Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

Abstract

La proteina del ritardo mentale dell'X fragile (FMRP) è una proteina legante l'mRNA che regola la traduzione proteica locale. La perdita o la disfunzione della FMRP porta ad attività neuronali e sinaptiche aberranti nella sindrome dell'X fragile (FXS), che è caratterizzata da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e problemi di comunicazione sociale. Studi sulla funzione FMRP e sulla patogenesi FXS sono stati condotti principalmente con knockout Fmr1 (il gene che codifica per FMRP) in animali transgenici. Qui riportiamo un metodo in vivo per determinare la funzione autonoma cellulare di FMRP durante il periodo di assemblaggio del circuito e formazione sinaptica utilizzando embrioni di pollo. Questo metodo impiega l'elettroporazione specifica per stadio, sito e direzione di un sistema vettoriale inducibile da farmaci contenente Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e un reporter EGFP. Con questo metodo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP nel ganglio uditivo (AG) e in uno dei suoi bersagli del tronco cerebrale, il nucleo magnocellularis (NM), fornendo così una manipolazione specifica del componente all'interno del circuito AG-NM. Inoltre, il modello a mosaico della trasfezione consente controlli all'interno degli animali e confronti neurone/fibra vicini per una maggiore affidabilità e sensibilità nell'analisi dei dati. Il sistema vettoriale inducibile fornisce il controllo temporale dell'insorgenza dell'editing genico per ridurre al minimo gli effetti accumulati sullo sviluppo. La combinazione di queste strategie fornisce uno strumento innovativo per analizzare la funzione autonoma cellulare di FMRP nello sviluppo sinaptico e circuitale.

Introduction

La sindrome dell'X fragile (FXS) è un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e comportamenti autistici. Nella maggior parte dei casi, la FXS è causata da una perdita globale della proteina di ritardo mentale dell'X fragile (FMRP; codificata dal gene Fmr1) a partire dalle prime fasi embrionali1. FMRP è una proteina legante l'RNA che è normalmente espressa nella maggior parte dei neuroni e delle cellule gliali nel cervello, così come negli organi sensoriali 2,3,4. Nel cervello dei mammiferi, FMRP è probabilmente associato a centinaia di mRNA che codificano proteine importanti per varie attività neurali5. Studi su animali knockout convenzionali Fmr1 hanno dimostrato che l'espressione di FMRP è particolarmente importante per l'assemblaggio e la plasticità della neurotrasmissione sinaptica6. Diversi modelli di knockout condizionale e a mosaico hanno ulteriormente dimostrato che le azioni e i segnali FMRP variano tra regioni del cervello, tipi di cellule e siti sinaptici durante diversi eventi di sviluppo tra cui proiezione assonale, pattern dendritico e plasticità sinaptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La funzione acuta di FMRP nella regolazione della trasmissione sinaptica è stata studiata mediante somministrazione intracellulare di anticorpi inibitori FMRP o FMRP stesso in fette di cervello o neuroni in coltura15,16,17,18. Questi metodi, tuttavia, non offrono la possibilità di tracciare le conseguenze indotte da espressioni errate di FMRP durante lo sviluppo. Pertanto, lo sviluppo di metodi in vivo per studiare le funzioni autonome cellulari di FMRP è in grande bisogno e dovrebbe aiutare a determinare se le anomalie riportate nei pazienti con FXS sono conseguenze dirette della perdita di FMRP nei neuroni e nei circuiti associati o conseguenze secondarie derivate da cambiamenti a livello di rete durante lo sviluppo19.

Il tronco cerebrale uditivo degli embrioni di pollo offre un modello straordinariamente vantaggioso per analisi funzionali approfondite della regolazione FMRP nello sviluppo di circuiti e sinapsi. Il facile accesso ai cervelli embrionali di pollo e la ben consolidata tecnica di elettroporazione ovo per la manipolazione genetica hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione dello sviluppo del cervello nelle prime fasi embrionali. In uno studio pubblicato di recente, questa tecnica è stata combinata con strumenti molecolari avanzati che consentono il controllo temporale della misespressione di FMRP20,21. Qui, la metodologia è avanzata per indurre manipolazioni selettive dei neuroni presinaptici e postsinaptici separatamente. Questo metodo è stato sviluppato nel circuito uditivo del tronco cerebrale. Il segnale acustico viene rilevato dalle cellule ciliate nell'orecchio interno uditivo e quindi trasmesso al ganglio uditivo (AG; chiamato anche ganglio a spirale nei mammiferi). I neuroni bipolari nell'AG innervano le cellule ciliate con i loro processi periferici e a loro volta inviano una proiezione centrale (il nervo uditivo) al tronco cerebrale dove terminano in due nuclei cocleari primari, il nucleo magnocellularis (NM) e il nucleo angolare (NA). I neuroni nella NM sono strutturalmente e funzionalmente paragonabili alle cellule cespugliose sferiche del nucleo cocleare anteroventrale dei mammiferi. All'interno della NM, sinapsi delle fibre nervose uditive (ANF) sulla somata dei neuroni NM attraverso il grande bulbo terminale dei terminali Held22. Durante lo sviluppo, i neuroni NM derivano dai rombomeri 5 e 6 (r5/6) nel cervello posteriore23, mentre i neuroni AG derivano dai neuroblasti che risiedono nell'otocisti24. Qui, descriviamo la procedura per abbattere selettivamente l'espressione di FMRP nei neuroni AG presinaptici e nei neuroni NM postsinaptici separatamente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Le uova e gli embrioni di pollo sono stati trattati con cura e rispetto in conformità con i protocolli animali approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Jinan.

1. Preparazione di uova e plasmidi

  1. Preparazione delle uova
    1. Procurarsi uova di gallina fresche fecondate (Gallus gallus) dalla South China Agricultural University e conservare a 16 °C prima dell'incubazione. Per una vitalità ottimale, impostare tutte le uova per l'incubazione entro una settimana dall'arrivo.
    2. Mettere le uova orizzontalmente e incubare a 38 °C per 46-48 ore fino allo stadio 1225 di Hamburger e Hamilton (HH) per la trasfezione del tubo neurale, o per 54-56 ore fino a HH13 per la trasfezione di otoste. Poiché il polo animale dell'uovo è più leggero del polo vegetale, il posizionamento orizzontale posiziona l'embrione sulla parte superiore dell'uovo per una facile manipolazione. Prestare attenzione per mantenere l'uovo orizzontale in questo e in tutti i passaggi successivi.
    3. La posizione dell'embrione appare come un'area scura sul guscio d'uovo quando si proietta luce dal fondo dell'uovo usando una torcia. Nelle fasi HH desiderate, utilizzare questo metodo torcia per contrassegnare la posizione dell'embrione sul guscio d'uovo con la matita.
    4. Pulire le uova con una garza contenente etanolo al 75%. Praticare un foro nell'estremità appuntita delle uova usando la punta delle forbici e rimuovere 2 ml di albumina con una siringa ad ago da 18 G. Assicurarsi che il foro sia abbastanza grande da consentire l'inserimento dell'ago. Pulire via l'albumina che perde con una garza e sigillare il foro con nastro trasparente.
    5. Per ridurre al minimo le crepe e per evitare la caduta di detriti del guscio durante la finestratura, coprire la parte superiore delle uova con nastro trasparente, centrando l'area scura segnata dalla matita.
  2. Estrazione del DNA plasmidico
    1. Clonare il pollo Fmr1 shRNA utilizzando un sistema Tet-on basato su trasposone come descritto in precedenza20. Questo sistema contiene tre plasmidi: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 e pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, fornendo un sistema vettoriale inducibile da farmaci attraverso il quale l'espressione di Fmr1 shRNA e EGFP viene silenziata dopo la trasfezione e può essere attivata dall'induzione della doxiciclina (Dox).
      NOTA: questi plasmidi non sono attualmente disponibili in un repository. Gli autori si impegnano a fornire i plasmidi su ragionevole richiesta.
    2. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit di preparazione privo di endotossine secondo le istruzioni del produttore e precipitare aggiungendo 1/15 di volume di acetato di sodio 7,5 M e 1 volume di isopropanolo al 100%.
    3. Precipitare i plasmidi a -20 °C durante la notte e centrifugare a 13.000 x g per 10 minuti. Sciogliere il pellet con il tampone Tris-EDTA fornito nel kit fino a una concentrazione finale di 4-5 μg/μL. I plasmidi possono essere conservati a -20 °C per 12 mesi senza ridurre l'efficienza di trasfezione.
    4. Il giorno dell'elettroporazione, mescolare accuratamente 2 μL di ciascun plasmide in una provetta sterile da centrifuga utilizzando una punta per pipetta. Il volume risultante di 6 μL della miscela plasmidica è sufficiente per elettroporare tre dozzine di uova. Per aiutare a visualizzare il plasmide durante l'elettroporazione, aggiungere 1 μL di verde veloce allo 0,1% (preparato inddH 2O sterile) per ogni 6 μL di miscela di DNA26, che trasforma la miscela plasmidica in blu.

2. Elettroporazione in ovo

  1. Finestra degli ovuli e identificazione degli embrioni
    1. Il giorno dell'elettroporazione, rimuovere le uova dall'incubatrice, una dozzina di uova alla volta. Tenere le uova fuori dalla loro incubatrice per più di 1 ora introduce variazioni di sviluppo e riduce la vitalità.
    2. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con una garza contenente etanolo al 75%.
    3. Metti ogni uovo in un portaschiuma su misura. Pulire l'area ricoperta di nastro con etanolo al 75% e tagliare una finestra (1-2 cm2) attorno alla circonferenza del segno della matita usando un piccolo paio di forbici (Figura 1A). Durante il taglio, tenere le forbici piatte per evitare di danneggiare l'embrione sottostante.
    4. Posizionare l'uovo finestrato sotto uno stereomicroscopio con un oculare 10x e uno zoom 2x e identificare l'embrione. Regolare l'angolo e la luminosità della sorgente luminosa per una migliore visualizzazione.
      NOTA: Ci vuole pratica ed esperienza per visualizzare l'embrione e identificare il tubo neurale in questa fase.
      1. Per i principianti, utilizzare la seguente iniezione di inchiostro opzionale per facilitare l'identificazione dell'embrione. Preparare in anticipo una soluzione di inchiostro indiano al 10% in soluzione salina tamponata con fosfato 0,01 M (PBS) e autoclave. Riempire una siringa da 1 mL con la soluzione di inchiostro e quindi inserire un ago da 27G. Piegare l'ago con un angolo di 45° con una pinza.
      2. Sotto il microscopio, colpire con attenzione dal bordo dell'area opaca e inserire l'ago sotto l'embrione. Iniettare ~ 50 μL di inchiostro, che si diffonderà sotto l'area pellucida per la visualizzazione dell'embrione. L'inchiostro formerà uno sfondo scuro per una chiara visualizzazione dell'embrione.
        NOTA: Espellere l'aria dalla siringa prima dell'inserimento e dell'iniezione. Quando si è esperti nella visualizzazione, evitare la fase di iniezione dell'inchiostro in quanto riduce il tasso di sopravvivenza.
  2. Iniezione di tubo neurale ed elettroporazione
    NOTA: Questa procedura viene eseguita a HH12 per trasfettare i neuroni NM nel tronco cerebrale.
    1. Tirare capillari di vetro (~1 mm di diametro e 100 mm di lunghezza) in pipette utilizzando un estrattore di pipette. Sotto un microscopio da dissezione, aprire con attenzione la punta dell'ago capillare a 10-20 μm di diametro con una pinza. Conservare le pipette (di solito 5-10 alla volta) in una scatola fino all'uso.
    2. Riempire una pipetta capillare con 0,5-1 μL della miscela plasmidica applicando una pressione negativa attraverso un tubo di gomma all'estremità della pipetta. Questo può essere ottenuto con una siringa o una pompa ad aria.
    3. Posizionare l'uovo al microscopio in modo che l'embrione sia orientato verticalmente con la coda vicino a te (o orizzontalmente per iniettare pipette capillari usando un manipolatore a tre assi). Tenere la pipetta capillare con una mano o con il manipolatore a tre assi e guidare la punta della pipetta verso l'r5/6 in direzione coda-testa.
      NOTA: L'area del cervello posteriore più anteriore è r1 e ogni successivo rigonfiamento lungo il tubo neurale è un rombomero individuale. R5/6 è allo stesso livello anteroposteriore dell'otocisti, che è una struttura a coppa facilmente riconoscibile (Figura 1B-C).
    4. Colpire delicatamente la punta attraverso la membrana vitellina e nel tubo neurale dorsale e quindi ritirare leggermente la pipetta in modo che la punta sia nel lume del tubo neurale. Iniettare la miscela plasmidica applicando la pressione dell'aria fino a quando il plasmide colorato si diffonde completamente in r5/6 e si estende in r3 e r4.
      NOTA: Non è necessario creare una fessura sulla membrana vitellina per l'iniezione.
    5. Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la soluzione plasmidica blu si diffonde rapidamente lungo il tubo neurale senza perdite (Figura 1B-C). Quando si verifica una perdita, il blu svanisce rapidamente.
    6. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare un elettrodo bipolare di platino su entrambi i lati del tubo neurale (Figura 1D). Erogare due impulsi di 12 V e 50 ms di durata con un elettroporatore. Osservare le bolle d'aria alle estremità dell'elettrodo bipolare, con più sul lato negativo.
    7. Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela plasmidica colorata entra nel tessuto del tubo neurale vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare.
    8. Coprire la finestra sul guscio d'uovo con un pezzo di pellicola trasparente che viene pre-tagliato in 2 in quadrati e spruzzato con etanolo al 75%. Rimetti l'uovo nella sua incubatrice.
    9. Pulire l'elettrodo bipolare erogando 10-20 impulsi di 12 V e 50 ms di durata in soluzione salina prima di procedere all'uovo successivo.
  3. Iniezione di otocisti ed elettroporazione
    NOTA: Questa procedura viene eseguita a HH13 per trasfettare le cellule ciliate e i neuroni AG nell'orecchio interno.
    1. A HH13 (che è ~ embrionale giorno 2.5), l'embrione si è girato in modo che il lato destro della testa sia rivolto verso l'alto. Sotto il microscopio, posiziona l'uovo in modo che l'embrione sia verticale, con la coda vicino a te. Tenere la pipetta capillare e colpire delicatamente l'otocisti destra in direzione dorsolaterale (Figura 2A).
      NOTA: In questa fase, l'otocisti appare come una piccola struttura circolare sulla parte superiore del corpo allo stesso livello anteroposteriore di r5/6.
    2. Iniettare la miscela plasmidica con pressione dell'aria fino a riempire l'otocisti con la soluzione blu27. Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la miscela di plasmide blu è confinata all'interno dell'otocisti e non fuoriesce.
    3. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare l'elettrodo bipolare sull'otocisti come illustrato nella Figura 2B. Posizionare i lati positivo e negativo anteriormente e posteriormente all'otocisti, rispettivamente. Erogare due impulsi di 12 V e 50 ms di durata con l'elettroporatore.
    4. Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela di plasmidi blu entra nel tessuto dell'otocisti vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare. Coprire la finestra sul guscio d'uovo con un film trasparente e restituire l'uovo all'incubatrice.

3. Somministrazione di Dox per avviare e mantenere la trascrizione plasmidica

  1. Preparazione della soluzione Dox
    1. Misurare 100 mg di polvere di Dox sotto una cappa chimica e scioglierla in 100 ml di PBS sterile per ottenere una soluzione di lavoro da 1 mg/ml. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,22 μm e conservare 1 mL di aliquote a -20 °C. Proteggere dalla luce20,28.
  2. Somministrazione di Dox
    1. Per l'editing genetico a piena forza, a 24 ore prima dell'età desiderata, scongelare un'aliquota Dox sul ghiaccio. Rilasciare 50 μL di Dox direttamente sulla membrana corioallantoica dell'uovo usando una siringa che penetra nel film trasparente. Sigillare il foro dell'ago con pellicola trasparente o nastro adesivo dopo l'iniezione.
    2. Per mantenere l'effetto knockdown, somministrare Dox a giorni alterni fino alla raccolta dei tessuti nella fase di sviluppo desiderata.

4. Dissezione e sezionamento dei tessuti

  1. Tronco encefalico
    1. Per gli embrioni allo stadio embrionale 3 (E3) ed E6, aprire il guscio d'uovo e tagliare la membrana associata con le forbici. Estrarre l'embrione e immergerlo in paraformaldeide (PFA) al 4% in tampone fosfato da 0,1 M.
    2. Per gli embrioni E9, aprire il guscio d'uovo, decapitare l'embrione con le forbici e trasferire la testa su una piastra con fondo di silicio riempita di PBS. Fissare la testa verso il basso attraverso le orbite e tagliare la parte superiore del cranio. Posizionare con attenzione la pinza sotto il cervello da entrambi i lati ed elevare l'intero cervello dal cranio con le spalle del forcipe. Immergere il cervello in PFA al 4%.
    3. Per gli embrioni E15 ed E19, aprire il guscio d'uovo, decapitare l'embrione con le forbici e posizionare la testa su una piastra con fondo di silicone riempita di PBS. Tagliare la pelle sulla parte superiore della testa per esporre il cranio.
    4. Incidi attraverso il cranio verticalmente con un rasoio per separare il proencefalo e il cervello caudale. Immergere il blocco caudale in PBS, rimuovere la parte superiore del cranio e quindi togliere il cervello dal cranio.
    5. Appuntare il cervello attraverso il lobo ottico e separare il cervelletto e il tronco cerebrale. Fare attenzione a non danneggiare il tronco cerebrale uditivo, che si trova proprio sotto il cervelletto. Rimuovere quanta più dura possibile dal tronco cerebrale e quindi immergerla in PFA al 4%.
    6. Mantenere gli embrioni e i tessuti cerebrali in PFA al 4% a 4 °C durante la notte, ad eccezione dei tronchi cerebrali E19, che devono essere mantenuti nelle stesse condizioni per 24 ore.
    7. Dopo la fissazione, disidratare il tessuto in PBS contenente il 30% di saccarosio fino a quando non si deposita, che di solito richiede 1-3 giorni, a seconda dell'età.
    8. Sezione il tronco encefalico (E15 ed E19) a 30 μm sul piano coronale usando un microtomo scorrevole. Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 °C prima dell'immunocolorazione.
    9. Per gli embrioni E3 ed E6 e il tronco encefalico E9, sezione a 50 μm trasversalmente. Raccogliere le sezioni in PBS e conservare a 4 °C. Montare le sezioni su vetrini da microscopio rivestiti di gelatina prima dell'immunocolorazione. La raccolta di sezioni più spesse per queste età facilita la manipolazione dei tessuti.
  2. Dotto uditivo
    1. Dopo aver rimosso i tronchi cerebrali dagli embrioni E9, E15 ed E19, il dotto uditivo, che è incorporato nell'osso temporale, è facilmente identificabile giacendo sotto il cranio e l'osso temporale è facilmente separabile dal cranio circostante. Per gli embrioni E9, fissare l'intero osso temporale in PFA al 4%. Per gli embrioni più anziani, rimuovere la struttura ossea dell'osso temporale per isolare il dotto uditivo e fissare il dotto uditivo in PFA al 4%.
    2. Mantenere tutte le ossa temporali e i dotti uditivi in PFA al 4% a 4 °C durante la notte prima dell'incorporazione dei tessuti.
    3. Eseguire l'incorporamento del tessuto come descritto. Preparare la soluzione incorporante come segue: immergere il 10% di gelatina (da pelle bovina) in acqua fredda fino a quando i granuli di gelatina si gonfiano e si depositano (circa 30 minuti). Riscaldare la miscela a ~50 °C per sciogliere la gelatina e aggiungere il 20% di saccarosio nella soluzione di gelatina e mescolare per sciogliere. Conservare la soluzione di gelatina e saccarosio a 4 °C per un mese.
    4. Per l'uso, riscaldare la soluzione di gelatina e saccarosio a 37 °C. Immergere le ossa temporali/dotti uditivi nella soluzione calda di gelatina-saccarosio su una piastra a 96 pozzetti a 37 °C fino a quando non si depositano, di solito 30-60 min.
    5. Rivestire il fondo dei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti con una striscia di pellicola trasparente. Aggiungere uno strato di soluzione calda di gelatina e saccarosio e attendere che si solidifichi. Trasferire un osso temporale / dotto uditivo a ciascun pozzetto.
    6. Impiantare il tessuto con un secondo strato di soluzione calda di gelatina-saccarosio. Regolare la posizione del tessuto in modo che sia al centro del gel e il dotto uditivo sia orientato orizzontalmente. Spostare con cautela la piastra in un frigorifero a 4 °C e attendere che il gel sia rassodato.
    7. Tirare la striscia di pellicola trasparente per spostare il blocco di tessuto gel fuori dal pozzetto. Tagliare il gel extra in un blocco quadrato e tagliare un angolo del blocco per identificare l'orientamento. Avvolgere il blocco di gelatina con un foglio di alluminio, congelare su ghiaccio secco e quindi conservare a -80 °C fino al sezionamento.
    8. Sezione il blocco a 20 μm lungo la longitudine del dotto uditivo con un criostato. Montare le sezioni direttamente su vetrini da microscopio rivestiti di gelatina. Conservare i vetrini a -80 °C prima dell'immunocolorazione.
    9. Prima dell'immunocolorazione, immergere i vetrini in PBS preriscaldato (45 °C) per 5 minuti per sciogliere la gelatina, quindi lavare i vetrini 3 volte con PBS a temperatura ambiente per rimuovere la gelatina residua.

5. Immunocolorazione e imaging al microscopio

NOTA: Vengono eseguiti due tipi di immunocolorazione a seconda che le sezioni siano montate su vetrini o fluttuanti in PBS.

  1. Immunocolorazione sui vetrini
    1. Lavare i vetrini 3 volte per 10 minuti ciascuno con PBS. Circondare la regione contenente le sezioni con una penna ad olio per evitare perdite di liquido durante la colorazione. Coprire le sezioni con una soluzione bloccante contenente il 5% di siero di capra normale in PBS e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
    2. Diluire gli anticorpi primari (per la concentrazione finale utilizzata fare riferimento alla Tabella dei Materiali) in PBS contenente lo 0,3% di TritonX-100 e il 5% di siero di capra normale. Rimuovere la soluzione bloccante e quindi coprire le sezioni con la soluzione anticorpale primaria. Incubare i vetrini a 4 °C per una notte in una scatola contenente uno strato di acqua distillata sul fondo.
    3. Risciacquare i vetrini 3 volte per 10 minuti con PBS. Applicare anticorpi secondari fluorescenti diluiti a 1:500 in PBS contenenti lo 0,3% di TritonX-100 sui vetrini. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 4 ore, al riparo dalla luce.
    4. Lavare i vetrini 3 volte con PBS. Far cadere delicatamente due gocce di supporto di montaggio sulle guide e coprire le sezioni con dei vetrini. Fare attenzione a non generare bolle d'aria tra il coprivetrino e il vetrino.
  2. Immunocolorazione per embrioni interi e sezioni fluttuanti
    1. Lavare gli embrioni/sezioni con PBS 3x per 10 minuti ciascuno in una piastra a pozzetto. Diluire gli anticorpi primari in PBS contenenti lo 0,3% di TritonX-100 e il 5% di siero di capra normale in provette centrifughe. Trasferire ogni embrione/sezione in un tubo con gancio di vetro e incubare su uno shaker a 60 giri/min per una notte a 4 °C.
    2. Lavare gli embrioni / sezioni 3 volte con PBS per 10 minuti ciascuno in una piastra del pozzetto. Trasferire ogni embrione/sezione in una provetta centrifuga scura riempita con una soluzione di anticorpi secondari fluorescenti e incubare a temperatura ambiente per 4 ore sullo shaker.
    3. Lavare gli embrioni/sezioni 3 volte con PBS in una piastra del pozzetto. Utilizzare un pennello per montare le sezioni su vetrini da microscopio rivestiti di gelatina in un piatto da 15 cm contenente PBS. Dopo che i vetrini si sono asciugati leggermente (~ 5 min), applicare due gocce di supporto di montaggio e posizionare un vetrino. Fare attenzione a non generare bolle d'aria tra il coprivetrino e il vetrino. Mantenere l'intero tessuto di montaggio in PBS per l'imaging.
  3. Imaging
    1. Immagina l'intero tessuto di montaggio in PBS in un piatto con un fondo di silicio contenente polvere di carbonio, che fornisce uno sfondo nero. Acquisizione ed elaborazione di immagini utilizzando un pacchetto software Olympus di elaborazione di immagini commerciali, come descritto in precedenza29.
    2. Immagini delle sezioni sui vetrini con un microscopio confocale come descritto in precedenza20. Immagina le sezioni su un singolo piano focale con obiettivi 10x, 20x e 63x. Cattura tutte le immagini dallo stesso animale usando gli stessi parametri. Prestare attenzione a regolare il livello laser e le impostazioni di acquisizione delle immagini per evitare la saturazione del segnale.
    3. Eseguire l'elaborazione delle immagini utilizzando il software Fiji. Per l'illustrazione, regola la luminosità, il contrasto e la gamma dell'immagine utilizzando un software di editing delle immagini professionale.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eseguendo l'elettroporazione ovo in diversi siti e in diversi stadi di sviluppo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP sia nella periferia uditiva che nel tronco cerebrale uditivo.

FMRP knockdown in NM
L'RNA a forcina piccola (shRNA) contro il pollo Fmr1 è stato progettato e clonato nel sistema vettoriale Tet-On come descritto in precedenza20. La configurazione per l'elettroporazione in ovo è mostrata nella Figura 1A. Il DNA plasmidico colorato con verde veloce è stato iniettato nel tubo neurale a livello r5 / r6 a HH12 (Figura 1B-C). Un elettrodo bipolare di platino è stato posizionato su ciascun lato del tubo neurale a livello r5/6 (Figura 1D). Sono stati erogati due impulsi a 12 V per guidare il plasmide nel tessuto vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dox è stato applicato sulla membrana corioallantoica per innescare l'espressione di Fmr1 shRNA ed EGFP. Dopo 24 ore di trattamento Dox, l'EGFP era evidente sotto uno stereomicroscopio fluorescente. La Figura 1E-F mostra un esempio in E3 quando Dox è stato applicato in E2. Le sezioni trasversali hanno confermato la posizione delle cellule che esprimono EGFP + (EGFP +) su un lato del cervello posteriore (Figura 1G-H). Inoltre, un gruppo di cellule trasfettate è stato trovato anteriormente all'otocisti; queste erano cellule della cresta neurale cranica che migravano ventrolateralmente dal tubo neurale (Figura 1F). Gli embrioni elettroporati possono anche essere incubati più a lungo per studiare la formazione del circuito nelle fasi successive. A E15, EGFP è stato osservato nel tronco cerebrale, ma solo sul lato trasfettato (Figura 1I-J). Le sezioni trasversali a livello del tronco cerebrale dorsale hanno dimostrato una manciata di neuroni EGFP+ che erano sparsi nel NM sul lato dell'elettroporazione (Figura 1L). Le fibre EGFP+ sono state viste proiettarsi verso il bersaglio dei neuroni NM: il nucleo laminaris dorsale (NL) sul lato omolaterale (Figura 1L) e il NL ventrale sul lato controlaterale (Figura 1K). L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato da marcate riduzioni dell'immunoreattività FMRP nei neuroni NM trasfettati rispetto ai neuroni vicini non trasfettati (Figura 1M-N). Nel ganglio uditivo (AG), i neuroni erano non-trasfettati (EGFP-), sebbene alcune cellule gliali che circondano i neuroni AG fossero EGFP+ (Figura 1O-P), presumibilmente derivate da cellule della cresta neurale cranica EGFP+ (vedi Figura 1F). Pertanto, questa strategia di elettroporazione fornisce una trasfezione selettiva dei neuroni postsinaptici nel circuito AG-NM.

Abbattimento FMRP nel condotto uditivo
La miscela plasmidica è stata iniettata nell'otocisti a HH13 (Figura 2A), seguita da elettroporazione posizionando il lato positivo dell'elettrodo anteriormente all'otocisti e il lato negativo posteriore all'otocisti (Figura 2B). Le sezioni dell'intera testa a E6 hanno dimostrato una forte fluorescenza di EGFP nell'otocisti destra, ma non nel tronco cerebrale (Figura 2C). I condotti uditivi isolati a E9 hanno mostrato un'ampia fluorescenza EGFP per tutta la lunghezza del condotto (Figura 2D-E). Sulle sezioni trasversali, le cellule EGFP+ sono state confermate nella papilla basilare (BP) lungo la parete del dotto cocleare e nell'AG (Figura 2F-G). L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato da marcate riduzioni dell'immunoreattività FMRP nelle cellule ciliate trasfettate (*, Figura 2H-J) rispetto alle cellule ciliate vicine non trasfettate (•, Figura 2H-J). Per le cellule di supporto, l'immunoreattività FMRP era debole sia nelle cellule trasfettate che in quelle non trasfettate (Figura 2H-J). Analogamente alle cellule ciliate, l'immunoreattività FMRP era ampiamente diminuita nei neuroni AG trasfettati rispetto ai vicini neuroni non trasfettati (Figura 2K-M).

Abbiamo poi monitorato la proiezione centrale dei neuroni AG trasfettati al tronco cerebrale attraverso il nervo uditivo. Il pattern a mosaico della trasfezione di shRNA Fmr1 nell'AG è stato ulteriormente confermato a E6 utilizzando l'immunoreattività Islet-1 (Figura 3A), un marker per l'orecchio interno del pollo in via di sviluppo31. Quando una parte dell'AG è stata estratta con il tronco cerebrale durante la dissezione, i neuroni EGFP+ AG isolati e le loro fibre all'interno del tronco encefalico sono stati visualizzati in situ nelle stesse preparazioni (Figura 3B-C). Sulle sezioni trasversali a livello della NM, le ANF EGFP+ avevano raggiunto la NM a E9 (Figura 3D) e sono state continuamente osservate a E15 ed E19 (Figura 3E-F). Le immagini ad alto ingrandimento hanno rivelato terminazioni simili a coni di crescita di ANF a E9 (Figura 3H), che formavano il grande bulbo terminale simile a un palmo a E15 prima di crescere nel bulbo terminale caratterizzato della morfologia di Held con rami complessi a E19 (Figura 3I-J). Oltre al NM, estesi rami di ANF sono stati osservati anche nel NA, un altro nucleo cocleare primario (Figura 3E). Questo era previsto, poiché gli stessi ANF si biforcano per innervare sia l'NM che il NA nei polli32. Abbiamo anche visto fibre EGFP+ entrare nei gruppi di cellule vestibolari adiacenti, incluso il nucleo vestibolare discendente (VeD) come mostrato nella Figura 3E. Sebbene abbiamo ottimizzato la posizione dell'elettrodo elettroporetico per colpire preferenzialmente la porzione anteriore dell'otocisti in cui si forma AG, anche alcuni neuroni gangliari vestibolari sono stati trasfettati. L'immunocolorazione per la parvalbumina, un marker per gli ANF nei polli, può essere utilizzata per differenziare le fibre uditive rispetto a quelle vestibolari nel tronco cerebrale (Figura 3F-G).

In sintesi, questa strategia di elettroporazione fornisce una trasfezione selettiva dei neuroni presinaptici nel circuito AG-NM e può essere utilizzata per monitorare lo sviluppo del bulbo terminale di Held a singoli livelli terminali a seguito di manipolazioni genetiche.

Figure 1
Figura 1. Knockdown FMRP nel pollo NM. (A) Immagine della configurazione dell'elettroporazione. (B) Disegno schematico che mostra il sito di microiniezione al livello rombomero r5/6 di un embrione di pollo HH12. Abbreviazioni: NT = tubo neurale; SO = somite. (C) Per una maggiore visibilità, l'inchiostro indiano (nero) è stato iniettato sotto l'embrione con una siringa. La miscela plasmidica colorata con verde veloce è stata quindi iniettata nel lume del tubo neurale. (D) Posizionamento dell'elettrodo bipolare per l'elettroporazione. + e - indicano rispettivamente i lati positivi e negativi. Si noti che la miscela di plasmidi blu si è diffusa nel tubo neurale sul lato positivo dopo l'elettroporazione. (E-F) L'immagine in campo luminoso (BF) (E) si è fusa con il canale EGFP (F) di un embrione di pollo elettroporato al giorno embrionale 3 (E3), mostrando la trasfezione nel tubo neurale allo stesso livello anteroposteriore dell'otocisti. Dox è stato applicato a E2, 6 ore dopo l'elettroporazione. Le cellule della cresta neurale cranica migrante (CNC) sono indicate dalla freccia gialla e ingrandite nell'inserto in F. Barra di scala = 500 μm in E, si applica a E e F; 100 μm nel riquadro. (G-H) Cellule trasfettate con shRNA Fmr1 ed EGFP sulla sezione trasversale di un embrione E3 trasfettato. Le cellule EGFP+ erano confinate su un lato del tubo neurale. La sezione è stata colorata a doppia colorazione con immunoreattività FMRP (grigio). Barra di scala = 40 μm in G, si applica a G e H. (I-J) Immagine BF (I) fusa con il canale EGFP (J) di un tronco encefalico E15 dopo trattamento Dox a E8. Barra di scala = 1 mm in I, si applica a I e J. (K-L) Sezione trasversale di un tronco cerebrale E15 con neuroni NM EGFP+ solo sul lato trasfettato (trans). Sul lato controlaterale (contro) (K), gli assoni EGFP+ sono stati osservati nella porzione ventrale del nucleo laminaris (NL). (M-N) Immagini ad alto ingrandimento della NM a E19 con doppia marcatura di immunocolorazione FMRP (rosso) e SNAP25 (blu). SNAP25 è un marcatore presinaptico che etichetta l'endbulb di Held. Si noti la marcata riduzione dell'immunoreattività FMRP nei neuroni trasfettati (verde; *) rispetto ai neuroni vicini non trasfettati (•). (O-P) Immagini ad alto ingrandimento del ganglio uditivo (AG) a E19 con immunoreattività FMRP. I neuroni AG (AGN) non sono stati trasfettati (EGFP-). Alcune cellule gliali derivate da cellule CNC indicate in F sono state trasfettate. Barra di scala = 10 μm in M, si applica a M-P. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Abbattimento FMRP nel condotto uditivo del pollo. (A) Immagine in campo luminoso (BF) che mostra la microiniezione di plasmidi nell'otocisti a HH13. L'inchiostro indiano (nero) è stato iniettato sotto l'embrione per una maggiore visibilità. (B) Posizionamento dell'elettrodo bipolare per l'elettroporazione. Il lato positivo (etichettato con un simbolo più, +) era posizionato anteriormente all'otocisti e il lato negativo (etichettato con un simbolo meno, -) era posto posteriormente all'otocisti. (C) La sezione trasversale di una testa di pollo a E6 è stata immunocolorata per FMRP (rosso) e neurofilamento (NF; blu). Dox è stato applicato all'E3 dopo l'elettroporazione. La fluorescenza dell'EGFP è stata rilevata nell'otocisti ma non nel tronco cerebrale. Barra di scala = 100 μm. (D-E) Immagine BF (D) fusa con il canale EGFP (E) di un dotto uditivo a E9. Barra della scala = 500 μm. (F-G) Sezione trasversale di un dotto uditivo E9 con immunocolorazione FMRP (rosso) e NF (blu). Le cellule EGFP+ sono state osservate nella parete del dotto cocleare, nella papilla basilare (BP) e nel ganglio uditivo (AG). Barra di scala = 50 μm in F, si applica a F e G. (H-J) Immagini ad alto ingrandimento di un E9 BP che mostrano un'immunoreattività FMRP ampiamente diminuita nelle cellule ciliate trasfettate (HC; *) rispetto agli HC non trasfettati (•). Le fibre NF-positive (blu) erano l'innervazione periferica dai neuroni AG. (K-M) Immagini ad alto ingrandimento dei neuroni AG a E9 con immunocolorazione FMRP (rosso). L'immunoreattività FMRP era forte nei neuroni non trasfettati (•) e non rilevabile nei neuroni trasfettati (EGFP+; *). Barra di scala = 50 μm in H, e si applica a H-M. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Tracciamento assonale dei neuroni AG trasfettati nel tronco cerebrale. Gli embrioni sono stati elettroporati a HH13 per la trasfezione di otocisti di Fmr1 shRNA. L'applicazione Dox è iniziata all'E2. (A) Sezioni trasversali di una testa di pollo E6 con immunocolorazione Islet-1 e controcolorazione DAPI. Le cellule EGFP+ erano evidenti nel ganglio uditivo (AG). Le stelle* indicano diversi neuroni AG trasfettati nel riquadro. Barra di scala = 100 μm in A e 10 μm in inserto. (B-C) Immagine in campo luminoso (BF) (B) fusa con il canale EGFP (C) di un tronco cerebrale E9. In questo caso, una porzione dell'AG (frecce bianche) è stata lasciata collegata al tronco cerebrale uditivo. La freccia gialla indica i neuroni AG trasfettati (AGN) nel riquadro. Le fibre EGFP+ erano evidenti sul lato trasfettato del tronco cerebrale. Barra della scala = 1 mm in B, si applica a B e C; 100 μm nel riquadro. (D) Sezione trasversale del tronco encefalico E9 al livello indicato in C dalla linea tratteggiata. Le fibre nervose uditive EGFP+ (ANF; verde) si estendevano lungo il margine dorsale del tronco cerebrale e si avvicinavano al nucleo magnocellularis (NM). Barra di scala = 100 μm. (E-G) Fibre EGFP+ a E15 (E) ed E19 (F-G). Alcune fibre sono state osservate anche nel nucleo angolare (NA) e nel nucleo vestibolare discendente (VeD). Le sezioni E19 sono state colorate per l'immunoreattività della parvalbumina (PV) come marker per gli ANF. La casella tratteggiata in F è ingrandita nei riquadri, mostrando un EGFP + ANF, che era immunoreattivo PV. Barra di scala = 100 μm in E; 50 μm in F, si applica a F e G; 2 μm nei riquadri. (H-J) Immagini ad alto ingrandimento dei terminali ANF in NM a E9, E15 ed E19, che mostrano la formazione e la progressiva maturazione del bulbo finale di Held. Barra di scala = 5 μm in H, si applica a H-J. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Per determinare la funzione autonoma della cellula di FMRP, è necessario manipolare la sua espressione in singoli gruppi cellulari o tipi di cellule. Poiché una delle principali funzioni di FMRP è quella di regolare la formazione sinaptica e la plasticità, manipolare selettivamente ogni componente sinaptica di un determinato circuito è un prerequisito per una piena comprensione del meccanismo FMRP nella comunicazione sinaptica. Utilizzando l'elettroporazione in ovo di embrioni di pollo, abbiamo dimostrato un metodo per indirizzare l'espressione di FMRP nel circuito AG-NM, sia nei neuroni AG presinaptici che nei neuroni NM postsinaptici. Per raggiungere questo obiettivo, la scelta delle fasi di sviluppo appropriate per l'elettroporazione e il posizionamento accurato dell'elettrodo sull'embrione sono passaggi critici. I neuroni NM derivano da progenitori neurali nel tubo neurale a livello r5/6 a HH1223. Allo stesso stadio, le cellule della cresta neurale cranica migrano dalla punta dorsale del tubo neurale al ganglio cocleovestibolare per avvolgere i futuri neuroni AG33. Pertanto, sia i neuroni NM che le cellule gliali nell'AG sono derivati dal tubo neurale. Al contrario, le cellule ciliate e i neuroni AG provengono dall'ectoderma24. L'ectoderma adiacente al livello r5/6 si ispessisce a HH10 e poi si invagina per formare la coppa otica a HH13. La coppa otica quindi si chiude e si separa dall'ectoderma per formare l'otocisti, con la porzione anteriore che diventa l'organo sensoriale uditivo e la porzione posteriore che contribuisce al sistema vestibolare. In entrambe le porzioni uditive e vestibolari, le cellule neuroblasti che risiedono nella parte ventrale della coppa otica si delaminano e migrano per formare il ganglio cocleovestibolare. Sulla base di questi studi di mappatura del destino, abbiamo trasfettato i progenitori dei neuroni NM elettroporate il tubo neurale a HH12, una strategia che è stata stabilita in precedenza26,28,34. Sebbene questa strategia porti a un'ulteriore trasfezione delle cellule gliali nel tronco cerebrale e nell'AG, nessuno dei neuroni AG è stato trasfettato. La trasfezione neuronale-specifica può essere ottenuta impiegando una strategia guidata dal promotore Atoh1, come quello che abbiamo fatto in precedenza21. Per la trasfezione selettiva dei neuroni AG, abbiamo elettropolato l'otocisti a HH13. I plasmidi iniettati nella coppa otica sono entrati prevalentemente nella porzione anteriore dell'otocisti per la trasfezione delle cellule ciliate e dei neuroni AG simultaneamente quando posizionano gli elettrodi, come mostrato nella Figura 2B. Per colpire preferenzialmente i neuroni AG sulle cellule ciliate, è possibile iniettare la soluzione plasmidica direttamente nella regione adiacente all'otocisti anteriore, dove i neuroblasti delaminati ne localizzano35. Tuttavia, questo metodo ha una minore efficienza della trasfezione dei neuroni AG rispetto all'iniezione di otoste, poiché i plasmidi si diffondono rapidamente dopo l'iniezione. Questo metodo può anche portare a un'ulteriore trasfezione delle cellule mesenchimali circostanti. Un metodo per colpire preferenzialmente le cellule ciliate rispetto ai neuroni AG è quello di ritardare l'iniezione di otocisti e l'elettroporazione a HH18 (che è ~ embrionale giorno 3), poiché la maggior parte dei neuroblasti (precursori dei neuroni AG) sono migrati fuori dall'otocisti in questa fase24.

Con modifiche, questo metodo può essere esteso per studiare il sistema vestibolare. Per la trasfezione del ganglio vestibolare, la direzione degli elettrodi mostrata nella Figura 2B deve essere invertita per trasfettare la porzione posteriore dell'otocisti a causa della posizione distinta dei precursori del ganglio uditivo e vestibolare.

In ovo l'elettroporazione degli embrioni di pollo è una tecnica consolidata per studiare le prime fasi di sviluppo (entro la prima settimana di incubazione). Per gli studi a lungo termine, il tasso di sopravvivenza è una delle principali preoccupazioni. Quando si inizia il trattamento Dox a E8, il tasso di sopravvivenza trovato qui è ~ 60% a E9, ma scende al 30% a E15 e ancora più basso a E19. I piccoli di uova elettroporate sono possibili ma rari e possono sopravvivere solo per diversi giorni nella maggior parte dei casi. Per aumentare il tasso di sopravvivenza, è necessario considerare quanto segue: 1) utilizzare un elettroporatore che fornisca onde quadrate anziché onde taglienti; 2) applicare una o due gocce di PBS sterile sulla parte superiore dell'embrione se lo strato di albumina non è abbastanza spesso da promuovere la conduttività elettrica (questo aiuterà a ridurre il trauma elettrico); 3) l'apertura della membrana vitellina per esporre l'embrione nel sito di iniezione non è necessaria per una trasfezione di successo e può danneggiare l'embrione; 4) per ridurre il rischio di contaminazione, utilizzare una siringa per colpire il parafilm e somministrare Dox invece di riaprire la finestra. Dopo l'iniezione, pulire il film trasparente con etanolo al 75% e coprire l'apertura dell'ago con del nastro adesivo; 5) Per la trasfezione dell'otocisti, iniettare plasmidi nell'otocisti dorsolateralmente con una pipetta angolata di 45° per evitare possibili punture dell'aorta dorsale sottostante. Se l'aorta dorsale è danneggiata, il sanguinamento scoverà i plasmidi e causerà persino la morte; 6) se possibile, evitare di usare inchiostro di china per visualizzare l'embrione. Meno manipolazione e meno procedure si tradurranno in un tasso di sopravvivenza più elevato.

Oltre alla capacità di trasfettare selettivamente i neuroni AG o NM, l'elettroporazione in ovo fornisce un sistema unico che consente confronti vicini per l'analisi dei dati. Dopo l'elettroporazione, solo un sottogruppo di cellule nella NM o nell'AG viene trasfettato, consentendo alle cellule circostanti non trasfettate nello stesso gruppo cellulare di fungere da controllo ideale20. Se la potenziale interazione tra i neuroni vicini è una preoccupazione, le controparti neuronali dal lato non trasfettato dell'orecchio e del cervello possono fungere da controllo aggiuntivo. Per gli studi istologici e di imaging, questo risultato consente analisi dei dati con elevata efficienza a livello di singola cellula o singola fibra. Le analisi molecolari sono fattibili anche se combinate con la selezione cellulare basata su fluorescenza e analisi di proteine e RNA su larga scala come la spettrometria di massa e il sequenziamento di prossima generazione. Tuttavia, l'uso dell'elettroporazione ovo come mezzo di modifica genica può essere difficile per gli studi funzionali e comportamentali perché la percentuale di cellule trasfettate all'interno di un gruppo cellulare potrebbe non essere abbastanza grande da provocare conseguenze funzionali.

È essenziale eseguire due analisi di verifica quando si adotta l'approccio dell'elettroporazione in ovo. In primo luogo, l'effetto dell'editing genetico sulla proteina di interesse dovrebbe essere confermato. Nell'ovo l'elettroporazione trasfetta solo un sottoinsieme di neuroni nel NM o AG (cioè un modello a mosaico). L'esecuzione di western blot su tessuti omogeneizzati che contengono una miscela di neuroni trasfettati e non trasfettati non è abbastanza sensibile da riflettere accuratamente l'effetto knockdown. Pertanto, la convalida deve essere condotta a livello di singola cellula utilizzando metodi come l'immunocitochimica. A tale scopo, abbiamo precedentemente generato un anticorpo che riconosce FMRP di pollo. La specificità di questo anticorpo è stata verificata mediante immunocitochimica e western blot in uno studio precedente30. L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato quantitativamente osservando riduzioni significative dell'intensità dell'immunoreattività FMRP nei neuroni NM trasfettati rispetto ai neuroni vicini non trasfettati. In secondo luogo, i gruppi di controllo che utilizzano RNA criptati, o altri costrutti di controllo, dovrebbero essere impiegati per confermare la specificità degli effetti cellulari osservati della misespressione di FMRP20,21. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo progettato uno shRNA criptato, clonato nello stesso sistema vettoriale Tet-On e elettropolato in precursori NM, come descritto in precedenza20. L'espressione di FMRP nei neuroni NM trasfettati con lo shRNA strapazzato non è stata influenzata, come evidenziato dall'intensità invariata dell'immunoreattività FMRP rispetto ai neuroni vicini non trasfettati. Abbiamo anche identificato una serie di effetti della trasfezione di shRNA Fmr1 sulla crescita assonale, sulla potatura dendritica, sulla formazione terminale e sulla neurotrasmissione (rivisti in Curnow e Wang, 2022)36. Abbiamo concluso che questi effetti sono stati indotti specificamente dalla perdita autonoma cellulare di FMRP perché lo shRNA criptato non è riuscito a indurre cambiamenti simili.

In conclusione, la tecnica di elettroporazione in ovo consente l'editing selettivo del gene Fmr1 con controllo temporale e specificità dei componenti nei circuiti uditivi orecchio-tronco encefalico e può essere modificata per manipolare il sistema vestibolare. Lo sviluppo di questa tecnologia avanzata nell'embrione di pollo, un modello consolidato nella biologia dello sviluppo, ha e continuerà a contribuire alla nostra comprensione dello sviluppo del cervello in condizioni normali e anormali come la FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da: una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 32000697); il Programma di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (202102080139); la Fondazione per le scienze naturali del Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); i fondi per la ricerca fondamentale delle università centrali (11620324); una borsa di ricerca del Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministero della Pubblica Istruzione, Università di Jinan (No. ZSYXM202107); i fondi per la ricerca fondamentale per le università centrali della Cina (21621054); e la Medical Scientific Research Foundation della provincia cinese del Guangdong (20191118142729581). Ringraziamo il centro medico sperimentale dell'Università di Jinan. Ringraziamo la dottoressa Terra Bradley per l'attenta revisione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

Neuroscienze Numero 185 sindrome dell'X fragile circuito sensoriale orecchio interno nucleo cocleare formazione di sinapsi sviluppo cerebrale endbulb di Held embrione di pollo
Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione <em>in ovo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter