Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

باستخدام التثقيب الكهربائي للبويضات ، ابتكرنا طريقة لنقل الأذن الداخلية السمعية ونواة القوقعة بشكل انتقائي في أجنة الدجاج لتحقيق ضربة قاضية خاصة بمجموعة الخلايا لبروتين التخلف العقلي X الهش خلال فترات منفصلة من تجميع الدائرة.

Abstract

بروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP) هو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال ينظم ترجمة البروتين المحلي. يؤدي فقدان FMRP أو اختلاله الوظيفي إلى أنشطة عصبية ومشبكية شاذة في متلازمة X الهشة (FXS) ، والتي تتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية ومشاكل التواصل الاجتماعي. أجريت دراسات على وظيفة FMRP والتسبب في FXS في المقام الأول مع Fmr1 (الجين المشفر FMRP) بالضربة القاضية في الحيوانات المعدلة وراثيا. هنا نبلغ عن طريقة في الجسم الحي لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP خلال فترة تجميع الدائرة والتكوين المشبكي باستخدام أجنة الدجاج. تستخدم هذه الطريقة التثقيب الكهربائي الخاص بالمرحلة والموقع والاتجاه لنظام ناقل محفز للدواء يحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير Fmr1 (shRNA) ومراسل EGFP. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP في العقدة السمعية (AG) وفي أحد أهداف جذع الدماغ ، النواة المغنطيسية (NM) ، وبالتالي توفير معالجة خاصة بالمكونات داخل دائرة AG-NM. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نمط الفسيفساء للنقل بضوابط داخل الحيوان ومقارنات الخلايا العصبية / الألياف المجاورة لتعزيز الموثوقية والحساسية في تحليل البيانات. يوفر نظام الناقل المحرض تحكما زمنيا في بداية تحرير الجينات لتقليل التأثيرات التنموية المتراكمة. يوفر الجمع بين هذه الاستراتيجيات أداة مبتكرة لتشريح وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP في تطوير المشبكي والدوائر.

Introduction

متلازمة X الهشة (FXS) هي اضطراب في النمو العصبي يتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية وسلوكيات التوحد. في معظم الحالات ، يحدث FXS بسبب فقدان عالمي لبروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP ؛ مشفر بواسطة جين Fmr1) بدءا من المراحل الجنينية المبكرة1. FMRP هو بروتين ملزم للحمض النووي الريبي يتم التعبير عنه عادة في معظم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ ، وكذلك في الأعضاء الحسية2،3،4. في أدمغة الثدييات ، من المحتمل أن يرتبط FMRP بمئات من mRNAs التي تشفر البروتينات المهمة لمختلف الأنشطة العصبية5. أظهرت الدراسات التي أجريت على الضربة القاضية Fmr1 التقليدية أن تعبير FMRP مهم بشكل خاص لتجميع ومرونة النقل العصبي المشبكي6. أظهرت العديد من نماذج الضربة القاضية الشرطية والفسيفسائية كذلك أن إجراءات وإشارات FMRP تختلف عبر مناطق الدماغ وأنواع الخلايا والمواقع المشبكية خلال العديد من الأحداث التنموية بما في ذلك الإسقاط المحوري ، والزخرفة الشجيرية ، واللدونة المشبكية7،8،9،10،11،12،13،14 . تمت دراسة الوظيفة الحادة ل FMRP في تنظيم الانتقال المشبكي عن طريق التوصيل داخل الخلايا للأجسام المضادة FMRP المثبطة أو FMRP نفسها في شرائح الدماغ أو الخلايا العصبية المستزرعة15،16،17،18. ومع ذلك ، لا توفر هذه الأساليب القدرة على تتبع العواقب الناجمة عن سوء التعبير عن FMRP أثناء التطوير. وبالتالي ، فإن تطوير طرق في الجسم الحي للتحقيق في وظائف الخلايا المستقلة ل FMRP في حاجة ماسة ، ومن المتوقع أن يساعد في تحديد ما إذا كانت الحالات الشاذة المبلغ عنها في مرضى FXS هي عواقب مباشرة لفقدان FMRP في الخلايا العصبية والدوائر المرتبطة ، أو عواقب ثانوية مشتقة من التغييرات على مستوى الشبكة أثناء التطوير19.

يقدم جذع الدماغ السمعي لأجنة الدجاج نموذجا مفيدا بشكل فريد للتحليلات الوظيفية المتعمقة لتنظيم FMRP في تطور الدائرة والمشبك. ساهمت سهولة الوصول إلى أدمغة الدجاج الجنينية وتقنية التثقيب الكهربائي للبيض الراسخة للتلاعب الجيني بشكل كبير في فهمنا لنمو الدماغ في المراحل الجنينية المبكرة. في دراسة نشرت مؤخرا ، تم دمج هذه التقنية مع الأدوات الجزيئية المتقدمة التي تسمح بالتحكم الزمني في التعبير الخاطئFMRP 20,21. هنا ، يتم تطوير المنهجية للحث على التلاعب الانتقائي للخلايا العصبية قبل المشبكية وما بعد المشبكية بشكل منفصل. تم تطوير هذه الطريقة في دائرة جذع الدماغ السمعي. يتم الكشف عن الإشارة الصوتية بواسطة خلايا الشعر في الأذن الداخلية السمعية ثم يتم نقلها إلى العقدة السمعية (AG ؛ وتسمى أيضا العقدة الحلزونية في الثدييات). تقوم الخلايا العصبية ثنائية القطب في AG بتعصيب خلايا الشعر بعملياتها المحيطية وترسل بدورها إسقاطا مركزيا (العصب السمعي) إلى جذع الدماغ حيث تنتهي في نواتين قوقعيتين أساسيتين ، النواة المغنطيسية (NM) والنواة الزاوية (NA). يمكن مقارنة الخلايا العصبية في NM هيكليا ووظيفيا بالخلايا الكثيفة الكروية لنواة القوقعة الأمامية البطنية للثدييات. داخل NM ، تتشابك الألياف العصبية السمعية (ANFs) على سوماتا الخلايا العصبية NM عبر المصباح النهائي الكبير للمحطات الطرفية22. أثناء التطور ، تنشأ الخلايا العصبية NM من المعينات 5 و 6 (r5 / 6) في الدماغ الخلفي23 ، بينما يتم اشتقاق الخلايا العصبية AG من الخلايا العصبية المقيمة في كيس الأذن24. هنا ، نصف الإجراء الخاص بضرب تعبير FMRP بشكل انتقائي في الخلايا العصبية AG قبل المشبكية وفي الخلايا العصبية NM بعد المشبكي بشكل منفصل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم التعامل مع البيض وأجنة الدجاج بعناية واحترام وفقا لبروتوكولات الحيوانات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة جينان.

1. إعداد البيض والبلازميد

  1. تحضير البيض
    1. احصل على بيض الدجاج الطازج المخصب (جالوس غالوس) من جامعة جنوب الصين الزراعية وخزنه في درجة حرارة 16 درجة مئوية قبل الحضانة. للحصول على الجدوى المثلى ، ضع كل البيض للحضانة في غضون أسبوع من الوصول.
    2. ضع البيض أفقيا واحتضانه عند 38 درجة مئوية لمدة 46-48 ساعة حتى مرحلة هامبرغر وهاملتون (HH) 1225 لنقل الأنبوب العصبي ، أو لمدة 54-56 ساعة حتى HH13 لنقل الكيسة الأذنية. نظرا لأن القطب الحيواني للبيضة أخف من القطب النباتي ، فإن الوضع الأفقي يضع الجنين في الجزء العلوي من البويضة لسهولة التلاعب به. توخ الحذر للحفاظ على البيضة أفقية في هذه الخطوة وجميع الخطوات التالية.
    3. يظهر موقع الجنين كمنطقة مظلمة على قشر البيض عند صب الضوء من قاع البويضة باستخدام مصباح يدوي. في مراحل HH المرغوبة ، استخدم طريقة المصباح اليدوي هذه لتحديد موقع الجنين على قشر البيض بقلم رصاص.
    4. امسح البيض بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول. حفر حفرة في نهاية مدببة من البيض باستخدام طرف المقص وإزالة 2 مل من الألبومين مع حقنة إبرة 18 غرام. تأكد من أن الفتحة كبيرة بما يكفي للسماح بإدخال الإبرة. امسح أي ألبومين متسرب بالشاش وأغلق الفتحة بشريط شفاف.
    5. لتقليل التشققات ومنع سقوط حطام القشرة أثناء النوافذ ، قم بتغطية الجزء العلوي من البيض بشريط شفاف ، مع التركيز على المنطقة المظلمة التي تحمل علامة قلم رصاص.
  2. استخراج الحمض النووي البلازميد
    1. استنساخ الدجاج Fmr1 shRNA باستخدام نظام Tet-on القائم على الترانسبوزون كما هو موضح سابقا20. يحتوي هذا النظام على ثلاثة بلازميدات: pCAGGS-T2TP و pT2K-CAGGS-rtTA-M2 و pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA ، مما يوفر نظام ناقل قابل للحث على الدواء يتم من خلاله إسكات تعبير Fmr1 shRNA و EGFP بعد النقل ويمكن تشغيله عن طريق تحريض الدوكسيسيكلين (Dox).
      ملاحظة: هذه البلازميدات غير متوفرة حاليا في مستودع. يوافق المؤلفون على توفير البلازميدات بناء على طلب معقول.
    2. استخرج الحمض النووي للبلازميد باستخدام مجموعة تحضير خالية من السموم الداخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وترسب بإضافة 1/15 حجم 7.5 م أسيتات الصوديوم وحجم واحد من الأيزوبروبانول بنسبة 100٪.
    3. ترسيب البلازميدات عند -20 درجة مئوية طوال الليل وأجهزة الطرد المركزي عند 13000 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإذابة الحبيبات باستخدام المخزن المؤقت Tris-EDTA المتوفر في المجموعة إلى تركيز نهائي من 4-5 ميكروغرام / ميكرولتر. يمكن تخزين البلازميدات عند -20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا دون تقليل كفاءة النقل.
    4. في يوم التثقيب الكهربائي ، قم بخلط 2 ميكرولتر من كل بلازميد في أنبوب طرد مركزي معقم باستخدام طرف ماصة. حجم 6 ميكرولتر الناتج من خليط البلازميد يكفي لكهرباء ثلاثين بيضة. للمساعدة في تصور البلازميد أثناء التثقيب الكهربائي ، أضف 1 ميكرولتر من 0.1٪ أخضر سريع (محضر في ddH2O معقم) لكل 6 ميكرولتر من خليط الحمض النووي26 ، مما يحول خليط البلازميد إلى اللون الأزرق.

2. في التثقيب الكهربائي للبيض

  1. نافذة البيض وتحديد الأجنة
    1. في يوم التثقيب الكهربائي ، أخرج البيض من الحاضنة ، عشرات البيض في وقت واحد. إن إبقاء البيض خارج حاضنته لأكثر من 1 ساعة يقدم اختلافات في النمو ويقلل من القدرة على البقاء.
    2. امسح جميع أدوات الجراحة بشاش يحتوي على 75٪ إيثانول.
    3. ضع كل بيضة في حامل رغوة حسب الطلب. امسح المنطقة المغطاة بالشريط بنسبة 75٪ من الإيثانول واقطع نافذة (1-2 سم2) حول محيط علامة القلم الرصاص باستخدام مقص صغير (الشكل 1 أ). عند القطع ، أمسك المقص بشكل مسطح لتجنب إتلاف الجنين تحته.
    4. ضع البويضة ذات النوافذ تحت مجهر مجسم بعدسة 10x وتكبير 2x وحدد الجنين. اضبط زاوية وسطوع مصدر الضوء للحصول على تصور أفضل.
      ملاحظة: يتطلب الأمر ممارسة وخبرة لتصور الجنين وتحديد الأنبوب العصبي في هذه المرحلة.
      1. للمبتدئين ، استخدم حقن الحبر الاختياري التالي لتسهيل التعرف على الجنين. تحضير محلول حبر هندي 10٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.01 متر (PBS) والأوتوكلاف مسبقا. املأ حقنة سعة 1 مل بمحلول الحبر ثم قم بتركيب إبرة 27G. ثني الإبرة بزاوية 45 درجة بالملقط.
      2. تحت المجهر ، كزة بعناية من حافة المنطقة opaca وأدخل الإبرة تحت الجنين. حقن ~ 50 ميكرولتر من الحبر ، والتي سوف تنتشر تحت المنطقة pellucida لتصور الجنين. سيشكل الحبر خلفية داكنة لتصور واضح للجنين.
        ملاحظة: طرد الهواء من المحقنة قبل إدخالها وحقنها. عندما تكون ماهرا في التصور ، تجنب خطوة حقن الحبر لأنها تقلل من معدل البقاء على قيد الحياة.
  2. حقن الأنبوب العصبي والتثقيب الكهربائي
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في HH12 لنقل الخلايا العصبية NM في جذع الدماغ.
    1. اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية (~ 1 مم في القطر وطول 100 مم) إلى ماصات باستخدام مجتذب ماصة. تحت مجهر تشريح ، افتح بعناية طرف الإبرة الشعرية إلى قطر 10-20 ميكرومتر بالملقط. قم بتخزين الماصات (عادة 5-10 في وقت واحد) في صندوق تخزين حتى الاستخدام.
    2. املأ ماصة شعرية ب 0.5-1 ميكرولتر من خليط البلازميد عن طريق تطبيق ضغط سلبي من خلال أنبوب مطاطي في نهاية الماصة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق حقنة أو مضخة هواء.
    3. ضع البويضة تحت المجهر بحيث يكون الجنين موجها رأسيا مع الذيل بالقرب منك (أو أفقيا لحقن الماصات الشعرية باستخدام مناور ثلاثي المحاور). أمسك الماصة الشعرية بيد واحدة أو باستخدام مناور ثلاثي المحاور وقم بقيادة طرف الماصة إلى r5 / 6 في اتجاه من الذيل إلى الرأس.
      ملاحظة: منطقة الدماغ الخلفي الأمامية هي r1 وكل انتفاخ لاحق على طول الأنبوب العصبي هو معين فردي. R5 / 6 في نفس المستوى الأمامي الخلفي مثل كيس الأذن ، وهو هيكل يشبه الكوب يمكن التعرف عليه بسهولة (الشكل 1B-C).
    4. قم بوخز الطرف برفق عبر الغشاء الزجاجي إلى الأنبوب العصبي الظهري ثم اسحب الماصة قليلا بحيث يكون الطرف في تجويف الأنبوب العصبي. حقن خليط البلازميد عن طريق الضغط على الهواء حتى ينتشر البلازميد الملون بالكامل في r5 / 6 ويمتد إلى r3 و r4.
      ملاحظة: ليس من الضروري عمل فتحة على غشاء vitelline للحقن.
    5. تحقق من نجاح الحقن ، والذي يتحقق عندما ينتشر محلول البلازميد الأزرق بسرعة أسفل الأنبوب العصبي دون تسرب (الشكل 1B-C). عندما يحدث تسرب ، يتلاشى اللون الأزرق بسرعة.
    6. بعد الحقن مباشرة ، ضع قطبا كهربائيا ثنائي القطب من البلاتين على جانبي الأنبوب العصبي (الشكل 1 د). قم بتوصيل نبضتين بطول 12 فولت و 50 مللي ثانية باستخدام جهاز كهربائي. راقب فقاعات الهواء في نهايات القطب ثنائي القطب ، مع وجود المزيد على الجانب السلبي.
    7. تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الملون إلى نسيج الأنبوب العصبي بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية.
    8. قم بتغطية النافذة على قشر البيض بقطعة من الفيلم الشفاف الذي تم تقطيعه مسبقا إلى 2 في مربعات ورشه بنسبة 75٪ من الإيثانول. ضع البيضة مرة أخرى في حاضنتها.
    9. نظف القطب ثنائي القطب عن طريق توصيل 10-20 نبضة بطول 12 فولت و 50 مللي ثانية في محلول ملحي قبل الانتقال إلى البويضة التالية.
  3. حقن كيس الأذن والتثقيب الكهربائي
    ملاحظة: يتم تنفيذ هذا الإجراء في HH13 لنقل خلايا الشعر والخلايا العصبية AG في الأذن الداخلية.
    1. في HH13 (وهو ~ اليوم الجنيني 2.5) ، استدار الجنين بحيث يواجه الجانب الأيمن من الرأس لأعلى. تحت المجهر ، ضع البويضة بحيث يكون الجنين عموديا ، مع وجود الذيل بالقرب منك. امسك الماصة الشعرية وكز الكيسة الأذنية اليمنى برفق في اتجاه ظهري جانبي (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، تظهر كيس الأذن كهيكل دائري صغير في الجزء العلوي من الجسم في نفس المستوى الأمامي الخلفي مثل r5 / 6.
    2. حقن خليط البلازميد بضغط الهواء حتى تمتلئ كيس الأذن بمحلول أزرق27. تحقق من نجاح الحقن، والذي يتحقق عندما يكون خليط البلازميد الأزرق محصورا داخل الكيسة الأذنية ولا يتسرب.
    3. بعد الحقن مباشرة ، ضع القطب ثنائي القطب على كيس الأذن كما هو موضح في الشكل 2 ب. ضع الجوانب الإيجابية والسلبية الأمامية والخلفية لكيس الأذن ، على التوالي. قم بتوصيل نبضتين بطول 12 فولت و 50 مللي ثانية باستخدام جهاز التثقيب الكهربائي.
    4. تحقق من التثقيب الكهربائي الناجح ، والذي يتحقق عندما يدخل خليط البلازميد الأزرق إلى أنسجة كيس الأذن بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بإزالة القطب ثنائي القطب بعناية. غطي النافذة على قشر البيض بفيلم شفاف وأعد البويضة إلى الحاضنة.

3. إدارة Dox لبدء وصيانة نسخ البلازميد

  1. تحضير محلول Dox
    1. قم بقياس 100 مجم من مسحوق Dox تحت غطاء كيميائي وقم بإذابته في 100 مل من PBS المعقم لعمل 1 مجم / مل من محلول العمل. قم بتصفية المحلول بفلتر 0.22 ميكرومتر وقم بتخزين 1 مل من القسمة عند -20 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء20,28.
  2. إدارة دوكس
    1. لتحرير الجينات كاملة القوة ، في 24 ساعة قبل العمر المطلوب ، قم بإذابة حصص Dox على الجليد. قم بإسقاط 50 ميكرولتر من Dox مباشرة على الغشاء المشيمي للبيضة باستخدام حقنة تخترق الفيلم الشفاف. أغلق فتحة الإبرة بغشاء شفاف أو شريط لاصق بعد الحقن.
    2. للحفاظ على تأثير ضربة قاضية ، قم بتطبيق Dox كل يومين حتى حصاد الأنسجة في مرحلة النمو المطلوبة.

4. تشريح الأنسجة وتقسيمها

  1. جذع الدماغ
    1. بالنسبة للأجنة في المرحلة الجنينية 3 (E3) و E6 ، افتح قشر البيض وقطع الغشاء المرتبط بالمقص. أخرج الجنين بالملعقة واغمره في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول فوسفات 0.1 متر.
    2. بالنسبة لأجنة E9 ، افتح قشر البيض ، واقطع رأس الجنين بالمقص ، وانقل الرأس إلى صفيحة ذات قاع سيليكون مملوءة ب PBS. دبوس الرأس لأسفل من خلال المدارات وقطع الجزء العلوي من الجمجمة بعيدا. ضع الملقط بعناية تحت الدماغ من كلا الجانبين وارفع الدماغ بالكامل من الجمجمة بأكتاف الملقط. اغمر الدماغ في 4٪ PFA.
    3. بالنسبة للأجنة E15 و E19 ، افتح قشر البيض ، واقطع رأس الجنين بالمقص ، وضع الرأس على طبق ذو قاع سيليكون مملوء ب PBS. قطع الجلد على الجزء العلوي من الرأس لفضح الجمجمة.
    4. شق الجمجمة عموديا باستخدام ماكينة حلاقة لفصل الدماغ الأمامي والدماغ الذيلي. اغمر الكتلة الذيلية في برنامج تلفزيوني ، وأزل الجزء العلوي من الجمجمة ، ثم أخرج الدماغ من الجمجمة.
    5. ثبت الدماغ لأسفل من خلال الفص البصري وافصل المخيخ وجذع الدماغ. احرص على عدم إتلاف جذع الدماغ السمعي ، الذي يقع أسفل المخيخ مباشرة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الجافية من جذع الدماغ ثم اغمرها في 4٪ PFA.
    6. احتفظ بالأجنة وأنسجة المخ في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل باستثناء جذع الدماغ E19 ، والذي يجب أن يبقى تحت نفس الحالة لمدة 24 ساعة.
    7. بعد التثبيت ، قم بتجفيف الأنسجة في PBS التي تحتوي على 30٪ سكروز حتى تستقر ، والتي تستغرق عادة 1-3 أيام ، اعتمادا على العمر.
    8. قسم جذع الدماغ (E15 و E19) عند 30 ميكرومتر في المستوى الإكليلي باستخدام ميكروتوم منزلق. اجمع الأقسام في برنامج تلفزيوني واحفظها في 4 درجات مئوية قبل تلطيخ المناعة.
    9. بالنسبة للأجنة E3 و E6 وجذع الدماغ E9 ، القسم عند 50 ميكرومتر بشكل مستعرض. اجمع الأقسام في PBS وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية. قم بتركيب الأقسام على شرائح المجهر المغلفة بالجيلاتين قبل التلطيخ المناعي. جمع أقسام أكثر سمكا لهذه الأعمار يسهل التعامل مع الأنسجة.
  2. القناة السمعية
    1. بعد إزالة الدماغ من أجنة E9 و E15 و E19 ، يمكن التعرف بسهولة على القناة السمعية ، المضمنة في العظم الصدغي ، تحت الجمجمة ، ويمكن فصل العظم الصدغي بسهولة عن الجمجمة المحيطة. بالنسبة لأجنة E9 ، ثبت العظم الصدغي بالكامل في 4٪ PFA. بالنسبة للأجنة الأكبر سنا ، قم بإزالة البنية العظمية للعظم الصدغي لعزل القناة السمعية وإصلاح القناة السمعية في 4٪ PFA.
    2. احتفظ بجميع العظام الصدغية والقنوات السمعية في 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية طوال الليل قبل تضمين الأنسجة.
    3. أداء تضمين الأنسجة كما هو موضح. تحضير حل التضمين على النحو التالي: نقع الجيلاتين 10 ٪ (من الجلد البقري) في الماء البارد حتى تنتفخ حبيبات الجيلاتين وتستقر (حوالي 30 دقيقة). سخني الخليط إلى ~ 50 درجة مئوية لإذابة الجيلاتين وإضافة 20٪ سكروز إلى محلول الجيلاتين وحركه حتى يذوب. قم بتخزين محلول الجيلاتين والسكروز في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.
    4. للاستخدام، قم بتسخين محلول الجيلاتين والسكروز عند 37 درجة مئوية. انقع العظام الصدغية / القنوات السمعية في محلول الجيلاتين والسكروز الدافئ على طبق من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية حتى تستقر ، عادة 30-60 دقيقة.
    5. قم بتبطين قاع آبار صفيحة مكونة من 12 بئرا بشريط من الفيلم الشفاف. أضف طبقة من محلول الجيلاتين والسكروز الدافئ وانتظر حتى تصلب. انقل العظم الصدغي / القناة السمعية إلى كل بئر.
    6. زرع الأنسجة مع طبقة ثانية من محلول الجيلاتين والسكروز الدافئ. اضبط موضع الأنسجة بحيث تكون في وسط الجل وتكون القناة السمعية موجهة أفقيا. انقل الطبق بحذر إلى ثلاجة 4 درجات مئوية وانتظر حتى يصبح الجل متماسكا.
    7. اسحب شريط الفيلم الشفاف لتحريك كتلة الأنسجة الهلامية خارج البئر. تقليم هلام إضافي في كتلة مربعة وقطع زاوية من كتلة لتحديد الاتجاه. لف كتلة الجيلاتين بقطعة من ورق القصدير ، وقم بتجميدها على الثلج الجاف ، ثم خزنها في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمها.
    8. قسم الكتلة عند 20 ميكرومتر على طول خط طول القناة السمعية باستخدام cryostat. قم بتركيب الأقسام مباشرة على شرائح المجهر المغلفة بالجيلاتين. قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة -80 درجة مئوية قبل تلطيخ المناعة.
    9. قبل التلوين المناعي ، اغمر الشرائح في PBS الدافئ مسبقا (45 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لإذابة الجيلاتين ، ثم اغسل الشرائح 3x مع PBS بدرجة حرارة الغرفة لإزالة الجيلاتين المتبقي.

5. التلوين المناعي والتصوير المجهري

ملاحظة: يتم إجراء نوعين من التلوين المناعي اعتمادا على ما إذا كانت الأقسام مثبتة على شرائح أو تطفو بحرية في برنامج تلفزيوني.

  1. تلطيخ المناعة على الشرائح
    1. اغسل الشرائح 3x لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام PBS. ضع دائرة حول المنطقة التي تحتوي على الأقسام بقلم زيت لمنع تسرب السائل أثناء التلطيخ. قم بتغطية الأقسام بمحلول مانع يحتوي على 5٪ مصل ماعز طبيعي في PBS واحتضانه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. تمييع الأجسام المضادة الأولية (للتركيز النهائي المستخدم الرجوع إلى جدول المواد) في PBS التي تحتوي على 0.3٪ TritonX-100 و 5٪ مصل الماعز الطبيعي. أزل محلول الحجب ثم قم بتغطية الأقسام بمحلول الجسم المضاد الأساسي. احتضان الشرائح عند 4 درجات مئوية طوال الليل في صندوق يحتوي على طبقة من الماء المقطر في الأسفل.
    3. شطف الشرائح 3x لمدة 10 دقائق مع PBS. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخففة في 1: 500 في PBS التي تحتوي على 0.3 ٪ TritonX-100 على الشرائح. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات ، محمية من الضوء.
    4. اغسل الشرائح 3x باستخدام PBS. قم بإسقاط قطرتين من وسيط التثبيت برفق على الشرائح وقم بتغطية الأقسام بأغطية أغطية. احرص على عدم توليد فقاعات هواء بين الغطاء والشريحة.
  2. التلوين المناعي للأجنة الكاملة والأقسام العائمة الحرة
    1. اغسل الأجنة / الأقسام باستخدام PBS 3x لمدة 10 دقائق لكل منها في طبق جيد. تمييع الأجسام المضادة الأولية في PBS التي تحتوي على 0.3٪ TritonX-100 و 5٪ مصل الماعز الطبيعي في أنابيب الطرد المركزي. انقل كل جنين / قسم إلى أنبوب بخطاف زجاجي واحتضانه على شاكر عند 60 دورة في الدقيقة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    2. اغسل الأجنة / الأقسام 3x باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في طبق جيد. انقل كل جنين / قسم إلى أنبوب طرد مركزي مظلم مملوء بمحلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات على شاكر.
    3. اغسل الأجنة / الأقسام 3x باستخدام PBS في طبق جيد. استخدم فرشاة لتركيب الأقسام على شرائح مجهر مغلفة بالجيلاتين في طبق 15 سم يحتوي على PBS. بعد تجفيف الشرائح قليلا (~ 5 دقائق) ، ضع قطرتين من وسط التثبيت وضع غطاء غطاء. احرص على عدم توليد فقاعات هواء بين الغطاء والشريحة. الحفاظ على الأنسجة جبل كامل في PBS للتصوير.
  3. التصوير
    1. تخيل أنسجة التركيب بأكملها في PBS في طبق به قاع سيليكون يحتوي على مسحوق الكربون ، والذي يوفر خلفية سوداء. التقاط الصور ومعالجتها باستخدام حزمة برامج أوليمبوس لمعالجة الصور التجارية، كما هو موضح سابقا29.
    2. قم بتصوير الأقسام الموجودة على الشرائح باستخدام مجهر متحد البؤر كما هو موضح سابقا20. تخيل الأقسام على مستوى بؤري واحد بأهداف 10x و 20x و 63x. التقط جميع الصور من نفس الحيوان باستخدام نفس المعلمات. احرص على ضبط مستوى الليزر وإعدادات اكتساب التصوير لتجنب تشبع الإشارة.
    3. قم بإجراء معالجة الصور باستخدام برنامج فيجي. للتوضيح ، اضبط سطوع الصورة والتباين وجاما باستخدام برنامج تحرير صور احترافي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من خلال إجراء التثقيب الكهربائي للبيض في مواقع مختلفة وفي مراحل نمو مختلفة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP إما في المحيط السمعي أو في جذع الدماغ السمعي.

ضربة قاضية FMRP في NM
تم تصميم الحمض النووي الريبي الصغير (shRNA) ضد الدجاج Fmr1 واستنساخه في نظام ناقل Tet-On كما هو موضح سابقا20. يظهر الإعداد للتثقيب الكهربائي في ovo في الشكل 1A. تم حقن الحمض النووي البلازميد الملون باللون الأخضر السريع في الأنبوب العصبي عند مستوى r5 / r6 عند HH12 (الشكل 1B-C). تم وضع قطب كهربائي ثنائي القطب من البلاتين على كل جانب من الأنبوب العصبي عند مستوى r5 / 6 (الشكل 1D). تم تسليم نبضتين عند 12 فولت لدفع البلازميد إلى الأنسجة بالقرب من الجانب الإيجابي للقطب الكهربائي. تم تطبيق Dox على الغشاء المشيمي لتحفيز التعبير عن Fmr1 shRNA و EGFP. بعد 24 ساعة من علاج Dox ، كان EGFP واضحا تحت المجهر المجسم الفلوري. يوضح الشكل 1E-F مثالا في E3 عندما تم تطبيق Dox في E2. أكدت المقاطع المستعرضة موقع خلايا التعبير EGFP (EGFP +) على جانب واحد من الدماغ الخلفي (الشكل 1G-H). بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على مجموعة من الخلايا المنقولة أمام كيس الأذن. كانت هذه خلايا قمة عصبية قحفية تهاجر بطنيا من الأنبوب العصبي (الشكل 1F). يمكن أيضا تحضين الأجنة المثقوبة بالكهرباء لفترة أطول لدراسة تكوين الدائرة في مراحل لاحقة. في E15 ، لوحظ EGFP في جذع الدماغ ، ولكن فقط على الجانب المنقول (الشكل 1I-J). أظهرت المقاطع العرضية على مستوى جذع الدماغ الظهري حفنة من الخلايا العصبية EGFP + التي كانت منتشرة في NM على جانب التثقيب الكهربائي (الشكل 1L). شوهدت ألياف EGFP + تبرز هدف الخلايا العصبية NM: النواة الظهرية الصفيحية (NL) على الجانب المماثل (الشكل 1L) و NL البطني على الجانب المقابل (الشكل 1K). تم التحقق من صحة تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA من خلال تخفيضات ملحوظة في النشاط المناعي FMRP في الخلايا العصبية NM المنقولة مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة (الشكل 1M-N). في العقدة السمعية (AG) ، كانت الخلايا العصبية غير منقولة (EGFP-) ، على الرغم من أن بعض الخلايا الدبقية المحيطة بالخلايا العصبية AG كانت EGFP + (الشكل 1O-P) ، ويفترض أنها مشتقة من خلايا القمة العصبية القحفية EGFP + (انظر الشكل 1F). وبالتالي ، توفر استراتيجية التثقيب الكهربائي هذه نقلا انتقائيا للخلايا العصبية بعد المشبكية في دائرة AG-NM.

ضربة قاضية FMRP في القناة السمعية
تم حقن خليط البلازميد في كيس الأذن عند HH13 (الشكل 2 أ) ، متبوعا بالتثقيب الكهربائي عن طريق وضع الجانب الإيجابي من القطب الأمامي للكيسة الأذنية والجانب السلبي الخلفي للكيسة الأذنية (الشكل 2 ب). أظهرت أقسام الرأس بالكامل في E6 مضان EGFP قويا في كيس الأذن الأيمن ، ولكن ليس في جذع الدماغ (الشكل 2C). أظهرت القنوات السمعية المعزولة في E9 مضان EGFP واسع النطاق طوال طول القناة (الشكل 2D-E). في المقاطع المستعرضة ، تم تأكيد خلايا EGFP + في الحليمة القاعدية (BP) على طول جدار قناة القوقعة وفي AG (الشكل 2F-G). تم التحقق من صحة تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA من خلال انخفاضات ملحوظة في النشاط المناعي FMRP في خلايا الشعر المنقولة (* ، الشكل 2H-J) مقارنة بخلايا الشعر المجاورة غير المنقولة (• ، الشكل 2H-J). بالنسبة للخلايا الداعمة ، كان النشاط المناعي FMRP ضعيفا في كل من الخلايا المنقولة وغير المنقولة (الشكل 2H-J). على غرار خلايا الشعر ، تضاءل النشاط المناعي FMRP إلى حد كبير في الخلايا العصبية AG المنقولة مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة (الشكل 2K-M).

تتبعنا بعد ذلك الإسقاط المركزي للخلايا العصبية AG المنقولة إلى جذع الدماغ عبر العصب السمعي. تم تأكيد نمط الفسيفساء لانتقال Fmr1 shRNA في AG في E6 باستخدام النشاط المناعي Islet-1 (الشكل 3A) ، وهي علامة للأذن الداخلية للدجاجالنامي 31. عندما تم استخراج جزء من AG مع جذع الدماغ أثناء التشريح ، تم تصور الخلايا العصبية EGFP + AG المعزولة وأليافها داخل جذع الدماغ في الموقع في نفس الاستعدادات (الشكل 3B-C). في المقاطع المستعرضة على مستوى NM ، وصلت EGFP + ANFs إلى NM عند E9 (الشكل 3D) وتمت ملاحظتها باستمرار عند E15 و E19 (الشكل 3E-F). كشفت الصور عالية التكبير عن نهايات تشبه مخروط النمو ل ANFs في E9 (الشكل 3H) ، والتي شكلت البصيلة الطرفية الكبيرة التي تشبه النخيل عند E15 قبل أن تنمو لتصبح البصلة النهائية المميزة لمورفولوجيا Held ذات الفروع المعقدة في E19 (الشكل 3I-J). بالإضافة إلى NM ، شوهدت أيضا فروع واسعة من ANFs في NA ، وهي نواة قوقعة أولية أخرى (الشكل 3E). كان هذا متوقعا ، حيث تتشعب نفس ANFs لتعصيب كل من NM و NA في الدجاج32. رأينا أيضا ألياف EGFP+ تدخل مجموعات الخلايا الدهليزية المجاورة، بما في ذلك النواة الدهليزية الهابطة (VeD) كما هو موضح في الشكل 3E. على الرغم من أننا قمنا بتحسين موقع القطب الكهربائي لاستهداف الجزء الأمامي من كيس الأذن بشكل تفضيلي حيث يتم تشكيل AG ، فقد تم أيضا نقل بعض الخلايا العصبية العقدية الدهليزية. يمكن استخدام التلوين المناعي للبارفالبومين ، وهو علامة ل ANFs في الدجاج ، للتمييز بين الألياف السمعية والألياف الدهليزية في جذع الدماغ (الشكل 3F-G).

باختصار ، توفر استراتيجية التثقيب الكهربائي هذه نقلا انتقائيا للخلايا العصبية قبل المشبكية في دائرة AG-NM ويمكن استخدامها لتتبع تطور المصباح النهائي ل Held على المستويات النهائية الفردية بعد التلاعب الجيني.

Figure 1
الشكل 1. ضربة قاضية FMRP في الدجاج NM. أ: صورة إعداد التثقيب الكهربائي. (ب) رسم تخطيطي يوضح موقع الحقن المجهري عند مستوى المعين r5/6 لجنين دجاج HH12. الاختصارات: NT = الأنبوب العصبي. SO = سوميت. (ج) لتحسين الرؤية، تم حقن الحبر الهندي (الأسود) تحت الجنين بحقنة. ثم تم حقن خليط البلازميد الملون باللون الأخضر السريع في تجويف الأنبوب العصبي. د: وضع القطب ثنائي القطب للتثقيب الكهربي. + و - تشير إلى الجوانب الإيجابية والسلبية ، على التوالي. لاحظ أن خليط البلازميد الأزرق ينتشر في الأنبوب العصبي على الجانب الإيجابي بعد التثقيب الكهربائي. (ه-و) اندمجت صورة المجال الساطع (BF) (E) مع قناة EGFP (F) لجنين دجاج كهربائي في اليوم الجنيني 3 (E3) ، مما يدل على انتقال في الأنبوب العصبي في نفس المستوى الأمامي الخلفي من كيس الأذن. تم تطبيق Dox في E2 ، 6 ساعات بعد التثقيب الكهربائي. يشار إلى خلايا القمة العصبية القحفية المهاجرة (CNC) بالسهم الأصفر ويتم تكبيرها في الجزء الداخلي في F. شريط المقياس = 500 ميكرومتر في E ، ينطبق على E و F ؛ 100 ميكرومتر في أقحم. (G-H) الخلايا المنقولة مع Fmr1 shRNA و EGFP على المقطع العرضي لجنين E3 المنقول. كانت خلايا EGFP + محصورة على جانب واحد من الأنبوب العصبي. كان القسم ملطخا مرتين بالنشاط المناعي FMRP (رمادي). شريط المقياس = 40 ميكرومتر في G ، ينطبق على G و H. (I-J) صورة BF (I) مدمجة مع قناة EGFP (J) لجذع الدماغ E15 بعد علاج Dox في E8. شريط المقياس = 1 مم في I ، ينطبق على المقطع العرضي I و J. (K-L) لجذع الدماغ E15 مع الخلايا العصبية EGFP + NM على الجانب المنقول (العابر) فقط. على الجانب المقابل (كونترا) (K) ، شوهدت محاور EGFP + في الجزء البطني من النواة الصفيحية (NL). (م-ن) صور تكبير عالية ل NM في E19 مع وضع علامات مزدوجة على FMRP (أحمر) و SNAP25 (أزرق) صبغة مناعية. SNAP25 هي علامة ما قبل المشبكي التي تسمي المصباح النهائي ل Held. لاحظ الانخفاض الملحوظ في النشاط المناعي FMRP في الخلايا العصبية المنقولة (الخضراء ؛ *) مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة (•). (O-P) صور تكبير عالية للعقدة السمعية (AG) في E19 مع تفاعل مناعي FMRP. لم يتم نقل الخلايا العصبية AG (AGN) (EGFP-). تم نقل بعض الخلايا الدبقية المشتقة من خلايا CNC المشار إليها في F. شريط المقياس = 10 ميكرومتر في M ، ينطبق على M-P. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2. ضربة قاضية FMRP في القناة السمعية الدجاج. (أ) صورة المجال الساطع (BF) توضح الحقن الدقيق للبلازميدات في كيس الأذن عند HH13. تم حقن الحبر الهندي (الأسود) أسفل الجنين لتحسين الرؤية. ب: وضع القطب ثنائي القطب للتثقيب الكهربي. تم وضع الجانب الإيجابي (المسمى برمز زائد ، +) أمام كيس الأذن ، وتم وضع الجانب السلبي (المسمى برمز ناقص ، -) خلف الكيسة الأذنية. (ج) كان المقطع المستعرض لرأس دجاجة عند E6 ملطخا بالمناعة ل FMRP (أحمر) وخيوط عصبية (NF ؛ أزرق). تم تطبيق Dox في E3 بعد التثقيب الكهربائي. تم الكشف عن مضان EGFP في كيس الأذن ولكن ليس في جذع الدماغ. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (D-E) تم دمج صورة BF (D) مع قناة EGFP (E) لقناة سمعية عند E9. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (F-G) مقطع عرضي من القناة السمعية E9 مع تلطيخ مناعي FMRP (أحمر) و NF (أزرق). شوهدت خلايا EGFP + في جدار القناة القوقعية والحليمة القاعدية (BP) والعقدة السمعية (AG). شريط المقياس = 50 ميكرومتر في F ، ينطبق على F و G. (H-J) صور تكبير عالية ل E9 BP تظهر إلى حد كبير انخفاض النشاط المناعي FMRP في خلايا الشعر المنقولة (HCs ؛ *) مقارنة ب HCs غير المنقولة (•). كانت الألياف الإيجابية NF (الزرقاء) هي التعصيب المحيطي من الخلايا العصبية AG. (كم) صور مكبرة عالية للخلايا العصبية AG في E9 مع تلطيخ مناعي FMRP (أحمر). كان النشاط المناعي FMRP قويا في الخلايا العصبية غير المنقولة (•) ولا يمكن اكتشافه في الخلايا العصبية المنقولة (EGFP + ؛ *). شريط المقياس = 50 ميكرومتر في H ، وينطبق على H-M. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3. التتبع المحوري للخلايا العصبية AG المنقولة في جذع الدماغ. تم حقن الأجنة بالكهرباء في HH13 لنقل كيس الأذن من Fmr1 shRNA. بدأ تطبيق Dox في E2. (أ) مقاطع عرضية من رأس دجاج E6 مع تلطيخ مناعي Islet-1 وصبغة مضادة DAPI. كانت خلايا EGFP + واضحة في العقدة السمعية (AG). تشير النجوم * إلى العديد من الخلايا العصبية AG المنقولة في الجزء الداخلي. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في A و 10 ميكرومتر في أقحم. (ب - ج) اندمجت صورة المجال الساطع (BF) (B) مع قناة EGFP (C) لجذع الدماغ E9. في هذه الحالة ، تم ترك جزء من AG (الأسهم البيضاء) متصلا بجذع الدماغ السمعي. يشير السهم الأصفر إلى الخلايا العصبية AG المنقولة (AGN) في الجزء الداخلي. كانت ألياف EGFP + واضحة على الجانب المنقول من جذع الدماغ. شريط المقياس = 1 مم في B ، ينطبق على B و C ؛ 100 ميكرومتر في أقحم. د: مقطع عرضي لجذع الدماغ E9 عند المستوى المشار إليه في C بالخط المتقطع. امتدت الألياف العصبية السمعية EGFP + (ANF ؛ أخضر) على طول الهامش الظهري لجذع الدماغ واقتربت من النواة المغنطيسية (NM). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (E-G) ألياف EGFP + عند E15 (E) و E19 (F-G). شوهدت بعض الألياف أيضا في النواة الزاوية (NA) والنواة الدهليزية الهابطة (VeD). تم تلطيخ أقسام E19 للتفاعل المناعي ل parvalbumin (PV) كعلامة ل ANFs. يتم تكبير الصندوق المتقطع في F في الإدخالات ، مما يدل على EGFP + ANF ، والذي كان متفاعلا مناعيا PV. شريط المقياس = 100 ميكرومتر في E ؛ 50 ميكرومتر في F ، ينطبق على F و G ؛ 2 ميكرومتر في الإدخالات. (ح-ج) صور تكبير عالية لمحطات ANF في NM عند E9 و E15 و E19 ، تظهر التكوين والنضج التدريجي للمصباح النهائي ل Held. شريط المقياس = 5 ميكرومتر في H ، ينطبق على H-J. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP ، من الضروري معالجة تعبيرها في مجموعات الخلايا الفردية أو أنواع الخلايا. نظرا لأن إحدى الوظائف الرئيسية ل FMRP هي تنظيم التكوين المشبكي واللدونة ، فإن المعالجة الانتقائية لكل مكون متشابك لدائرة معينة هي شرط أساسي لفهم كامل لآلية FMRP في الاتصال المشبكي. باستخدام التثقيب الكهربائي للبيض لأجنة الدجاج ، أظهرنا طريقة لاستهداف تعبير FMRP في دائرة AG-NM ، إما في الخلايا العصبية AG قبل المشبكية أو الخلايا العصبية NM بعد المشبكي. لتحقيق ذلك ، يعد اختيار مراحل النمو المناسبة للتثقيب الكهربائي ووضع قطب التثقيب الكهربائي بدقة على الجنين خطوات حاسمة. تنشأ الخلايا العصبية NM من السلف العصبي في الأنبوب العصبي عند مستوى r5 / 6 عند HH1223. في نفس المرحلة ، تهاجر خلايا القمة العصبية القحفية من الطرف الظهري للأنبوب العصبي إلى العقدة القوقعة الشبكية لتغليف الخلايا العصبية AG المستقبلية33. وبالتالي ، فإن كل من الخلايا العصبية NM والخلايا الدبقية في AG مشتقة من الأنبوب العصبي. في المقابل ، تنشأ خلايا الشعر والخلايا العصبية AG من الأديم الظاهر24. يثخن الأديم الظاهر المجاور لمستوى r5 / 6 عند HH10 ثم يغزو لتشكيل الكوب الأذني عند HH13. ثم يغلق الكوب الأذني وينفصل عن الأديم الظاهر لتشكيل كيس الأذن ، حيث يصبح الجزء الأمامي هو العضو الحسي السمعي والجزء الخلفي يساهم في الجهاز الدهليزي. في كل من الأجزاء السمعية والدهليزية ، تتفكك خلايا الخلايا العصبية الموجودة في الجزء البطني من الكوب الأذني وتهاجر لتشكيل العقدة القوقعية. بناء على دراسات رسم خرائط المصير هذه ، قمنا بنقل أسلاف الخلايا العصبية NM عن طريق الإلكتروبومغناطيس الأنبوب العصبي في HH12 ، وهي استراتيجية تم وضعها سابقا26،28،34. على الرغم من أن هذه الاستراتيجية تؤدي إلى نقل إضافي للخلايا الدبقية في جذع الدماغ و AG ، لم يتم نقل أي من الخلايا العصبية AG. يمكن تحقيق النقل الخاص بالخلايا العصبية من خلال استخدام استراتيجية Atoh1 التي تحركها المحفزات ، كما فعلنا سابقا21. من أجل النقل الانتقائي للخلايا العصبية AG ، قمنا بكهرباء كيس الأذن عند HH13. دخلت البلازميدات المحقونة في الكوب الأذني في الغالب إلى الجزء الأمامي من كيس الأذن لخلية الشعر ونقل الخلايا العصبية AG في وقت واحد عند وضع الأقطاب الكهربائية كما هو موضح في الشكل 2 ب. لاستهداف الخلايا العصبية AG بشكل تفضيلي على خلايا الشعر ، من الممكن حقن محلول البلازميد مباشرة في المنطقة المجاورة للكيس الأذني الأمامي ، حيث توجد الخلايا العصبية المنزوعة35. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها كفاءة أقل في نقل الخلايا العصبية AG مقارنة بحقن كيس الأذن ، حيث تنتشر البلازميدات بسرعة بعد الحقن. قد تؤدي هذه الطريقة أيضا إلى نقل إضافي لخلايا اللحمة المتوسطة المحيطة بالرأس. تتمثل إحدى طرق استهداف خلايا الشعر بشكل تفضيلي على الخلايا العصبية AG في تأخير حقن كيس الأذن والتثقيب الكهربائي إلى HH18 (وهو ~ اليوم الجنيني 3) ، حيث أن غالبية الخلايا العصبية (سلائف الخلايا العصبية AG) قد هاجرت من كيس الأذن في هذه المرحلة24.

مع التعديلات ، يمكن تمديد هذه الطريقة لدراسة النظام الدهليزي. بالنسبة لنقل العقدة الدهليزية، يجب عكس اتجاه الأقطاب الكهربائية الموضحة في الشكل 2B لنقل الجزء الخلفي من الكيسة الأذنية بسبب الموقع المميز لسلائف العقدة السمعية والدهليزية.

في التثقيب الكهربائي للبيض من أجنة الدجاج هو تقنية راسخة للتحقيق في المراحل المبكرة من التطور (خلال الأسبوع الأول من الحضانة). بالنسبة للدراسات طويلة الأجل ، يعد معدل البقاء على قيد الحياة مصدر قلق كبير. عند بدء علاج Dox في E8 ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة الموجود هنا هو ~ 60٪ في E9 ، ولكنه ينخفض إلى 30٪ عند E15 ، وحتى أقل في E19. الفقس من البيض الكهربائي ممكن ولكنه نادر ولا يمكنه البقاء على قيد الحياة إلا لعدة أيام في معظم الحالات. لزيادة معدل البقاء على قيد الحياة ، ينبغي النظر في ما يلي: 1) استخدام electroporator الذي يوفر موجات مربعة بدلا من الموجات الحادة. 2) ضع قطرة أو قطرتين من PBS المعقم على الجزء العلوي من الجنين إذا لم تكن طبقة الألبومين سميكة بما يكفي لتعزيز التوصيل الكهربائي (سيساعد ذلك في تقليل الصدمات الكهربائية) ؛ 3) فتح غشاء vitelline لفضح الجنين في موقع الحقن غير مطلوب لعملية نقل ناجحة وقد يضر الجنين ؛ 4) لتقليل مخاطر التلوث ، استخدم حقنة لكزة البارافيلم وإدارة Dox بدلا من إعادة فتح النافذة. بعد الحقن ، امسح الفيلم الشفاف بنسبة 75٪ من الإيثانول وقم بتغطية فتحة الإبرة بشريط ؛ 5) لنقل كيس الأذن ، قم بحقن البلازميدات في كيس الأذن ظهريا باستخدام ماصة بزاوية 45 درجة لتجنب ثقب الشريان الأورطي الظهري تحتها. في حالة تلف الشريان الأورطي الظهري ، سيؤدي النزيف إلى طرد البلازميدات وحتى يسبب الوفاة ؛ 6) إذا أمكن ، تجنب استخدام الحبر الهندي لتصور الجنين. ستؤدي معالجة أقل وإجراءات أقل إلى معدل بقاء أعلى.

بالإضافة إلى القدرة على نقل الخلايا العصبية AG أو NM بشكل انتقائي ، في التثقيب الكهربائي للبيض يوفر نظاما فريدا يسمح بإجراء مقارنات مجاورة لتحليل البيانات. بعد التثقيب الكهربائي ، يتم نقل مجموعة فرعية فقط من الخلايا في NM أو AG ، مما يسمح للخلايا المحيطة غير المنقولة في نفس مجموعة الخلايا بالعمل كعنصر تحكم مثالي20. إذا كان التفاعل المحتمل بين الخلايا العصبية المجاورة مصدر قلق ، فإن نظراء الخلايا العصبية من الجانب غير المنقول من الأذن والدماغ يمكن أن يكونوا بمثابة عنصر تحكم إضافي. بالنسبة للدراسات النسيجية والتصويرية ، تتيح هذه النتيجة تحليل البيانات بكفاءة عالية على مستوى الخلية المفردة أو الألياف المفردة. التحليلات الجزيئية ممكنة أيضا إذا تم دمجها مع فرز الخلايا القائمة على الفلورسنت وتحليلات البروتين والحمض النووي الريبي على نطاق واسع مثل قياس الطيف الكتلي وتسلسل الجيل التالي. ومع ذلك ، فإن استخدام التثقيب الكهربائي للبيض كوسيلة لتحرير الجينات قد يكون تحديا للدراسات الوظيفية والسلوكية لأن النسبة المئوية للخلايا المنقولة داخل مجموعة الخلايا قد لا تكون كبيرة بما يكفي لتؤدي إلى عواقب وظيفية.

من الضروري إجراء تحليلين للتحقق عند اعتماد نهج التثقيب الكهربائي في البيض. أولا ، يجب تأكيد تأثير تحرير الجينات على البروتين محل الاهتمام. في التثقيب الكهربائي للبيض ينقل فقط مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في NM أو AG (أي نمط الفسيفساء). إن إجراء اللطخة الغربية على الأنسجة المتجانسة التي تحتوي على خليط من الخلايا العصبية المنقولة وغير المنقولة ليس حساسا بما يكفي ليعكس بدقة تأثير الضربة القاضية. وبالتالي ، يجب إجراء التحقق على مستوى الخلية الفردية باستخدام طرق مثل الكيمياء المناعية. لهذا الغرض ، قمنا سابقا بإنشاء جسم مضاد يتعرف على الدجاج FMRP. تم التحقق من خصوصية هذا الجسم المضاد من خلال الكيمياء المناعية واللطخة الغربية في دراسة سابقة30. تم التحقق من تأثير ضربة قاضية ل Fmr1 shRNA كميا من خلال ملاحظة انخفاضات كبيرة في شدة النشاط المناعي FMRP في الخلايا العصبية NM المنقولة مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة. ثانيا ، يجب استخدام مجموعات التحكم التي تستخدم الحمض النووي الريبي المخلوط ، أو تركيبات التحكم الأخرى ، لتأكيد خصوصية التأثيرات الخلوية المرصودة للتعبير الخاطئFMRP 20,21. لتحقيق هذا الهدف ، قمنا بتصميم shRNA المخفوق ، واستنساخه في نفس نظام ناقل Tet-On ، وقمنا بتحويله إلى سلائف NM ، كما هو موضح سابقا20. لم يتأثر تعبير FMRP في الخلايا العصبية NM المنقولة مع shRNA المخلوط ، كما يتضح من الكثافة غير المتغيرة للتفاعل المناعي FMRP مقارنة بالخلايا العصبية المجاورة غير المنقولة. لقد حددنا أيضا عددا من تأثيرات نقل Fmr1 shRNA على النمو المحوري ، والتقليم التغصني ، والتكوين النهائي ، والنقل العصبي (تمت مراجعته في Curnow and Wang ، 2022)36. وخلصنا إلى أن هذه التأثيرات كانت ناجمة على وجه التحديد عن طريق فقدان الخلية المستقل ل FMRP لأن shRNA المخلوط فشل في إحداث تغييرات مماثلة.

في الختام ، تتيح تقنية التثقيب الكهربائي في البويضات تحرير جين Fmr1 الانتقائي مع التحكم الزمني وخصوصية المكونات في دوائر جذع الأذن والدماغ السمعية ويمكن تعديلها للتعامل مع النظام الدهليزي. إن تطوير هذه التكنولوجيا المتقدمة في جنين الدجاج ، وهو نموذج راسخ في علم الأحياء التنموي ، قد ساهم وسيستمر في فهمنا لنمو الدماغ في ظل الظروف العادية وغير الطبيعية مثل FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ودعمت هذه الدراسة كل من: منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32000697)؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم )؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم )؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (202102080139) ؛ مؤسسة قوانغدونغ للعلوم الطبيعية (2019A1515110625 ، 2021A1515010619) ؛ صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (11620324)؛ منحة بحثية من المختبر الرئيسي للطب التجديدي ، وزارة التربية والتعليم ، جامعة جينان (رقم. ZSYXM202107); صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية في الصين (21621054) ؛ ومؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ الصينية (20191118142729581). نشكر مركز التجارب الطبية بجامعة جينان. نشكر الدكتورة تيرا برادلي على التحرير الدقيق للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

علم الأعصاب، العدد 185، متلازمة X الهشة، الدائرة الحسية، الأذن الداخلية، نواة القوقعة، تكوين المشبك العصبي، نمو الدماغ، بصيلة هيلد، جنين الدجاج
تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة <em>التثقيب الكهربائي في Ovo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter