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Neuroscience

Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Abstract

La proteína de retraso mental X frágil (FMRP) es una proteína de unión al ARNm que regula la traducción local de proteínas. La pérdida o disfunción de FMRP conduce a actividades neuronales y sinápticas aberrantes en el síndrome X frágil (FXS), que se caracteriza por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y problemas de comunicación social. Los estudios de la función de FMRP y la patogénesis del FXS se han realizado principalmente con Fmr1 (el gen que codifica FMRP) knockout en animales transgénicos. Aquí informamos un método in vivo para determinar la función autónoma celular de FMRP durante el período de ensamblaje del circuito y la formación sináptica utilizando embriones de pollo. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN de horquilla pequeña Fmr1 (shRNA) y un reportero de EGFP. Con este método, logramos una eliminación selectiva de FMRP en el ganglio auditivo (AG) y en uno de sus objetivos del tronco encefálico, el núcleo magnocellularis (NM), proporcionando así una manipulación específica del componente dentro del circuito AG-NM. Además, el patrón de mosaico de la transfección permite controles dentro de los animales y comparaciones de neuronas / fibras vecinas para mejorar la confiabilidad y la sensibilidad en el análisis de datos. El sistema vectorial inducible proporciona control temporal del inicio de la edición de genes para minimizar los efectos acumulativos en el desarrollo. La combinación de estas estrategias proporciona una herramienta innovadora para diseccionar la función autónoma celular de FMRP en el desarrollo sináptico y de circuitos.

Introduction

El síndrome X frágil (SXF) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y comportamientos autistas. En la mayoría de los casos, el SXF es causado por una pérdida global de la proteína X frágil de retraso mental (FMRP; codificada por el gen Fmr1) que comienza en las primeras etapas embrionarias1. FMRP es una proteína de unión al ARN que normalmente se expresa en la mayoría de las neuronas y células gliales en el cerebro, así como en los órganos sensoriales 2,3,4. En los cerebros de mamíferos, la FMRP probablemente está asociada con cientos de ARNm que codifican proteínas que son importantes para diversas actividades neuronales5. Estudios de animales knockout convencionales Fmr1 demostraron que la expresión de FMRP es particularmente importante para el ensamblaje y la plasticidad de la neurotransmisión sináptica6. Varios modelos de knockout condicional y mosaico han demostrado además que las acciones y señales de FMRP varían según las regiones cerebrales, los tipos de células y los sitios sinápticos durante varios eventos de desarrollo, incluida la proyección axonal, el patrón dendrítico y la plasticidad sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La función aguda de FMRP en la regulación de la transmisión sináptica fue estudiada por la administración intracelular de anticuerpos inhibidores de FMRP o FMRP en cortes cerebrales o neuronas cultivadas15,16,17,18. Estos métodos, sin embargo, no ofrecen la capacidad de rastrear las consecuencias inducidas por la expresión errónea de FMRP durante el desarrollo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos in vivo para investigar las funciones autónomas celulares de FMRP está en gran necesidad, y se espera que ayude a determinar si las anomalías reportadas en pacientes con FXS son consecuencias directas de la pérdida de FMRP en las neuronas y circuitos asociados, o consecuencias secundarias derivadas de cambios en toda la red durante el desarrollo19.

El tronco cerebral auditivo de embriones de pollo ofrece un modelo excepcionalmente ventajoso para análisis funcionales en profundidad de la regulación FMRP en el desarrollo de circuitos y sinapsis. El fácil acceso a los cerebros embrionarios de pollo y la bien establecida técnica de electroporación in ovo para la manipulación genética han contribuido en gran medida a nuestra comprensión del desarrollo cerebral en las primeras etapas embrionarias. En un estudio recientemente publicado, esta técnica se combinó con herramientas moleculares avanzadas que permiten el control temporal de la expresión errónea de FMRP20,21. Aquí, la metodología es avanzada para inducir manipulaciones selectivas de neuronas presinápticas y postsinápticas por separado. Este método fue desarrollado en el circuito auditivo del tronco encefálico. La señal acústica es detectada por las células ciliadas en el oído interno auditivo y luego transportada al ganglio auditivo (AG; también llamado ganglio espiral en mamíferos). Las neuronas bipolares en el AG inervan las células ciliadas con sus procesos periféricos y, a su vez, envían una proyección central (el nervio auditivo) al tronco encefálico donde terminan en dos núcleos cocleares primarios, el núcleo magnocellularis (NM) y el núcleo angularis (NA). Las neuronas en el NM son estructural y funcionalmente comparables a las células esféricas tupidas del núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro del NM, las fibras nerviosas auditivas (ANF) hacen sinapsis en el somata de las neuronas NM a través del bulbo terminal grande de los terminales de Held22. Durante el desarrollo, las neuronas NM surgen de los rombómeros 5 y 6 (r5/6) en el cerebro posterior23, mientras que las neuronas AG se derivan de neuroblastos que residen en el otocisto24. Aquí, describimos el procedimiento para derribar selectivamente la expresión de FMRP en las neuronas AG presinápticas y en las neuronas NM postsinápticas por separado.

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Protocol

Los huevos y los embriones de pollo se manejaron con cuidado y respeto de acuerdo con los protocolos animales aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jinan.

