Summary

Oprettelse af et knæled-på-en-chip til modellering af ledsygdomme og test af lægemidler

Published: January 27, 2023
doi:

Summary

Vi leverer detaljerede metoder til generering af fire typer væv fra humane mesenkymale stamceller, som bruges til at rekapitulere brusk, knogle, fedtpude og synovium i det menneskelige knæled. Disse fire væv er integreret i en tilpasset bioreaktor og forbundet via mikrofluidik, hvilket genererer et knæled-på-en-chip.

Abstract

Den høje forekomst af invaliderende ledsygdomme som slidgigt (OA) udgør en høj socioøkonomisk byrde. I øjeblikket er de tilgængelige lægemidler, der er målrettet mod ledlidelser, for det meste palliative. Det uopfyldte behov for effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD’er) skyldes primært manglen på passende modeller til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og testning af potentielle DMOAD’er. Heri beskriver vi etableringen af et miniature synovialt led-efterlignende mikrofysiologisk system (miniJoint) bestående af fedt-, fibrøse og osteokondrale vævskomponenter afledt af humane mesenkymale stamceller (MSC’er). For at opnå de tredimensionelle (3D) mikrovæv blev MSC’er indkapslet i fototværbindende methacryleret gelatine før eller efter differentiering. De cellebelastede vævskonstruktioner blev derefter integreret i en 3D-printet bioreaktor, der dannede miniJoint. Separate strømme af osteogene, fibrogene og adipogene medier blev introduceret for at opretholde de respektive vævsfænotyper. En almindeligt delt strøm blev perfuseret gennem brusk, synoviale og fedtvæv for at muliggøre vævskrydstale. Dette strømningsmønster tillader induktion af forstyrrelser i en eller flere af vævskomponenterne til mekanistiske undersøgelser. Desuden kan potentielle DMOAD’er testes via enten “systemisk administration” gennem alle mediestrømme eller “intraartikulær administration” ved kun at tilføje lægemidlerne til det delte “synovialvæske”-simulerende flow. Således kan miniJoint fungere som en alsidig in vitro-platform til effektivt at studere sygdomsmekanismer og teste lægemidler i personlig medicin.

Introduction

Fælles sygdomme som slidgigt (OA) er meget udbredt og invaliderende og repræsenterer en førende årsag til handicap på verdensplan1. Det anslås, at OA alene i USA påvirker 27 millioner patienter og forekommer hos 12,1% af voksne i alderen 60 år og derover2. Desværre er de fleste lægemidler, der i øjeblikket bruges til at håndtere ledsygdomme, palliative, og der findes ingen effektive sygdomsmodificerende OA-lægemidler (DMOAD’er)3. Dette uopfyldte medicinske behov skyldes primært, at der ikke findes en effektiv model til undersøgelse af sygdomsmekanismerne og udvikling af potentielle DMOAD’er. Den konventionelle todimensionelle (2D) cellekultur afspejler ikke ledvævets 3D-natur, og kulturen af vævseksplanter hindres ofte af betydelig celledød og replikerer normalt ikke de dynamiske vævsforbindelser4. Derudover reducerer genetiske og anatomiske forskelle signifikant den fysiologiske relevans af dyremodeller4.

Organ-on-chips (OoC’er) eller mikrofysiologiske systemer er et lovende forskningsfelt i grænsefladen mellem teknik, biologi og medicin. Disse in vitro-platforme er minimale funktionelle enheder, der replikerer definerede sunde eller patologiske træk ved deres in vivo-modstykker 5. Desuden kan disse miniaturiserede systemer være vært for forskellige celler og matricer og simulere de biofysiske og biokemiske interaktioner mellem forskellige væv. Derfor lover et mikrofysiologisk system, der trofast kan rekapitulere det oprindelige synoviale led, at tilbyde en effektiv platform til modellering af ledsygdomme og udvikling af potentielle DMOAD’er.

Humane mesenkymale stamceller (MSC’er) kan isoleres fra mange væv i hele kroppen og differentieres til osteogene, kondrogene og adipogene slægter6. MSC’er er med succes blevet brugt til at konstruere forskellige væv, herunder knogle-, brusk- og fedtvæv6, hvilket betyder, at de repræsenterer en lovende cellekilde til konstruktion af knæleddets vævskomponenter. Vi har for nylig udviklet et mikrofysiologisk miniaturesystem, der efterligner leddene, kaldet miniJoint, der omfatter MSC-afledt knogle-, brusk-, fibrøst- og fedtvæv7. Især muliggør det nye design vævskrydstale ved mikrofluidisk strømning eller gennemtrængning (figur 1). Heri præsenterer vi protokollerne for fremstilling af chipkomponenterne, konstruktion af vævskomponenterne, kulturen af det manipulerede væv i chippen og indsamling af væv til downstream-analyser.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over miniJoint-chippen, der viser arrangementet af de forskellige vævskomponenter og mediestrømme. OC = osteokondralt væv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Følgende protokol følger de etiske retningslinjer fra University of Pittsburgh og den menneskelige forskningsetiske komité ved University of Pittsburgh. Oplysninger om de materialer, der anvendes i denne undersøgelse, er anført i materialetabellen. 1. Fremstilling af 3D-printede bioreaktorer Brug en computersoftware til at designe osteochondral (figur 2A) og miniJoint bioreaktorer (figur 2B</str…

Representative Results

Alle væv i miniJoint blev indsamlet for at analysere deres fænotyper efter 28 dages kultur i miniJoint (figur 4A). Dette er blevet beskrevet i vores tidligere publikation7. Gennem brug af RT-qPCR, immunfarvning og histologisk farvning blev det bekræftet, at de vævsspecifikke fænotyper var godt vedligeholdt for de enkelte mikrovæv (figur 4). For eksempel udtrykte den osseøse komponent i OC-mikrovævene (O…

Discussion

I denne artikel præsenterer vi en protokol til oprettelse af et knæled-på-en-chip-system, hvor knogler, brusk, fedtvæv og synoviumlignende væv dannes fra MSC’er og dyrkes sammen i en tilpasset bioreaktor. Dette multikomponent, humane celleafledte system med plug-and-play-funktioner repræsenterer et nyt værktøj til at studere patogenesen af ledsygdomme og udvikle lægemidler.

I betragtning af at forskellige væv favoriserer specifikke kulturmedier, er det afgørende at tilvejebringe de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev primært støttet af finansiering fra National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Derudover takker vi Dr. Paul Manner (University of Washington) for at levere de humane vævsprøver og Dr. Jian Tan for deres hjælp med at isolere MSC’erne og skabe cellepuljen.

Materials

3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma -Aldrich I17018-1G
6 well non-tissue culture plate Corning Falcon® Plates 351146
24 well non-tissue culture plate Corning Falcon® Plates 351147
30 mL syringes BD Syringe Luer Lock Cascade Health 302832
Alcian blue stain EK Industries 1198 1% w/v, pH 1.0
Advanced DMEM Gibco 12491-015
αMEM Gibco 12571-063
Antibiotic-antimycotic Gibco 15240-062
Biopsy punch Integra Miltex 12-460-407
BODIPY® fluorophore Molecular Probes
Bone morphogenic protein 7 (BMP7) Peprotech
Curved forceps Fisher Brand 16100110
DMEM Gibco 11995-065 Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Dexmethasome Sigma -Aldrich 02-05-2002
E-Shell 450 photopolymer in EnvisionTec RES-01-4022
Fetal Bovine Serum Gemini-Bio Products 900-208
GlutaMAX Gibco 3505-061
gelatin from bovine skin Hyclone 1003372809
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma -Aldrich SH30588.02
indomethacin Sigma -Aldrich I7378-56
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS) Gibco 51500-056
interleukin 1β Peprotech 200-01B
Leur-loc connectors Cole-Parmer Instruments 45508-50
L-proline Sigma -Aldrich 115388-93-7
β-glycerophosphate Sigma -Aldrich 1003129352
Medium bags KiYATEC FC045
Methacrylic Anhydride Sigma -Aldrich 102378580
Phosphate buffered Saline Corning 21-040-CM
Pointed forceps Fisher Brand 12000122
Silicon mold McMaster-Carr RC00114P
Silicon o-rings McMaster-Carr ZMCCs1X5 1mm x 5mm
SolidWorks Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France
Surgical Blades Integra Miltex 4-122
Syringe pump Lagato210P, KD Scientific Z569631 10 syringe racks
T-182 tissue culture flasks Fisher Brand FB012939
Tissue Culture Dish 150 mm Fisher Brand FB012925
Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3) Peprotech 100-36E
Trypsin Gibco 25200-056
UV Flashlight KBS KB70109 395 nm
Vida Desktop 3D Printer EnvisionTec
Vitamin D3 Sigma -Aldrich 32222-06-3 1,25-dihydroxyvitamin D3

References

  1. Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
  2. Lawrence, R. C., et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II. Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).
  3. Makarczyk, M. J., et al. Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs. Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).
  4. He, Y., et al. Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models. Biology. 9 (8), 194 (2020).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  6. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  7. Li, Z., et al. Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing. Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).
  8. Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
  9. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  10. Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β. Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).
  11. Yin, B., et al. Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration. International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).
  12. Lin, Z., et al. Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).
  13. Atukorala, I., et al. Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).
  14. Occhetta, P., et al. Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).
  15. He, C., et al. Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models. Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).
  16. Elsissy, J. G., et al. Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review. JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).
  17. Romero-Lopez, M., et al. Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model. Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).

Play Video

Cite This Article
Makarcyzk, M. J., Li, Z. A., Yu, I., Yagi, H., Zhang, X., Yocum, L., Li, E., Fritch, M. R., Gao, Q., Bunnell, B. A., Goodman, S. B., Tuan, R. S., Alexander, P. G., Lin, H. Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs. J. Vis. Exp. (191), e64186, doi:10.3791/64186 (2023).

View Video