Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dissekering av cellautonom funktion av bräckligt X mental retardationsprotein i en hörselkrets genom in ovo-elektroporation

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Med hjälp av ovo-elektroporering utarbetade vi en metod för att selektivt transfektera det auditiva innerörat och den cochleära kärnan i kycklingembryon för att uppnå en cellgruppsspecifik knockdown av bräckligt X-mental retardationsprotein under diskreta perioder av kretsmontering.

Abstract

Fragile X mental retardation protein (FMRP) är ett mRNA-bindande protein som reglerar lokal proteinöversättning. FMRP-förlust eller dysfunktion leder till avvikande neuronala och synaptiska aktiviteter vid bräckligt X-syndrom (FXS), som kännetecknas av intellektuell funktionsnedsättning, sensoriska abnormiteter och sociala kommunikationsproblem. Studier av FMRP-funktion och FXS-patogenes har främst utförts med Fmr1 (genen som kodar för FMRP) knockout hos transgena djur. Här rapporterar vi en in vivo-metod för att bestämma den cellautonoma funktionen hos FMRP under perioden för kretsmontering och synaptisk bildning med kycklingembryon. Denna metod använder scen-, plats- och riktningsspecifik elektroporering av ett läkemedelsinducerbart vektorsystem innehållande Fmr1 litet hårnåls-RNA (shRNA) och en EGFP-reporter. Med denna metod uppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditiva ganglionen (AG) och i ett av dess hjärnstamsmål, kärnan magnocellularis (NM), vilket ger en komponentspecifik manipulation inom AG-NM-kretsen. Dessutom tillåter mosaikmönstret för transfektionen kontroller inom djur och närliggande neuron/ fiberjämförelser för förbättrad tillförlitlighet och känslighet vid dataanalys. Det inducerbara vektorsystemet ger tidsmässig kontroll av genredigeringsdebut för att minimera ackumulerande utvecklingseffekter. Kombinationen av dessa strategier ger ett innovativt verktyg för att dissekera FMRP: s cellautonoma funktion i synaptisk och kretsutveckling.

Introduction

Bräckligt X-syndrom (FXS) är en neurodevelopmental störning som kännetecknas av intellektuell funktionsnedsättning, sensoriska abnormiteter och autistiska beteenden. I de flesta fall orsakas FXS av en global förlust av bräckligt X-mentalt retardationsprotein (FMRP; kodat av Fmr1-genen) som börjar i tidiga embryonala stadier1. FMRP är ett RNA-bindande protein som normalt uttrycks i de flesta nervceller och gliaceller i hjärnan, liksom i sensoriska organ 2,3,4. I däggdjurshjärnor är FMRP sannolikt associerat med hundratals mRNA som kodar för proteiner som är viktiga för olika neurala aktiviteter5. Studier av konventionella Fmr1-knockoutdjur visade att FMRP-uttryck är särskilt viktigt för montering och plasticitet av synaptisk neurotransmission6. Flera villkorliga och mosaik knockout-modeller har vidare visat att FMRP-åtgärder och signaler varierar mellan hjärnregioner, celltyper och synaptiska platser under flera utvecklingshändelser inklusive axonal projektion, dendritisk mönstring och synaptisk plasticitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akut funktion av FMRP vid reglering av synaptisk överföring studerades genom intracellulär leverans av hämmande FMRP-antikroppar eller FMRP själv i hjärnskivor eller odlade neuroner15,16,17,18. Dessa metoder erbjuder dock inte möjligheten att spåra FMRP-feluttrycksinducerade konsekvenser under utvecklingen. Således är det i stort behov att utveckla in vivo-metoder för att undersöka FMRP: s cellautonoma funktioner och förväntas hjälpa till att avgöra om de rapporterade avvikelserna hos FXS-patienter är direkta konsekvenser av FMRP-förlust i de associerade neuronerna och kretsarna, eller sekundära konsekvenser härledda från nätverksomfattande förändringar under utveckling19.

Den auditiva hjärnstammen hos kycklingembryon erbjuder en unikt fördelaktig modell för djupgående funktionella analyser av FMRP-reglering i krets- och synapsutveckling. Den enkla tillgången till embryonala kycklinghjärnor och den väletablerade ovo-elektroporationstekniken för genmanipulation har i hög grad bidragit till vår förståelse av hjärnans utveckling i tidiga embryonala stadier. I en nyligen publicerad studie kombinerades denna teknik med avancerade molekylära verktyg som möjliggör tidsmässig kontroll av FMRP-feluttryck20,21. Här är metodiken avancerad för att inducera selektiva manipuleringar av presynaptiska och postsynaptiska neuroner separat. Denna metod utvecklades i den auditiva hjärnstamskretsen. Akustisk signal detekteras av hårceller i det auditiva innerörat och överförs sedan till den auditiva ganglionen (AG; även kallad spiral ganglion hos däggdjur). Bipolära nervceller i AG innerverar hårceller med sina perifera processer och skickar i sin tur en central projektion (hörselnerven) till hjärnstammen där de slutar i två primära cochleära kärnor, kärnan magnocellularis (NM) och kärnan angularis (NA). Neuroner i NM är strukturellt och funktionellt jämförbara med de sfäriska buskiga cellerna i däggdjurets anteroventrala cochleära kärna. Inom NM, hörselnervfibrer (ANFs) synaps på somata av NM-neuroner via den stora endbulben av Held-terminaler22. Under utvecklingen uppstår NM-neuroner från rhombomererna 5 och 6 (r5/6) i bakhjärnan23, medan AG-neuroner härrör från neuroblaster som bor i otocysten24. Här beskriver vi proceduren för att selektivt slå ner FMRP-uttryck i de presynaptiska AG-neuronerna och i de postsynaptiska NM-neuronerna separat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ägg och kycklingembryon hanterades med omsorg och respekt i enlighet med de djurprotokoll som godkänts av Jinan University Animal Care and Use Committee.

1. Ägg- och plasmidberedning

  1. Förberedelse av ägg
    1. Få färskt befruktade kycklingägg (Gallus gallus) från South China Agricultural University och förvara vid 16 ° C före inkubation. För optimal livskraft, sätt alla ägg för inkubation inom en vecka efter ankomst.
    2. Placera äggen horisontellt och inkubera vid 38 °C i 46–48 timmar tills Hamburger och Hamilton (HH) steg 1225 för neuralrörstransfektion, eller i 54–56 timmar till HH13 för otocysttransfektion. Eftersom äggets djurpol är lättare än vegetabiliska polen, placerar horisontell placering embryot på toppen av ägget för enkel manipulation. Var försiktig så att ägget hålls horisontellt i detta och alla följande steg.
    3. Placeringen av embryot framträder som ett mörkt område på äggskalet när man kastar ljus från botten av ägget med hjälp av en ficklampa. Vid önskade HH-steg, använd denna ficklampametod för att markera embryots placering på äggskalet med penna.
    4. Torka äggen med gasväv som innehåller 75% etanol. Borra ett hål i äggets spetsiga ände med saxspetsen och ta bort 2 ml albumin med en 18 G nålspruta. Se till att hålet bara är tillräckligt stort för att tillåta nålinsättning. Torka bort eventuellt läckande albumin med gasväv och försegla hålet med klar tejp.
    5. För att minimera sprickor och för att förhindra fallande skalskräp under fönster, täck toppen av ägg med klar tejp, centrerad på det pennmarkerade mörka området.
  2. Plasmid-DNA-extraktion
    1. Klona kyckling Fmr1 shRNA med hjälp av ett transposonbaserat Tet-on-system som beskrivits tidigare20. Detta system innehåller tre plasmider: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 och pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, vilket ger ett läkemedelsinducerbart vektorsystem genom vilket uttrycket av Fmr1 shRNA och EGFP tystas efter transfektion och kan slås på genom doxycyklin (Dox) induktion.
      OBS: Dessa plasmider är för närvarande inte tillgängliga i ett arkiv. Författarna samtycker till att tillhandahålla plasmiderna på rimlig begäran.
    2. Extrahera plasmid-DNA med hjälp av ett endotoxinfritt beredningssats enligt tillverkarens instruktioner och fäll ut genom att tillsätta 1/15 volym 7,5 M natriumacetat och 1 volym 100% isopropanol.
    3. Fäll ut plasmider vid -20 °C över natten och centrifugera vid 13 000 x g i 10 minuter. Lös upp pelleten med Tris-EDTA-bufferten i satsen till en slutlig koncentration på 4-5 μg/μl. Plasmider kan förvaras vid -20 °C i 12 månader utan minskad transfektionseffektivitet.
    4. På dagen för elektroporation, blanda noggrant 2 μL av varje plasmid i ett sterilt centrifugrör med hjälp av en pipettspets. Den resulterande volymen på 6 μL av plasmidblandningen är tillräcklig för att elektropolera tre dussin ägg. För att visualisera plasmiden under elektroporering, tillsätt 1 μL 0,1% snabbgrön (beredd i steril ddH 2O) för varje6 μL DNA-blandning26, vilket gör plasmidblandningen blå.

2. I ovo elektroporation

  1. Äggfönster och embryoidentifiering
    1. På dagen för elektroporation, ta bort äggen från inkubatorn, ett dussin ägg i taget. Att hålla ägg ur inkubatorn i mer än 1 h introducerar utvecklingsvariationer och minskar livskraften.
    2. Torka av alla operationsverktyg med gasväv som innehåller 75% etanol.
    3. Lägg varje ägg i en skräddarsydd skumhållare. Torka av det tejptäckta området med 75% etanol och skär ett fönster (1-2 cm2) runt pennmärkets omkrets med en liten sax (figur 1A). Håll saxen platt när du klipper för att undvika att skada embryot under.
    4. Placera det fönsterförsedda ägget under ett stereomikroskop med ett 10x okular och 2x zoom och identifiera embryot. Justera ljuskällans vinkel och ljusstyrka för bättre visualisering.
      OBS: Det krävs övning och erfarenhet för att visualisera embryot och identifiera nervröret i detta skede.
      1. För nybörjare, använd följande valfria bläckinjektion för att underlätta embryoidentifiering. Förbered 10% indisk bläcklösning i 0,01 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och autoklav i förväg. Fyll en 1 ml spruta med bläcklösningen och sätt sedan på en 27 G nål. Böj nålen i 45° vinkel med pincett.
      2. Under mikroskopet, stick försiktigt från kanten av området opaca och sätt in nålen under embryot. Injicera ~ 50 μL bläck, som kommer att diffundera under området pellucida för embryovisualisering. Bläcket kommer att bilda en mörk bakgrund för en tydlig visualisering av embryot.
        OBS: Släpp ut luften från sprutan innan du sätter i och injicerar. När du är skicklig på att visualisera, undvik bläckinjektionssteget eftersom det minskar överlevnaden.
  2. Neuralrörsinjektion och elektroporering
    OBS: Denna procedur utförs vid HH12 för transfektering av NM-neuroner i hjärnstammen.
    1. Dra glaskapillärer (~ 1 mm i diameter och 100 mm långa) i pipetter med en pipettdragare. Under ett dissekerande mikroskop, öppna försiktigt kapillärnålens spets till 10-20 μm i diameter med pincett. Förvara pipetterna (vanligtvis 5-10 åt gången) i en förvaringslåda tills de används.
    2. Fyll en kapillärpipett med 0,5-1 μL av plasmidblandningen genom att applicera undertryck genom ett gummirör i slutet av pipetten. Detta kan uppnås med en spruta eller luftpump.
    3. Placera ägget under mikroskopet så att embryot är vertikalt orienterat med svansen nära dig (eller horisontellt för att injicera kapillärpipetter med en treaxlig manipulator). Håll kapillärpipetten med en hand eller med den treaxliga manipulatorn och kör pipettens spets till r5/6 i en svans-till-huvud-riktning.
      OBS: Det mest främre bakhjärnområdet är r1 och varje efterföljande utbuktning längs nervröret är en individuell rombomer. R5/6 är på samma anteroposterior nivå som otocysten, som är en lätt igenkännlig koppliknande struktur (figur 1B-C).
    4. Stick försiktigt spetsen genom vitellinmembranet och in i dorsala nervröret och dra sedan ut pipetten lite så att spetsen är i neuralrörets lumen. Injicera plasmidblandningen genom att applicera lufttryck tills den tonade plasmiden diffunderar helt till r5/6 och sträcker sig in i r3 och r4.
      OBS: Det är inte nödvändigt att göra en slits på vitellinmembranet för injektion.
    5. Kontrollera om det finns en lyckad injektion, vilket uppnås när den blå plasmidlösningen snabbt diffunderar ner i neuralröret utan att läcka (figur 1B-C). När läckage inträffar bleknar det blå snabbt.
    6. Omedelbart efter injektionen, placera en platina bipolär elektrod på vardera sidan av nervröret (figur 1D). Leverera två pulser med 12 V och 50 ms varaktighet med en elektroporator. Observera luftbubblor i ändarna av den bipolära elektroden, med mer på den negativa sidan.
    7. Kontrollera om det finns framgångsrik elektroporering, vilket uppnås när den tonade plasmidblandningen kommer in i neuralrörsvävnaden nära elektrodens positiva sida. Efter elektroporering, ta försiktigt bort den bipolära elektroden.
    8. Täck fönstret på äggskalet med en bit transparent film som förskärs i 2 i rutor och sprutas med 75% etanol. Placera ägget tillbaka i inkubatorn.
    9. Rengör den bipolära elektroden genom att leverera 10-20 pulser med 12 V och 50 ms varaktighet i saltlösning innan du fortsätter till nästa ägg.
  3. Otocystinjektion och elektroporering
    OBS: Denna procedur utförs vid HH13 för transfektering av hårceller och AG-neuroner i innerörat.
    1. Vid HH13 (som är ~embryonal dag 2,5) har embryot vänt sig så höger sida av huvudet uppåt. Under mikroskopet placerar du ägget så att embryot är vertikalt, med svansen nära dig. Håll kapillärpipetten och stick försiktigt rätt otocyst i dorsolateral riktning (figur 2A).
      OBS: I detta skede framträder otocysten som en liten cirkulär struktur på toppen av kroppen på samma anteroposterior nivå som r5/6.
    2. Injicera plasmidblandningen med lufttryck tills otocysten är fylld med blå lösning27. Kontrollera om det finns en lyckad injektion, vilket uppnås när den blå plasmidblandningen är begränsad i otocysten och inte läcker.
    3. Placera omedelbart efter injektionen den bipolära elektroden på otocysten enligt figur 2B. Placera de positiva respektive negativa sidorna främre respektive bakre till otocysten. Leverera två pulser med 12 V och 50 ms varaktighet med elektroporatorn.
    4. Kontrollera om det finns framgångsrik elektroporering, vilket uppnås när den blå plasmidblandningen kommer in i otocystens vävnad nära elektrodens positiva sida. Efter elektroporering, ta försiktigt bort den bipolära elektroden. Täck fönstret på äggskalet med en transparent film och sätt tillbaka ägget till inkubatorn.

3. Administrering av Dox för att initiera och upprätthålla plasmidtranskription

  1. Beredning av Dox-lösningen
    1. Mät upp 100 mg Dox-pulver under en kemisk huva och lös upp det i 100 ml steril PBS för att få en arbetslösning på 1 mg/ml. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm filter och förvara alikvoter på 1 ml vid -20 °C. Skydda mot ljus20,28.
  2. Administration av Dox
    1. För genredigering med full styrka, vid 24 timmar före önskad ålder, tina en Dox-alikvot på is. Släpp 50 μL Dox direkt på äggets korioallantoiska membran med en spruta som tränger in i den transparenta filmen. Försegla nålhålet med transparent film eller tejp efter injektion.
    2. För att bibehålla knockdown-effekten, administrera Dox varannan dag tills vävnadsskörd i önskat utvecklingsstadium.

4. Vävnadsdissektion och sektionering

  1. Hjärnstammen
    1. För embryon på embryonal stadium 3 (E3) och E6, öppna äggskalet och skär det tillhörande membranet med sax. Sked ut embryot och sänk ner det i 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert.
    2. För E9-embryon, öppna äggskalet, halshugga embryot med sax och överför huvudet till en kiselbottnad platta fylld med PBS. Fäst huvudet ner genom banorna och skär isär toppen av skallen. Placera försiktigt pincetten under hjärnan från båda sidor och lyft hela hjärnan från skallen med tångens axlar. Fördjupa hjärnan i 4% PFA.
    3. För E15- och E19-embryon, öppna äggskalet, halshugga embryot med sax och placera huvudet på en kiselbottnad platta fylld med PBS. Skär upp huden ovanpå huvudet för att exponera skallen.
    4. Incise genom skallen vertikalt med en rakhyvel för att separera framhjärnan och den kaudala hjärnan. Fördjupa det kaudala blocket i PBS, ta bort toppen av skallen och ta sedan hjärnan från skallen.
    5. Fäst hjärnan ner genom syntungen och separera lillhjärnan och hjärnstammen. Var försiktig så att du inte skadar den auditiva hjärnstammen, som ligger precis under cerebellum. Ta bort så mycket dura som möjligt från hjärnstammen och sänk sedan ner den i 4% PFA.
    6. Förvara embryon och hjärnvävnader i 4 % PFA vid 4 °C över natten, med undantag för E19-hjärnstammar, som bör förvaras under samma förhållanden i 24 timmar.
    7. Efter fixering, dehydrera vävnaden i PBS som innehåller 30% sackaros tills den sätter sig, vilket vanligtvis tar 1-3 dagar, beroende på ålder.
    8. Sektion hjärnstammen (E15 och E19) vid 30 μm vid koronalplanet med hjälp av ett glidande mikrotom. Samla sektionerna i PBS och förvara vid 4 °C före immunfärgning.
    9. För E3- och E6-embryon och E9-hjärnstammar, sektion vid 50 μm tvärs. Samla sektioner i PBS och förvara vid 4 °C. Montera sektionerna på gelatinbelagda mikroskopglas före immunfärgning. Att samla tjockare sektioner för dessa åldrar underlättar vävnadshanteringen.
  2. Hörselkanal
    1. Efter att ha tagit bort hjärnstammarna från E9-, E15- och E19-embryon är hörselkanalen, som är inbäddad i det temporala benet, lätt identifierbar liggande under skallen, och det temporala benet kan lätt separeras från den omgivande skallen. För E9-embryon, fixera hela det temporala benet i 4% PFA. För äldre embryon, ta bort den beniga strukturen hos det temporala benet för att isolera hörselgången och fixera hörselkanalen i 4% PFA.
    2. Förvara alla temporala ben och hörselgångar i 4% PFA vid 4 ° C över natten före vävnadsinbäddning.
    3. Utför vävnadsinbäddning enligt beskrivningen. Förbered inbäddningslösningen enligt följande: Blötlägg 10% gelatin (från nötkreatur) i kallt vatten tills gelatingranulerna sväller och sätter sig (ca 30 min). Värm blandningen till ~ 50 ° C för att lösa upp gelatinet och tillsätt 20% sackaros i gelatinlösningen och rör om för att lösa upp. Förvara gelatin-sackaroslösningen vid 4 °C i upp till en månad.
    4. Värm gelatin-sackaroslösningen vid 37 °C för användning. Blötlägg de temporala benen/hörselkanalerna i den varma gelatin-sackaroslösningen på en 96-brunnsplatta vid 37 °C tills de sätter sig, vanligtvis 30-60 min.
    5. Linja botten av brunnarna på en 12-brunnsplatta med en remsa av transparent film. Tillsätt ett lager varm gelatin-sackaroslösning och vänta tills den stelnar. Överför ett temporalt ben / hörselkanal till varje brunn.
    6. Implantera vävnaden med ett andra lager av varm gelatin-sackaroslösning. Justera vävnadens position så att den ligger i mitten av gelén och hörselkanalen är orienterad horisontellt. Flytta försiktigt plattan till ett 4 °C kylskåp och vänta tills gelén är fast.
    7. Dra den genomskinliga filmremsan för att flytta gelvävnadsblocket ur brunnen. Trimma extra gel i ett fyrkantigt block och skär ett hörn av blocket för att identifiera orienteringen. Vik in gelatinblocket med en bit folie, frys på torris och förvara sedan vid -80 ° C tills det är sektionerat.
    8. Dela blocket vid 20 μm längs hörselkanalens longitud med en kryostat. Montera sektionerna direkt på gelatinbelagda mikroskopglas. Förvara objektsglasen vid -80 °C före immunfärgning.
    9. Före immunfärgning, sänk ner objektglasen i förvärmd PBS (45 ° C) i 5 minuter för att lösa upp gelatinet och tvätta sedan glasen 3x med rumstemperatur PBS för att ta bort kvarvarande gelatin.

5. Immunfärgning och mikroskopavbildning

OBS: Två typer av immunfärgning utförs beroende på om sektioner är monterade på glidbanor eller fritt flytande i PBS.

  1. Immunfärgning på glidbanor
    1. Tvätta bilderna 3x i 10 min vardera med PBS. Cirkla området som innehåller sektionerna med en oljepenna för att förhindra att vätska läcker ut under färgning. Täck sektionerna med en blockerande lösning som innehåller 5% normalt getserum i PBS och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
    2. Späd de primära antikropparna (för den slutliga koncentrationen som används se materialtabellen) i PBS innehållande 0,3% TritonX-100 och 5% normalt getserum. Ta bort blockeringslösningen och täck sedan sektionerna med den primära antikroppslösningen. Inkubera objektglasen vid 4 °C över natten i en låda som innehåller ett lager destillerat vatten i botten.
    3. Skölj bilderna 3x i 10 min med PBS. Applicera fluorescerande sekundära antikroppar utspädda vid 1:500 i PBS innehållande 0,3% TritonX-100 på objektglas. Inkubera bilderna vid rumstemperatur i 4 h, avskärmade från ljus.
    4. Tvätta bilderna 3x med PBS. Släpp försiktigt två droppar monteringsmedium på bilderna och täck sektionerna med täckglas. Var försiktig så att du inte genererar luftbubblor mellan täckglaset och bilden.
  2. Immunfärgning för helmonterade embryon och fritt flytande sektioner
    1. Tvätta embryona/sektionerna med PBS 3x i 10 min vardera i en brunnsplatta. Späd de primära antikropparna i PBS innehållande 0,3% TritonX-100 och 5% normalt getserum i centrifugalrör. Överför varje embryo/sektion till ett rör med en glaskrok och inkubera på en skakapparat vid 60 rpm över natten vid 4 °C.
    2. Tvätta embryon/sektioner 3x med PBS i 10 min vardera i en brunnsplatta. Överför varje embryo/sektion till ett mörkt centrifugalrör fyllt med fluorescerande sekundär antikroppslösning och inkubera vid rumstemperatur i 4 timmar på skakapparaten.
    3. Tvätta embryona/sektionerna 3x med PBS i en brunnsplatta. Använd en borste för att montera sektionerna på gelatinbelagda mikroskopglas i en 15 cm skål som innehåller PBS. Efter att bilderna har torkats något (~ 5 min), applicera två droppar monteringsmedium och placera en täckglas. Var försiktig så att du inte genererar luftbubblor mellan täckglaset och bilden. Förvara hela monteringsvävnaderna i PBS för avbildning.
  3. Imaging
    1. Föreställ dig hela monteringsvävnaderna i PBS i en skål med en kiselbotten som innehåller kolpulver, vilket ger en svart bakgrund. Ta och bearbeta bilder med hjälp av ett kommersiellt bildbehandlings-Olympus-programvarupaket, som beskrivits tidigare29.
    2. Föreställ avsnitten på bilderna med ett konfokalmikroskop som beskrivits tidigare20. Föreställ sektionerna i ett enda fokusplan med 10x, 20x och 63x mål. Ta alla bilder från samma djur med samma parametrar. Var noga med att justera lasernivån och inställningarna för bildförvärv för att undvika signalmättnad.
    3. Utför bildbehandling med Fiji-programvaran. För illustration, justera bildens ljusstyrka, kontrast och gamma med ett professionellt bildredigeringsprogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genom att utföra ovo-elektroporering på olika platser och i olika utvecklingsstadier uppnådde vi selektiv FMRP-knockdown antingen i hörselperiferin eller i den auditiva hjärnstammen.

FMRP knockdown i NM
Litet hårnåls-RNA (shRNA) mot kycklingen Fmr1 designades och klonades in i Tet-On-vektorsystemet som beskrivits tidigare20. Inställningen för in ovo-elektroporering visas i figur 1A. Plasmid-DNA tonat med snabbt grönt injicerades i nervröret på r5/r6-nivå vid HH12 (figur 1B-C). En platina bipolär elektrod placerades på varje sida av nervröret på r5/6-nivån (figur 1D). Två pulser vid 12 V levererades för att driva plasmiden in i vävnaden nära elektrodens positiva sida. Dox applicerades på det korioallantoiska membranet för att utlösa uttrycket av Fmr1 shRNA och EGFP. Efter 24 timmars Dox-behandling var EGFP uppenbart under ett fluorescerande stereomikroskop. Figur 1E-F visar ett exempel på E3 när Dox tillämpades vid E2. Tvärgående sektioner bekräftade placeringen av EGFP-uttryckande (EGFP +) celler på ena sidan av bakhjärnan (figur 1G-H). Dessutom hittades en grupp transfekterade celler främre till otocysten; dessa var kraniala neurala vapenceller som migrerade ventrolateralt från nervröret (figur 1F). Elektroporerade embryon kan också inkuberas längre för att studera kretsbildning i senare skeden. Vid E15 observerades EGFP i hjärnstammen, men endast på den transfekterade sidan (figur 1I-J). Tvärsnitt på nivån av dorsal hjärnstam visade en handfull EGFP + neuroner som var utspridda i NM på sidan av elektroporering (figur 1L). EGFP + -fibrer sågs projicera mot målet för NM-neuroner: dorsalkärnan laminaris (NL) på den ipsilaterala sidan (figur 1L) och ventral NL på den kontralaterala sidan (figur 1K). Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA validerades genom markanta minskningar av FMRP-immunreaktivitet i transfekterade NM-neuroner jämfört med närliggande icke-transfekterade neuroner (figur 1M-N). I den auditiva ganglionen (AG) var neuroner icke-transfekterade (EGFP-), även om vissa gliaceller som omger AG-neuroner var EGFP + (figur 1O-P), förmodligen härledda från EGFP + kraniala neurala vapenceller (se figur 1F). Således ger denna elektroporeringsstrategi en selektiv transfektion av de postsynaptiska neuronerna i AG-NM-kretsen.

FMRP-knockdown i hörselgången
Plasmidblandningen injicerades i otocysten vid HH13 (figur 2A), följt av elektroporering genom att placera den positiva sidan av elektroden främre till otocysten och den negativa sidan bakom otocysten (figur 2B). Helhuvudsektioner vid E6 visade stark EGFP-fluorescens i höger otocyst, men inte i hjärnstammen (figur 2C). Isolerade hörselkanaler vid E9 uppvisade omfattande EGFP-fluorescens i hela kanalens längd (figur 2D-E). På tvärgående sektioner bekräftades EGFP + -celler i basilarpapillen (BP) längs väggen i den cochleära kanalen och i AG (figur 2F-G). Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA validerades genom markanta minskningar av FMRP-immunreaktivitet i transfekterade hårceller (*, figur 2H-J) jämfört med angränsande icke-transfekterade hårceller (•, figur 2H-J). För stödceller var FMRP-immunreaktiviteten svag i både transfekterade och icke-transfekterade celler (figur 2H-J). I likhet med hårceller minskade FMRP-immunreaktiviteten till stor del i transinfekterade AG-neuroner jämfört med närliggande icke-transfekterade neuroner (figur 2K-M).

Vi spårade sedan den centrala projektionen av transfekterade AG-neuroner till hjärnstammen via hörselnerven. Mosaikmönstret för Fmr1 shRNA-transfektion i AG bekräftades ytterligare vid E6 med hjälp av ö-1-immunreaktivitet (figur 3A), en markör för det utvecklande kycklingörat31. När en del av AG extraherades med hjärnstammen under dissektion visualiserades isolerade EGFP + AG-neuroner och deras fibrer i hjärnstammen in situ i samma preparat (figur 3B-C). På tvärgående sektioner på NM-nivå hade EGFP + ANF nått NM vid E9 (figur 3D) och observerades kontinuerligt vid E15 och E19 (figur 3E-F). Bilder med hög förstoring avslöjade tillväxtkonliknande ändar av ANF vid E9 (figur 3H), som bildade den stora palmliknande ändbulben vid E15 innan de växte in i den karakteriserade ändbulben av hållen morfologi med komplexa grenar vid E19 (figur 3I-J). Utöver NM sågs också omfattande grenar av ANF i NA, en annan primär cochleär kärna (figur 3E). Detta var väntat, eftersom samma ANFs bifurcate för att innervera både NM och NA hos kycklingar32. Vi såg också EGFP + -fibrer komma in i de intilliggande vestibulära cellgrupperna, inklusive den fallande vestibulära kärnan (VeD) som visas i figur 3E. Även om vi optimerade placeringen av den elektroporerande elektroden för att företrädesvis rikta in oss på den främre delen av otocysten där AG bildas, transfekterades också vissa vestibulära ganglionneuroner. Immunfärgning för parvalbumin, en markör för ANF hos kycklingar, kan användas för att skilja hörsel- kontra vestibulära fibrer i hjärnstammen (figur 3F-G).

Sammanfattningsvis ger denna elektroporationsstrategi en selektiv transfektion av de presynaptiska neuronerna i AG-NM-kretsen och kan användas för att spåra utvecklingen av endbulb of Held på individuella terminalnivåer efter genetiska manipulationer.

Figure 1
Figur 1. FMRP knockdown i kycklingen NM. (A) Bild av elektroporeringsinställning. B) Schematisk ritning som visar mikroinjektionsstället på rhombomer r5/6-nivå för ett HH12-kycklingembryo. Förkortningar: NT = neuralrör; SO = somit. (C) För ökad synlighet injicerades indiskt bläck (svart) under embryot med en spruta. Plasmidblandning tonad med snabbgrönt injicerades sedan i nervrörets lumen. (D) Placering av den bipolära elektroden för elektroporering. + och - ange de positiva respektive negativa sidorna. Observera att den blå plasmidblandningen diffunderade in i nervröret på den positiva sidan efter elektroporering. (E-F) Ljus fältbild (BF) (E) sammanslagen med EGFP-kanal (F) av ett elektroporerat kycklingembryo vid embryonal dag 3 (E3), som visar transfektion i nervröret vid samma anteroposterior nivå av otocysten. Dox applicerades vid E2, 6 h efter elektroporeringen. Migrerande kranialneurala crest (CNC) -celler indikeras med den gula pilen och förstoras i insatsen i F. Skalstången = 500 μm i E, gäller för E och F; 100 μm i insatsen. (G-H) Transfekterade celler med Fmr1 shRNA och EGFP på tvärsnittet av ett transfekterat E3-embryo. EGFP + -celler var begränsade på ena sidan av nervröret. Sektionen var dubbelfärgad med FMRP-immunreaktivitet (grå). Skalstreck = 40 μm i G, gäller för G och H. (I-J) BF-bild (I) sammanslagen med EGFP-kanal (J) i en E15-hjärnstam efter Dox-behandling vid E8. Skalstång = 1 mm i I, gäller för I och J. (K-L) Tvärsnitt av en E15-hjärnstam med EGFP + NM-neuroner endast på den transinfekterade (trans) sidan. På den kontralaterala (contra) sidan (K) sågs EGFP + axoner i den ventrala delen av kärnan laminaris (NL). (M–N) Högförstoringsbilder av NM vid E19 med dubbel märkning av FMRP (röd) och SNAP25 (blå) immunfärgning. SNAP25 är en presynaptisk markör som märker endbulb av Held. Observera den markanta minskningen av FMRP-immunreaktivitet i de transfekterade (gröna; *) neuronerna jämfört med närliggande icke-transfekterade neuroner (•). (O-P) Bilder med hög förstoring av den auditiva ganglionen (AG) vid E19 med FMRP-immunreaktivitet. AG-neuroner (AGN) transfekterades inte (EGFP-). Vissa gliaceller härledda från CNC-celler som indikeras i F transfekterades. Skalstreck = 10 μm i M, gäller för M-P. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. FMRP knockdown i kycklingens hörselkanal. (A) Bild av ljusfält (BF) som visar mikroinjektion av plasmider i otocysten vid HH13. Indiskt bläck (svart) injicerades under embryot för ökad synlighet. B) Placering av den bipolära elektroden för elektroporering. Den positiva sidan (märkt med en plussymbol, +) placerades främre mot otocysten, och den negativa sidan (märkt med en minussymbol, -) placerades bakom otocysten. (C) Tvärgående sektion av ett kycklinghuvud vid E6 immunbehandlades för FMRP (röd) och neurofilament (NF; blå). Dox applicerades vid E3 efter elektroporeringen. EGFP-fluorescens upptäcktes i otocysten men inte i hjärnstammen. Skalstreck = 100 μm. (D-E) BF-bild (D) sammanslagen med EGFP-kanal (E) för en hörselkanal vid E9. Skalstång = 500 μm. (F-G) Tvärsektion av en E9-hörselkanal med FMRP (röd) och NF (blå) immunfärgning. EGFP+-celler sågs i den cochleära kanalväggen, basilarpapilla (BP) och auditiv ganglion (AG). Skalstreck = 50 μm i F, gäller för F och G. (H-J) Högförstoringsbilder av en E9 BP som visar till stor del minskad FMRP-immunreaktivitet i transfekterade hårceller (HC; *) jämfört med icke-transfekterade HC (•). NF-positiva fibrer (blå) var periferinnervationen från AG-neuroner. (K-M) Bilder med hög förstoring av AG-neuroner vid E9 med FMRP-immunfärgning (röd). FMRP-immunreaktiviteten var stark i icke-transfekterade nervceller (•) och inte detekterbar i transfekterade nervceller (EGFP+; *). Skalstreck = 50 μm i H, och gäller för H-M. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Axonal spårning av transfekterade AG-neuroner i hjärnstammen. Embryon elektroporerades vid HH13 för otocysttransfektion av Fmr1 shRNA. Dox-ansökan startade på E2. (A) Tvärgående sektioner av ett E6-kycklinghuvud med ö-1-immunfärgning och DAPI-motfläck. EGFP + -celler var tydliga i den auditiva ganglionen (AG). Stjärnor* indikerar flera transfekterade AG-neuroner i insatsen. Skalstreck = 100 μm i A och 10 μm i insats. (B–C) Bild av ljust fält (BF) (B) sammanslagen med EGFP-kanal (C) i en E9-hjärnstam. I detta fall lämnades en del av AG (vita pilar) ansluten till den auditiva hjärnstammen. Gul pil indikerar transfekterade AG-neuroner (AGN) i insatsen. EGFP + -fibrer var uppenbara på den transinfekterade sidan av hjärnstammen. Skalstång = 1 mm i B, gäller för B och C; 100 μm i insatsen. D) Tvärsnitt av E9-hjärnstammen på den nivå som anges i C med den streckade linjen. EGFP + hörselnervfibrer (ANF; grön) sträckte sig längs hjärnstammens dorsala marginal och närmade sig kärnan magnocellularis (NM). Skalstreck = 100 μm. (E-G) EGFP + fibrer vid E15 (E) och E19 (F-G). Vissa fibrer sågs också i kärnan angularis (NA) och den fallande vestibulära kärnan (VeD). E19-sektioner färgades för parvalbumin (PV) immunreaktivitet som en markör för ANF. Den streckade rutan i F förstoras i infällningarna och visar en EGFP + ANF, som var PV-immunreaktiv. Skalstreck = 100 μm i E; 50 μm i F, gäller F och G; 2 μm i inläggen. (H-J) Bilder med hög förstoring av ANF-terminaler i NM vid E9, E15 och E19, som visar bildandet och den progressiva mognaden av Helds ändbulb. Skalstreck = 5 μm i H, gäller för H-J. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att bestämma FMRP: s cellautonoma funktion är det nödvändigt att manipulera dess uttryck i enskilda cellgrupper eller celltyper. Eftersom en av FMRP: s huvudfunktioner är att reglera synaptisk bildning och plasticitet, är selektiv manipulering av varje synaptisk komponent i en viss krets en förutsättning för en fullständig förståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikation. Med hjälp av ovo-elektroporering av kycklingembryon demonstrerade vi en metod för att rikta FMRP-uttryck i AG-NM-kretsen, antingen i presynaptiska AG-neuroner eller postsynaptiska NM-neuroner. För att uppnå detta är det kritiska steg att välja lämpliga utvecklingssteg för elektroporering och exakt positionera elektrodioden på embryot. NM-neuroner uppstår från neurala förfäder i neuralröret vid r5/6-nivån vid HH1223. I samma skede migrerar kraniala neurala vapenceller från nervrörets dorsala spets till cochleovestibulära ganglion för att omsluta framtida AG-neuroner33. Således är både NM-neuronerna och gliacellerna i AG neuralröret härledda. Däremot kommer hårceller och AG-neuroner från ectoderm24. Ektodermen intill r5/6-nivån tjocknar vid HH10 och invaginerar sedan för att bilda den otiska koppen vid HH13. Den otiska koppen stängs sedan och separeras från ektodermen för att bilda otocysten, med den främre delen som blir det auditiva sensoriska organet och den bakre delen som bidrar till det vestibulära systemet. I både de auditiva och vestibulära delarna delaminerar neuroblastcellerna som bor i den ventrala delen av den otiska koppen och migrerar för att bilda cochleovestibulär ganglion. Baserat på dessa ödeskartläggningsstudier transfekterade vi förfäderna till NM-neuroner genom att elektroporera nervröret vid HH12, en strategi som tidigare har fastställts26,28,34. Även om denna strategi leder till ytterligare transfektion av gliaceller i hjärnstammen och AG, transfekterades ingen av AG-neuronerna. Neuronalspecifik transfektion kan uppnås genom att använda en Atoh1 promotordriven strategi, som vad vi gjorde tidigare21. För selektiv transfektion av AG-neuroner elektroporerade vi otocysten vid HH13. Plasmider injicerade i den otiska koppen kom huvudsakligen in i den främre delen av otocysten för hårceller och AG-neurontransfektion samtidigt vid positionering av elektroder som visas i figur 2B. För att företrädesvis rikta in sig på AG-neuroner framför hårceller är det möjligt att injicera plasmidlösningen rakt in i regionen intill den främre otocysten, där de delaminerade neuroblasterna lokaliserar35. Denna metod har emellertid en lägre effektivitet av AG-neurontransfektion jämfört med otocystinjektion, eftersom plasmiderna diffunderar snabbt efter injektion. Denna metod kan också leda till ytterligare transfektion av de omgivande huvudets mesenkymala celler. En metod för att företrädesvis rikta in sig på hårceller framför AG-neuroner är att fördröja otocystinjektionen och elektroporationen till HH18 (som är ~ embryonal dag 3), eftersom majoriteten av neuroblaster (AG-neuronprekursorer) har migrerat ut från otocysten i detta skede24.

Med modifieringar kan denna metod utvidgas för att studera det vestibulära systemet. För vestibulär gangliontransfektion måste riktningen för elektroderna som visas i figur 2B vändas för att transfektera den bakre delen av otocysten på grund av den distinkta platsen för auditiva och vestibulära ganglionprekursorer.

I ovo är elektroporering av kycklingembryon en väletablerad teknik för att undersöka tidiga utvecklingsstadier (inom den första veckan av inkubation). För långtidsstudier är överlevnaden ett stort problem. När du påbörjar Dox-behandling vid E8 är överlevnadsgraden som finns här ~60% vid E9, men sjunker till 30% vid E15 och ännu lägre vid E19. Hatchlings från elektroporerade ägg är möjliga men sällsynta och kan bara överleva i flera dagar i de flesta fall. För att öka överlevnadsgraden bör följande beaktas: 1) använd en elektroporator som ger fyrkantiga vågor istället för skarpa vågor; 2) applicera en eller två droppar steril PBS på toppen av embryot om albuminskiktet inte är tillräckligt tjockt för att främja elektrisk ledningsförmåga (detta hjälper till att minska elektriskt trauma); 3) öppning av vitellinmembranet för att exponera embryot på injektionsstället krävs inte för en framgångsrik transfektion och kan skada embryot; 4) för att minska risken för kontaminering, använd en spruta för att peta i parafilmen och administrera Dox istället för att öppna fönstret igen. Torka av den transparenta filmen med 75% etanol efter injektion och täck nålöppningen med tejp; 5) för otocysttransfektion, injicera plasmider i otocysten dorsolateralt med en 45 ° vinklad pipett för att undvika eventuell punktering av aorta dorsalis under. Om aorta dorsalis är skadad kommer blödning att spola ut plasmiderna och till och med orsaka dödsfall; 6) Undvik om möjligt att använda indiskt bläck för att visualisera embryot. Mindre hantering och färre procedurer kommer att resultera i en högre överlevnad.

Förutom förmågan att selektivt transfektera AG- eller NM-neuroner , ger ovo-elektroporation ett unikt system som möjliggör närliggande jämförelser för dataanalyser. Efter elektroporering transfekteras endast en delmängd av cellerna i antingen NM eller AG, vilket gör att de omgivande icke-transfekterade cellerna i samma cellgrupp kan fungera som en idealisk kontroll20. Om potentiell interaktion mellan närliggande neuroner är ett problem, kan neuron motsvarigheter från den icke-transfekterade sidan av örat och hjärnan fungera som en ytterligare kontroll. För histologiska studier och avbildningsstudier möjliggör detta resultat dataanalyser med hög effektivitet på encells- eller singelfibernivå. Molekylära analyser är också möjliga om de kombineras med fluorescerande baserad cellsortering och storskaliga protein- och RNA-analyser som masspektrometri och nästa generations sekvensering. Att använda i ovo-elektroporering som ett medel för genredigering kan dock vara utmanande för funktions- och beteendestudier eftersom andelen transfekterade celler inom en cellgrupp kanske inte är tillräckligt stor för att resultera i funktionella konsekvenser.

Det är viktigt att utföra två verifieringsanalyser när man antar in ovo-elektroporationsmetoden. För det första bör effekten av genredigering på proteinet av intresse bekräftas. I ovo-elektroporationstransfekter endast en delmängd av neuroner i NM eller AG (dvs ett mosaikmönster). Att utföra western blott på homogeniserade vävnader som innehåller en blandning av transfekterade och icke-transfekterade neuroner är inte tillräckligt känsligt för att korrekt återspegla knockdown-effekten. Således måste valideringen utföras på individuell cellnivå med hjälp av metoder såsom immunocytokemi. För detta ändamål genererade vi tidigare en antikropp som känner igen kyckling FMRP. Specificiteten hos denna antikropp verifierades av immunocytokemi och western blot i en tidigare studie30. Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA validerades kvantitativt genom att observera signifikanta minskningar av intensiteten av FMRP-immunreaktivitet i transfekterade NM-neuroner jämfört med närliggande icke-transfekterade neuroner. För det andra bör kontrollgrupper som använder krypterade RNA eller andra kontrollkonstruktioner användas för att bekräfta specificiteten av observerade cellulära effekter av FMRP-feluttryck20,21. För att uppnå detta mål designade vi ett krypterat shRNA, klonade det i samma Tet-On-vektorsystem och elektroporerade det till NM-prekursorer, som beskrivits tidigare20. FMRP-uttryck i NM-neuronerna som transfekterades med det krypterade shRNA påverkades inte, vilket framgår av den oförändrade intensiteten av FMRP-immunreaktivitet jämfört med närliggande icke-transfekterade neuroner. Vi har också identifierat ett antal effekter av Fmr1 shRNA-transfektion på axonal tillväxt, dendritisk beskärning, terminalbildning och neurotransmission (granskad i Curnow och Wang, 2022)36. Vi drog slutsatsen att dessa effekter inducerades specifikt av cellautonom förlust av FMRP eftersom det krypterade shRNA misslyckades med att inducera liknande förändringar.

Sammanfattningsvis möjliggör in ovo-elektroporationstekniken selektiv Fmr1-genredigering med tidskontroll och komponentspecificitet i de auditiva öron-hjärnstamskretsarna och kan modifieras för att manipulera det vestibulära systemet. Utvecklingen av denna avancerade teknik i kycklingembryot, en väletablerad modell inom utvecklingsbiologi, har och kommer att fortsätta att bidra till vår förståelse av hjärnans utveckling under normala och onormala förhållanden som FXS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av: ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 32000697); Vetenskaps- och teknikprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); Grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (11620324). ett forskningsbidrag från Key Laboratory of Regenerative Medicine, utbildningsministeriet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); Grundforskningsfonderna för Kinas centrala universitet (21621054). och Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi tackar det medicinska experimentella centret vid Jinan University. Vi tackar Dr. Terra Bradley för noggrann redigering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

Neurovetenskap utgåva 185 bräckligt X-syndrom sensorisk krets innerörat cochleakärna synapsbildning hjärnutveckling endbulb av Held kycklingembryo
Dissekering av cellautonom funktion av bräckligt X mental retardationsprotein i en hörselkrets genom in ovo-elektroporation <em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter