Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा श्रवण सर्किट में नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन के सेल-स्वायत्त कार्य का विच्छेदन

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करते हुए, हमने सर्किट असेंबली की असतत अवधि के दौरान नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन के सेल-समूह-विशिष्ट वध को प्राप्त करने के लिए चिकन भ्रूण में श्रवण आंतरिक कान और कॉक्लियर न्यूक्लियस को चुनिंदा रूप से स्थानांतरित करने की एक विधि तैयार की।

Abstract

नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन (एफएमआरपी) एक एमआरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन है जो स्थानीय प्रोटीन अनुवाद को नियंत्रित करता है। एफएमआरपी हानि या शिथिलता नाजुक एक्स सिंड्रोम (एफएक्सएस) में असामान्य न्यूरोनल और सिनैप्टिक गतिविधियों की ओर जाता है, जो बौद्धिक विकलांगता, संवेदी असामान्यताओं और सामाजिक संचार समस्याओं की विशेषता है। एफएमआरपी फ़ंक्शन और एफएक्सएस रोगजनन का अध्ययन मुख्य रूप से ट्रांसजेनिक जानवरों में एफएमआर 1 (जीन एन्कोडिंग एफएमआरपी) नॉकआउट के साथ आयोजित किया गया है। यहां हम चिकन भ्रूण का उपयोग करके सर्किट असेंबली और सिनैप्टिक गठन की अवधि के दौरान एफएमआरपी के सेल-स्वायत्त कार्य को निर्धारित करने के लिए एक इनविवो विधि की रिपोर्ट करते हैं। यह विधि एफएमआर 1 छोटे हेयरपिन आरएनए (एसएचआरएनए) और एक ईजीएफपी रिपोर्टर युक्त दवा-इंड्यूसेबल वेक्टर सिस्टम के चरण-, साइट-और दिशा-विशिष्ट इलेक्ट्रोपोरेशन को नियोजित करती है। इस विधि के साथ, हमने श्रवण नाड़ीग्रन्थि (एजी) में चयनात्मक एफएमआरपी वध हासिल किया और इसके ब्रेनस्टेम लक्ष्यों में से एक में, न्यूक्लियस मैग्नोसेलुलरिस (एनएम), इस प्रकार एजी-एनएम सर्किट के भीतर एक घटक-विशिष्ट हेरफेर प्रदान किया। इसके अतिरिक्त, अभिकर्मक का मोज़ेक पैटर्न डेटा विश्लेषण में बढ़ी हुई विश्वसनीयता और संवेदनशीलता के लिए पशु नियंत्रण और पड़ोसी न्यूरॉन / फाइबर तुलना की अनुमति देता है। इंड्यूसेबल वेक्टर सिस्टम विकास ता्मक प्रभावों को कम करने के लिए जीन संपादन की शुरुआत का अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है। इन रणनीतियों का संयोजन सिनैप्टिक और सर्किट विकास में एफएमआरपी के सेल-स्वायत्त कार्य को विच्छेदित करने के लिए एक अभिनव उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

नाजुक एक्स सिंड्रोम (एफएक्सएस) एक न्यूरोडेवलपमेंटल विकार है जो बौद्धिक विकलांगता, संवेदी असामान्यताओं और ऑटिस्टिक व्यवहार की विशेषता है। ज्यादातर मामलों में, एफएक्सएस नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन (एफएमआरपी; एफएमआर 1 जीन द्वारा एन्कोडेड) के वैश्विक नुकसान के कारण होता है जो प्रारंभिक भ्रूण चरण1 से शुरू होता है। एफएमआरपी एक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन है जो आमतौर पर मस्तिष्क में अधिकांश न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं के साथ-साथ संवेदी अंगों 2,3,4 में व्यक्त किया जाता है। स्तनधारी दिमाग में, एफएमआरपी संभवतः सैकड़ों एमआरएनए से जुड़ा हुआ है जो प्रोटीन को एन्कोड करते हैं जो विभिन्नतंत्रिका गतिविधियों के लिए महत्वपूर्ण हैं। पारंपरिक एफएमआर 1 नॉकआउट जानवरों के अध्ययन से पता चला है कि एफएमआरपी अभिव्यक्ति सिनैप्टिक न्यूरोट्रांसमिशन6 की असेंबली और प्लास्टिसिटी के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। कई सशर्त और मोज़ेक नॉकआउट मॉडल ने आगे दिखाया है कि एफएमआरपी क्रियाएं और संकेत कई विकासात्मक घटनाओं के दौरान मस्तिष्क क्षेत्रों, सेल प्रकारों और सिनैप्टिक साइटों में भिन्न होते हैं, जिनमें अक्षीय प्रक्षेपण, डेंड्राइटिक पैटर्निंग और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी 7,8,9,10,11,12,13,14 शामिल हैं। . सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को विनियमित करने में एफएमआरपी के तीव्र कार्य का अध्ययन मस्तिष्क स्लाइस या सुसंस्कृत न्यूरॉन्स15,16,17,18 में निरोधात्मक एफएमआरपी एंटीबॉडी या एफएमआरपी के इंट्रासेल्युलर वितरण द्वारा किया गया था। हालांकि, ये विधियां विकास के दौरान एफएमआरपी गलत अभिव्यक्ति-प्रेरित परिणामों को ट्रैक करने की क्षमता प्रदान नहीं करती हैं। इस प्रकार, एफएमआरपी के सेल-स्वायत्त कार्यों की जांच करने के लिए विवो विधियों में विकास करना बहुत आवश्यकता है, और यह निर्धारित करने में मदद करने की उम्मीद है कि क्या एफएक्सएस रोगियों में रिपोर्ट की गई विसंगतियां संबंधित न्यूरॉन्स और सर्किट में एफएमआरपी हानि के प्रत्यक्ष परिणाम हैं, या विकासके दौरान नेटवर्क-व्यापक परिवर्तनों से प्राप्त द्वितीयक परिणाम हैं।

चिकन भ्रूण का श्रवण ब्रेनस्टेम सर्किट और सिनैप्स विकास में एफएमआरपी विनियमन के गहन कार्यात्मक विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट लाभप्रद मॉडल प्रदान करता है। भ्रूण चिकन दिमाग तक आसान पहुंच और आनुवंशिक हेरफेर के लिए ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक में अच्छी तरह से स्थापित ने प्रारंभिक भ्रूण चरणों में मस्तिष्क के विकास की हमारी समझ में बहुत योगदान दिया है। हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन में, इस तकनीक को उन्नत आणविक उपकरणों के साथ जोड़ा गया था जो एफएमआरपी मिसएक्सप्रेशन20,21 के अस्थायी नियंत्रण की अनुमति देते हैं। यहां, कार्यप्रणाली को प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक न्यूरॉन्स के चयनात्मक जोड़तोड़ को अलग-अलग प्रेरित करने के लिए उन्नत किया गया है। यह विधि श्रवण ब्रेनस्टेम सर्किट में विकसित की गई थी। ध्वनिक संकेत श्रवण आंतरिक कान में बाल कोशिकाओं द्वारा पता लगाया जाता है और फिर श्रवण नाड़ीग्रन्थि (एजी; स्तनधारियों में सर्पिल नाड़ीग्रन्थि भी कहा जाता है) को बताया जाता है। एजी इनरवेट बाल कोशिकाओं में द्विध्रुवी न्यूरॉन्स अपनी परिधीय प्रक्रियाओं के साथ और बदले में ब्रेनस्टेम में एक केंद्रीय प्रक्षेपण (श्रवण तंत्रिका) भेजते हैं जहां वे दो प्राथमिक कॉक्लियर नाभिक, न्यूक्लियस मैग्नोसेलुलरिस (एनएम) और न्यूक्लियस एंगुलरिस (एनए) में समाप्त होते हैं। एनएम में न्यूरॉन्स संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से स्तनधारी एंटरोवेंट्रल कॉक्लियर न्यूक्लियस की गोलाकार झाड़ीदार कोशिकाओं के बराबर होते हैं। एनएम के भीतर, श्रवण तंत्रिका फाइबर (एएनएफ) हेल्ड टर्मिनल22 के बड़े एंडबल्ब के माध्यम से एनएम न्यूरॉन्स के सोमाटा पर सिनैप्स करते हैं। विकास के दौरान, एनएम न्यूरॉन्स हिंडब्रेन23 में रोडोमेरेस 5 और 6 (आर 5/6) से उत्पन्न होते हैं, जबकि एजी न्यूरॉन्स ओटोसिस्ट24 में रहने वाले न्यूरोब्लास्ट्स से प्राप्त होते हैं। यहां, हम प्रीसिनेप्टिक एजी न्यूरॉन्स और पोस्टसिनेप्टिक एनएम न्यूरॉन्स में एफएमआरपी अभिव्यक्ति को अलग से अलग से मारने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

जिनान विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार अंडे और चिकन भ्रूण को देखभाल और सम्मान के साथ संभाला गया था।

1. अंडे और प्लास्मिड की तैयारी

  1. अंडे की तैयारी
    1. दक्षिण चीन कृषि विश्वविद्यालय से ताजा निषेचित चिकन अंडे (गैलस गैलस) प्राप्त करें और इनक्यूबेशन से पहले 16 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इष्टतम व्यवहार्यता के लिए, आगमन के एक सप्ताह के भीतर इनक्यूबेशन के लिए सभी अंडे निर्धारित करें।
    2. अंडे को क्षैतिज रूप से रखें और 46-48 घंटे के लिए 38 डिग्री सेल्सियस पर सेनेंचें जब तक हैमबर्गर और हैमिल्टन (एचएच) चरण12 25 न्यूरल ट्यूब अभिकर्मक के लिए, या ओटोसिस्ट अभिकर्मक के लिए एचएच 13 तक 54-56 घंटे तक। क्योंकि अंडे का पशु ध्रुव वनस्पति ध्रुव की तुलना में हल्का होता है, क्षैतिज प्लेसमेंट आसान हेरफेर के लिए भ्रूण को अंडे के शीर्ष पर रखता है। अंडे को इसमें क्षैतिज रखने के लिए सावधानी बरतें और सभी निम्नलिखित चरणों का पालन करें।
    3. टॉर्च का उपयोग करके अंडे के नीचे से प्रकाश डालते समय भ्रूण का स्थान अंडे के छिलके पर एक अंधेरे क्षेत्र के रूप में दिखाई देता है। वांछित एचएच चरणों में, पेंसिल के साथ अंडे के छिलके पर भ्रूण के स्थान को चिह्नित करने के लिए इस टॉर्च विधि का उपयोग करें।
    4. अंडे को 75% इथेनॉल युक्त धुंध के साथ पोंछें। कैंची की नोक का उपयोग करके अंडे के नुकीले छोर में एक छेद करें और 18 ग्राम सुई सिरिंज के साथ 2 एमएल एल्बुमिन निकालें। सुनिश्चित करें कि छेद केवल सुई सम्मिलन की अनुमति देने के लिए पर्याप्त बड़ा है। धुंध के साथ किसी भी लीक एल्बुमिन को मिटा दें और छेद को स्पष्ट टेप के साथ सील करें।
    5. दरारों को कम करने और खिड़की के दौरान गिरने वाले शेल मलबे को रोकने के लिए, पेंसिल-चिह्नित अंधेरे क्षेत्र पर केंद्रित अंडे के शीर्ष को स्पष्ट टेप के साथ कवर करें।
  2. प्लास्मिड डीएनए निष्कर्षण
    1. क्लोन चिकन एफएमआर 1 एसएचआरएनए एक ट्रांसपोसन-आधारित टेट-ऑन सिस्टम का उपयोग करके जैसा कि पहले20 वर्णित है। इस प्रणाली में तीन प्लास्मिड होते हैं: पीसीएजीजीएस-टी 2 टीपी, पीटी 2 के-सीएजीजीएस-आरटीटीए-एम 2, और पीटी 2 के-बीआई-टीआरई-ईजीएफपी-एफएमआर 1 एसएचआरएनए, एक दवा-इंड्यूसेबल वेक्टर सिस्टम प्रदान करता है जिसके द्वारा एफएमआर 1 एसएचआरएनए और ईजीएफपी की अभिव्यक्ति अभिकर्मक के बाद शांत हो जाती है और डॉक्सीसाइक्लिन (डॉक्स) प्रेरण द्वारा चालू की जा सकती है।
      नोट: ये प्लास्मिड वर्तमान में एक भंडार में उपलब्ध नहीं हैं। लेखक उचित अनुरोध पर प्लास्मिड प्रदान करने के लिए सहमत हैं।
    2. निर्माता के निर्देश के अनुसार एंडोटॉक्सिन-मुक्त तैयारी किट का उपयोग करके प्लास्मिड डीएनए निकालें और 7.5 एम सोडियम एसीटेट की 1/15 मात्रा और 100% आइसोप्रोपेनॉल की 1 मात्रा जोड़कर अवक्षेपित करें।
    3. प्लास्मिड को रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर और सेंट्रीफ्यूज को 10 मिनट के लिए 13,000 x g पर अवक्षेपित करें। किट में प्रदान किए गए ट्राइस-ईडीटीए बफर के साथ गोली को 4-5 μg / μL की अंतिम सांद्रता तक घोलें। प्लास्मिड को कम अभिकर्मक दक्षता के बिना 12 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. इलेक्ट्रोपोरेशन के दिन, पिपेट टिप का उपयोग करके एक बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक प्लास्मिड के 2 μL को अच्छी तरह से मिलाएं। प्लास्मिड मिश्रण का परिणामी 6 μL की मात्रा तीन दर्जन अंडों को इलेक्ट्रोपोरेट करने के लिए पर्याप्त है। इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान प्लास्मिड की कल्पना करने में मदद करने के लिए, डीएनए मिश्रण26 के प्रत्येक 6 μL के लिए 0.1% तेज हरे रंग (बाँझ ddH2O में तैयार) का 1 μL जोड़ें, जो प्लास्मिड मिश्रण को नीला कर देता है।

2. विद्युतीकरण में

  1. अंडे की खिड़की और भ्रूण की पहचान
    1. इलेक्ट्रोपोरेशन के दिन, इनक्यूबेटर से अंडे निकालें, एक बार में एक दर्जन अंडे। अंडे को 1 घंटे से अधिक समय तक अपने इनक्यूबेटर से बाहर रखने से विकासात्मक विविधताओं का परिचय मिलता है और व्यवहार्यता कम हो जाती है।
    2. 75% इथेनॉल युक्त धुंध के साथ सभी सर्जरी उपकरणों को पोंछें।
    3. प्रत्येक अंडे को कस्टम-निर्मित फोम धारक में रखें। टेप से ढके क्षेत्र को 75% इथेनॉल के साथ पोंछें और कैंची की एक छोटी जोड़ी (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके पेंसिल चिह्न की परिधि के चारों ओर एक खिड़की (1-2 सेमी 2) काटें। काटते समय, कैंची को सपाट रखें ताकि नीचे भ्रूण को नुकसान न पहुंचे।
    4. खिड़की वाले अंडे को 10x आईपीस और 2x ज़ूम के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें और भ्रूण की पहचान करें। बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन के लिए प्रकाश स्रोत के कोण और चमक को समायोजित करें।
      नोट: भ्रूण की कल्पना करने और इस स्तर पर तंत्रिका ट्यूब की पहचान करने के लिए अभ्यास और अनुभव की आवश्यकता होती है।
      1. शुरुआती लोगों के लिए, भ्रूण की पहचान की सुविधा के लिए निम्नलिखित वैकल्पिक स्याही इंजेक्शन का उपयोग करें। 10% भारतीय स्याही का घोल 0.01 एम फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) और ऑटोक्लेव में पहले से तैयार करें। स्याही के घोल के साथ एक 1 एमएल सिरिंज भरें और फिर 27 जी सुई फिट करें। सुई को बल के साथ 45 ° कोण पर मोड़ें।
      2. माइक्रोस्कोप के नीचे, ध्यान से क्षेत्र ओपाका के किनारे से पोक करें और भ्रूण के नीचे सुई डालें। इंजेक्शन ~ 50 μL स्याही, जो भ्रूण विज़ुअलाइज़ेशन के लिए क्षेत्र पेलुसीडा के नीचे फैल जाएगा। स्याही भ्रूण के स्पष्ट दृश्य के लिए एक अंधेरे पृष्ठभूमि का निर्माण करेगी।
        नोट: सम्मिलन और इंजेक्शन से पहले सिरिंज से हवा को बाहर निकालें। कल्पना करने में कुशल होने पर, स्याही इंजेक्शन चरण से बचें क्योंकि यह जीवित रहने की दर को कम करता है।
  2. न्यूरल ट्यूब इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन
    नोट: यह प्रक्रिया ब्रेनस्टेम में एनएम न्यूरॉन्स को स्थानांतरित करने के लिए एचएच 12 में की जाती है।
    1. पिपेट पुलर का उपयोग करके पिपेट में ग्लास केशिकाओं (~ 1 मिमी व्यास और 100 मिमी लंबा) को खींचें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, सावधानीपूर्वक केशिका सुई की नोक को बल के साथ व्यास में 10-20 μm तक खोलें। उपयोग होने तक एक भंडारण बॉक्स में पिपेट (आमतौर पर एक समय में 5-10) स्टोर करें।
    2. पिपेट के अंत में रबर ट्यूब के माध्यम से नकारात्मक दबाव लगाकर प्लास्मिड मिश्रण के 0.5-1 μL के साथ एक केशिका पिपेट भरें। यह सिरिंज या एयर पंप द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
    3. माइक्रोस्कोप के नीचे अंडे को रखें ताकि भ्रूण आपके पास पूंछ के साथ लंबवत रूप से उन्मुख हो (या क्षैतिज रूप से तीन-अक्ष मैनिपुलेटर का उपयोग करके केशिका पिपेट इंजेक्ट करने के लिए)। केशिका पिपेट को एक हाथ से या तीन-अक्ष मैनिपुलेटर के साथ पकड़ें और पिपेट के सिरे को पूंछ-से-सिर की दिशा में आर 5/6 तक चलाएं।
      नोट: सबसे पूर्ववर्ती हिंदब्रेन क्षेत्र आर 1 है और तंत्रिका ट्यूब के साथ प्रत्येक बाद का उभार एक व्यक्तिगत रोडोमेरे है। आर 5/6 ओटोसिस्ट के समान पूर्ववर्ती स्तर पर है, जो एक आसानी से पहचानने योग्य कप जैसी संरचना है (चित्रा 1 बी-सी)।
    4. धीरे से विटेलिन झिल्ली के माध्यम से और पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूब में नोक को घुमाएं और फिर पिपेट को थोड़ा वापस ले लें ताकि टिप तंत्रिका ट्यूब के लुमेन में हो। हवा का दबाव लगाकर प्लास्मिड मिश्रण को इंजेक्ट करें जब तक कि टिंटेड प्लास्मिड पूरी तरह से आर 5/6 में फैल न जाए और आर 3 और आर 4 में फैल जाए।
      नोट: इंजेक्शन के लिए विटेलिन झिल्ली पर स्लॉट बनाना आवश्यक नहीं है।
    5. एक सफल इंजेक्शन की जांच करें, जो तब प्राप्त होता है जब ब्लू प्लास्मिड समाधान रिसाव के बिना तंत्रिका ट्यूब में तेजी से फैलता है (चित्रा 1 बी-सी)। रिसाव होने पर, नीला जल्दी से फीका पड़ जाता है।
    6. इंजेक्शन के तुरंत बाद, तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 1 डी) के दोनों ओर एक प्लैटिनम द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड रखें। एक इलेक्ट्रोपोरेटर के साथ 12 वी और 50 एमएस अवधि की दो दालें वितरित करें। द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड के सिरों पर हवा के बुलबुले का निरीक्षण करें, नकारात्मक पक्ष पर अधिक के साथ।
    7. सफल इलेक्ट्रोपोरेशन की जांच करें, जो तब प्राप्त होता है जब टिंटेड प्लास्मिड मिश्रण इलेक्ट्रोड के सकारात्मक पक्ष के पास तंत्रिका ट्यूब ऊतक में प्रवेश करता है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    8. अंडे के छिलके पर खिड़की को पारदर्शी फिल्म के एक टुकड़े के साथ कवर करें जिसे वर्गों में 2 में पूर्व-काटा जाता है और 75% इथेनॉल के साथ छिड़का जाता है। अंडे को वापस अपने इनक्यूबेटर में रखें।
    9. अगले अंडे में जाने से पहले खारा में 12 वोल्ट और 50 एमएस अवधि की 10-20 दालें वितरित करके द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड को साफ करें।
  3. ओटोसिस्ट इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन
    नोट: यह प्रक्रिया आंतरिक कान में बाल कोशिकाओं और एजी न्यूरॉन्स को स्थानांतरित करने के लिए एचएच 13 में की जाती है।
    1. एचएच 13 (जो ~ भ्रूण दिवस 2.5 है) में, भ्रूण मुड़ गया है ताकि सिर का दाहिना हिस्सा ऊपर की ओर हो। माइक्रोस्कोप के नीचे, अंडे को रखें ताकि भ्रूण ऊर्ध्वाधर हो, पूंछ आपके पास हो। केशिका पिपेट को पकड़ें और धीरे से दाहिने ओटोसिस्ट को एक डोरसोलेटरल दिशा में घुमाएं (चित्रा 2 ए)।
      नोट: इस स्तर पर, ओटोसिस्ट शरीर के शीर्ष पर एक छोटी गोलाकार संरचना के रूप में दिखाई देता है जो आर 5/6 के समान पूर्ववर्ती स्तर पर होता है।
    2. प्लास्मिड मिश्रण को हवा के दबाव के साथ इंजेक्ट करें जब तक कि ओटोसिस्ट नीले समाधान27 से भर न जाए। एक सफल इंजेक्शन की जांच करें, जो तब प्राप्त होता है जब नीले प्लास्मिड मिश्रण को ओटोसिस्ट के भीतर सीमित किया जाता है और रिसाव नहीं होता है।
    3. इंजेक्शन के तुरंत बाद, द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड को ओटोसिस्ट पर रखें जैसा कि चित्र 2 बी में दर्शाया गया है। सकारात्मक और नकारात्मक पक्षों को क्रमशः ओटोसिस्ट के पूर्ववर्ती और पीछे रखें। इलेक्ट्रोपोरेटर के साथ 12 वी और 50 एमएस अवधि की दो दालें वितरित करें।
    4. सफल इलेक्ट्रोपोरेशन की जांच करें, जो तब प्राप्त होता है जब नीला प्लास्मिड मिश्रण इलेक्ट्रोड के सकारात्मक पक्ष के पास ओटोसिस्ट के ऊतक में प्रवेश करता है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड को सावधानीपूर्वक हटा दें। अंडे के छिलके पर खिड़की को एक पारदर्शी फिल्म के साथ कवर करें और अंडे को इनक्यूबेटर में वापस कर दें।

3. प्लास्मिड प्रतिलेखन शुरू करने और बनाए रखने के लिए डॉक्स का प्रशासन

  1. डॉक्स समाधान की तैयारी
    1. एक रासायनिक हुड के तहत 100 मिलीग्राम डॉक्स पाउडर को मापें और इसे 100 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस में घोलकर 1 मिलीग्राम / एमएल काम करने वाला घोल बनाएं। समाधान को 0.22 μm फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और -20 °C पर 1 mL एलिकोट स्टोर करें। प्रकाश 20,28 से बचाएं।
  2. डॉक्स का प्रशासन
    1. पूर्ण शक्ति जीन संपादन के लिए, वांछित उम्र से 24 घंटे पहले, बर्फ पर एक डॉक्स एलिकोट पिघलाएं। पारदर्शी फिल्म को भेदने वाली सिरिंज का उपयोग करके सीधे अंडे के कोरिओलैंटोइक झिल्ली पर डॉक्स के 50 μL गिराएं। इंजेक्शन के बाद पारदर्शी फिल्म या टेप के साथ सुई छेद को सील करें।
    2. वध प्रभाव को बनाए रखने के लिए, वांछित विकास चरण में ऊतक की कटाई तक हर दूसरे दिन डॉक्स का प्रशासन करें।

4. ऊतक विच्छेदन और सेक्शनिंग

  1. ब्रेनस्टेम
    1. भ्रूण चरण 3 (ई 3) और ई 6 में भ्रूण के लिए, अंडे के छिलके खोलें और कैंची के साथ संबंधित झिल्ली को काटें। भ्रूण को बाहर निकालें और इसे 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में डुबोएं।
    2. ई 9 भ्रूण के लिए, अंडे के छिलके खोलें, कैंची के साथ भ्रूण को काट दें, और सिर को पीबीएस से भरे सिलिकॉन-बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें। कक्षाओं के माध्यम से सिर को नीचे पिन करें और खोपड़ी के शीर्ष को अलग करें। सावधानी से मस्तिष्क के नीचे दोनों तरफ से बल रखें और बल के कंधों के साथ खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क को ऊपर उठाएं। मस्तिष्क को 4% पीएफए में डुबोएं।
    3. ई 15 और ई 1 9 भ्रूण के लिए, अंडे के छिलके खोलें, कैंची के साथ भ्रूण को काट दें, और सिर को पीबीएस से भरे सिलिकॉन-तल प्लेट पर रखें। खोपड़ी को उजागर करने के लिए सिर के ऊपर की त्वचा को काटें।
    4. फोरब्रेन और पुच्छल मस्तिष्क को अलग करने के लिए एक रेजर के साथ खोपड़ी के माध्यम से लंबवत रूप से प्रवेश करें। पीबीएस में पुच्छल ब्लॉक को डुबोएं, खोपड़ी के शीर्ष को हटा दें, और फिर मस्तिष्क को खोपड़ी से हटा दें।
    5. ऑप्टिक लोब के माध्यम से मस्तिष्क को नीचे पिन करें और सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम को अलग करें। श्रवण ब्रेनस्टेम को नुकसान न पहुंचाने का ध्यान रखें, जो सेरिबैलम के ठीक नीचे स्थित है। ब्रेनस्टेम से जितना संभव हो उतना ड्यूरा निकालें और फिर इसे 4% पीएफए में डुबो दें।
    6. भ्रूण और मस्तिष्क के ऊतकों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में रखें, सिवाय ई 19 ब्रेनस्टेम को छोड़कर, जिन्हें 24 घंटे के लिए एक ही स्थिति में रखा जाना चाहिए।
    7. निर्धारण के बाद, पीबीएस में ऊतक को 30% सुक्रोज युक्त निर्जलित करें जब तक कि यह ठीक न हो जाए, जिसमें आमतौर पर उम्र के आधार पर 1-3 दिन लगते हैं।
    8. एक स्लाइडिंग माइक्रोटोम का उपयोग करके कोरोनल प्लेन में 30 μm पर ब्रेनस्टेम (E15 और E19) को अनुभाग करें। पीबीएस में अनुभाग एकत्र करें और इम्यूनोस्टेनिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. E3 और E6 भ्रूण और E9 ब्रेनस्टेम के लिए, 50 μm पर अनुभाग अनुप्रस्थ रूप से। पीबीएस में अनुभाग एकत्र करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इम्यूनोस्टेनिंग से पहले जिलेटिन-लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर अनुभागों को माउंट करें। इन उम्र के लिए मोटे वर्गों को इकट्ठा करना ऊतक हैंडलिंग की सुविधा प्रदान करता है।
  2. श्रवण नलिका
    1. ई 9, ई 15, और ई 1 9 भ्रूण से ब्रेनस्टेम को हटाने के बाद, श्रवण वाहिनी, जो लौकिक हड्डी में एम्बेडेड है, खोपड़ी के नीचे आसानी से पहचान योग्य है, और अस्थायी हड्डी आसानी से आसपास की खोपड़ी से अलग हो जाती है। ई 9 भ्रूण के लिए, 4% पीएफए में पूरी अस्थायी हड्डी को ठीक करें। पुराने भ्रूण के लिए, श्रवण वाहिनी को अलग करने के लिए लौकिक हड्डी की बोनी संरचना को हटा दें और श्रवण वाहिनी को 4% पीएफए में ठीक करें।
    2. ऊतक एम्बेडिंग से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में सभी अस्थायी हड्डियों और श्रवण नलिकाओं को रखें।
    3. वर्णित के रूप में ऊतक एम्बेडिंग करें। एम्बेडिंग समाधान निम्नानुसार तैयार करें: 10% जिलेटिन (गोजातीय त्वचा से) को ठंडे पानी में भिगोएं जब तक कि जिलेटिन कणिकाएं सूज न जाएं और बस जाएं (लगभग 30 मिनट)। जिलेटिन को भंग करने के लिए मिश्रण को ~ 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और जिलेटिन के घोल में 20% सुक्रोज जोड़ें और घुलने के लिए हिलाएं। जिलेटिन-सुक्रोज समाधान को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. उपयोग के लिए, जिलेटिन-सुक्रोज समाधान को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें। श्रवण नलिकाओं को गर्म जिलेटिन-सुक्रोज घोल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 96-वेल प्लेट पर भिगोएं, जब तक कि वे ठीक न हो जाएं, आमतौर पर 30-60 मिनट।
    5. पारदर्शी फिल्म की एक पट्टी के साथ 12-वेल प्लेट के कुओं के निचले हिस्से को पंक्तिबद्ध करें। गर्म जिलेटिन-सुक्रोज समाधान की एक परत जोड़ें और जमने तक प्रतीक्षा करें। प्रत्येक कुएं में एक अस्थायी हड्डी / श्रवण वाहिनी स्थानांतरित करें।
    6. गर्म जिलेटिन-सुक्रोज समाधान की दूसरी परत के साथ ऊतक को प्रत्यारोपित करें। ऊतक की स्थिति को समायोजित करें ताकि यह जेल के केंद्र में हो और श्रवण वाहिनी क्षैतिज रूप से उन्मुख हो। प्लेट को सावधानीपूर्वक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में ले जाएं और जेल के दृढ़ होने तक प्रतीक्षा करें।
    7. जेल-ऊतक ब्लॉक को कुएं से बाहर ले जाने के लिए पारदर्शी फिल्म पट्टी खींचें। अतिरिक्त जेल को एक वर्ग ब्लॉक में ट्रिम करें और अभिविन्यास की पहचान करने के लिए ब्लॉक के एक कोने को काटें। जिलेटिन ब्लॉक को पन्नी के टुकड़े के साथ लपेटें, सूखी बर्फ पर जम जाएं, और फिर सेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. क्रायोस्टेट के साथ श्रवण वाहिनी के देशांतर के साथ ब्लॉक को 20 μm पर खंडित करें। जिलेटिन-लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सीधे अनुभागों को माउंट करें। इम्यूनोस्टेनिंग से पहले स्लाइड्स को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. इम्यूनोस्टेनिंग से पहले, जिलेटिन को भंग करने के लिए स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए पूर्व-गर्म पीबीएस (45 डिग्री सेल्सियस) में डुबोएं, और फिर अवशिष्ट जिलेटिन को हटाने के लिए कमरे के तापमान पीबीएस के साथ स्लाइड 3x धोएं।

5. इम्यूनोस्टेनिंग और माइक्रोस्कोप इमेजिंग

नोट: दो प्रकार के इम्यूनोस्टेनिंग इस बात पर निर्भर करते हैं कि क्या अनुभाग स्लाइड पर लगाए गए हैं या पीबीएस में फ्री-फ्लोटिंग हैं।

  1. स्लाइड्स पर इम्यूनोस्टेनिंग
    1. पीबीएस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए स्लाइड्स को 3x धोएं। धुंधला होने के दौरान तरल रिसाव को रोकने के लिए तेल पेन के साथ वर्गों वाले क्षेत्र को घेरें। पीबीएस में 5% सामान्य बकरी सीरम युक्त ब्लॉकिंग समाधान के साथ अनुभागों को कवर करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी (सामग्री तालिका को संदर्भित करने के लिए उपयोग की जाने वाली अंतिम एकाग्रता के लिए) को पतला करें जिसमें 0.3% ट्राइटनएक्स -100 और 5% सामान्य बकरी सीरम होता है। ब्लॉकिंग समाधान को हटा दें और फिर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ अनुभागों को कवर करें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड्स को एक बॉक्स में इनक्यूबेट करें जिसमें नीचे आसुत जल की एक परत हो।
    3. पीबीएस के साथ 10 मिनट के लिए स्लाइड्स को 3x धो लें। पीबीएस में 1:500 पर पतला फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी लागू करें जिसमें स्लाइड पर 0.3% ट्राइटनएक्स -100 होता है। प्रकाश से परिरक्षित 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
    4. पीबीएस के साथ स्लाइड 3x धो लें। धीरे से स्लाइड पर माउंटिंग माध्यम की दो बूंदें गिराएं और कवरलिप्स के साथ अनुभागों को कवर करें। कवरस्लिप और स्लाइड के बीच हवा के बुलबुले उत्पन्न न करें, इसका ध्यान रखें।
  2. पूरे माउंट भ्रूण और मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों के लिए इम्यूनोस्टेनिंग
    1. भ्रूण/अनुभागों को पीबीएस 3x के साथ एक अच्छी प्लेट में 10 मिनट के लिए धोएं। केन्द्रापसारक ट्यूबों में 0.3% ट्राइटनएक्स -100 और 5% सामान्य बकरी सीरम युक्त पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। प्रत्येक भ्रूण/खंड को ग्लास हुक के साथ एक ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 60 आरपीएम पर एक शेकर पर इनक्यूबेट करें।
    2. एक अच्छी प्लेट में प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ भ्रूण / अनुभाग 3x धोएं। प्रत्येक भ्रूण /खंड को फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान से भरे एक अंधेरे केन्द्रापसारक ट्यूब में स्थानांतरित करें और शेकर पर 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. भ्रूण /अनुभाग 3x को पीबीएस के साथ एक अच्छी प्लेट में धो लें। पीबीएस युक्त 15 सेमी डिश में जिलेटिन-लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों को माउंट करने के लिए ब्रश का उपयोग करें। स्लाइड्स को थोड़ा सूखने के बाद (~ 5 मिनट), माउंटिंग माध्यम की दो बूंदें लागू करें और एक कवरस्लिप रखें। कवरस्लिप और स्लाइड के बीच हवा के बुलबुले उत्पन्न न करें, इसका ध्यान रखें। इमेजिंग के लिए पीबीएस में पूरे माउंट ऊतकों को रखें।
  3. इमेजिंग
    1. कार्बन पाउडर युक्त सिलिकॉन तल के साथ एक डिश में पीबीएस में पूरे माउंट ऊतकों को चित्रित करें, जो एक काली पृष्ठभूमि प्रदान करता है। वाणिज्यिक छवि प्रसंस्करण Olympus सॉफ़्टवेयर पैकेज का उपयोग करके छवियों को कैप्चर और संसाधित करें, जैसा कि पहले वर्णितहै।
    2. पहले वर्णित20 के रूप में एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ स्लाइड पर अनुभागों को चित्रित करें। 10x, 20x और 63x उद्देश्यों के साथ एकल फोकल प्लेन पर अनुभागों को चित्रित करें। एक ही पैरामीटर का उपयोग करके एक ही जानवर से सभी छवियों को कैप्चर करें। सिग्नल संतृप्ति से बचने के लिए लेजर स्तर और इमेजिंग अधिग्रहण सेटिंग्स को समायोजित करने का ध्यान रखें।
    3. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि प्रसंस्करण करें। चित्रण के लिए, एक पेशेवर छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि चमक, कंट्रास्ट और गामा समायोजित करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विभिन्न साइटों पर और विभिन्न विकास चरणों में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में प्रदर्शन करके, हमने श्रवण परिधि में या श्रवण मस्तिष्क में चयनात्मक एफएमआरपी वध हासिल किया।

एनएम में एफएमआरपी का वध
चिकन एफएमआर 1 के खिलाफ छोटे हेयरपिन आरएनए (एसएचआरएनए) को टेट-ऑन वेक्टर सिस्टम में डिजाइन और क्लोन किया गया था जैसा कि पहले20 वर्णित है। इन ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए सेटअप चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। तेजी से हरे रंग के साथ रंगे प्लास्मिड डीएनए को एचएच 12 (चित्रा 1 बी-सी) पर आर 5 / आर 6 स्तर पर तंत्रिका ट्यूब में इंजेक्ट किया गया था। एक प्लेटिनम द्विध्रुवी इलेक्ट्रोड को आर 5/6 स्तर (चित्रा 1 डी) पर तंत्रिका ट्यूब के प्रत्येक तरफ रखा गया था। इलेक्ट्रोड के सकारात्मक पक्ष के पास ऊतक में प्लास्मिड को चलाने के लिए 12 वी पर दो दालें वितरित की गईं। एफएमआर 1 एसएचआरएनए और ईजीएफपी की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करने के लिए कोरियोलैंटोइक झिल्ली पर डॉक्स लागू किया गया था। डॉक्स उपचार के 24 घंटे के बाद, ईजीएफपी एक फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत स्पष्ट था। चित्रा 1 ई-एफ ई 3 पर एक उदाहरण दिखाता है जब डॉक्स को ई 2 पर लागू किया गया था। अनुप्रस्थ खंडों ने हिंडब्रेन (चित्रा 1 जी-एच) के एक तरफ ईजीएफपी अभिव्यक्ति (ईजीएफपी +) कोशिकाओं के स्थान की पुष्टि की। इसके अतिरिक्त, संक्रमित कोशिकाओं का एक समूह ओटोसिस्ट के पूर्ववर्ती पाया गया था; ये कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं थीं जो तंत्रिका ट्यूब (चित्रा 1 एफ) से वेंट्रोलेटरल रूप से पलायन करती थीं। इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूण को बाद के चरणों में सर्किट गठन का अध्ययन करने के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेट किया जा सकता है। ई 15 में, ईजीएफपी को ब्रेनस्टेम में देखा गया था, लेकिन केवल ट्रांसक्रिप्टेड साइड (चित्रा 1 आई-जे) पर। पृष्ठीय ब्रेनस्टेम के स्तर पर क्रॉस सेक्शन ने मुट्ठी भर ईजीएफपी + न्यूरॉन्स का प्रदर्शन किया जो इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 1 एल) के किनारे एनएम में बिखरे हुए थे। ईजीएफपी + फाइबर को एनएम न्यूरॉन्स के लक्ष्य पर प्रोजेक्ट करते हुए देखा गया था: पृष्ठीय नाभिक लैमिनारिस (एनएल) दूसरी तरफ (चित्रा 1 एल) और वेंट्रल एनएल विपरीत पक्ष पर (चित्रा 1 के)। एफएमआर 1 एसएचआरएनए के वध प्रभाव को पड़ोसी गैर-संक्रमित न्यूरॉन्स (चित्रा 1 एम-एन) की तुलना में ट्रांसक्रिप्टेड एनएम न्यूरॉन्स में एफएमआरपी विकृति में उल्लेखनीय कमी द्वारा मान्य किया गया था। श्रवण नाड़ीग्रन्थि (एजी) में, न्यूरॉन्स गैर-संक्रमित (ईजीएफपी-) थे, हालांकि एजी न्यूरॉन्स के आसपास की कुछ ग्लियल कोशिकाएं ईजीएफपी + (चित्रा 1 ओ-पी) थीं, जो संभवतः ईजीएफपी + कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाओं से प्राप्त होती हैं (चित्रा 1 एफ देखें)। इस प्रकार, यह इलेक्ट्रोपोरेशन रणनीति एजी-एनएम सर्किट में पोस्टसिनेप्टिक न्यूरॉन्स का चयनात्मक अभिकर्मक प्रदान करती है।

श्रवण वाहिनी में एफएमआरपी का वध
प्लास्मिड मिश्रण को एचएच 13 (चित्रा 2 ए) में ओटोसिस्ट में इंजेक्ट किया गया था, इसके बाद इलेक्ट्रोड के सकारात्मक पक्ष को ओटोसिस्ट के लिए और नकारात्मक पक्ष को ओटोसिस्ट के पीछे रखकर इलेक्ट्रोपोरेशन किया गया था (चित्रा 2 बी)। ई 6 में पूरे सिर के वर्गों ने दाएं ओटोसिस्ट में मजबूत ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया, लेकिन ब्रेनस्टेम (चित्रा 2 सी) में नहीं। ई 9 पर पृथक श्रवण नलिकाओं ने वाहिनी की लंबाई में व्यापक ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन किया (चित्रा 2 डी-ई)। अनुप्रस्थ खंडों पर, ईजीएफपी + कोशिकाओं की पुष्टि बेसिलर पैपिला (बीपी) में कॉक्लियर डक्ट की दीवार के साथ और एजी (चित्रा 2 एफ-जी) में की गई थी। एफएमआर 1 एसएचआरएनए के वध प्रभाव को पड़ोसी गैर-संक्रमित बाल कोशिकाओं (•, चित्रा 2 एच-जे) की तुलना में ट्रांसक्रिप्टेड बाल कोशिकाओं (*, चित्रा 2 एच-जे) में एफएमआरपी विकृति में उल्लेखनीय कमी द्वारा मान्य किया गया था। सहायक कोशिकाओं के लिए, एफएमआरपी विकृति संक्रमित और गैर-संक्रमित कोशिकाओं दोनों में कमजोर थी (चित्रा 2 एच-जे)। बालों की कोशिकाओं के समान, एफएमआरपी की कमी पड़ोसी गैर-संक्रमित न्यूरॉन्स (चित्रा 2के-एम) की तुलना में संक्रमित एजी न्यूरॉन्स में काफी हद तक कम हो गई थी।

हमने आगे श्रवण तंत्रिका के माध्यम से ब्रेनस्टेम में स्थानांतरित एजी न्यूरॉन्स के केंद्रीय प्रक्षेपण को ट्रैक किया। एजी में एफएमआर 1 एसएचआरएनए अभिकर्मक के मोज़ेक पैटर्न को आइलेट -1 विकृति (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके ई 6 पर आगे पुष्टि की गई थी, जो विकासशील चिकन आंतरिक कान31 के लिए एक मार्कर है। जब विच्छेदन के दौरान ब्रेनस्टेम के साथ एजी का एक हिस्सा निकाला गया था, तो पृथक ईजीएफपी + एजी न्यूरॉन्स और ब्रेनस्टेम के भीतर उनके तंतुओं को एक ही तैयारी में सीटू में देखा गया था (चित्रा 3 बी-सी)। एनएम के स्तर पर अनुप्रस्थ खंडों पर, ईजीएफपी + एएनएफ ई 9 (चित्रा 3 डी) पर एनएम तक पहुंच गया था और लगातार ई 15 और ई 1 9 (चित्रा 3 ई-एफ) पर देखा गया था। उच्च-आवर्धन छवियों ने ई 9 (चित्रा 3 एच) में एएनएफ के विकास शंकु जैसे अंत का खुलासा किया, जिसने ई 19 (चित्रा 3 आई-जे) में जटिल शाखाओं के साथ हेल्ड आकृति विज्ञान के विशेषता एंडबल्ब में विकसित होने से पहले ई 15 पर बड़ी हथेली जैसे एंडबल्ब का निर्माण किया। एनएम से परे, एएनएफ की व्यापक शाखाओं को एनए में भी देखा गया था, जो एक और प्राथमिक कॉक्लियर न्यूक्लियस (चित्रा 3 ई) था। यह अपेक्षित था, क्योंकि एक ही एएनएफ मुर्गियों32 में एनएम और एनए दोनों को इनरवेट करने के लिए विभाजित करता है। हमने ईजीएफपी + फाइबर को आसन्न वेस्टिबुलर सेल समूहों में प्रवेश करते हुए भी देखा, जिसमें अवरोही वेस्टिबुलर न्यूक्लियस (वीईडी) शामिल है जैसा कि चित्रा 3 ई में दिखाया गया है। यद्यपि हमने इलेक्ट्रोपोरेटिंग इलेक्ट्रोड के स्थान को ओटोसिस्ट के पूर्ववर्ती हिस्से को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जहां एजी बनता है, कुछ वेस्टिबुलर गैंग्लियन न्यूरॉन्स को भी स्थानांतरित किया गया था। मुर्गियों में एएनएफ के लिए एक मार्कर, परवलबुमिन के लिए इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग ब्रेनस्टेम में श्रवण बनाम वेस्टिबुलर फाइबर को अलग करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 3 एफ-जी)।

सारांश में, यह इलेक्ट्रोपोरेशन रणनीति एजी-एनएम सर्किट में प्रीसिनेप्टिक न्यूरॉन्स का चयनात्मक अभिकर्मक प्रदान करती है और इसका उपयोग आनुवंशिक जोड़तोड़ के बाद व्यक्तिगत टर्मिनल स्तरों पर हेल्ड के एंडबल्ब के विकास को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1. चिकन एनएम में एफएमआरपी वध। (ए) इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप की छवि। (बी) एचएच 12 चिकन भ्रूण के रोडोमेर आर 5/6 स्तर पर माइक्रोइंजेक्शन साइट को दिखाने वाला योजनाबद्ध ड्राइंग। संक्षेप: एनटी = तंत्रिका ट्यूब; SO = somite. (C) बढ़ी हुई दृश्यता के लिए, भारतीय स्याही (काली) को सिरिंज के साथ भ्रूण के नीचे इंजेक्ट किया गया था। प्लास्मिड मिश्रण को तेजी से हरे रंग के साथ रंगा गया था, फिर तंत्रिका ट्यूब के लुमेन में इंजेक्ट किया गया था। (डी) इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए द्विध्रुवीय इलेक्ट्रोड की स्थिति। + और - क्रमशः सकारात्मक और नकारात्मक पक्षों को इंगित करते हैं। ध्यान दें, नीले प्लास्मिड मिश्रण इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद सकारात्मक पक्ष पर तंत्रिका ट्यूब में फैल गया। (E-F) ब्राइट फील्ड (बीएफ) छवि (ई) भ्रूण के दिन 3 (ई 3) में एक इलेक्ट्रोपोरेटेड चिकन भ्रूण के ईजीएफपी चैनल (एफ) के साथ विलय हो गई, जो ओटोसिस्ट के समान एंटेरोपोस्टीरियर स्तर पर तंत्रिका ट्यूब में अभिकर्मक दिखाती है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद ई 2, 6 घंटे पर डॉक्स लागू किया गया था। माइग्रेटिंग क्रैनियल न्यूरल क्रेस्ट (सीएनसी) कोशिकाओं को पीले तीर द्वारा इंगित किया जाता है और एफ में इनसेट में बढ़ाया जाता है। स्केल बार = ई में 500 μm, E और F पर लागू होता है; इनसेट में 100 μm. (G-H) एक ट्रांसक्रिप्टेड ई 3 भ्रूण के क्रॉस सेक्शन पर एफएमआर 1 एसएचआरएनए और ईजीएफपी के साथ संक्रमित कोशिकाएं। ईजीएफपी + कोशिकाएं तंत्रिका ट्यूब के एक तरफ सीमित थीं। खंड को एफएमआरपी विकृति (ग्रे) के साथ डबल दाग दिया गया था। स्केल बार = G में 40 μm, G और H पर लागू होता है। (I-J) BF छवि (I) E8 पर Dox उपचार के बाद E15 ब्रेनस्टेम के EGFP चैनल (J) के साथ विलय हो गई। स्केल बार = I में 1 मिमी, I और J पर लागू होता है( K-L) E15 ब्रेनस्टेम के क्रॉस सेक्शन में केवल ट्रांसक्रिप्टेड (ट्रांस) साइड पर ईजीएफपी + एनएम न्यूरॉन्स होते हैं। विपरीत (कॉन्ट्रा) साइड (के) पर, ईजीएफपी + अक्षतंतु न्यूक्लियस लैमिनारिस (एनएल) के उदर भाग में देखे गए थे। (एम-एन) एफएमआरपी (लाल) और एसएनएपी 25 (नीला) इम्यूनोस्टेनिंग के डबल लेबलिंग के साथ ई 19 पर एनएम की उच्च आवर्धन छवियां। SNAP25 एक प्रीसिनेप्टिक मार्कर है जो हेल्ड के एंडबल्ब को लेबल करता है। पड़ोसी गैर-संक्रमित न्यूरॉन्स (*) की तुलना में ट्रांसक्रिप्टेड (हरे; *) न्यूरॉन्स में एफएमआरपी की कमी पर ध्यान दें ।। (ओ-पी) एफएमआरपी विकृति के साथ ई 19 पर श्रवण नाड़ीग्रन्थि (एजी) की उच्च आवर्धन छवियां। एजी न्यूरॉन्स (एजीएन) को स्थानांतरित नहीं किया गया था (ईजीएफपी-)। एफ में इंगित सीएनसी कोशिकाओं से प्राप्त कुछ ग्लियल कोशिकाओं को स्थानांतरित कर दिया गया था। स्केल बार = एम में 10 μm, M-P पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2. चिकन श्रवण वाहिनी में एफएमआरपी वध। (ए) उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) छवि एचएच 13 में ओटोसिस्ट में प्लास्मिड के माइक्रोइंजेक्शन को दर्शाती है। बढ़ी हुई दृश्यता के लिए भ्रूण के नीचे भारतीय स्याही (काली) इंजेक्ट की गई थी। (बी) इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए द्विध्रुवीय इलेक्ट्रोड की स्थिति। सकारात्मक पक्ष (प्लस प्रतीक, +के साथ लेबल) को ओटोसिस्ट के पूर्ववर्ती स्थित किया गया था, और नकारात्मक पक्ष (माइनस प्रतीक के साथ लेबल किया गया था, -) को ओटोसिस्ट के पीछे रखा गया था। (ग) ई6 में चिकन हेड के अनुप्रस्थ खंड को एफएमआरपी (लाल) और न्यूरोफिलामेंट (एनएफ; नीला) के लिए इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद ई 3 पर डॉक्स लागू किया गया था। ईजीएफपी फ्लोरेसेंस का पता ओटोसिस्ट में लगाया गया था लेकिन ब्रेनस्टेम में नहीं। स्केल बार = 100 μm. (D-E) BF छवि (D) E9 पर एक श्रवण वाहिनी के EGFP चैनल (E) के साथ विलय हो गया। स्केल बार = 500 μm. (F-G) FMRP (लाल) और NF (नीला) इम्यूनोस्टेनिंग के साथ E9 श्रवण वाहिनी का अनुप्रस्थ खंड। ईजीएफपी + कोशिकाओं को कॉक्लियर डक्ट दीवार, बेसिलर पैपिला (बीपी), और श्रवण नाड़ीग्रन्थि (एजी) में देखा गया था। (एच-जे) ई 9 बीपी की उच्च आवर्धन छवियां गैर-संक्रमित एचसी (•) की तुलना में ट्रांसक्रिप्टेड हेयर कोशिकाओं (एचसी; *) में काफी हद तक कम एफएमआरपी विकृति दिखाती हैं। एनएफ-पॉजिटिव फाइबर (नीला) एजी न्यूरॉन्स से परिधि संक्रमण थे। (के-एम) एफएमआरपी इम्यूनोस्टेनिंग (लाल) के साथ ई 9 पर एजी न्यूरॉन्स की उच्च आवर्धन छवियां। एफएमआरपी की कमी गैर-संक्रमित न्यूरॉन्स (•) में मजबूत थी और ट्रांसक्रिप्टेड न्यूरॉन्स (ईजीएफपी +; *) में पता लगाने योग्य नहीं थी। स्केल बार = H में 50 μm, और H-M पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3. ब्रेनस्टेम में संक्रमित एजी न्यूरॉन्स की अक्षीय ट्रैकिंग। एफएमआर 1 एसएचआरएनए के ओटोसिस्ट अभिकर्मक के लिए एचएच 13 में भ्रूण को इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था। Dox आवेदन E2 पर शुरू हुआ। (ए) आइलेट -1 इम्यूनोस्टेनिंग और डीएपीआई काउंटरस्टेन के साथ ई 6 चिकन हेड के अनुप्रस्थ खंड। ईजीएफपी + कोशिकाएं श्रवण नाड़ीग्रन्थि (एजी) में स्पष्ट थीं। तारे * इनसेट में कई संक्रमित एजी न्यूरॉन्स का संकेत देते हैं। स्केल बार = ए में 100 μm और इनसेट में 10 μm। (बी-सी) उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) छवि (बी) एक ई 9 ब्रेनस्टेम के ईजीएफपी चैनल (सी) के साथ विलय हो गया। इस मामले में, एजी (सफेद तीर) का एक हिस्सा श्रवण ब्रेनस्टेम से जुड़ा हुआ छोड़ दिया गया था। पीला तीर इनसेट में संक्रमित एजी न्यूरॉन्स (एजीएन) को इंगित करता है। ईजीएफपी + फाइबर ब्रेनस्टेम के ट्रांसक्रिप्टेड साइड पर स्पष्ट थे। स्केल बार = बी में 1 मिमी, बी और सी पर लागू होता है; इनसेट में 100 μm. (डी) धराशायी रेखा द्वारा सी में इंगित स्तर पर ई 9 ब्रेनस्टेम का क्रॉस सेक्शन। ईजीएफपी + श्रवण तंत्रिका फाइबर (एएनएफ; हरा) ब्रेनस्टेम के पृष्ठीय मार्जिन के साथ विस्तारित हुआ और न्यूक्लियस मैग्नोसेलुलरिस (एनएम) के पास पहुंचा। स्केल बार = 100 μm. (E-G) E15 (E) और E19 (F-G) पर EGFP + फाइबर। कुछ तंतुओं को नाभिक कोणीय (एनए) और अवरोही वेस्टिबुलर नाभिक (वीईडी) में भी देखा गया था। ई 19 वर्गों को एएनएफ के लिए मार्कर के रूप में परवलबुमिन (पीवी) विकृति के लिए दाग दिया गया था। एफ में डैश्ड बॉक्स को इनसेट में बढ़ाया जाता है, जिसमें ईजीएफपी + एएनएफ दिखाया जाता है, जो पीवी इम्यूनोरिएक्टिव था। स्केल बार = E में 100 μm; F में 50 μm, F और G पर लागू होता है; इनसेट में 2 मीटर। (एच-जे) ई 9, ई 15 और ई 1 9 में एनएम में एएनएफ टर्मिनलों की उच्च आवर्धन छवियां, हेल्ड के एंडबल्ब के गठन और प्रगतिशील परिपक्वता को दर्शाती हैं। स्केल बार = H में 5 μm, H-J पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एफएमआरपी के सेल-स्वायत्त कार्य को निर्धारित करने के लिए, व्यक्तिगत सेल समूहों या सेल प्रकारों में इसकी अभिव्यक्ति में हेरफेर करना आवश्यक है। चूंकि एफएमआरपी के प्रमुख कार्यों में से एक सिनैप्टिक गठन और प्लास्टिसिटी को विनियमित करना है, इसलिए सिनैप्टिक संचार में एफएमआरपी तंत्र की पूरी समझ के लिए चुनिंदा रूप से एक निश्चित सर्किट के प्रत्येक सिनैप्टिक घटक में हेरफेर करना आवश्यक है। चिकन भ्रूण के ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करते हुए, हमने एजी-एनएम सर्किट में एफएमआरपी अभिव्यक्ति को लक्षित करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया, या तो प्रीसिनैप्टिक एजी न्यूरॉन्स या पोस्टसिनेप्टिक एनएम न्यूरॉन्स में। इसे प्राप्त करने के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए उपयुक्त विकास चरणों का चयन करना और भ्रूण पर इलेक्ट्रोपोरेशन इलेक्ट्रोड को सटीक रूप से स्थापित करना महत्वपूर्ण कदम हैं। एनएम न्यूरॉन्स एचएच 12 23 पर आर 5/6 स्तर पर तंत्रिका ट्यूब में तंत्रिकापूर्वजों से उत्पन्न होते हैं। उसी चरण में, कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं भविष्य के एजी न्यूरॉन्स को ढंकने के लिए तंत्रिका ट्यूब के पृष्ठीय सिरे से कोक्लियोवेस्टिबुलर गैंग्लियन में स्थानांतरितहोती हैं। इस प्रकार, एजी में एनएम न्यूरॉन्स और ग्लिया कोशिकाएं दोनों तंत्रिका ट्यूब व्युत्पन्न हैं। इसके विपरीत, बाल कोशिकाएं और एजी न्यूरॉन्स एक्टोडर्म24 से उत्पन्न होते हैं। आर 5/6 स्तर से सटे एक्टोडर्म एचएच 10 पर गाढ़ा हो जाता है और फिर एचएच 13 पर ओटिक कप बनाने के लिए इनवेजाइनेट होता है। ओटिक कप तब बंद हो जाता है और ओटोसिस्ट बनाने के लिए एक्टोडर्म से अलग हो जाता है, जिसमें पूर्ववर्ती भाग श्रवण संवेदी अंग बन जाता है और पीछे का हिस्सा वेस्टिबुलर सिस्टम में योगदान देता है। श्रवण और वेस्टिबुलर दोनों भागों में, ओटिक कप के उदर भाग में रहने वाली न्यूरोब्लास्ट कोशिकाएं डिलैमिनेट करती हैं और कोक्लियोवेस्टिबुलर गैंग्लियन बनाने के लिए पलायन करती हैं। इन भाग्य मानचित्रण अध्ययनों के आधार पर, हमने एचएच 12 में तंत्रिका ट्यूब को इलेक्ट्रोपोरेट करके एनएम न्यूरॉन्स के पूर्वजों को स्थानांतरित किया, एक रणनीति जो पहले 26,28,34 स्थापित की गई है। यद्यपि यह रणनीति ब्रेनस्टेम और एजी में ग्लियल कोशिकाओं के अतिरिक्त अभिकर्मक की ओर ले जाती है, एजी न्यूरॉन्स में से कोई भी स्थानांतरित नहीं हुआ था। न्यूरोनल-विशिष्ट अभिकर्मक को एटोह 1 प्रोमोटर-संचालित रणनीति को नियोजित करके प्राप्त किया जा सकता है, जैसा कि हमने पहले21 किया था। एजी न्यूरॉन्स के चयनात्मक अभिकर्मक के लिए, हमने एचएच 13 पर ओटोसिस्ट को इलेक्ट्रोपोरेट किया। ओटिक कप में इंजेक्ट किए गए प्लास्मिड मुख्य रूप से हेयर सेल और एजी न्यूरॉन अभिकर्मक के लिए ओटोसिस्ट के पूर्ववर्ती भाग में प्रवेश करते हैं, जब इलेक्ट्रोड की स्थिति चित्र 2 बी में दिखाया गया है। बाल कोशिकाओं पर एजी न्यूरॉन्स को अधिमानतः लक्षित करने के लिए, प्लास्मिड समाधान को सीधे पूर्ववर्ती ओटोसिस्ट से सटे क्षेत्र में इंजेक्ट करना संभव है, जहां डिलेमिनेटेड न्यूरोब्लास्ट35 का पता लगाते हैं। हालांकि, इस विधि में ओटोसिस्ट इंजेक्शन की तुलना में एजी न्यूरॉन अभिकर्मक की कम दक्षता है, क्योंकि प्लास्मिड इंजेक्शन के बाद जल्दी से फैलते हैं। इस विधि से आसपास के सिर मेसेनकाइमल कोशिकाओं का अतिरिक्त अभिकर्मक भी हो सकता है। एजी न्यूरॉन्स पर बाल कोशिकाओं को अधिमानतः लक्षित करने का एक तरीका यह है कि ओटोसिस्ट इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन को एचएच 18 (जो ~ भ्रूण दिवस 3 है) में देरी करना है, क्योंकि अधिकांश न्यूरोब्लास्ट्स (एजी न्यूरॉन अग्रदूत) इस चरण24 में ओटोसिस्ट से बाहर चले गए हैं।

