för att justera bildens kontrast och pixelmättnad. Klicka på skärmdump ikonen i det allmänna verktygsfältet för att spara bilden på datorn beroende på önskat bildformat.
- Mät banddensiteterna med hjälp av ImageJ-programvaran och analysera med hjälp av lämpliga statistiska verktyg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här undersökte det representativa resultatet som presenteras i figur 1 effekten av staurosporin och NEM på WNK-SPAK / OSR1-medierad fosforylering av KCC2 och NKCC1 i HEK293-cellinjer som stabilt uttrycker KCC2b (HEKrnKCC2b)18 med hjälp av western blotting-tekniken. Omfattande detaljer om de representativa resultaten diskuteras i Zhang et al.15. I likhet med NEM är staurosporin en bred kinashämmare som kan förbättra KCC2-transportaktiviteten och hämma NKCC1-aktivitet15,20. Behandlingen av HEK293-celler med staurosporin och NEM orsakade minskad fosforylering vid PAK-målplatser - Thr233 belägen i T-loopkinasdomänen och S-loop-fosforyleringsstället Ser373 för hsSPAK. Således förkortade båda föreningarna fosforyleringsnivåerna för de ovannämnda PAK-fosfo-platserna. Staurosporin minskade också fosforyleringen av Ser940 i HEKrnKCC2b, men NEM ökade signifikant dess fosforylering. Dessutom minskar staurosporin fosforyleringen vid Thr505-stället, medan NEM orsakade en liten men obetydlig ökning av fosforylering på samma plats. De differentiella effekterna av båda föreningarna på fosforyleringen av proteinkinas C (PKC) vid Thr505-platsen och KCC2b vid Ser940-platsen korrelerar väl. Det representativa resultatet visade också att båda medlen förändrade uttrycket av total rnKCC2b, hsNKCC1 eller hsSPAK. NEM (men inte staurosporinbehandling) orsakade en signifikant ökning av uttrycket av den totala KCC2-mängden, medan uttrycket av total NKCC1 och SPAK inte förändrades signifikant när det behandlades med båda föreningarna. Dessutom orsakade de två föreningarna en minskad fosforylering av SPAK vid Thr233- och Ser373-platser, och detta korrelerade med den förkortade fosforyleringen av Thr906 / Thr1007 och Thr203/207/212-platser i rnKCC2b respektive hsNKCC1. Dessutom reducerade och ökade staurosporin och NEM fosforyleringen av PKC vid Ser940-stället i rnKCC2b, vilket korrelerade med reduktionen och ökningen av fosforyleringen av PKC-δ vid Thr505-platsen vid staurosporin respektive NEM-behandling (figur 1).
Figur 1: Kvantitativa analyser av rn KCC2b och hsNKCC1 fosfo-platser vid staurosporin och NEM-behandling i HEK rn KCC2b-celler. (A) Stabilt transfekterade HEK rnKCC2b-celler behandlades med DMSO (kontroll), 8 μM staurosporin eller 0,5 mM NEM i 15 minuter. Celllysater skördades och utsattes för immunoprecipitation (IP) och immunoblott (IB) med indikerade antikroppar. Förkortningar: D = dimerisk KCC2; M = monomer KCC2. B) Immunoblotkvantifiering av stabilt transfekterade HEKrnKCC2b-celler. Bandintensiteter kvantifierades med ImageJ-programvaran. p < 0,001; **p < 0,01; Wilcoxon-Mann Whitney-test (n = 6). Denna siffra har modifierats från Zhang et al.15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 8 ml 8% separeringsgel | 5 ml 6% staplingsgel | ||
| Material som behövs | Volym (μL) | Material som behövs | Volym (μL) |
| DestilleradH2O | 4200 | DestilleradH2O | 2900 |
| 40% akrylamid | 1600 | 40% akrylamid | 750 |
| 1,5 M Tris pH 8,8 | 2000 | 0,5 M Tris pH 6,8 | 1250 |
| 10% SDS | 80 | 10% SDS | 50 |
| 10% APS | 80 | 10% APS | 50 |
| TEMA | 8 | TEMA | 5 |
| Gör separeringsgelén: | |
| 1) | Börja med 4,2 ml ddH2O |
| 2) | Tillsätt 1,6 ml 40 % akrylamid/bis-akrylamidlösning |
| 3) | Tillsätt 2 ml 1,5 M Tris pH 8,8 och blanda |
| 4) | Blanda i 80 μl 10% SDS |
| 5) | När du är klar att använda, tillsätt 8 μL TEMED och blanda |
| 6) | Tillsätt 80 μl 10 % APS* och blanda |
| Gör staplingsgelén: | |
| 1) | Börja med 2,9 ml ddH2O |
| 2) | Tillsätt 0,75 ml 40 % akrylamid/bis-akrylamidlösning |
| 3) | Tillsätt 1,25 ml 0,5 M Tris pH 6,8 och blanda |
| 4) | Blanda i 50 μl 10% SDS |
| 5) | När du är klar att använda, tillsätt 5 μl TEMED och blanda |
| 6) | Tillsätt 50 μl 10 % APS* och blanda |
| SDS = Natriumdodecylsulfat | |
| APS = Ammonium per sulfat | |
| TEMED = N, N, Nʹ, Nʹ-tetrametyletylendiamin | |
| *Vid tillsats av APS ska lösningen omedelbart hällas i gjutapparaten eftersom lösningen polymeriseras inom några minuter. Därför är det lämpligt att förbereda separerings- och staplingsgellösningarna nästan när lösningarna behövs. | |
Tabell 1: Recept för att göra polyakrylamidgelblandning (separering och stapling av gellösningar).
| Gel procent (%) | Protein storlek (kDa) |
| Upp till 20 | 4 till 40 |
| 15 | 12 till 45 |
| 12.5 | 10 till 70 |
| 10 | 15 till 100 |
| 8 | 50 till 200 |
| 4 till 6 | > 200 |
Tabell 2: Rekommenderad SDS-PAGE-gelprocent för olika storlekar av proteiner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många metoder har använts för att mäta aktiviteterna hos SLC12 av CCC som uttrycks i neuronerna, inklusive KCC2. Många av dessa tekniker har visat sig öka den vetenskapliga kunskapen om analysen av dessa transportörers funktionella relevans och deras struktur-funktionsmönster i olika sjukdomsrelaterade mutationer. Kritiskt finns det fördelar och förbehåll för de olika metoderna21. Protokollet som förklaras ovan beskrev dock hur man bedömer KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen, Thr906 och Thr1007, med hjälp av western blot, vilket kan vara till hjälp för att studera KCC2: s funktioner och aktiviteter.
Regleringen av KCC2 sker genom fosforylering och defosforylering vid viktiga serin/treoninrester1. Western blotting är en effektiv teknik som kan användas för att undersöka KCC2-fosforylering vid kinasregleringsställen vid Thr906 och Thr1007. I princip detekteras förändringar i fosforyleringen av KCC2 med användning av fosfospecifika antikroppar riktade mot fosfopeptider av immunoblotproverna/proteinerna av intresse. Western blot är en metod som används för att detektera det specifika proteinet av intresse från ett vävnads- eller cellprov. Denna metod separerar först proteinerna efter storlek genom elektrofores. Proteinerna överförs sedan elektroforetiskt till ett fast stöd (vanligtvis ett membran) innan målproteinet markeras med hjälp av en specifik antikropp. Antikropparna konjugeras till olika taggar eller fluoroforkonjugerade antikroppar som detekteras med antingen kolorimetriska, kemiluminescens eller fluorescensmetoder. Detta gör det möjligt att detektera ett specifikt målprotein från en blandning av proteiner. Denna teknik har använts för att karakterisera fosfospecifika ställen för KCC2 2,8 och har använts för att identifiera hämmare av KCC2 som motverkar KCC2 Thr906/Thr1007 fosforylering15. HEK293-linjer har använts för flera experiment på grund av deras fördel i molekylärbiologiska experiment. De är snabba att reproducera, lätta att underhålla och mycket effektiva för transfektion och proteinproduktion22. Vissa åsikter hävdar dock att det kanske inte är den mest lämpliga kandidaten för att utföra neurobiologiska experiment eftersom det inte är en cell som kommer från hjärnan, och därför kan dess fysiologiska specificitet ifrågasättas i neurovetenskaplig forskning. Tidigare arbeten har dock visat att liknande resultat observeras i uttrycket av KCC2 i HEK293-celler och faktiska neuronala vävnader/celler15,23. Därför kan relevansen av HEK293 i neurovetenskaplig forskning inte kasseras direkt.
I studier som omfattar analys av proteinuttryck med western blotting-teknik bör särskild uppmärksamhet ägnas åt valet av lysbuffertsammansättning, arten (typ och koncentration) av det tvättmedel som skall användas24 och proteashämmarna. Buffertens sammansättning måste optimeras för att passa målproteinet för att underlätta dess solubiliserings- och extraktionsprocesser och för att möjliggöra dess enkla detektion av western blot25. Milt tvättmedel i låg koncentration krävs vanligtvis för lösliga proteiner, medan membranproteiner kan kräva starkare tvättmedel. Starka tvättmedel kan dock störa interaktioner och komplex kan gå förlorade. Både typer och koncentrationer av tvätt- och rengöringsmedel kan påverka proteinets art och aktivitet, därför finns det ett behov av att hålla sig till ett begränsat/tolererat koncentrationsintervall för dessa tvätt- och rengöringsmedel. Tillsatsen av proteashämmare kommer att förhindra att målproteinet bryts ned av endogena proteiner, och den optimala rekommenderade arbetstemperaturen är 4 ° C för att effektivt minska proteolytiska hastigheter. Ibland, i ett försök att uppnå högkvalitativa immunoblotsignaler för antikroppar som ger dåliga immunoblotsignaler, utförs immunoprecipitation (IP) som ett uppströms experiment för western blotting. Denna teknik är fördelaktig eftersom den underlättar interaktionen mellan antigener och deras respektive antikroppar i deras ursprungliga konformation före deras därav följande separation och kvantifiering26. Därför kan IP förbättra kvaliteten på utdata från western blotting-förfaranden. Före tillämpningen av IP-tekniken är det viktigt att bedöma närvaron och effektiviteten av uttrycket av de co-immunoprecipiterade partnerproteinerna i lysatet genom att analysera antingen hela celllysatet eller ingångsfraktionerna genom western blotting. Vidare är förkunskaper om molekylvikten hos det protein som ska undersökas nödvändiga innan man förbereder de önskade procentuella gellösningarna för SDS-PAGE-elektrofores eftersom proteinets storlek påverkar siktningseffekten av gelmatrisen.
Detektionen av proteinkonjugerade antikroppar med denna teknik är dock mycket instrumentell eftersom den bidrar till att förbättra förståelsen för samarbetsaktiviteter vid fosfo-platserna i KCC2 som kan ge information om cotransporterfosforylering och integriteten hos signalvägen som kan reglera cotransportersna, för en tillförlitlig förutsägelse av samtransportaktivitet. Det är dock viktigt att notera att western blot-tekniken endast kan producera semikvantitativa data, vilket innebär att tekniken endast belyser den relativa bedömningen av proteinuttryck men inte absolut kvantifiering. Detta är ackrediterat till avvikelser i hastigheterna för provbelastning och överföring i separata körfält, som skiljer sig åt på enskilda blottar. Den detekterade signalen som genereras är inte heller linjär och återspeglar inte koncentrationsintervallet för prover27. Dessutom kanske fosforyleringsstatus inte är en tillförlitlig faktor för att rapportera proteinaktivitet eftersom interventioner som hämmare, mutationer och proteininteraktioner med dess miljö direkt kan påverka proteinaktiviteten utan att ändra dess fosforyleringsnivå28,29,30. Således kan det vara mer fördelaktigt att använda fosfospecifika antikroppar för att komplettera andra biokemiska metoder.
Som tidigare nämnts finns det andra klassiska metoder som används för att direkt mäta KCC2-aktivitet. Bedömningen av KCC2 genom mätning av radioaktivt 86Rb+ flöde genom membranet i homogena cellpreparat är ett populärt tillvägagångssätt. Denna metod använder aktiva radioisotoper som spårämnen genom att leda dem genom jonkanaler. Kortfattat inkuberas cellerna av intresse i katjonfria lösningar för att hämma endogen KCC2, följt av inkubation med specifika hämmare såsom ouabain, och sedan med upptagsmedium innehållande hämmaren och 86Rb+. Vätskescintillationsräknare används för att mäta/spåra aktiviteter uppföljare till celllys. Denna metod är dock robust, mycket känslig och selektiv och är mindre benägen för störningar. Emellertid, dess tillämpningar sträcker sig inte till vävnader med flera celltyper som hjärnan eller neuron kulturer. Dessutom begränsar denna teknik förändringar i upplösningen av jonkoncentrationen på subcellulär nivå. Vidare finns det säkerhetsfrågor angående den potentiella toxiciteten och hälsorisken med att arbeta med korta halveringstider (18,65 dagar) radioisotoper som kännetecknas av hög energiemission (max 1,77 MeV; max 1,08 MeV)31. Detta kan massivt tyda på en olämplighet för neuronala cellstudier där ett stort antal celler vanligtvis krävs. Dessa problem leder till utvecklingen av den icke-radioaktiva 85Rb+ effluxanalysen av Terstappen 1999, som ett alternativ till den radioaktiva 86Rb+ för bestämning av jonflöden. Det icke-radioaktiva tillvägagångssättet har kraftigt förvisat de radioaktiva 86Rb+ -analyserna för analys av K + och icke-selektiva katjonkanaler i läkemedelsindustrin31. Icke-radioaktiv 85Rb+ effluxanalys involverar två huvudprocesser, den första är cellodling och manipulation och den andra är bestämningen av spårämnet rubidium genom atomabsorptionsspektroskopi (AAS). Denna metod är lätt att använda, men den kräver ett antal analysvalideringsexperiment och lider av dålig tidsupplösning32. Icke desto mindre har icke-radioaktiv 85Rb+ effluxanalys successivt visat sig vara en tillförlitlig teknik för bedömning av KCC och NKCC33.
Talliumflödesanalysen (TI+) använder TI+ som en surrogatjon för K+ på grund av dess höga bindningsaffinitet till K+-platsen på KCC2 och NKCC2. TI + tillströmning till celler kan detekteras med användning av ett talliumkänsligt fluorescerande färgämne såsom bensotiazolkumarin och fluozin-2. När TI+ har transporterats av kanalen kan det associeras med BTC/fluozin-2-färgämnet och orsaka en fluorescerande förändring som kan detekteras med fluorometrisk bildplattläsare31. TI + -indikatorfärger kommer in i celler som acetoximetylestrar som sedan klyvs av cytoplasmatiska esteraser för att frigöra de aktiva fluorogena formerna. För att aktivera KCC stimuleras cellerna med en blandning av K+ och Tl+ i närvaro eller frånvaro av testföreningar (t.ex. KCC2-hämmare). Tallium kommer in och binder till fluorescensfärgämnet. Ökningen av fluorescerande signal är proportionell mot tillströmningen av Tl+ in i cellen specifikt genom kotransportern och representerar därför en funktionell mätning av kotransportaktiviteten. Denna metod har också använts väl för att mäta KCC2- och NKCC2-aktivitet i olika typer av cellkulturer, till exempel studier på HEK293-cellinje som stabilt uttrycker human KCC234. I en demeritände finns det en mängd potentiella linjer utanför målet som kan störa TI + -tillströmningen, till exempel kan Na + / K + ATPas i HEK293-celler orsaka en högre falsk positiv eller falsk negativ träfffrekvens35. Dessutom, som med andra flödesanalyser, förblir implementeringen av ett sådant tillvägagångssätt i neuronala celler begränsat på grund av den dåliga överlevnaden av neuronala celler efter flera tvättsteg. Det neuronala uttrycket av flera K + -kanaler och transportör kan också hindra den exakta bedömningen av KCC2-specifika K + -flöden. Denna teknik presenterar begränsningar för studier av kanaler i små neuronala fack såsom dendriter och dendritiska ryggar, och axonerna berodde på brist på rumslig upplösning i kombination med låg tidsupplösning.
Ytterligare tekniker såsom patch-clamp-electrophysiology används för att mäta GABA-aktivitet; därför indirekt reflekterande aktiverad och/eller inaktiverad KCC2 som informerats av bedömningen av intracellulär kloridjonhomeostas. I allmänhet förlitar sig elektrofysiologiska mätningar av SLC12-funktionen på principen att GABA A-receptorerna (GABAA R) är permeabla för klorid36. KCC2 är nyckeln till modulering av GABAergisk hämning. Särskilt [Cl-] i extruderingsaktiviteten hos KCC2 ligger till grund för hyperpolariseringen av GABAAR6. Intracellulära inspelningar ger avgörande insikter genom extrapolering av kloridextruderingskapacitet för KCC2 från vändningen i potentialen för GABAAR-medierade strömmar (EGABA). En hyperpolariserad EGABA indikerar lägre [Cl-]i och därmed en ökning av aktiviteten hos KCC2. Gramicidin patch-clamp-teknik inom elektrofysiologi är en guldstandardmetod för att mäta GABA-aktivitet. Några tidigare publicerade studier har använt gramicidin patch-clamp inspelning för att undersöka funktionerna och aktiviteterna hos KCC2 för att bedöma / övervaka [Cl-] i homeostas har verkligen visat sig vara framgångsrika 8,9,37,38,39,40 . Under en gramicidin-patch-kläminspelning skapas en tät tätning på cell- / vävnadsytan med hjälp av en glaselektrod med en relativ lapp för att registrera jonkanalernas intracellulära aktivitet i förhållande till en annan elektrod i ett bad som omger cellen / vävnaden. Denna teknik kan utföras genom att mäta mängden ström som passerar en cells membran vid en fast spänning i spänningsklämläget eller genom att registrera mängden spänning som rör sig över membranet vid en fast ström i strömklämläget36. Flera varianter av grundtekniken kan tillämpas vilket till stor del beror på forskningsfrågan. Tekniken skapar inte en relativt stor porliknande helcellsplåsterinspelning utan det porbildande antibiotikumet (gramicidin) som finns i elektrodlösningen används för att bilda små porer i membranet36. Särskilt tillsatsen av gramicidin skapar katjonselektiva porer i membranet, som uppvisar obetydlig anjonpermeabilitet. Spänningsrampprotokoll är ett effektivt och pålitligt alternativ till att registrera strömmen vid en stadig spänning. De ström/ spänningsrelationer som erhållits med spänningsrampprotokoll verkar ge en bättre registrering av GABAAR-medierade membranströmmar. I detta protokoll appliceras en ständigt föränderlig men övervakad spänning (med jämn hastighet) och strömmen mäts ständigt samtidigt36,41. Under detta protokoll används appliceringen av spänningspulser (vanligtvis i hyperpolariserande riktning) för att aktivera läckströmmen som ett resultat av ohmiska svar. Vanligtvis beräknas de GABAAR-medierade membranströmmarna från läckströmmen (dvs. omkastningspotentialerna för de läckagesubtraherade agonistströmmarna)36. Strömspänningsföreningarna som erhållits från detta protokoll hjälper till att ge en bättre förståelse för var förändringarna sker i jonkoncentrationer under ett experimentellt scenario som involverar GABAA-receptorkanaler. Yelhekar et al.41 använde en beräkningsmodell för att visa att slutsatser om stabila jonkoncentrationer från interpoleringsmetoden kanske inte är motiverade eftersom den uppskattade återföringspotentialen från metoden kan vara felaktig.
Det genomsnittliga motståndet som används för de flesta inspelningar är 5 MΩ. Pipetter med lägre motstånd på 3-4 MΩ kan resultera i lägre seriemotstånd vilket är att föredra för spänningskläminspelningar. Pipettens spets kommer dock att vara jämförelsevis bredare för pipetter med högre motstånd och som en följd av detta utgör den en utmaning i form av svårigheter att täta bildning och stabilitet36,42. Därför är det nödvändigt att övervaka GΩ-bildningen för att erhålla inspelningar med en avsevärd minskning av nivån på genererade bullriga data. Robustheten hos denna teknik för att studera KCC2: s funktion och aktiviteter enligt dess lämplighet och tillförlitlighet vid mätning av GABA-aktivitet har bekräftats av flera studier. Tidigare studier har visat att [Cl-]i förblir stabil med denna teknik genom att mäta svaren från GABAARs (som kan grinda kloridkonduktans) till sina respektive agonister. Underförstått kommer kontinuerlig elektrisk åtkomst med liten eller ingen modifiering av intracellulär kloridkoncentration43,44. Dessutom underlättar denna teknik kringgående av artificiella förändringar i membranpotentialen och EGABA under GABA AR-aktivering (vilket öppnar klorid- och bikarbonatkonduktans)45. Det ovan nämnda ger denna teknik en fördel före andra typer av elektrofysiologiska inspelningar. Begränsningarna med denna teknik inkluderar emellertid följande: (1) frekvent inspelningsbrus kan uppstå på grund av spetsen på elektroden som upptar en del av membranet vilket kan minska den aktuella upplösningen, och (2) perforering av membranet med gramicidin tar vanligtvis en relativt längre tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av The Royal Society UK (Grant no. IEC \ NSFC \ 201094) och ett Commonwealth Ph.D. Scholarship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Sigma-Aldrich | A2917 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Ammonium Per Sulfate | Sigma-Aldrich | 248614 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| anti pSPAK | Dundee University | S670B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 | Dundee University | S700C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pSer940 | Thermo Fisher Scientific | PA5-95678 | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr1007 | Dundee University | S961C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-KCC2 pThr906 | Dundee University | S959C | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-mouse | Cell Signalling technology | 66002 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 | Dundee University | S841B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-NKCC1 pThr203/207/212 | Dundee University | S763B | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-rabbit | Cell Signalling technology | C29F4 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-sheep | abcam | ab6900 | Used as secondary antibody for western blotting |
| anti-SPAK | Dundee University | S669D | Used as primary antibody for western blotting |
| anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich | T8578 | Used as primary antibody for western blotting |
| Benzamine | Merck UK | 135828 | Used as component of lysis buffer |
| Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Used as component of loading buffer and lysis buffer |
| Bradford Coomasie | Thermo Scientific | 1856209 | Used for lysate protein quantification |
| Casting apparatus | Atto | WSE-1165W | Used to run SDS-page electrophoresis |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | Used in lysate preparation |
| Centrifuge | VWR | MicroStar 17R | Used for spinning samples |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Used for cell culture experiment |
| Dried Skimmed Milk | Marvel | N/A | Used to make blocking buffer |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | Used for cell culture |
| ECL reagent | Perkin Elmer | ORTT755/2655 | Used to develop image for western blotting |
| EDTA | Fisher Scientific | D/0700/53 | Used as component of lysis buffer |
| EGTA | Sigma-Aldrich | e4378 | Used as component of lysis buffer |
| Electrophoresis Power Supply | BioRad | PowerPAC HC | To supply power to run SDS-page electrophoresis |
| Ethanol | ThermoFisher | E/0650DF/17 | Used for preparing sterilized equipments and environment |
| Fetal Bovine Serum - heat inactivated | Merck Life Sciences UK | F9665 | Used for cell culture |
| Fumehood | Walker | A7277 | Used for cell culture |
| Gel Blotting - Whatman | GE Healthcare | 10426981 | Used in western blotting to make transfer sandwich |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15527 | Used to make buffers |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software, Inc., USA | Version 6.0 | Used for plotting graphs and analysing data for western blotting |
| HCl | Acros Organics | 10647282 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Heating block | Grant | QBT1 | Used to heat WB loading samples |
| HEK293 cells | Merck UK | 12022001-1VL | Cell line for culture experiment |
| ImageJ Software | Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA | ImageJ 1.53e | Used to measure band intensities from western blotting images |
| Imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | Used to take western blotting images |
| Incubator | LEEC | LEEC precision 190D | Used for cell culture |
| Isopropanol | Honeywell | 24137 | Used in casting gel for electrophoresis |
| L-glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | Used for cell culture |
| Lithium dodecyl sulfate (LDS) | Novex | NP0008 | Used as loading buffer for western blotting |
| MEM Non-essential amino acid | Merck Life Sciences UK | M7145 | Used for cell culture |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | Used for preparing lysates for WB |
| Microplate reader | BioRad | iMark | Used for lysate protein concentration readout |
| Microsoft Powerpoint | Microsoft, USA | PowerPoint2016 | Used to edit western blotting images |
| Molecular Weight Marker | BioRad | 1610373 | Used for western blotting |
| N-ethylmaleimide | Thermo Fisher Scientific | 23030 | Used for cell culture experiment |
| Nitrocellulose membrane | Fisher Scientific | 45004091 | Used for western blotting |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Used for cell culture |
| pH Meter | Mettler Toledo | Seven compact s210 | Used to monitor pH of buffer solutions |
| Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | Used as component of lysis buffer |
| Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for cell culture |
| PKCδ pThr505 | Cell Signalling technology | 9374 | Used as primary antibody for western blotting |
| Sepharose Protein G | Generon | PG50-00-0002 | Used for immunoprecipitation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used as component of wash buffer |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Used to prepare TBS-T buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L5750 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | Used as component of lysis buffer |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | Used for cell culture |
| sodium-β-glycerophosphate | Merck UK | G9422 | Used as component of lysis buffer |
| Staurosporine (from Streptomyces sp.) | Scientific Laboratory Supplies, UK | S4400-1MG | Used for cell culture experiment |
| Sucrose | Scientifc Laboratory Supplies | S0389 | Used as component of lysis buffer |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T7024 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Transfer Chamber | BioRad | 1658005EDU | Used in western blotting to transfer protein on membrane |
| Tris | Sigma-Aldrich | T6066 | Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used as component of lysis buffer |
| Trypsin-EDTA Solution | Merck Life Sciences UK | T4049 | Used for cell culture |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P3179 | Used as make TBS-T buffer |
| Vacuum pump | Charles Austen | Dymax 5 | Used for cell culture |
| Vortex | Scientific Industries | K-550-GE | Used in sample preparation |
| Vortex mixer | Scientific Industries Ltd | Vortex-Genie K-550-GE | Used of mixing resolved sample |
| Water bath | Grant Instruments Ltd. (JB Academy) | JBA5 | Used to incubate solutions |
References
- de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
- Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
- Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
- Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
- Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
- Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
- Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
- Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
- Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
- Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
- Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
- AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
- Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
- Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
- Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
- Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
- Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
- Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
- Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
- Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
- Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
- Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
- Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
- Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
- Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
- Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
- Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
- Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
- Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
- Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
- Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
- Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
- Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
- Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
- Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
- Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
- Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
- Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
- Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
- Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
- Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
- Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).