1. Preparación de huevos y plásmidos

  1. Preparación del huevo
    1. Obtenga huevos de gallina fertilizados frescos (Gallus gallus) de la Universidad Agrícola del Sur de China y guárdelos a 16 ° C antes de la incubación. Para una viabilidad óptima, coloque todos los huevos para la incubación dentro de una semana de su llegada.
    2. Colocar los huevos horizontalmente e incubar a 38 °C durante 46-48 h hasta la etapa 12a 25 de Hamburger y Hamilton (HH) para la transfección del tubo neural, o durante 54-56 h hasta HH13 para la transfección de otocistos. Debido a que el polo animal del huevo es más ligero que el polo vegetal, la colocación horizontal coloca el embrión en la parte superior del huevo para facilitar la manipulación. Tenga cuidado de mantener el huevo horizontal en este y todos los pasos siguientes.
    3. La ubicación del embrión aparece como un área oscura en la cáscara del huevo cuando se proyecta luz desde el fondo del huevo con una linterna. En las etapas deseadas de HH, use este método de linterna para marcar la ubicación del embrión en la cáscara del huevo con lápiz.
    4. Limpie los huevos con una gasa que contenga 75% de etanol. Perfore un agujero en el extremo puntiagudo de los huevos con la punta de las tijeras y retire 2 ml de albúmina con una jeringa de aguja de 18 G. Asegúrese de que el orificio solo sea lo suficientemente grande como para permitir la inserción de la aguja. Limpie cualquier albúmina que gotee con una gasa y selle el orificio con cinta adhesiva transparente.
    5. Para minimizar las grietas y evitar la caída de restos de cáscara durante las ventanas, cubra la parte superior de los huevos con cinta adhesiva transparente, centrándose en el área oscura marcada con lápiz.
  2. Extracción de ADN plásmido
    1. Clone pollo Fmr1 shRNA usando un sistema Tet-on basado en transposones como se describió anteriormente20. Este sistema contiene tres plásmidos: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 y pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, proporcionando un sistema vectorial inducible por fármaco por el cual la expresión de Fmr1 shRNA y EGFP se silencia después de la transfección y puede activarse mediante la inducción de doxiciclina (Dox).
      NOTA: Estos plásmidos no están disponibles actualmente en un repositorio. Los autores se comprometen a proporcionar los plásmidos a petición razonable.
    2. Extraiga ADN plásmido utilizando un kit de preparación libre de endotoxinas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precipite agregando 1/15 volumen de acetato de sodio 7.5 M y 1 volumen de isopropanol al 100%.
    3. Precipitar plásmidos a -20 °C durante la noche y centrifugar a 13.000 x g durante 10 min. Disuelva el pellet con el tampón Tris-EDTA proporcionado en el kit hasta una concentración final de 4-5 μg/μL. Los plásmidos pueden almacenarse a -20 °C durante 12 meses sin reducir la eficiencia de la transfección.
    4. El día de la electroporación, mezclar bien 2 μL de cada plásmido en un tubo de centrífuga estéril con una punta de pipeta. El volumen resultante de 6 μL de la mezcla de plásmidos es suficiente para electropolar tres docenas de huevos. Para ayudar a visualizar el plásmido durante la electroporación, agregue 1 μL de verde rápido al 0,1% (preparado en ddH2O estéril) por cada 6 μL de mezcla de ADN26, lo que convierte la mezcla de plásmidos en azul.

2. Electroporación in ovo

  1. Ventana de óvulos e identificación de embriones
    1. El día de la electroporación, retire los huevos de la incubadora, una docena de huevos a la vez. Mantener los huevos fuera de su incubadora durante más de 1 h introduce variaciones en el desarrollo y reduce la viabilidad.
    2. Limpie todas las herramientas de cirugía con una gasa que contenga 75% de etanol.
    3. Coloque cada huevo en un soporte de espuma hecho a medida. Limpie el área cubierta con cinta adhesiva con etanol al 75% y corte una ventana (1-2 cm2) alrededor de la circunferencia de la marca del lápiz con un pequeño par de tijeras (Figura 1A). Al cortar, sostenga las tijeras planas para evitar dañar el embrión debajo.
    4. Coloque el huevo con ventana bajo un microscopio estereoscópico con un ocular de 10x y un zoom de 2x e identifique el embrión. Ajuste el ángulo y el brillo de la fuente de luz para una mejor visualización.
      NOTA: Se necesita práctica y experiencia para visualizar el embrión e identificar el tubo neural en esta etapa.
      1. Para principiantes, use la siguiente inyección de tinta opcional para facilitar la identificación del embrión. Prepare una solución de tinta india al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) al 0,01 M y autoclave con antelación. Llene una jeringa de 1 ml con la solución de tinta y luego coloque una aguja de 27G. Doble la aguja en un ángulo de 45° con fórceps.
      2. Bajo el microscopio, asomar cuidadosamente desde el borde del área opaca e insertar la aguja debajo del embrión. Inyecte ~ 50 μL de tinta, que se difundirá debajo del área pelúcida para la visualización del embrión. La tinta formará un fondo oscuro para una visualización clara del embrión.
        NOTA: Expulse el aire de la jeringa antes de la inserción y la inyección. Cuando sea experto en visualización, evite el paso de inyección de tinta, ya que reduce la tasa de supervivencia.
  2. Inyección del tubo neural y electroporación
    NOTA: Este procedimiento se realiza en HH12 para transfectar neuronas NM en el tronco encefálico.
    1. Tire de los capilares de vidrio (~1 mm de diámetro y 100 mm de largo) en pipetas con un extractor de pipetas. Bajo un microscopio de disección, abra cuidadosamente la punta de la aguja capilar a 10-20 μm de diámetro con fórceps. Guarde las pipetas (generalmente 5-10 a la vez) en una caja de almacenamiento hasta que las use.
    2. Llenar una pipeta capilar con 0,5-1 μL de la mezcla plásmida aplicando presión negativa a través de un tubo de goma en el extremo de la pipeta. Esto se puede lograr con una jeringa o bomba de aire.
    3. Coloque el óvulo bajo el microscopio para que el embrión esté orientado verticalmente con la cola cerca de usted (u horizontalmente para inyectar pipetas capilares usando un manipulador de tres ejes). Sujete la pipeta capilar con una mano o con el manipulador de tres ejes y conduzca la punta de la pipeta hacia el r5/6 en dirección de cola a cabeza.
      NOTA: El área más anterior del cerebro posterior es r1 y cada protuberancia posterior a lo largo del tubo neural es un rombómero individual. R5/6 está en el mismo nivel anteroposterior que el otocisto, que es una estructura similar a una copa fácilmente reconocible (Figura 1B-C).
    4. Empuje suavemente la punta a través de la membrana vitelina y en el tubo neural dorsal y luego retire la pipeta un poco para que la punta esté en el lumen del tubo neural. Inyecte la mezcla de plásmidos aplicando presión de aire hasta que el plásmido teñido se difunda completamente en r5/6 y se extienda a r3 y r4.
      NOTA: No es necesario hacer una ranura en la membrana vitelina para inyección.
    5. Verifique si la inyección es exitosa, lo que se logra cuando la solución de plásmido azul se difunde rápidamente por el tubo neural sin fugas (Figura 1B-C). Cuando se produce una fuga, el azul se desvanece rápidamente.
    6. Inmediatamente después de la inyección, coloque un electrodo bipolar de platino a cada lado del tubo neural (Figura 1D). Entregar dos pulsos de 12 V y 50 ms de duración con un electroporador. Observe burbujas de aire en los extremos del electrodo bipolar, con más en el lado negativo.
    7. Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos teñidos ingresa al tejido del tubo neural cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar.
    8. Cubra la ventana con la cáscara del huevo con un trozo de película transparente que se corta previamente en 2 cuadrados y se rocía con etanol al 75%. Vuelva a colocar el huevo en su incubadora.
    9. Limpie el electrodo bipolar administrando 10-20 pulsos de 12 V y 50 ms de duración en solución salina antes de proceder al siguiente huevo.
  3. Inyección de otocisto y electroporación
    NOTA: Este procedimiento se realiza en HH13 para transfectar células ciliadas y neuronas AG en el oído interno.
    1. En HH13 (que es ~ día embrionario 2.5), el embrión ha girado para que el lado derecho de la cabeza mire hacia arriba. Bajo el microscopio, coloque el óvulo de manera que el embrión quede vertical, con la cola cerca de usted. Sostenga la pipeta capilar y empuje suavemente el otocisto derecho en dirección dorsolateral (Figura 2A).
      NOTA: En esta etapa, el otocisto aparece como una pequeña estructura circular en la parte superior del cuerpo al mismo nivel anteroposterior que r5/6.
    2. Inyecte la mezcla de plásmidos con presión de aire hasta que el otocisto se llene con solución azul27. Verifique si hay una inyección exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmido azul está confinada dentro del otocisto y no tiene fugas.
    3. Inmediatamente después de la inyección, coloque el electrodo bipolar en el otocisto como se muestra en la Figura 2B. Coloque los lados positivo y negativo anterior y posterior al otocisto, respectivamente. Entregar dos pulsos de 12 V y 50 ms de duración con el electroporador.
    4. Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos azules ingresa al tejido del otocisto cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar. Cubra la ventana de la cáscara del huevo con una película transparente y devuelva el huevo a la incubadora.

3. Administración de Dox para iniciar y mantener la transcripción de plásmidos

  1. Preparación de la solución Dox
    1. Mida 100 mg de polvo de Dox bajo una campana química y disuélvalo en 100 ml de PBS estéril para hacer 1 mg / ml de solución de trabajo. Filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm y conservar 1 ml de alícuotas a -20 °C. Proteger de la luz20,28.
  2. Administración de Dox
    1. Para la edición de genes de fuerza completa, a las 24 h antes de la edad deseada, descongele una alícuota de Dox en hielo. Dejar caer 50 μL de Dox directamente sobre la membrana corioalantoidea del huevo con una jeringa que penetre en la película transparente. Selle el orificio de la aguja con una película transparente o cinta adhesiva después de la inyección.
    2. Para mantener el efecto de derribo, administre Dox cada dos días hasta la recolección de tejido en la etapa de desarrollo deseada.

4. Disección y seccionamiento de tejidos

  1. Tronco encefálico
    1. Para embriones en etapa embrionaria 3 (E3) y E6, abra la cáscara del huevo y corte la membrana asociada con tijeras. Sacar el embrión con una cuchara y sumergirlo en paraformaldehído (PFA) al 4% en tampón fosfato 0,1 M.
    2. Para los embriones E9, abra la cáscara del huevo, decapite el embrión con tijeras y transfiera la cabeza a una placa con fondo de silicio llena de PBS. Fije la cabeza hacia abajo a través de las órbitas y corte la parte superior del cráneo. Coloque cuidadosamente los fórceps debajo del cerebro desde ambos lados y eleve todo el cerebro desde el cráneo con los hombros de los fórceps. Sumergir el cerebro en un 4% de PFA.
    3. Para los embriones E15 y E19, abra la cáscara del huevo, decapite el embrión con tijeras y coloque la cabeza en una placa con fondo de silicio llena de PBS. Corte la piel en la parte superior de la cabeza para exponer el cráneo.
    4. Incide a través del cráneo verticalmente con una navaja de afeitar para separar el cerebro anterior y el cerebro caudal. Sumerja el bloque caudal en PBS, retire la parte superior del cráneo y luego retire el cerebro del cráneo.
    5. Fije el cerebro a través del lóbulo óptico y separe el cerebelo y el tronco encefálico. Tenga cuidado de no dañar el tronco cerebral auditivo, que se encuentra justo debajo del cerebelo. Retire la mayor cantidad de duramadre posible del tronco encefálico y luego sumérjala en PFA al 4%.
    6. Mantener los embriones y los tejidos cerebrales en PFA al 4% a 4 °C durante la noche, excepto los troncos cerebrales E19, que deben mantenerse en la misma condición durante 24 h.
    7. Después de la fijación, deshidrate el tejido en PBS que contiene 30% de sacarosa hasta que se asiente, lo que generalmente toma de 1 a 3 días, dependiendo de la edad.
    8. Seccionar el tronco encefálico (E15 y E19) a 30 μm en el plano coronal utilizando un micrótomo deslizante. Recoger las secciones en PBS y almacenar a 4 °C antes de la inmunotinción.
    9. Para embriones E3 y E6 y troncos cerebrales E9, sección transversal a 50 μm. Recoger las secciones en PBS y almacenar a 4 °C. Monte las secciones en portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina antes de la inmunotinción. La recolección de secciones más gruesas para estas edades facilita el manejo de los tejidos.
  2. Conducto auditivo
    1. Después de extraer los troncos cerebrales de los embriones E9, E15 y E19, el conducto auditivo, que está incrustado en el hueso temporal, es fácilmente identificable debajo del cráneo, y el hueso temporal es fácilmente separable del cráneo circundante. Para embriones E9, fijar todo el hueso temporal en 4% PFA. Para embriones más viejos, retire la estructura ósea del hueso temporal para aislar el conducto auditivo y fije el conducto auditivo en 4% PFA.
    2. Mantenga todos los huesos temporales y conductos auditivos en PFA al 4% a 4 °C durante la noche antes de la incrustación del tejido.
    3. Realice la incrustación de tejido como se describe. Prepare la solución de incrustación de la siguiente manera: Remoje la gelatina al 10% (de la piel bovina) en agua fría hasta que los gránulos de gelatina se hinchen y se asienten (aproximadamente 30 min). Caliente la mezcla a ~ 50 ° C para disolver la gelatina y agregue sacarosa al 20% en la solución de gelatina y revuelva para disolver. Conservar la solución de gelatina y sacarosa a 4 °C durante un máximo de un mes.
    4. Para su uso, calentar la solución de gelatina y sacarosa a 37 °C. Remojar los huesos temporales/conductos auditivos en la solución tibia de gelatina y sacarosa en una placa de 96 pocillos a 37 °C hasta que se asienten, generalmente 30-60 min.
    5. Forre el fondo de los pocillos de una placa de 12 pocillos con una tira de película transparente. Agregue una capa de solución tibia de gelatina y sacarosa y espere hasta que se solidifique. Transfiera un hueso temporal/conducto auditivo a cada pocillo.
    6. Implante el tejido con una segunda capa de solución tibia de gelatina y sacarosa. Ajuste la posición del tejido para que quede en el centro del gel y el conducto auditivo esté orientado horizontalmente. Mueva con cuidado la placa a una nevera a 4 °C y espere hasta que el gel esté firme.
    7. Tire de la tira de película transparente para mover el bloque de tejido gel fuera del pozo. Recorte el gel adicional en un bloque cuadrado y corte una esquina del bloque para identificar la orientación. Envuelva el bloque de gelatina con un trozo de papel de aluminio, congele en hielo seco y luego guárdelo a -80 ° C hasta seccionarlo.
    8. Seccionar el bloque a 20 μm a lo largo de la longitud del conducto auditivo con un criostato. Monte las secciones directamente en portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina. Conservar los portaobjetos a -80 °C antes de la inmunotinción.
    9. Antes de la inmunotinción, sumergir los portaobjetos en PBS precalentado (45 °C) durante 5 minutos para disolver la gelatina, y luego lavar los portaobjetos 3 veces con PBS a temperatura ambiente para eliminar la gelatina residual.

5. Inmunotinción e imágenes de microscopio

NOTA: Se realizan dos tipos de inmunotinción dependiendo de si las secciones están montadas en portaobjetos o flotando libremente en PBS.

  1. Inmunotinción en portaobjetos
    1. Lave las diapositivas 3 veces durante 10 minutos cada una con PBS. Rodee la región que contiene las secciones con una pluma de aceite para evitar fugas de líquido durante la tinción. Cubrir las secciones con una solución de bloqueo que contenga un 5% de suero normal de cabra en PBS e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    2. Diluir los anticuerpos primarios (para la concentración final utilizada consultar la Tabla de materiales) en PBS que contiene 0,3% de TritonX-100 y 5% de suero normal de cabra. Retire la solución bloqueante y luego cubra las secciones con la solución de anticuerpos primarios. Incubar los portaobjetos a 4 °C durante la noche en una caja que contenga una capa de agua destilada en la parte inferior.
    3. Enjuague las diapositivas 3 veces durante 10 minutos con PBS. Aplicar anticuerpos secundarios fluorescentes diluidos a 1:500 en PBS que contengan 0,3% de TritonX-100 en portaobjetos. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 4 h, protegidos de la luz.
    4. Lave las diapositivas 3 veces con PBS. Deje caer suavemente dos gotas de medio de montaje sobre las guías y cubra las secciones con cubreobjetos. Tenga cuidado de no generar burbujas de aire entre el cubreobjetos y el portaobjetos.
  2. Inmunotinción para embriones de montaje entero y secciones de flotación libre
    1. Lave los embriones/secciones con PBS 3x durante 10 minutos cada uno en una placa de pozo. Diluir los anticuerpos primarios en PBS que contienen 0,3% de TritonX-100 y 5% de suero normal de cabra en tubos centrífugos. Transfiera cada embrión o sección a un tubo con un gancho de vidrio e incube en un agitador a 60 rpm durante la noche a 4 °C.
    2. Lave los embriones/secciones 3x con PBS durante 10 minutos cada uno en una placa de pozo. Transfiera cada embrión / sección a un tubo centrífugo oscuro lleno de solución de anticuerpos secundarios fluorescentes e incube a temperatura ambiente durante 4 h en el agitador.
    3. Lave los embriones/secciones 3x con PBS en una placa de pozo. Use un cepillo para montar las secciones en portaobjetos de microscopio recubiertos de gelatina en un plato de 15 cm que contenga PBS. Después de que los portaobjetos se sequen ligeramente (~ 5 min), aplique dos gotas de medio de montaje y coloque un cubreobjetos. Tenga cuidado de no generar burbujas de aire entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Mantenga todos los tejidos de montaje en PBS para obtener imágenes.
  3. Imagenológico
    1. Imagen de todos los tejidos de montaje en PBS en un plato con un fondo de silicio que contiene polvo de carbono, que proporciona un fondo negro. Capture y procese imágenes utilizando un paquete de software comercial de procesamiento de imágenes Olympus, como se describió anteriormente29.
    2. Imagen de las secciones de las diapositivas con un microscopio confocal como se describió anteriormente20. Imagen de las secciones en un solo plano focal con objetivos de 10x, 20x y 63x. Captura todas las imágenes del mismo animal utilizando los mismos parámetros. Tenga cuidado de ajustar el nivel del láser y la configuración de adquisición de imágenes para evitar la saturación de la señal.
    3. Realice el procesamiento de imágenes utilizando el software Fiji. Para ilustrar, ajuste el brillo, el contraste y la gamma de la imagen utilizando un software profesional de edición de imágenes.

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Representative Results

Al realizar electroporación in ovo en diferentes sitios y en diferentes etapas de desarrollo, logramos un knockdown selectivo de FMRP en la periferia auditiva o en el tronco cerebral auditivo.

Derribo de FMRP en NM
El ARN horquilla pequeño (shRNA) contra el pollo Fmr1 fue diseñado y clonado en el sistema vectorial Tet-On como se describió anteriormente20. La configuración para la electroporación in ovo se muestra en la Figura 1A. El ADN plásmido teñido de verde rápido se inyectó en el tubo neural en el nivel r5/r6 en HH12 (Figura 1B-C). Se colocó un electrodo bipolar de platino a cada lado del tubo neural en el nivel r5/6 (Figura 1D). Se administraron dos pulsos a 12 V para conducir el plásmido hacia el tejido cerca del lado positivo del electrodo. Dox se aplicó en la membrana corioalantoidea para desencadenar la expresión de Fmr1 shRNA y EGFP. Después de 24 h de tratamiento con Dox, EGFP fue evidente bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. La Figura 1E-F muestra un ejemplo en E3 cuando Dox se aplicó en E2. Las secciones transversales confirmaron la ubicación de las células que expresan EGFP (EGFP+) en un lado del cerebro posterior (Figura 1G-H). Además, se encontró un grupo de células transfectadas anterior al otocisto; estas eran células de la cresta neural craneal que migraban ventrolateralmente desde el tubo neural (Figura 1F). Los embriones electroporados también se pueden incubar durante más tiempo para estudiar la formación de circuitos en etapas posteriores. En E15, se observó EGFP en el tronco encefálico, pero solo en el lado transfectado (Figura 1I-J). Las secciones transversales a nivel del tronco encefálico dorsal demostraron un puñado de neuronas EGFP+ que estaban dispersas en el NM en el lado de la electroporación (Figura 1L). Se observaron fibras EGFP+ proyectándose hacia el objetivo de las neuronas NM: el núcleo dorsal laminar (NL) en el lado ipsilateral (Figura 1L) y el NL ventral en el lado contralateral (Figura 1K). El efecto de derribo del shRNA Fmr1 se validó mediante reducciones marcadas en la inmunorreactividad FMRP en neuronas NM transfectadas en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas (Figura 1M-N). En el ganglio auditivo (AG), las neuronas no estaban transfectadas (EGFP-), aunque algunas células gliales que rodean a las neuronas AG eran EGFP+ (Figura 1O-P), presumiblemente derivadas de las células de la cresta neural craneal EGFP+ (ver Figura 1F). Por lo tanto, esta estrategia de electroporación proporciona una transfección selectiva de las neuronas postsinápticas en el circuito AG-NM.

Knockdown FMRP en el conducto auditivo
La mezcla de plásmidos se inyectó en el otocisto en HH13 (Figura 2A), seguida de electroporación colocando el lado positivo del electrodo anterior al otocisto y el lado negativo posterior al otocisto (Figura 2B). Las secciones de cabeza entera en E6 demostraron una fuerte fluorescencia de EGFP en el otocisto derecho, pero no en el tronco encefálico (Figura 2C). Los conductos auditivos aislados en E9 exhibieron una extensa fluorescencia EGFP a lo largo del conducto (Figura 2D-E). En las secciones transversales, se confirmaron células EGFP+ en la papila basilar (PA) a lo largo de la pared del conducto coclear y en el AG (Figura 2F-G). El efecto de knockdown del shRNA Fmr1 se validó mediante reducciones marcadas en la inmunorreactividad FMRP en células ciliadas transfectadas (*, Figura 2H-J) en comparación con las células ciliadas vecinas no transfectadas (•, Figura 2H-J). Para las células de soporte, la inmunorreactividad FMRP fue débil tanto en células transfectadas como no transfectadas (Figura 2H-J). Al igual que en las células ciliadas, la inmunorreactividad FMRP disminuyó en gran medida en las neuronas AG transfectadas en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas (Figura 2K-M).

Luego rastreamos la proyección central de las neuronas AG transfectadas al tronco encefálico a través del nervio auditivo. El patrón de mosaico de la transfección de shRNA Fmr1 en el AG se confirmó aún más en E6 utilizando inmunorreactividad del islote-1 (Figura 3A), un marcador para el oído interno del pollo en desarrollo31. Cuando se extrajo una parte del AG con el tronco encefálico durante la disección, las neuronas AG EGFP+ aisladas y sus fibras dentro del tronco encefálico se visualizaron in situ en las mismas preparaciones (Figura 3B-C). En secciones transversales a nivel del NM, los ANF EGFP+ habían alcanzado el NM en E9 (Figura 3D) y se observaron continuamente en E15 y E19 (Figura 3E-F). Las imágenes de gran aumento revelaron terminaciones en forma de cono de crecimiento de ANFs en E9 (Figura 3H), que formaron el gran bulbo final en forma de palma en E15 antes de que se convirtieran en el bulbo final caracterizado de morfología Held con ramas complejas en E19 (Figura 3I-J). Más allá del NM, también se observaron extensas ramas de ANF en el NA, otro núcleo coclear primario (Figura 3E). Esto era de esperar, ya que los mismos ANFs se bifurcan para inervar tanto el NM como el NA en pollos32. También vimos fibras EGFP+ entrando en los grupos de células vestibulares adyacentes, incluyendo el núcleo vestibular descendente (VeD) como se muestra en la Figura 3E. Aunque optimizamos la ubicación del electrodo electroporante para apuntar preferentemente a la porción anterior del otocisto donde se forma AG, también se transfectaron algunas neuronas ganglionares vestibulares. La inmunotinción para la parvalbúmina, un marcador de ANF en pollos, se puede utilizar para diferenciar las fibras auditivas de las vestibulares en el tronco encefálico (Figura 3F-G).

En resumen, esta estrategia de electroporación proporciona una transfección selectiva de las neuronas presinápticas en el circuito AG-NM y se puede utilizar para rastrear el desarrollo del bulbo final de Held a niveles terminales individuales después de manipulaciones genéticas.

Figure 1
Figura 1. Knockdown FMRP en el pollo NM. (A) Imagen de la configuración de electroporación. (B) Dibujo esquemático que muestra el sitio de microinyección en el nivel rombomero r5/6 de un embrión de pollo HH12. Abreviaturas: NT = tubo neural; SO = somite. (C) Para mejorar la visibilidad, se inyectó tinta india (negra) debajo del embrión con una jeringa. Luego se inyectó una mezcla de plásmidos teñida con verde rápido en el lumen del tubo neural. (D) Posicionamiento del electrodo bipolar para electroporación. + y - indican los lados positivo y negativo, respectivamente. Tenga en cuenta que la mezcla de plásmido azul se difundió en el tubo neural en el lado positivo después de la electroporación. (E-F) Imagen de campo brillante (BF) (E) fusionada con el canal EGFP (F) de un embrión de pollo electroporado en el día embrionario 3 (E3), que muestra transfección en el tubo neural al mismo nivel anteroposterior del otocisto. Dox se aplicó en E2, 6 h después de la electroporación. Las células migratorias de la cresta neural craneal (CNC) se indican con la flecha amarilla y se magnifican en el recuadro en F. Barra de escala = 500 μm en E, se aplica a E y F; 100 μm en el recuadro. (G-H) Células transfectadas con Fmr1 shRNA y EGFP en la sección transversal de un embrión E3 transfectado. Las células EGFP+ estaban confinadas en un lado del tubo neural. La sección fue doblemente teñida con inmunorreactividad FMRP (gris). Barra de escala = 40 μm en G, se aplica a G y H. (I-J) Imagen BF (I) fusionada con el canal EGFP (J) de un tronco encefálico E15 después del tratamiento con Dox en E8. Barra de escala = 1 mm en I, se aplica a I y J. (K-L) Sección transversal de un tronco encefálico E15 con neuronas EGFP+ NM solo en el lado transfectado (trans). En el lado contralateral (contra) (K), se observaron axones EGFP+ en la porción ventral del núcleo laminar (NL). (M-N) Imágenes de gran aumento del NM en E19 con doble etiquetado de inmunotinción FMRP (rojo) y SNAP25 (azul). SNAP25 es un marcador presináptico que etiqueta el bulbo final de Held. Tenga en cuenta la marcada reducción de la inmunorreactividad FMRP en las neuronas transfectadas (verde; *) en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas (•). (O-P) Imágenes de gran aumento del ganglio auditivo (AG) en E19 con inmunorreactividad FMRP. Las neuronas AG (AGN) no fueron transfectadas (EGFP-). Algunas células gliales derivadas de células CNC indicadas en F fueron transfectadas. Barra de escala = 10 μm en M, se aplica a M-P. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Derribo FMRP en el conducto auditivo del pollo. (A) Imagen de campo brillante (BF) que muestra la microinyección de plásmidos en el otocisto en HH13. Se inyectó tinta india (negra) debajo del embrión para mejorar la visibilidad. (B) Posicionamiento del electrodo bipolar para electroporación. El lado positivo (etiquetado con un símbolo más, +) se colocó antes del otocisto, y el lado negativo (etiquetado con un símbolo menos, -) se colocó posterior al otocisto. (C) La sección transversal de una cabeza de pollo en E6 fue inmunoteñida para FMRP (rojo) y neurofilamento (NF; azul). Dox se aplicó en el E3 después de la electroporación. Se detectó fluorescencia EGFP en el otocisto, pero no en el tronco encefálico. Barra de escala = 100 μm. (D-E) Imagen BF (D) fusionada con el canal EGFP (E) de un conducto auditivo en E9. Barra de escala = 500 μm. (F-G) Sección transversal de un conducto auditivo E9 con inmunotinción FMRP (rojo) y NF (azul). Se observaron células EGFP+ en la pared del conducto coclear, la papila basilar (PA) y el ganglio auditivo (AG). Barra de escala = 50 μm en F, se aplica a F y G. (H-J) Imágenes de gran aumento de una PA E9 que muestran inmunorreactividad FMRP en gran medida disminuida en células ciliadas transfectadas (HC; *) en comparación con HC no transfectadas (•). Las fibras positivas para NF (azul) fueron la inervación periférica de las neuronas AG. (K-M) Imágenes de gran aumento de neuronas AG en E9 con inmunotinción FMRP (rojo). La inmunorreactividad FMRP fue fuerte en neuronas no transfectadas (•) y no detectable en neuronas transfectadas (EGFP+; *). Barra de escala = 50 μm en H, y se aplica a H-M. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Seguimiento axonal de neuronas AG transfectadas en el tronco encefálico. Los embriones se electroporaron en HH13 para la transfección de otocisto de Fmr1 shRNA. La aplicación Dox comenzó en E2. (A) Secciones transversales de una cabeza de pollo E6 con inmunotinción del Islote-1 y contratinción DAPI. Las células EGFP+ fueron evidentes en el ganglio auditivo (AG). Las estrellas* indican varias neuronas AG transfectadas en el recuadro. Barra de escala = 100 μm en A y 10 μm en recuadro. (B-C) Imagen de campo brillante (BF) (B) fusionada con el canal EGFP (C) de un tronco encefálico E9. En este caso, una porción de las AG (flechas blancas) se dejó conectada al tronco cerebral auditivo. La flecha amarilla indica neuronas AG transfectadas (AGN) en el recuadro. Las fibras EGFP+ fueron evidentes en el lado transfectado del tronco encefálico. Barra de escala = 1 mm en B, se aplica a B y C; 100 μm en el recuadro. (D) Sección transversal del tronco encefálico E9 en el nivel indicado en C por la línea discontinua. Las fibras nerviosas auditivas EGFP+ (ANF; verde) se extendían a lo largo del margen dorsal del tronco encefálico y se acercaban al núcleo magnocelular (NM). Barra de escala = 100 μm. (E-G) Fibras EGFP+ en E15 (E) y E19 (F-G). También se observaron algunas fibras en el núcleo angular (NA) y el núcleo vestibular descendente (VeD). Las secciones E19 se tiñeron para la inmunorreactividad de la parvalbúmina (PV) como marcador de ANF. El cuadro discontinuo en F se magnifica en los recuadros, mostrando un ANF EGFP +, que era inmunorreactivo PV. Barra de escala = 100 μm en E; 50 μm en F, se aplica a F y G; 2 μm en los recuadros. (H-J) Imágenes de gran aumento de terminales ANF en NM en E9, E15 y E19, que muestran la formación y maduración progresiva del bulbo final de Held. Barra de escala = 5 μm en H, se aplica a H-J. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Para determinar la función autónoma celular de FMRP, es necesario manipular su expresión en grupos celulares individuales o tipos de células. Dado que una de las principales funciones de FMRP es regular la formación sináptica y la plasticidad, la manipulación selectiva de cada componente sináptico de un determinado circuito es un requisito previo para una comprensión completa del mecanismo FMRP en la comunicación sináptica. Usando electroporación in ovo de embriones de pollo, demostramos un método para apuntar a la expresión de FMRP en el circuito AG-NM, ya sea en neuronas AG presinápticas o neuronas NM postsinápticas. Para lograr esto, elegir las etapas de desarrollo apropiadas para la electroporación y colocar con precisión el electrodo de electroporación en el embrión son pasos críticos. Las neuronas NM surgen de progenitores neurales en el tubo neural en el nivel r5/6 en HH1223. En la misma etapa, las células de la cresta neural craneal migran desde la punta dorsal del tubo neural hasta el ganglio cocleovestibular para envolver futuras neuronas AG33. Por lo tanto, tanto las neuronas NM como las células gliales en el AG son derivadas del tubo neural. En contraste, las células ciliadas y las neuronas AG se originan en el ectodermo24. El ectodermo adyacente al nivel r5/6 se engrosa en HH10 y luego se invagina para formar la copa ótica en HH13. La copa ótica luego se cierra y se separa del ectodermo para formar el otocisto, con la porción anterior convirtiéndose en el órgano sensorial auditivo y la porción posterior contribuyendo al sistema vestibular. Tanto en la porción auditiva como en la vestibular, las células neuroblásticas que residen en la parte ventral de la copa ótica se deslaminan y migran para formar el ganglio cocleovestibular. Sobre la base de estos estudios de mapeo del destino, transfectamos los progenitores de las neuronas NM electroporando el tubo neural en HH12, una estrategia que se ha establecido previamente26,28,34. Aunque esta estrategia conduce a la transfección adicional de células gliales en el tronco encefálico y el AG, ninguna de las neuronas AG fue transfectada. La transfección neuronal específica se puede lograr empleando una estrategia impulsada por el promotor Atoh1, como lo que hicimos anteriormente21. Para la transfección selectiva de neuronas AG, electroporamos el otocisto en HH13. Los plásmidos inyectados en la copa ótica entraron predominantemente en la porción anterior del otocisto para la transfección de células ciliadas y neuronas AG simultáneamente al colocar electrodos como se muestra en la Figura 2B. Para dirigirse preferentemente a las neuronas AG sobre las células ciliadas, es factible inyectar la solución plásmida directamente en la región adyacente al otocisto anterior, donde los neuroblastos deslaminados localizan35. Sin embargo, este método tiene una menor eficiencia de la transfección de neuronas AG en comparación con la inyección de otocisto, ya que los plásmidos se difunden rápidamente después de la inyección. Este método también puede conducir a la transfección adicional de las células mesenquimales circundantes de la cabeza. Un método para dirigirse preferentemente a las células ciliadas sobre las neuronas AG es retrasar la inyección de otocisto y la electroporación a HH18 (que es ~ día embrionario 3), ya que la mayoría de los neuroblastos (precursores de neuronas AG) han migrado desde el otocisto en esta etapa24.

Con modificaciones, este método se puede extender para estudiar el sistema vestibular. Para la transfección del ganglio vestibular, la dirección de los electrodos que se muestra en la Figura 2B debe invertirse para transfectar la porción posterior del otocisto debido a la ubicación distinta de los precursores del ganglio auditivo y vestibular.

La electroporación in ovo de embriones de pollo es una técnica bien establecida para investigar las primeras etapas de desarrollo (dentro de la primera semana de incubación). Para los estudios a largo plazo, la tasa de supervivencia es una preocupación importante. Al comenzar el tratamiento con Dox en E8, la tasa de supervivencia que se encuentra aquí es ~ 60% en E9, pero cae al 30% en E15, e incluso más baja en E19. Las crías de huevos electroporados son posibles pero raras y solo pueden sobrevivir durante varios días en la mayoría de los casos. Para aumentar la tasa de supervivencia, se debe considerar lo siguiente: 1) usar un electroporador que proporcione ondas cuadradas en lugar de ondas agudas; 2) aplicar una o dos gotas de PBS estéril en la parte superior del embrión si la capa de albúmina no es lo suficientemente gruesa como para promover la conductividad eléctrica (esto ayudará a reducir el trauma eléctrico); 3) la apertura de la membrana vitelina para exponer el embrión en el lugar de la inyección no es necesaria para una transfección exitosa y puede dañar el embrión; 4) para reducir el riesgo de contaminación, use una jeringa para pinchar la parapelícula y administre Dox en lugar de volver a abrir la ventana. Después de la inyección, limpie la película transparente con etanol al 75% y cubra la abertura de la aguja con cinta adhesiva; 5) Para la transfección de otocistos, inyecte plásmidos en el otocisto dorsolateralmente con una pipeta en ángulo de 45° para evitar una posible punción de la aorta dorsal debajo. Si la aorta dorsal está dañada, el sangrado eliminará los plásmidos e incluso causará la muerte; 6) si es posible, evite usar tinta china para visualizar el embrión. Menos manipulación y menos procedimientos resultarán en una mayor tasa de supervivencia.

Además de la capacidad de transfectar selectivamente neuronas AG o NM, la electroporación in ovo proporciona un sistema único que permite comparaciones vecinas para análisis de datos. Después de la electroporación, solo se transfecta un subconjunto de células en el NM o el AG, lo que permite que las células circundantes no transfectadas en el mismo grupo celular sirvan como un control ideal20. Si la interacción potencial entre las neuronas vecinas es una preocupación, las contrapartes neuronales del lado no transfectado del oído y el cerebro pueden servir como un control adicional. Para estudios histológicos y de imagen, este resultado permite análisis de datos con alta eficiencia a nivel de una sola célula o de una sola fibra. Los análisis moleculares también son factibles si se combinan con la clasificación celular basada en fluorescentes y los análisis de proteínas y ARN a gran escala, como la espectrometría de masas y la secuenciación de próxima generación. Sin embargo, el uso de electroporación in ovo como medio de edición de genes puede ser un desafío para los estudios funcionales y de comportamiento porque el porcentaje de células transfectadas dentro de un grupo celular puede no ser lo suficientemente grande como para tener consecuencias funcionales.

Es esencial realizar dos análisis de verificación al adoptar el enfoque de electroporación in ovo. En primer lugar, debe confirmarse el efecto de la edición génica sobre la proteína de interés. La electroporación in ovo transfecta solo un subconjunto de neuronas en el NM o AG (es decir, un patrón de mosaico). Realizar Western blot en tejidos homogeneizados que contienen una mezcla de neuronas transfectadas y no transfectadas no es lo suficientemente sensible como para reflejar con precisión el efecto de derribo. Por lo tanto, la validación debe realizarse a nivel de célula individual utilizando métodos como la inmunocitoquímica. Para este propósito, previamente generamos un anticuerpo que reconoce el FMRP de pollo. La especificidad de este anticuerpo fue verificada por inmunocitoquímica y western blot en un estudio previo30. El efecto de derribo del shRNA Fmr1 se validó cuantitativamente observando reducciones significativas en la intensidad de la inmunorreactividad FMRP en las neuronas NM transfectadas en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas. En segundo lugar, se deben emplear grupos de control que utilicen ARN codificados, u otras construcciones de control, para confirmar la especificidad de los efectos celulares observados de la expresión errónea de FMRP20,21. Para lograr este objetivo, diseñamos un shRNA codificado, lo clonamos en el mismo sistema vectorial Tet-On y lo electroporamos en precursores de NM, como se describió anteriormente20. La expresión de FMRP en las neuronas NM transfectadas con el shRNA codificado no se vio afectada, como lo demuestra la intensidad sin cambios de la inmunorreactividad FMRP en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas. También hemos identificado una serie de efectos de la transfección de shRNA Fmr1 sobre el crecimiento axonal, la poda dendrítica, la formación terminal y la neurotransmisión (revisado en Curnow y Wang, 2022)36. Concluimos que estos efectos fueron inducidos específicamente por la pérdida autónoma celular de FMRP porque el shRNA revuelto no pudo inducir cambios similares.

En conclusión, la técnica de electroporación in ovo permite la edición selectiva del gen Fmr1 con control temporal y especificidad de componentes en los circuitos auditivos oído-tronco encefálico y puede modificarse para manipular el sistema vestibular. El desarrollo de esta tecnología avanzada en el embrión de pollo, un modelo bien establecido en biología del desarrollo, ha contribuido y continuará contribuyendo a nuestra comprensión del desarrollo del cerebro en condiciones normales y anormales como el SXF.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio contó con el apoyo de: una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 32000697); el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (202102080139); la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (11620324); una beca de investigación del Laboratorio Clave de Medicina Regenerativa, Ministerio de Educación, Universidad de Jinan (No. ZSYXM202107); los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales de China (21621054); y la Fundación de Investigación Científica Médica de la provincia china de Guangdong (20191118142729581). Agradecemos al centro médico experimental de la Universidad de Jinan. Agradecemos a la Dra. Terra Bradley por la cuidadosa edición del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

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References

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Neurociencia Número 185 síndrome X frágil circuito sensorial oído interno núcleo coclear formación de sinapsis desarrollo cerebral bulbo final de Held embrión de pollo
Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación <em>in ovo</em>
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Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

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