संशोधनों के साथ, इस विधि को वेस्टिबुलर प्रणाली का अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। वेस्टिबुलर गैंग्लियन अभिकर्मक के लिए, चित्रा 2 बी में दिखाए गए इलेक्ट्रोड की दिशा को श्रवण और वेस्टिबुलर गैंग्लियन अग्रदूतों के अलग-अलग स्थान के कारण ओटोसिस्ट के पीछे के हिस्से को स्थानांतरित करने के लिए उलट दिया जाना चाहिए।

चिकन भ्रूण के ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में विकास के शुरुआती चरणों की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है (इनक्यूबेशन के पहले सप्ताह के भीतर)। दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए, जीवित रहने की दर एक प्रमुख चिंता का विषय है। ई 8 पर डॉक्स उपचार शुरू करते समय, यहां पाई जाने वाली जीवित रहने की दर ई 9 पर ~ 60% है, लेकिन ई 15 पर 30% तक गिर जाती है, और ई 1 9 पर भी कम हो जाती है। इलेक्ट्रोपोरेटेड अंडे से हैचलिंग संभव है लेकिन दुर्लभ हैं और ज्यादातर मामलों में केवल कई दिनों तक जीवित रह सकते हैं। जीवित रहने की दर को बढ़ाने के लिए, निम्नलिखित पर विचार किया जाना चाहिए: 1) एक इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करें जो तेज तरंगों के बजाय वर्ग तरंगें प्रदान करता है; 2) भ्रूण के शीर्ष पर बाँझ पीबीएस की एक या दो बूंदें लागू करें यदि एल्बुमिन परत विद्युत चालकता को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त मोटी नहीं है (इससे विद्युत आघात को कम करने में मदद मिलेगी); 3) इंजेक्शन साइट पर भ्रूण को उजागर करने के लिए विटेलिन झिल्ली को खोलना एक सफल अभिकर्मक के लिए आवश्यक नहीं है और भ्रूण को नुकसान पहुंचा सकता है; 4) संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, पैराफिल्म को पोक करने के लिए सिरिंज का उपयोग करें और विंडो को फिर से खोलने के बजाय डॉक्स का प्रशासन करें। इंजेक्शन के बाद, पारदर्शी फिल्म को 75% इथेनॉल के साथ पोंछें और टेप के साथ खोलने वाली सुई को कवर करें; 5) ओटोसिस्ट अभिकर्मक के लिए, प्लास्मिड को 45 डिग्री कोण वाले पिपेट के साथ ओटोसिस्ट डोरसोलेटरल रूप से इंजेक्ट करें ताकि नीचे महाधमनी डोरसैलिस के संभावित पंचर से बचा जा सके। यदि महाधमनी पृष्ठीय क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो रक्तस्राव प्लास्मिड को बाहर निकाल देगा और यहां तक कि मृत्यु का कारण भी बनेगा; 6) यदि संभव हो, तो भ्रूण की कल्पना करने के लिए भारतीय स्याही का उपयोग करने से बचें। कम हैंडलिंग और कम प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप उच्च जीवित रहने की दर होगी।

चुनिंदा एजी या एनएम न्यूरॉन्स को स्थानांतरित करने की क्षमता के अलावा, ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में एक अनूठी प्रणाली प्रदान करता है जो डेटा विश्लेषण के लिए पड़ोसी तुलना की अनुमति देता है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, एनएम या एजी में कोशिकाओं का केवल एक उप-समूह स्थानांतरित हो जाता है, जिससे एक ही सेल समूह में आसपास की गैर-संक्रमित कोशिकाएं एक आदर्श नियंत्रण20 के रूप में काम कर सकती हैं। यदि पड़ोसी न्यूरॉन्स के बीच संभावित बातचीत एक चिंता का विषय है, तो कान और मस्तिष्क के गैर-संक्रमित पक्ष से न्यूरॉन समकक्ष एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में काम कर सकते हैं। हिस्टोलॉजिकल और इमेजिंग अध्ययनों के लिए, यह परिणाम एकल सेल या एकल फाइबर स्तर पर उच्च दक्षता के साथ डेटा विश्लेषण को सक्षम बनाता है। फ्लोरोसेंट-आधारित सेल सॉर्टिंग और बड़े पैमाने पर प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण जैसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ संयुक्त होने पर आणविक विश्लेषण भी संभव हैं। हालांकि, जीन संपादन के साधन के रूप में ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करना कार्यात्मक और व्यवहार अध्ययन के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि सेल समूह के भीतर संक्रमित कोशिकाओं का प्रतिशत कार्यात्मक परिणामों के परिणामस्वरूप पर्याप्त बड़ा नहीं हो सकता है।

इनवो इलेक्ट्रोपोरेशन दृष्टिकोण को अपनाते समय दो सत्यापन विश्लेषण करना आवश्यक है। सबसे पहले, रुचि के प्रोटीन पर जीन संपादन के प्रभाव की पुष्टि की जानी चाहिए। ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन में एनएम या एजी (यानी, एक मोज़ेक पैटर्न) में न्यूरॉन्स का केवल एक उप-समूह स्थानांतरित होता है। होमोजिनाइज्ड ऊतकों पर पश्चिमी धब्बा करना जिसमें ट्रांसक्रिप्टेड और नॉन-ट्रांसक्रिप्टेड न्यूरॉन्स का मिश्रण होता है, वध प्रभाव को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं है। इस प्रकार, सत्यापन को इम्युनोसाइटोकेमिस्ट्री जैसे तरीकों का उपयोग करके व्यक्तिगत सेल स्तर पर आयोजित किया जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, हमने पहले एक एंटीबॉडी उत्पन्न की थी जो चिकन एफएमआरपी को पहचानती है। इस एंटीबॉडी की विशिष्टता को पिछले अध्ययन30 में इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री और वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा सत्यापित किया गया था। एफएमआर 1 एसएचआरएनए के वध प्रभाव को पड़ोसी गैर-संक्रमित न्यूरॉन्स की तुलना में ट्रांसक्रिप्टेड एनएम न्यूरॉन्स में एफएमआरपी की तीव्रता में महत्वपूर्ण कमी देखकर मात्रात्मक रूप से मान्य किया गया था। दूसरा, एफएमआरपी गलत अभिव्यक्ति20,21 के देखे गए सेलुलर प्रभावों की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए स्क्रैम्बल्ड आरएनए, या अन्य नियंत्रण संरचनाओं का उपयोग करने वाले नियंत्रण समूहों को नियोजित किया जाना चाहिए। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हमने एक स्क्रैम्बल्ड एसएचआरएनए तैयार किया, इसे उसी टेट-ऑन वेक्टर सिस्टम में क्लोन किया, और इसे एनएम अग्रदूतों में इलेक्ट्रोपोरेट किया, जैसा कि पहले20 वर्णित है। स्क्रैम्बल्ड एसएचआरएनए के साथ स्थानांतरित एनएम न्यूरॉन्स में एफएमआरपी अभिव्यक्ति प्रभावित नहीं हुई थी, जैसा कि पड़ोसी गैर-संक्रमित न्यूरॉन्स की तुलना में एफएमआरपी विकृति की अपरिवर्तित तीव्रता से स्पष्ट है। हमने अक्षीय विकास, डेंड्राइटिक प्रूनिंग, टर्मिनल गठन और न्यूरोट्रांसमिशन (कर्नो और वांग, 2022 में समीक्षा) पर एफएमआर 1 एसएचआरएनए अभिकर्मक के कई प्रभावों की भी पहचान की है। हमने निष्कर्ष निकाला कि ये प्रभाव विशेष रूप से एफएमआरपी के सेल स्वायत्त नुकसान से प्रेरित थे क्योंकि स्क्रैम्बल्ड एसएचआरएनए समान परिवर्तनों को प्रेरित करने में विफल रहा।

अंत में, इनवो इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक श्रवण कान-ब्रेनस्टेम सर्किट में अस्थायी नियंत्रण और घटक-विशिष्टता के साथ चयनात्मक एफएमआर 1 जीन संपादन को सक्षम बनाती है और वेस्टिबुलर सिस्टम में हेरफेर करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। चिकन भ्रूण में इस उन्नत तकनीक का विकास, विकासात्मक जीव विज्ञान में एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल, एफएक्सएस जैसी सामान्य और असामान्य स्थितियों के तहत मस्तिष्क के विकास की हमारी समझ में योगदान देना जारी रखेगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन द्वारा समर्थित था: चीन अनुदान का एक राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 32000697); गुआंगज़ौ के विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (202102080139); गुआंग्डोंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2019 ए 1515110625, 2021 ए 1515010619); केन्द्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (11620324); पुनर्योजी चिकित्सा की प्रमुख प्रयोगशाला का एक अनुसंधान अनुदान, शिक्षा मंत्रालय, जिनान विश्वविद्यालय (सं। ZSYXM202107); चीन के केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (21621054); और चीन के गुआंग्डोंग प्रांत के मेडिकल साइंटिफिक रिसर्च फाउंडेशन (20191118142729581)। हम जिनान विश्वविद्यालय के चिकित्सा प्रयोगात्मक केंद्र को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक संपादन के लिए डॉ टेरा ब्रैडली को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 185 नाजुक एक्स सिंड्रोम संवेदी सर्किट आंतरिक कान कॉक्लियर न्यूक्लियस सिनैप्स गठन मस्तिष्क विकास एंडबल्ब ऑफ हेल्ड चिकन भ्रूण
<em>ओवो</em> इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा श्रवण सर्किट में नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन के सेल-स्वायत्त कार्य का विच्छेदन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter