Summary
Mit Hilfe der In-Ovo-Elektroporation entwickelten wir eine Methode, um das auditorische Innenohr und den Cochlea-Kern in Hühnerembryonen selektiv zu transfizieren, um einen zellgruppenspezifischen Knockdown des fragilen X-Mentalretardationsproteins während diskreter Perioden des Schaltkreisaufbaus zu erreichen.
Abstract
Fragile X mental retardation protein (FMRP) ist ein mRNA-bindendes Protein, das die lokale Proteintranslation reguliert. FMRP-Verlust oder -Dysfunktion führt zu aberranten neuronalen und synaptischen Aktivitäten beim fragilen X-Syndrom (FXS), das durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und soziale Kommunikationsprobleme gekennzeichnet ist. Studien zur FMRP-Funktion und FXS-Pathogenese wurden hauptsächlich mit Fmr1-Knockout (das Gen, das FMRP kodiert) bei transgenen Tieren durchgeführt. Hier berichten wir über eine in vivo Methode zur Bestimmung der zellautonomen Funktion von FMRP während der Zeit des Schaltkreisaufbaus und der synaptischen Bildung mit Hühnerembryonen. Diese Methode verwendet die phasen-, orts- und richtungsspezifische Elektroporation eines medikamenteninduzierbaren Vektorsystems, das Fmr1-kleine Haarnadel-RNA (shRNA) und einen EGFP-Reporter enthält. Mit dieser Methode erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown im auditorischen Ganglion (AG) und in einem seiner Hirnstammziele, dem Nucleus magnocellularis (NM), wodurch eine komponentenspezifische Manipulation innerhalb des AG-NM-Schaltkreises ermöglicht wurde. Darüber hinaus ermöglicht das Mosaikmuster der Transfektion Kontrollen innerhalb des Tieres und benachbarte Neuron/Faser-Vergleiche für eine erhöhte Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit bei der Datenanalyse. Das induzierbare Vektorsystem bietet eine zeitliche Kontrolle des Beginns der Genbearbeitung, um akkumulierende Entwicklungseffekte zu minimieren. Die Kombination dieser Strategien bietet ein innovatives Werkzeug, um die zellautonome Funktion von FMRP in der synaptischen und Schaltungsentwicklung zu analysieren.
Introduction
Das Fragile-X-Syndrom (FXS) ist eine neurologische Entwicklungsstörung, die durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und autistisches Verhalten gekennzeichnet ist. In den meisten Fällen wird FXS durch einen globalen Verlust des fragilen X-Mentalretardierungsproteins (FMRP; kodiert durch das Fmr1-Gen) ab frühen embryonalen Stadien1 verursacht. FMRP ist ein RNA-bindendes Protein, das normalerweise in den meisten Neuronen und Gliazellen im Gehirn sowie in Sinnesorganenexprimiert wird 2,3,4. In Säugetiergehirnen ist FMRP wahrscheinlich mit Hunderten von mRNAs assoziiert, die Proteine kodieren, die für verschiedene neuronale Aktivitäten wichtig sind5. Studien an konventionellen Fmr1-Knockout-Tieren zeigten, dass die FMRP-Expression besonders wichtig für den Aufbau und die Plastizität der synaptischen Neurotransmission ist6. Mehrere bedingte und mosaikartige Knockout-Modelle haben weiter gezeigt, dass FMRP-Aktionen und -Signale zwischen Gehirnregionen, Zelltypen und synaptischen Stellen während mehrerer Entwicklungsereignisse variieren, einschließlich axonaler Projektion, dendritischer Musterung und synaptischer Plastizität 7,8,9,10,11,12,13,14 . Die akute Funktion von FMRP bei der Regulierung der synaptischen Übertragung wurde durch intrazelluläre Verabreichung von inhibitorischen FMRP-Antikörpern oder FMRP selbst in Gehirnschnitten oder kultivierten Neuronen untersucht15,16,17,18. Diese Methoden bieten jedoch nicht die Möglichkeit, FMRP-Fehlausdrucksfolgen während der Entwicklung zu verfolgen. Daher ist die Entwicklung von In-vivo-Methoden zur Untersuchung der zellautonomen Funktionen von FMRP von großem Bedarf und soll dazu beitragen, festzustellen, ob die berichteten Anomalien bei FXS-Patienten direkte Folgen des FMRP-Verlusts in den zugehörigen Neuronen und Schaltkreisen oder sekundäre Konsequenzen sind, die sich aus netzwerkweiten Veränderungen während der Entwicklung ergeben19.
Der auditorische Hirnstamm von Hühnerembryonen bietet ein einzigartig vorteilhaftes Modell für eingehende funktionelle Analysen der FMRP-Regulation in der Schaltkreis- und Synapsenentwicklung. Der einfache Zugang zu embryonalen Hühnergehirnen und die etablierte Elektroporationstechnik zur genetischen Manipulation haben wesentlich zu unserem Verständnis der Gehirnentwicklung in frühen embryonalen Stadien beigetragen. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde diese Technik mit fortschrittlichen molekularen Werkzeugen kombiniert, die eine zeitliche Kontrolle der FMRP-Fehlexpression ermöglichen20,21. Hier wird die Methodik weiterentwickelt, um selektive Manipulationen von präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen getrennt voneinander zu induzieren. Diese Methode wurde im auditorischen Hirnstammkreislauf entwickelt. Das akustische Signal wird von Haarzellen im auditorischen Innenohr detektiert und dann an das Hörganglion (AG; bei Säugetieren auch Spiralganglion genannt) weitergeleitet. Bipolare Neuronen in der AG innervieren Haarzellen mit ihren peripheren Fortsätzen und senden wiederum eine zentrale Projektion (den Hörnerv) zum Hirnstamm, wo sie in zwei primären Cochlea-Kernen, dem Nucleus magnocellularis (NM) und dem Nucleus angularis (NA), enden. Neuronen in der NM sind strukturell und funktionell vergleichbar mit den kugelförmigen buschigen Zellen des anteroventralen Cochlea-Kerns von Säugetieren. Innerhalb der NM synapsieren Hörnervenfasern (ANFs) auf den Somata von NM-Neuronen über den großen Endbulb der Held-Terminals22. Während der Entwicklung entstehen NM-Neuronen aus den Rhombomeren 5 und 6 (r5/6) im Hinterhirn23, während AG-Neuronen von Neuroblasten abgeleitet werden, die sich in der Otozyste24 befinden. Hier beschreiben wir das Verfahren zur selektiven Knockdown-FMRP-Expression in den präsynaptischen AG-Neuronen und in den postsynaptischen NM-Neuronen getrennt.
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Protocol
Eier und Hühnerembryonen wurden mit Sorgfalt und Respekt in Übereinstimmung mit den Tierprotokollen behandelt, die vom Animal Care and Use Committee der Jinan University genehmigt wurden.
1. Ei- und Plasmidzubereitung
- Ei-Zubereitung
- Frisch befruchtete Hühnereier (Gallus gallus) von der South China Agricultural University beziehen und vor der Inkubation bei 16 °C lagern. Um eine optimale Lebensfähigkeit zu erzielen, legen Sie alle Eier innerhalb einer Woche nach der Ankunft zur Inkubation.
- Die Eier horizontal platzieren und bei 38 °C für 46-48 h bis Hamburger und Hamilton (HH) Stadium 1225 für die Neuralrohrtransfektion oder für 54-56 h bis HH13 für die Otozystentransfektion inkubieren. Da der Tierpol des Eies leichter ist als der Pflanzenpol, positioniert die horizontale Platzierung den Embryo auf der Oberseite des Eies für eine einfache Manipulation. Seien Sie vorsichtig, um das Ei in diesem und allen folgenden Schritten horizontal zu halten.
- Die Position des Embryos erscheint als dunkler Bereich auf der Eierschale, wenn Licht vom Boden des Eies mit einer Taschenlampe geworfen wird. Verwenden Sie in den gewünschten HH-Stadien diese Taschenlampenmethode, um die Position des Embryos auf der Eierschale mit Bleistift zu markieren.
- Wischen Sie die Eier mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält. Bohren Sie mit der Scherenspitze ein Loch in das spitze Ende der Eier und entfernen Sie 2 ml Albumin mit einer 18-G-Nadelspritze. Stellen Sie sicher, dass das Loch nur groß genug ist, um das Einführen der Nadel zu ermöglichen. Wischen Sie auslaufendes Albumin mit Gaze ab und verschließen Sie das Loch mit durchsichtigem Klebeband.
- Um Risse zu minimieren und herabfallende Schalenablagerungen während des Fensters zu verhindern, bedecken Sie die Oberseite der Eier mit klarem Klebeband und zentrieren Sie sich auf den mit Bleistift markierten dunklen Bereich.
- Plasmid-DNA-Extraktion
- Klonen Sie Hühner Fmr1 shRNA mit einem Transposon-basierten Tet-on-System, wie zuvor beschrieben20. Dieses System enthält drei Plasmide: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 und pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, die ein medikamenteninduzierbares Vektorsystem bereitstellen, durch das die Expression von Fmr1 shRNA und EGFP nach der Transfektion zum Schweigen gebracht wird und durch Doxycyclin (Dox) -Induktion eingeschaltet werden kann.
HINWEIS: Diese Plasmide sind derzeit nicht in einem Repository verfügbar. Die Autoren erklären sich damit einverstanden, die Plasmide auf angemessene Anfrage zur Verfügung zu stellen. - Extrahieren Sie Plasmid-DNAs mit einem endotoxinfreien Präparationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und fallen Sie durch Zugabe von 1/15 Volumen 7,5 M Natriumacetat und 1 Volumen von 100% Isopropanol aus.
- Plasmide bei -20 °C über Nacht ausfällen und bei 13.000 x g für 10 min zentrifugieren. Das Pellet wird mit dem im Kit enthaltenen Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 4-5 μg/μL gelöst. Plasmide können bei -20 °C für 12 Monate ohne verminderte Transfektionseffizienz gelagert werden.
- Mischen Sie am Tag der Elektroporation 2 μL jedes Plasmids gründlich in einem sterilen Zentrifugenröhrchen mit einer Pipettenspitze. Das resultierende 6 μL Volumen der Plasmidmischung reicht aus, um drei Dutzend Eier zu elektropolieren. Um das Plasmid während der Elektroporation sichtbar zu machen, fügen Sie 1 μL 0,1% schnelles Grün (hergestellt in sterilemddH2O) für jeweils 6 μL DNA-Mischung26 hinzu, wodurch die Plasmidmischung blau wird.
- Klonen Sie Hühner Fmr1 shRNA mit einem Transposon-basierten Tet-on-System, wie zuvor beschrieben20. Dieses System enthält drei Plasmide: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 und pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, die ein medikamenteninduzierbares Vektorsystem bereitstellen, durch das die Expression von Fmr1 shRNA und EGFP nach der Transfektion zum Schweigen gebracht wird und durch Doxycyclin (Dox) -Induktion eingeschaltet werden kann.
2. In ovo Elektroporation
- Eizellfenster und Embryonenidentifizierung
- Am Tag der Elektroporation die Eier aus dem Inkubator entfernen, jeweils ein Dutzend Eier. Eier länger als 1 Stunde aus ihrem Inkubator fernzuhalten, führt zu Entwicklungsschwankungen und verringert die Lebensfähigkeit.
- Wischen Sie alle Operationswerkzeuge mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält.
- Legen Sie jedes Ei in einen speziell angefertigten Schaumstoffhalter. Wischen Sie den mit Klebeband bedeckten Bereich mit 75% Ethanol ab und schneiden Sie mit einer kleinen Schere ein Fenster (1-2 cm2) um den Umfang der Bleistiftmarkierung herum (Abbildung 1A). Halten Sie beim Schneiden die Schere flach, um den darunter liegenden Embryo nicht zu beschädigen.
- Legen Sie das Fensterei unter ein Stereomikroskop mit einem 10-fachen Okular und 2-fachem Zoom und identifizieren Sie den Embryo. Passen Sie den Winkel und die Helligkeit der Lichtquelle für eine bessere Visualisierung an.
HINWEIS: Es erfordert Übung und Erfahrung, um den Embryo zu visualisieren und das Neuralrohr in diesem Stadium zu identifizieren.- Für Anfänger verwenden Sie die folgende optionale Tinteninjektion, um die Identifizierung des Embryos zu erleichtern. Bereiten Sie 10% ige indische Tintenlösung in 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Autoklav im Voraus vor. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit der Tintenlösung und passen Sie dann eine 27G-Nadel an. Biegen Sie die Nadel mit einer Pinzette in einen Winkel von 45°.
- Unter dem Mikroskop vorsichtig vom Rand des Opazakas stechen und die Nadel unter den Embryo einführen. Injizieren Sie ~ 50 μL Tinte, die unter dem Bereich pellucida zur Visualisierung des Embryos diffundiert. Die Tinte bildet einen dunklen Hintergrund für eine klare Visualisierung des Embryos.
HINWEIS: Stoßen Sie die Luft vor dem Einführen und Einspritzen aus der Spritze aus. Wenn Sie in der Visualisierung geschult sind, vermeiden Sie den Schritt der Tinteninjektion, da er die Überlebensrate verringert.
- Neuralrohrinjektion und Elektroporation
HINWEIS: Dieses Verfahren wird bei HH12 durchgeführt, um NM-Neuronen im Hirnstamm zu transfizieren.- Glaskapillaren (~1 mm Durchmesser und 100 mm lang) mit einem Pipettenzieher in Pipetten ziehen. Öffnen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig die Spitze der Kapillarnadel mit einer Pinzette auf einen Durchmesser von 10-20 μm. Lagern Sie die Pipetten (normalerweise 5-10 auf einmal) bis zur Verwendung in einer Aufbewahrungsbox.
- Füllen Sie eine Kapillarpipette mit 0,5-1 μL der Plasmidmischung, indem Sie Unterdruck durch einen Gummischlauch am Ende der Pipette anlegen. Dies kann durch eine Spritze oder Luftpumpe erreicht werden.
- Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal mit dem Schwanz in Ihrer Nähe ausgerichtet ist (oder horizontal zum Injizieren von Kapillarpipetten mit einem dreiachsigen Manipulator). Halten Sie die Kapillarpipette mit einer Hand oder mit dem dreiachsigen Manipulator und fahren Sie die Spitze der Pipette in Kopf-an-Kopf-Richtung zum r5/6.
HINWEIS: Der vordere Hinterhirnbereich ist r1 und jede nachfolgende Ausbuchtung entlang des Neuralrohrs ist ein individuelles Rhombomer. R5/6 befindet sich auf der gleichen anteroposterioren Ebene wie die Otozyste, die eine leicht erkennbare becherartige Struktur darstellt (Abbildung 1B-C). - Stecken Sie die Spitze vorsichtig durch die Vitellinmembran und in das dorsale Neuralrohr und ziehen Sie dann die Pipette ein wenig zurück, so dass sich die Spitze im Lumen des Neuralrohrs befindet. Das Plasmidgemisch wird durch Anlegen von Luftdruck injiziert, bis das getönte Plasmid vollständig in r5/6 diffundiert und sich in r3 und r4 erstreckt.
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, einen Schlitz auf der Vitelline-Membran für die Injektion zu machen. - Überprüfen Sie, ob eine erfolgreiche Injektion vorliegt, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidlösung schnell durch das Neuralrohr diffundiert, ohne auszulaufen (Abbildung 1B-C). Wenn es zu Undichtigkeiten kommt, verblasst das Blau schnell.
- Setzen Sie unmittelbar nach der Injektion eine bipolare Platinelektrode auf beiden Seiten des Neuralrohrs ein (Abbildung 1D). Liefern Sie zwei Impulse von 12 V und 50 ms Dauer mit einem Elektroporator. Beobachten Sie Luftblasen an den Enden der bipolaren Elektrode, mit mehr auf der negativen Seite.
- Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die getönte Plasmidmischung in das Neuralrohrgewebe in der Nähe der positiven Seite der Elektrode gelangt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode.
- Decken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einem Stück transparenter Folie ab, die in 2 Quadrate vorgeschnitten und mit 75% Ethanol besprüht wird. Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator.
- Reinigen Sie die bipolare Elektrode, indem Sie 10-20 Impulse von 12 V und 50 ms Dauer in Kochsalzlösung abgeben, bevor Sie mit dem nächsten Ei fortfahren.
- Otozysteninjektion und Elektroporation
HINWEIS: Dieses Verfahren wird bei HH13 zur Transfizierung von Haarzellen und AG-Neuronen im Innenohr durchgeführt.- Bei HH13 (das ist ~embryonaler Tag 2,5) hat sich der Embryo so gedreht, dass die rechte Seite des Kopfes nach oben zeigt. Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal ist, mit dem Schwanz in Ihrer Nähe. Halten Sie die Kapillarpipette fest, und stoßen Sie die rechte Otozyste vorsichtig in dorsolaterale Richtung (Abbildung 2A).
HINWEIS: In diesem Stadium erscheint die Otozyste als kleine kreisförmige Struktur auf der Oberseite des Körpers auf der gleichen anteroposterioren Ebene wie r5/6. - Das Plasmidgemisch wird mit Luftdruck injiziert, bis die Otozyste mit blauer Lösung27 gefüllt ist. Überprüfen Sie eine erfolgreiche Injektion, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in der Otozyste eingeschlossen ist und nicht austritt.
- Setzen Sie unmittelbar nach der Injektion die bipolare Elektrode auf die Otozyste, wie in Abbildung 2B dargestellt. Positionieren Sie die positive und negative Seite vor bzw. hinter der Otozyste. Liefern Sie zwei Impulse von 12 V und 50 ms Dauer mit dem Elektroporator.
- Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in das Gewebe der Otozyste in der Nähe der positiven Seite der Elektrode eindringt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode. Decken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einer transparenten Folie ab und geben Sie das Ei in den Inkubator zurück.
- Bei HH13 (das ist ~embryonaler Tag 2,5) hat sich der Embryo so gedreht, dass die rechte Seite des Kopfes nach oben zeigt. Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal ist, mit dem Schwanz in Ihrer Nähe. Halten Sie die Kapillarpipette fest, und stoßen Sie die rechte Otozyste vorsichtig in dorsolaterale Richtung (Abbildung 2A).
3. Verabreichung von Dox zur Einleitung und Aufrechterhaltung der Plasmidtranskription
- Herstellung der Dox-Lösung
- Messen Sie 100 mg Dox-Pulver unter einer chemischen Haube und lösen Sie es in 100 ml sterilem PBS auf, um eine 1 mg / ml Arbeitslösung herzustellen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Filter und lagern Sie 1 mL Aliquots bei -20 °C. Vor Licht schützen20,28.
- Verabreichung von Dox
- Für die Geneditierung in voller Stärke tauen Sie 24 h vor dem gewünschten Alter einen Dox aliquot auf Eis auf. Geben Sie 50 μL Dox direkt auf die Chorioallantoische Membran des Eies mit einer Spritze, die in den transparenten Film eindringt. Verschließen Sie das Nadelloch nach der Injektion mit transparenter Folie oder Klebeband.
- Um den Knockdown-Effekt aufrechtzuerhalten, verabreichen Sie Dox jeden zweiten Tag, bis die Gewebeentnahme im gewünschten Entwicklungsstadium erfolgt.
4. Gewebedissektion und -schnitte
- Hirnstamm
- Bei Embryonen im embryonalen Stadium 3 (E3) und E6 öffnen Sie die Eierschale und schneiden Sie die zugehörige Membran mit einer Schere ab. Löffeln Sie den Embryo aus und tauchen Sie ihn in 4% Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer.
- Für E9-Embryonen öffnen Sie die Eierschale, enthaupten Sie den Embryo mit einer Schere und übertragen Sie den Kopf auf eine mit PBS gefüllte Silikonbodenplatte. Stecken Sie den Kopf durch die Augenhöhlen und schneiden Sie die Oberseite des Schädels auseinander. Legen Sie die Pinzette vorsichtig von beiden Seiten unter das Gehirn und heben Sie das gesamte Gehirn mit den Schultern der Pinzette vom Schädel an. Tauchen Sie das Gehirn in 4% PFA.
- Für E15- und E19-Embryonen öffnen Sie die Eierschale, enthaupten Sie den Embryo mit einer Schere und legen Sie den Kopf auf eine mit PBS gefüllte Silikonbodenplatte. Schneiden Sie die Haut oben auf dem Kopf auf, um den Schädel freizulegen.
- Mit einem Rasiermesser senkrecht durch den Schädel schneiden, um das Vorderhirn und das Schwanzhirn zu trennen. Tauchen Sie den Schwanzblock in PBS, entfernen Sie die Oberseite des Schädels und nehmen Sie dann das Gehirn vom Schädel.
- Stecken Sie das Gehirn durch den Sehlappen und trennen Sie das Kleinhirn und den Hirnstamm. Achten Sie darauf, den auditorischen Hirnstamm, der sich direkt unter dem Kleinhirn befindet, nicht zu beschädigen. Entfernen Sie so viel Dura wie möglich aus dem Hirnstamm und tauchen Sie es dann in 4% PFA ein.
- Halten Sie Embryonen und Hirngewebe über Nacht in 4% PFA bei 4 °C, mit Ausnahme von E19-Hirnstämmen, die 24 h lang unter den gleichen Bedingungen aufbewahrt werden sollten.
- Nach der Fixierung dehydrieren Sie das Gewebe in PBS, das 30% Saccharose enthält, bis es sich absetzt, was je nach Alter normalerweise 1-3 Tage dauert.
- Schneiden Sie den Hirnstamm (E15 und E19) auf 30 μm in der koronalen Ebene mit einem gleitenden Mikrotom. Sammeln Sie Abschnitte in PBS und lagern Sie sie bei 4 °C vor der Immunfärbung.
- Für E3- und E6-Embryonen und E9-Hirnstämme Schnitt bei 50 μm quer. Abschnitte in PBS sammeln und bei 4 °C lagern. Montieren Sie die Abschnitte vor der Immunfärbung auf gelatinebeschichteten Objektträgern. Das Sammeln dickerer Abschnitte für diese Altersgruppen erleichtert die Handhabung des Gewebes.
- Gehörgang
- Nach der Entfernung der Hirnstängel von E9-, E15- und E19-Embryonen ist der Gehörgang, der in das Schläfenbein eingebettet ist, unter dem Schädel liegend leicht identifizierbar und das Schläfenbein ist leicht vom umgebenden Schädel zu trennen. Bei E9-Embryonen fixieren Sie das gesamte Schläfenbein in 4% PFA. Bei älteren Embryonen entfernen Sie die knöcherne Struktur des Schläfenbeins, um den Gehörgang zu isolieren und den Gehörgang in 4% PFA zu fixieren.
- Halten Sie alle Schläfenknochen und Gehörgänge über Nacht in 4% PFA bei 4 °C, bevor Sie das Gewebe einbetten.
- Führen Sie die Gewebeeinbettung wie beschrieben durch. Bereiten Sie die Einbettungslösung wie folgt vor: 10% Gelatine (von Rinderhaut) in kaltem Wasser einweichen, bis das Gelatinegranulat aufquillt und sich absetzt (ca. 30 min). Die Mischung auf ~50 °C erhitzen, um die Gelatine aufzulösen, 20% Saccharose in die Gelatinelösung geben und umrühren, um sich aufzulösen. Lagern Sie die Gelatine-Saccharose-Lösung bis zu einem Monat bei 4 °C.
- Zur Anwendung die Gelatine-Saccharose-Lösung bei 37 °C erwärmen. Die Schläfenknochen/Gehörgänge in der warmen Gelatine-Saccharose-Lösung auf einer 96-Well-Platte bei 37 °C einweichen, bis sie sich absetzen, normalerweise 30-60 min.
- Legen Sie den Boden der Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit einem Streifen transparenter Folie aus. Fügen Sie eine Schicht warme Gelatine-Saccharose-Lösung hinzu und warten Sie, bis sie erstarrt. Übertragen Sie einen Schläfenknochen / Gehörgang zu jedem Brunnen.
- Implantieren Sie das Gewebe mit einer zweiten Schicht warmer Gelatine-Saccharose-Lösung. Stellen Sie die Position des Gewebes so ein, dass es sich in der Mitte des Gels befindet und der Gehörgang horizontal ausgerichtet ist. Stellen Sie die Platte vorsichtig in einen 4 °C warmen Kühlschrank und warten Sie, bis das Gel fest ist.
- Ziehen Sie den transparenten Filmstreifen, um den Gelgewebeblock aus dem Vertiefung zu bewegen. Schneiden Sie zusätzliches Gel in einen quadratischen Block und schneiden Sie eine Ecke des Blocks ab, um die Ausrichtung zu identifizieren. Den Gelatineblock mit einem Stück Folie umwickeln, auf Trockeneis einfrieren und dann bei -80 °C bis zum Schneiden lagern.
- Schneiden Sie den Block in 20 μm Länge entlang der Länge des Gehörgangs mit einem Kryostaten. Montieren Sie die Schnitte direkt auf gelatinebeschichteten Objektträgern. Lagern Sie die Objektträger vor der Immunfärbung bei -80 °C.
- Vor der Immunfärbung tauchen Sie die Objektträger für 5 min in vorgewärmtes PBS (45 °C), um die Gelatine aufzulösen, und waschen Sie die Objektträger dann 3x bei Raumtemperatur PBS, um Restgelatine zu entfernen.
5. Immunfärbung und mikroskopische Bildgebung
HINWEIS: Es werden zwei Arten der Immunfärbung durchgeführt, je nachdem, ob Abschnitte auf Objektträgern montiert oder in PBS frei schwebend sind.
- Immunfärbung auf Objektträgern
- Waschen Sie die Objektträger 3x für jeweils 10 min mit PBS. Umkreisen Sie den Bereich, der die Abschnitte enthält, mit einem Ölstift, um zu verhindern, dass während der Färbung Flüssigkeit austritt. Die Abschnitte mit einer Blocklösung abdecken, die 5% normales Ziegenserum in PBS enthält, und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper (für die verwendete Endkonzentration siehe Tabelle der Materialien) in PBS, das 0,3% TritonX-100 und 5% normales Ziegenserum enthält. Entfernen Sie die blockierende Lösung und bedecken Sie dann die Abschnitte mit der primären Antikörperlösung. Die Objektträger bei 4 °C über Nacht in einer Box mit einer Schicht destilliertem Wasser am Boden inkubieren.
- Spülen Sie die Objektträger 3x für 10 min mit PBS. Tragen Sie fluoreszierende sekundäre Antikörper, verdünnt bei 1:500 in PBS, das 0,3% TritonX-100 enthält, auf Objektträger auf. Die Objektträger bei Raumtemperatur 4 h lichtgeschützt inkubieren.
- Waschen Sie die Dias 3x mit PBS. Lassen Sie vorsichtig zwei Tropfen Montagemedium auf die Objektträger fallen und decken Sie die Abschnitte mit Deckgläsern ab. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zwischen Deckglas und Objektträger zu erzeugen.
- Immunfärbung für Ganzmount-Embryonen und freischwebende Abschnitte
- Waschen Sie die Embryonen/Schnitte mit PBS 3x für jeweils 10 min in einer Well-Platte. Verdünnen Sie die primären Antikörper in PBS, das 0,3% TritonX-100 und 5% normales Ziegenserum enthält, in Zentrifugalröhrchen. Jeder Embryo/Abschnitt wird mit einem Glashaken in ein Röhrchen überführt und auf einem Shaker bei 60 U/min über Nacht bei 4 °C inkubiert.
- Embryonen/Schnitte 3x mit PBS für jeweils 10 min in einer Vertiefungsplatte waschen. Jeder Embryo/Abschnitt wird in ein dunkles Zentrifugalröhrchen gegeben, das mit fluoreszierender sekundärer Antikörperlösung gefüllt ist, und bei Raumtemperatur für 4 h auf dem Shaker inkubiert.
- Waschen Sie die Embryonen/Schnitte 3x mit PBS in einer Well-Platte. Verwenden Sie einen Pinsel, um die Schnitte auf gelatinebeschichteten Objektträgern in einer 15-cm-Schale mit PBS zu montieren. Nachdem die Objektträger leicht getrocknet sind (~5 min), tragen Sie zwei Tropfen Montagemedium auf und legen Sie ein Deckglas. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zwischen Deckglas und Objektträger zu erzeugen. Bewahren Sie das gesamte Mount-Gewebe für die Bildgebung in PBS auf.
- Bildgebung
- Stellen Sie sich das gesamte Gewebe in PBS in einer Schale mit einem Silikonboden vor, der Kohlenstoffpulver enthält, das einen schwarzen Hintergrund bietet. Erfassen und verarbeiten Sie Bilder mit einem kommerziellen Bildverarbeitungs-Softwarepaket von Olympus, wie zuvorbeschrieben 29.
- Bilden Sie die Abschnitte auf den Objektträgern mit einem konfokalen Mikroskop ab, wie zuvor beschrieben20. Stellen Sie die Schnitte auf einer einzigen Fokusebene mit 10x-, 20x- und 63x-Objektiven vor. Nehmen Sie alle Bilder desselben Tieres mit denselben Parametern auf. Achten Sie darauf, die Laserpegel- und Bilderfassungseinstellungen anzupassen, um eine Signalsättigung zu vermeiden.
- Führen Sie die Bildverarbeitung mit der Fidschi-Software durch. Zur Veranschaulichung können Sie Helligkeit, Kontrast und Gamma des Bildes mit einer professionellen Bildbearbeitungssoftware anpassen.
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Representative Results
Durch die Durchführung der Ovo-Elektroporation an verschiedenen Stellen und in verschiedenen Entwicklungsstadien erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown entweder in der auditiven Peripherie oder im auditorischen Hirnstamm.
FMRP-Knockdown in NM
Kleine Haarnadel-RNA (shRNA) gegen das Huhn Fmr1 wurde entworfen und in das Tet-On-Vektorsystem kloniert, wie zuvor beschrieben20. Der Aufbau für die In-Ovo-Elektroporation ist in Abbildung 1A dargestellt. Die grün gefärbte Plasmid-DNA wurde auf dem Niveau r5/r6 bei HH12 in das Neuralrohr injiziert (Abbildung 1B-C). Eine bipolare Platinelektrode wurde auf jeder Seite des Neuralrohrs auf der Ebene r5/6 platziert (Abbildung 1D). Zwei Impulse bei 12 V wurden abgegeben, um das Plasmid in das Gewebe nahe der positiven Seite der Elektrode zu treiben. Dox wurde auf die chorioallantoische Membran aufgetragen, um die Expression von Fmr1 shRNA und EGFP auszulösen. Nach 24 Stunden Dox-Behandlung zeigte sich EGFP unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop. Abbildung 1E-F zeigt ein Beispiel bei E3, als Dox bei E2 angewendet wurde. Querschnitte bestätigten die Lage von EGFP-exprimierenden (EGFP+) Zellen auf einer Seite des Hinterhirns (Abbildung 1G-H). Zusätzlich wurde eine Gruppe transfizierter Zellen vor der Otozyste gefunden; Dies waren kraniale Neuralleistenzellen, die ventrolateral aus dem Neuralrohr wanderten (Abbildung 1F). Elektropolierte Embryonen können auch länger inkubiert werden, um die Schaltkreisbildung in späteren Stadien zu untersuchen. Bei E15 wurde EGFP im Hirnstamm beobachtet, jedoch nur auf der transfizierten Seite (Abbildung 1I-J). Querschnitte auf der Ebene des dorsalen Hirnstamms zeigten eine Handvoll EGFP+-Neuronen, die im NM auf der Seite der Elektroporation verstreut waren (Abbildung 1L). EGFP+-Fasern projizierten auf das Ziel von NM-Neuronen: den dorsalen Nucleus laminaris (NL) auf der ipsilateralen Seite (Abbildung 1L) und die ventrale NL auf der kontralateralen Seite (Abbildung 1K). Der Knockdown-Effekt der Fmr1-shRNA wurde durch eine deutliche Verringerung der FMRP-Immunreaktivität in transfizierten NM-Neuronen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen validiert (Abbildung 1M-N). Im auditorischen Ganglion (AG) waren Neuronen nicht transfiziert (EGFP-), obwohl einige Gliazellen, die AG-Neuronen umgeben, EGFP+ waren (Abbildung 1O-P), vermutlich abgeleitet von EGFP+ kranialen Neuralleistenzellen (siehe Abbildung 1F). Somit sorgt diese Elektroporationsstrategie für eine selektive Transfektion der postsynaptischen Neuronen im AG-NM-Schaltkreis.
FMRP-Knockdown im Gehörgang
Das Plasmidgemisch wurde bei HH13 in die Otozyste injiziert (Abbildung 2A), gefolgt von einer Elektroporation, bei der die positive Seite der Elektrode vor der Otozyste und die negative Seite hinter der Otozyste platziert wurde (Abbildung 2B). Ganzkopfschnitte bei E6 zeigten eine starke EGFP-Fluoreszenz in der rechten Otozyste, aber nicht im Hirnstamm (Abbildung 2C). Isolierte Gehörgänge bei E9 zeigten eine ausgedehnte EGFP-Fluoreszenz über die gesamte Länge des Kanals (Abbildung 2D-E). An Querschnitten wurden EGFP+-Zellen in der Basilarpapille (BP) entlang der Wand des Cochlea-Gangs und in der AG bestätigt (Abbildung 2F-G). Der Knockdown-Effekt von Fmr1 shRNA wurde durch eine deutliche Reduktion der FMRP-Immunreaktivität in transfizierten Haarzellen (*, Abbildung 2H-J) im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Haarzellen validiert (•, Abbildung 2H-J). Für Stützzellen war die FMRP-Immunreaktivität sowohl in transfizierten als auch in nicht transfizierten Zellen schwach (Abbildung 2H-J). Ähnlich wie bei Haarzellen war die FMRP-Immunreaktivität in transfizierten AG-Neuronen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen weitgehend vermindert (Abbildung 2K-M).
Als nächstes verfolgten wir die zentrale Projektion von transfizierten AG-Neuronen über den Hörnerv zum Hirnstamm. Das Mosaikmuster der Fmr1-shRNA-Transfektion in der AG wurde bei E6 unter Verwendung der Islet-1-Immunreaktivität weiter bestätigt (Abbildung 3A), einem Marker für das sich entwickelnde Hühnerinnenohr 31. Wenn ein Teil der AG während der Dissektion mit dem Hirnstamm extrahiert wurde, wurden isolierte EGFP+ AG-Neuronen und ihre Fasern innerhalb des Hirnstamms in situ in den gleichen Präparaten sichtbar gemacht (Abbildung 3B-C). Auf transversalen Abschnitten auf Höhe der NM hatten EGFP+ ANFs die NM bei E9 erreicht (Abbildung 3D) und wurden kontinuierlich bei E15 und E19 beobachtet (Abbildung 3E-F). Bilder mit hoher Vergrößerung zeigten wachstumskegelartige Enden von ANFs bei E9 (Abbildung 3H), die die große handflächenartige Endbulb bei E15 bildeten, bevor sie in die charakterisierte Endbulb der Held-Morphologie mit komplexen Zweigen bei E19 wuchsen (Abbildung 3I-J). Über die NM hinaus wurden ausgedehnte Verzweigungen von ANFs auch im NA, einem weiteren primären Cochlea-Kern, beobachtet (Abbildung 3E). Dies wurde erwartet, da dieselben ANFs sich verzweigen, um sowohl die NM als auch die NA bei Hühnern zu innervieren32. Wir sahen auch, wie EGFP+-Fasern in die benachbarten vestibulären Zellgruppen eintraten, einschließlich des absteigenden vestibulären Kerns (VeD), wie in Abbildung 3E gezeigt. Obwohl wir die Position der elektropolierenden Elektrode optimiert haben, um bevorzugt auf den vorderen Teil der Otozyste zu zielen, wo AG gebildet wird, wurden auch einige vestibuläre Ganglienneuronen transfiziert. Die Immunfärbung für Parvalbumin, ein Marker für ANFs bei Hühnern, kann verwendet werden, um auditive vs. vestibuläre Fasern im Hirnstamm zu unterscheiden (Abbildung 3F-G).
Zusammenfassend bietet diese Elektroporationsstrategie eine selektive Transfektion der präsynaptischen Neuronen im AG-NM-Schaltkreis und kann verwendet werden, um die Entwicklung von Endbulb von Held auf einzelnen terminalen Ebenen nach genetischen Manipulationen zu verfolgen.
Abbildung 1. FMRP-Knockdown im Hühner-NM. (A) Bild des Elektroporationsaufbaus. (B) Schematische Zeichnung, die die Mikroinjektionsstelle auf dem Rhombomer-r5/6-Niveau eines HH12-Hühnerembryos zeigt. Abkürzungen: NT = Neuralrohr; SO = Somit. (C) Zur Verbesserung der Sichtbarkeit wurde indische Tinte (schwarz) mit einer Spritze unter den Embryo injiziert. Die mit schnellem Grün gefärbte Plasmidmischung wurde dann in das Lumen des Neuralrohrs injiziert. (D) Positionierung der bipolaren Elektrode für die Elektroporation. + und - geben die positive bzw. negative Seite an. Beachten Sie, dass die blaue Plasmidmischung nach der Elektroporation auf der positiven Seite in das Neuralrohr diffundierte. (E-F) Hellfeldbild (BF) (E) verschmolz mit EGFP-Kanal (F) eines elektropolierten Hühnerembryos am embryonalen Tag 3 (E3) und zeigte eine Transfektion im Neuralrohr auf der gleichen anteroposterioren Ebene der Otozyste. Dox wurde bei E2, 6 h nach der Elektroporation appliziert. Wandernde Zellen der Schädelneuralleiste (CNC) werden durch den gelben Pfeil angezeigt und im Einschub in F vergrößert. Maßstabsbalken = 500 μm in E, gilt für E und F; 100 μm im Einschub. (G-H) Transfizierte Zellen mit Fmr1 shRNA und EGFP im Querschnitt eines transfizierten E3-Embryos. EGFP+-Zellen waren auf einer Seite des Neuralrohrs eingeschlossen. Der Abschnitt war doppelt mit FMRP-Immunreaktivität (grau) gefärbt. Maßstabsbalken = 40 μm in G, gilt für G und H. (I-J) BF-Bild (I) verschmolzen mit EGFP-Kanal (J) eines E15-Hirnstamms nach Dox-Behandlung bei E8. Maßstabsbalken = 1 mm in I, gilt für I und J. (K-L) Querschnitt eines E15-Hirnstamms mit EGFP+ NM-Neuronen nur auf der transfizierten (trans) Seite. Auf der kontralateralen (kontra) Seite (K) wurden EGFP+-Axone im ventralen Teil des Nucleus laminaris (NL) beobachtet. (M-N) Bilder der NM mit hoher Vergrößerung bei E19 mit doppelter Markierung von FMRP (rot) und SNAP25 (blau) Immunfärbung. SNAP25 ist ein präsynaptischer Marker, der die Endbulb von Held kennzeichnet. Beachten Sie die deutliche Verringerung der FMRP-Immunreaktivität in den transfizierten (grün; *) Neuronen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen (•). (O-P) Hochvergrößernde Bilder des Gehörganglions (AG) bei E19 mit FMRP-Immunreaktivität. AG-Neuronen (AGN) wurden nicht transfiziert (EGFP-). Einige Gliazellen, die von CNC-Zellen abgeleitet wurden, die in F angegeben sind, wurden transfiziert. Maßstabsbalken = 10 μm in M, gilt für M-P. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. FMRP-Knockdown im Hühnergehörgang. (A) Hellfeldbild (BF), das die Mikroinjektion von Plasmiden in die Otozyste bei HH13 zeigt. Indische Tinte (schwarz) wurde unter den Embryo injiziert, um die Sichtbarkeit zu verbessern. (B) Positionierung der bipolaren Elektrode für die Elektroporation. Die positive Seite (gekennzeichnet mit einem Plus-Symbol, +) wurde vor der Otozyste positioniert, und die negative Seite (gekennzeichnet mit einem Minus-Symbol, -) wurde hinter der Otozyste platziert. (C) Der Querschnitt eines Hühnerkopfes bei E6 wurde für FMRP (rot) und Neurofilament (NF; blau) immungefärbt. Dox wurde nach der Elektroporation an E3 appliziert. EGFP-Fluoreszenz wurde in der Otozyste, aber nicht im Hirnstamm nachgewiesen. Maßstabsbalken = 100 μm. (D-E) BF-Bild (D) verschmolzen mit EGFP-Kanal (E) eines Gehörgangs bei E9. Maßstabsbalken = 500 μm. (F-G) Querschnitt eines E9-Gehörgangs mit FMRP (rot) und NF (blau) Immunfärbung. EGFP+-Zellen wurden in der Cochlea-Gangwand, der Basilarpapille (BP) und dem Gehörganglion (AG) beobachtet. Maßstabsbalken = 50 μm in F, gilt für F und G. (H-J) Bilder mit hoher Vergrößerung eines E9 BP zeigen eine stark verminderte FMRP-Immunreaktivität in transfizierten Haarzellen (HCs; *) im Vergleich zu nicht transfizierten HCs (•). NF-positive Fasern (blau) waren die periphere Innervation von AG-Neuronen. (K-M) Bilder mit hoher Vergrößerung von AG-Neuronen bei E9 mit FMRP-Immunfärbung (rot). Die FMRP-Immunreaktivität war in nicht transfizierten Neuronen stark (•) und in transfizierten Neuronen (EGFP+; *) nicht nachweisbar. Maßstabsbalken = 50 μm in H und gilt für H-M. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Axonales Tracking von transfizierten AG-Neuronen im Hirnstamm. Die Embryonen wurden bei HH13 für die Otozystentransfektion von Fmr1 shRNA elektropoliert. Die Dox-Anwendung begann bei E2. (A) Querschnitte eines E6-Hühnerkopfes mit Islet-1-Immunfärbung und DAPI-Gegenfärbung. EGFP+-Zellen zeigten sich im auditorischen Ganglion (AG). Sterne* zeigen mehrere transfizierte AG-Neuronen im Einschub an. Maßstabsbalken = 100 μm in A und 10 μm im Einschub. (B-C) Hellfeldbild (BF) (B) verschmolzen mit EGFP-Kanal (C) eines E9-Hirnstamms. In diesem Fall blieb ein Teil der AG (weiße Pfeile) mit dem auditorischen Hirnstamm verbunden. Der gelbe Pfeil zeigt transfizierte AG-Neuronen (AGN) im Einschub an. EGFP+-Fasern waren auf der transfizierten Seite des Hirnstamms offensichtlich. Maßstabsbalken = 1 mm in B, gilt für B und C; 100 μm im Einschub. (D) Querschnitt des Hirnstamms E9 auf dem Niveau, das in C durch die gestrichelte Linie angegeben ist. EGFP+ Hörnervenfasern (ANF; grün) erstreckten sich entlang des dorsalen Randes des Hirnstamms und näherten sich dem Nucleus magnocellularis (NM). Maßstabsbalken = 100 μm. (E-G) EGFP+ Fasern bei E15 (E) und E19 (F-G). Einige Fasern wurden auch im Nucleus angularis (NA) und im absteigenden vestibulären Kern (VeD) beobachtet. E19-Abschnitte wurden auf Parvalbumin (PV) Immunreaktivität als Marker für ANFs gefärbt. Der gestrichelte Kasten in F ist in den Einsätzen vergrößert und zeigt ein EGFP+ ANF, das PV immunreaktiv war. Maßstabsbalken = 100 μm in E; 50 μm in F, gilt für F und G; 2 μm in den Einsätzen. (H-J) Bilder mit hoher Vergrößerung von ANF-Terminals in NM bei E9, E15 und E19, die die Bildung und fortschreitende Reifung des Endbulbs von Held zeigen. Maßstabsbalken = 5 μm in H, gilt für H-J. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Um die zellautonome Funktion von FMRP zu bestimmen, ist es notwendig, seine Expression in einzelnen Zellgruppen oder Zelltypen zu manipulieren. Da eine der Hauptfunktionen von FMRP darin besteht, die synaptische Bildung und Plastizität zu regulieren, ist die selektive Manipulation jeder synaptischen Komponente eines bestimmten Schaltkreises Voraussetzung für ein vollständiges Verständnis des FMRP-Mechanismus in der synaptischen Kommunikation. Unter Verwendung der Ovo-Elektroporation von Hühnerembryonen demonstrierten wir eine Methode, um die FMRP-Expression im AG-NM-Schaltkreis zu steuern, entweder in präsynaptischen AG-Neuronen oder postsynaptischen NM-Neuronen. Um dies zu erreichen, sind die Auswahl geeigneter Entwicklungsstadien für die Elektroporation und die genaue Positionierung der Elektroporationselektrode auf dem Embryo entscheidende Schritte. NM-Neuronen entstehen aus neuronalen Vorläuferzellen im Neuralrohr auf der r5/6-Ebene bei HH1223. Im gleichen Stadium wandern kraniale Neuralleistenzellen von der dorsalen Spitze des Neuralrohrs zum Cochleovestibularganglion, um zukünftige AG-Neuronen zu umhüllen33. Somit sind sowohl die NM-Neuronen als auch die Gliazellen im AG vom Neuralrohr abgeleitet. Im Gegensatz dazu stammen Haarzellen und AG-Neuronen aus dem Ektoderm24. Das an die r5/6-Ebene angrenzende Ektoderm verdickt sich bei HH10 und invaginiert dann, um den otischen Becher bei HH13 zu bilden. Die otische Tasse schließt sich dann und trennt sich vom Ektoderm, um die Otozyste zu bilden, wobei der vordere Teil zum auditiven Sinnesorgan wird und der hintere Teil zum vestibulären System beiträgt. Sowohl im auditorischen als auch im vestibulären Teil delaminatieren die Neuroblastenzellen, die sich im ventralen Teil der otischen Tasse befinden, und wandern zum cochleovestibulären Ganglion. Aufbauend auf diesen Schicksalskartierungsstudien transfizierten wir die Vorläuferzellen von NM-Neuronen, indem wir das Neuralrohr an HH12 elektropolierten, eine Strategie, die zuvor etabliert wurde26,28,34. Obwohl diese Strategie zu einer zusätzlichen Transfektion von Gliazellen im Hirnstamm und der AG führt, wurde keines der AG-Neuronen transfiziert. Neuronal-spezifische Transfektion kann durch den Einsatz einer Atoh1-Promotor-getriebenen Strategie erreicht werden, wie wir es zuvor getan haben21. Für die selektive Transfektion von AG-Neuronen haben wir die Otozyste an HH13 elektropoliert. Plasmide, die in den otischen Becher injiziert wurden, drangen überwiegend in den vorderen Teil der Otozyste für die Haarzellen- und AG-Neuronentransfektion gleichzeitig ein, wenn Elektroden positioniert wurden, wie in Abbildung 2B gezeigt. Um bevorzugt AG-Neuronen gegenüber Haarzellen anzugreifen, ist es möglich, die Plasmidlösung direkt in die Region neben der vorderen Otozyste zu injizieren, wo sich die delaminierten Neuroblasten35 befinden. Diese Methode hat jedoch eine geringere Effizienz der AG-Neuronentransfektion im Vergleich zur Otozysteninjektion, da die Plasmide nach der Injektion schnell diffundieren. Diese Methode kann auch zu einer zusätzlichen Transfektion der umgebenden Kopfmesenchymzellen führen. Eine Methode, um Haarzellen gegenüber AG-Neuronen bevorzugt anzugreifen, besteht darin, die Otozysteninjektion und Elektroporation zu HH18 (~embryonaler Tag 3) zu verzögern, da die Mehrheit der Neuroblasten (AG-Neuronenvorläufer) in diesem Stadium aus der Otozyste ausgewandert ist24.
Mit Modifikationen kann diese Methode erweitert werden, um das vestibuläre System zu untersuchen. Für die vestibuläre Ganglientransfektion muss die in Abbildung 2B gezeigte Richtung der Elektroden umgekehrt werden, um den hinteren Teil der Otozyste aufgrund der unterschiedlichen Position der auditiven und vestibulären Ganglienvorläufer zu transfizieren.
In der Ovo ist die Elektroporation von Hühnerembryonen eine etablierte Technik zur Untersuchung früher Entwicklungsstadien (innerhalb der ersten Woche der Inkubation). Für Langzeitstudien ist die Überlebensrate ein großes Problem. Zu Beginn der Dox-Behandlung bei E8 beträgt die hier gefundene Überlebensrate ~ 60% bei E9, sinkt jedoch bei E15 auf 30% und bei E19 noch niedriger. Schlüpflinge aus elektrobetriebenen Eiern sind möglich, aber selten und können in den meisten Fällen nur mehrere Tage überleben. Um die Überlebensrate zu erhöhen, sollte Folgendes berücksichtigt werden: 1) Verwenden Sie einen Elektroporator, der Rechteckwellen anstelle von scharfen Wellen liefert; 2) Tragen Sie ein oder zwei Tropfen steriles PBS auf die Oberseite des Embryos auf, wenn die Albuminschicht nicht dick genug ist, um die elektrische Leitfähigkeit zu fördern (dies hilft, elektrische Traumata zu reduzieren); 3) Das Öffnen der Vitellinmembran zur Freilegung des Embryos an der Injektionsstelle ist für eine erfolgreiche Transfektion nicht erforderlich und kann den Embryo schädigen. 4) Um das Risiko einer Kontamination zu verringern, verwenden Sie eine Spritze, um den Parafilm zu stechen und Dox zu verabreichen, anstatt das Fenster erneut zu öffnen. Wischen Sie nach der Injektion die transparente Folie mit 75% Ethanol ab und bedecken Sie die Nadelöffnung mit Klebeband; 5) Für die Otozystentransfektion injizieren Sie Plasmide dorsolateral mit einer 45° abgewinkelten Pipette in die Otozyste, um eine mögliche Punktion der darunter liegenden Aorta dorsalis zu vermeiden. Wenn die Aorta dorsalis beschädigt ist, spülen Blutungen die Plasmide aus und führen sogar zum Tod; 6) Wenn möglich, vermeiden Sie die Verwendung von indischer Tinte, um den Embryo zu visualisieren. Weniger Handhabung und weniger Verfahren führen zu einer höheren Überlebensrate.
Neben der Fähigkeit, selektiv AG- oder NM-Neuronen zu transfizieren, bietet die ovo-Elektroporation ein einzigartiges System, das benachbarte Vergleiche für Datenanalysen ermöglicht. Nach der Elektroporation wird nur eine Teilmenge von Zellen entweder im NM oder im AG transfiziert, so dass die umgebenden nicht transfizierten Zellen in derselben Zellgruppe als ideale Kontrolle dienenkönnen 20. Wenn eine mögliche Interaktion zwischen benachbarten Neuronen ein Problem darstellt, können Neuronengegenstücke von der nicht transfizierten Seite des Ohrs und des Gehirns als zusätzliche Kontrolle dienen. Für histologische und bildgebende Untersuchungen ermöglicht dieses Ergebnis Datenanalysen mit hoher Effizienz auf Einzelzell- oder Einzelfaserebene. Molekulare Analysen sind auch in Kombination mit fluoreszenzbasierter Zellsortierung und groß angelegten Protein- und RNA-Analysen wie Massenspektrometrie und Next-Generation-Sequencing möglich. Die Verwendung der In-Ovo-Elektroporation als Mittel zur Genbearbeitung kann jedoch für Funktions- und Verhaltensstudien eine Herausforderung darstellen, da der Prozentsatz der transfizierten Zellen innerhalb einer Zellgruppe möglicherweise nicht groß genug ist, um zu funktionellen Konsequenzen zu führen.
Bei der Anwendung des In-Ovo-Elektroporationsansatzes müssen unbedingt zwei Verifikationsanalysen durchgeführt werden. Zunächst sollte der Effekt der Gen-Editierung auf das interessierende Protein bestätigt werden. Bei der Ovo-Elektroporation transfiziert nur eine Teilmenge von Neuronen im NM oder AG (d.h. ein Mosaikmuster). Die Durchführung von Western Blot an homogenisierten Geweben, die eine Mischung aus transfizierten und nicht transfizierten Neuronen enthalten, ist nicht empfindlich genug, um den Knockdown-Effekt genau widerzuspiegeln. Daher muss die Validierung auf Einzelzellebene mit Methoden wie der Immunzytochemie durchgeführt werden. Zu diesem Zweck haben wir zuvor einen Antikörper erzeugt, der Hühner-FMRP erkennt. Die Spezifität dieses Antikörpers wurde durch Immunzytochemie und Western Blot in einer früheren Studie30 überprüft. Der Knockdown-Effekt von Fmr1 shRNA wurde quantitativ validiert, indem eine signifikante Verringerung der Intensität der FMRP-Immunreaktivität in transfizierten NM-Neuronen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen beobachtet wurde. Zweitens sollten Kontrollgruppen, die verschlüsselte RNAs oder andere Kontrollkonstrukte verwenden, verwendet werden, um die Spezifität der beobachteten zellulären Effekte der FMRP-Fehlexpressionzu bestätigen 20,21. Um dieses Ziel zu erreichen, entwarfen wir eine verschlüsselte shRNA, klonierten sie in dasselbe Tet-On-Vektorsystem und elektropolierten sie in NM-Vorläufer, wie zuvor beschrieben20. Die FMRP-Expression in den NM-Neuronen, die mit der verschlüsselten shRNA transfiziert wurden, wurde nicht beeinflusst, wie die unveränderte Intensität der FMRP-Immunreaktivität im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen zeigt. Wir haben auch eine Reihe von Effekten der Fmr1-shRNA-Transfektion auf das axonale Wachstum, die dendritische Beschneidung, die terminale Bildung und die Neurotransmission identifiziert (überprüft in Curnow und Wang, 2022)36. Wir folgerten, dass diese Effekte spezifisch durch den zellautonomen Verlust von FMRP induziert wurden, da die verschlüsselte shRNA keine ähnlichen Veränderungen induzierte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die In-Ovo-Elektroporationstechnik eine selektive Fmr1-Genbearbeitung mit zeitlicher Kontrolle und Komponentenspezifität in den auditiven Ohr-Hirn-Stamm-Schaltkreisen ermöglicht und modifiziert werden kann, um das vestibuläre System zu manipulieren. Die Entwicklung dieser fortschrittlichen Technologie im Hühnerembryo, ein etabliertes Modell in der Entwicklungsbiologie, hat und wird weiterhin zu unserem Verständnis der Gehirnentwicklung unter normalen und abnormalen Bedingungen wie FXS beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt von: einem Stipendium der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32000697); das Wissenschafts- und Technologieprogramm von Guangzhou (202102080139); die Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); die Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten (11620324); ein Forschungsstipendium des Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University (No. ZSYXM202107); die Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten Chinas (21621054); und die Medical Scientific Research Foundation der chinesischen Provinz Guangdong (20191118142729581). Wir danken dem medizinischen Experimentalzentrum der Jinan Universität. Wir danken Dr. Terra Bradley für die sorgfältige Bearbeitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
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