Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre Otonom Fonksiyonunun Diseksiyonu

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64187
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Division of Histology & Embryology, Key Laboratory for Regenerative Medicine of the Ministry of Education, College of Medicine, Jinan University, 2Department of Clinical Pathology, First Affiliated Hospital of Jinan University, 3Program in Neuroscience, Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University
* These authors contributed equally

Summary

Ovo elektroporasyonunu kullanarak, devre montajının ayrı dönemlerinde kırılgan X mental retardasyon proteininin hücre grubuna özgü bir nakavtını sağlamak için tavuk embriyolarındaki işitsel iç kulağı ve koklear çekirdeği seçici olarak transfekte etmek için bir yöntem geliştirdik.

Abstract

Frajil X mental retardasyon proteini (FMRP), lokal protein translasyonunu düzenleyen mRNA bağlayıcı bir proteindir. FMRP kaybı veya disfonksiyonu, zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve sosyal iletişim sorunları ile karakterize olan kırılgan X sendromunda (FXS) anormal nöronal ve sinaptik aktivitelere yol açar. FMRP fonksiyonu ve FXS patogenezi çalışmaları öncelikle transgenik hayvanlarda Fmr1 (FMRP'yi kodlayan gen) nakavtı ile yapılmıştır. Burada, tavuk embriyolarını kullanarak devre montajı ve sinaptik oluşum döneminde FMRP'nin hücre otonom fonksiyonunu belirlemek için in vivo bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, Fmr1 küçük saç tokası RNA'sı (shRNA) ve bir EGFP muhabiri içeren ilaca bağlı bir vektör sisteminin aşama, saha ve yöne özgü elektroporasyonunu kullanır. Bu yöntemle, işitsel ganglionda (AG) ve beyin sapı hedeflerinden biri olan çekirdek magnoselülarisinde (NM) seçici FMRP nakavtı elde ettik, böylece AG-NM devresinde bileşene özgü bir manipülasyon sağladık. Ek olarak, transfeksiyonun mozaik deseni, veri analizinde gelişmiş güvenilirlik ve duyarlılık için hayvan içi kontrollere ve komşu nöron / lif karşılaştırmalarına izin verir. İndüklenebilir vektör sistemi, biriken gelişimsel etkileri en aza indirmek için gen düzenleme başlangıcının zamansal kontrolünü sağlar. Bu stratejilerin kombinasyonu, FMRP'nin sinaptik ve devre geliştirmedeki hücre otonom işlevini incelemek için yenilikçi bir araç sağlar.

Introduction

Frajil X sendromu (FXS), zihinsel yetersizlik, duyusal anormallikler ve otistik davranışlarla karakterize nörogelişimsel bir bozukluktur. Çoğu durumda, FXS, erken embriyonik aşama1'den başlayarak kırılgan X zihinsel gerilik proteininin (FMRP; Fmr1 geni tarafından kodlanmış) küresel bir kaybından kaynaklanır. FMRP, normalde beyindeki çoğu nöronda ve glial hücrede ve ayrıca duyu organlarında eksprese edilen RNA bağlayıcı bir proteindir 2,3,4. Memeli beyinlerinde, FMRP muhtemelen çeşitli sinirsel aktiviteler için önemli olan proteinleri kodlayan yüzlerce mRNA ile ilişkilidir5. Konvansiyonel Fmr1 nakavt hayvanları üzerinde yapılan çalışmalar, FMRP ekspresyonunun sinaptik nörotransmisyon6'nın montajı ve plastisitesi için özellikle önemli olduğunu göstermiştir. Birkaç koşullu ve mozaik nakavt modeli, FMRP eylemlerinin ve sinyallerinin aksonal projeksiyon, dendritik modelleme ve sinaptik plastisite 7,8,9,10,11,12,13,14 dahil olmak üzere çeşitli gelişimsel olaylar sırasında beyin bölgeleri, hücre tipleri ve sinaptik bölgeler arasında değiştiğini göstermiştir. . FMRP'nin sinaptik iletimi düzenlemedeki akut fonksiyonu, inhibitör FMRP antikorlarının veya FMRP'nin kendisinin beyin dilimlerinde veya kültürlenmiş nöronlarda hücre içi verilmesi ile incelenmiştir15,16,17,18. Bununla birlikte, bu yöntemler, geliştirme sırasında FMRP yanlış ifadeye bağlı sonuçları izleme yeteneği sunmaz. Bu nedenle, FMRP'nin hücre otonom fonksiyonlarını araştırmak için in vivo yöntemlerin geliştirilmesine büyük ihtiyaç duyulmaktadır ve FXS hastalarında bildirilen anomalilerin, ilişkili nöronlardaki ve devrelerdeki FMRP kaybının doğrudan sonuçları mı yoksa gelişim sırasında ağ çapındaki değişikliklerden kaynaklanan ikincil sonuçlar mı olduğunu belirlemeye yardımcı olması beklenmektedir19.

Tavuk embriyolarının işitsel beyin sapı, devre ve sinaps gelişiminde FMRP regülasyonunun derinlemesine fonksiyonel analizleri için benzersiz bir avantajlı model sunar. Embriyonik tavuk beyinlerine kolay erişim ve genetik manipülasyon için köklü ovo elektroporasyon tekniği, erken embriyonik aşamalarda beyin gelişimini anlamamıza büyük katkıda bulunmuştur. Yakın zamanda yayınlanan bir çalışmada, bu teknik, FMRP yanlış ekspresyonu20,21'in zamansal kontrolüne izin veren gelişmiş moleküler araçlarla birleştirilmiştir. Burada, metodoloji, presinaptik ve postsinaptik nöronların seçici manipülasyonlarını ayrı ayrı indüklemek için geliştirilmiştir. Bu yöntem işitsel beyin sapı devresinde geliştirilmiştir. Akustik sinyal, işitsel iç kulaktaki saç hücreleri tarafından tespit edilir ve daha sonra işitsel gangliona (AG; memelilerde spiral ganglion olarak da adlandırılır) iletilir. AG'deki bipolar nöronlar, periferik süreçleriyle saç hücrelerini innerve eder ve sırayla beyin sapına merkezi bir projeksiyon (işitme siniri) gönderir ve burada iki primer koklear çekirdekte, çekirdek magnocellularis (NM) ve çekirdek angularis (NA) ile sona erer. NM'deki nöronlar, yapısal ve işlevsel olarak memeli anteroventral koklear çekirdeğinin küresel gür hücreleriyle karşılaştırılabilir. NM'de, işitme siniri lifleri (ANF'ler), Held terminallerinin22'sinin büyük uç ampulü aracılığıyla NM nöronlarının somatası üzerinde sinaps oluşturur. Gelişim sırasında, NM nöronları arka beyin23'teki eşkenar dörtgen 5 ve 6'dan (r5/6) kaynaklanırken, AG nöronları otokist24'te bulunan nöroblastlardan türetilir. Burada, presinaptik AG nöronlarında ve postsinaptik NM nöronlarında FMRP ekspresyonunu seçici olarak yok etme prosedürünü ayrı ayrı açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Yumurta ve tavuk embriyoları, Jinan Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan hayvan protokollerine uygun olarak özen ve saygıyla ele alındı.

1. Yumurta ve plazmid hazırlanması

  1. Yumurta hazırlama
    1. Güney Çin Tarım Üniversitesi'nden taze döllenmiş tavuk yumurtası (Gallus gallus) alın ve kuluçkadan önce 16 ° C'de saklayın. Optimum canlılık için, tüm yumurtaları varıştan sonraki bir hafta içinde kuluçkaya koyun.
    2. Yumurtaları yatay olarak yerleştirin ve nöral tüp transfeksiyonu için Hamburger ve Hamilton (HH) evre 1225'e kadar 46-48 saat boyunca 38 ° C'de veya otokist transfeksiyonu için HH13'e kadar 54-56 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Yumurtanın hayvan kutbu bitkisel direkten daha hafif olduğundan, yatay yerleştirme embriyoyu kolay manipülasyon için yumurtanın üstüne yerleştirir. Yumurtayı bu ve sonraki tüm adımlarda yatay tutmak için dikkatli olun.
    3. Embriyonun yeri, bir el feneri kullanarak yumurtanın dibinden ışık dökerken yumurta kabuğu üzerinde karanlık bir alan olarak görünür. İstenilen HH aşamalarında, embriyonun yumurta kabuğu üzerindeki yerini kalemle işaretlemek için bu el feneri yöntemini kullanın.
    4. Yumurtaları% 75 etanol içeren gazlı bezle silin. Makasın ucunu kullanarak yumurtaların sivri ucunda bir delik açın ve 18 G iğne şırıngası ile 2 mL albümin çıkarın. Deliğin yalnızca iğne yerleştirmeye izin verecek kadar büyük olduğundan emin olun. Sızdıran albüminleri gazlı bezle silin ve deliği şeffaf bantla kapatın.
    5. Çatlakları en aza indirmek ve pencereleme sırasında düşen kabuk kalıntılarını önlemek için, yumurtaların üst kısmını, kalemle işaretlenmiş karanlık alana ortalayarak şeffaf bantla örtün.
  2. Plazmid DNA ekstraksiyonu
    1. Klon tavuk Fmr1 shRNA, daha önce tarif edildiği gibi transpozon tabanlı bir Tet-on sistemi kullanarak20. Bu sistem üç plazmid içerir: pCAGGS-T2TP, pT2K-CAGGS-rtTA-M2 ve pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA, Fmr1 shRNA ve EGFP ekspresyonunun transfeksiyondan sonra susturulduğu ve doksisiklin (Dox) indüksiyonu ile açılabildiği ilaca bağlı bir vektör sistemi sağlar.
      NOT: Bu plazmidler şu anda bir depoda mevcut değildir. Yazarlar makul talep üzerine plazmidleri sağlamayı kabul ederler.
    2. Üreticinin talimatına göre endotoksin içermeyen bir hazırlama kiti kullanarak plazmid DNA'larını çıkarın ve 1/15 hacim 7.5 M sodyum asetat ve 1 hacim% 100 izopropanol ekleyerek çökeltin.
    3. Plazmidleri gece boyunca -20 ° C'de çökeltin ve 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüj yapın. Pelet, kit içinde sağlanan Tris-EDTA tamponu ile 4-5 μg / μL'lik bir son konsantrasyona çözün. Plazmidler, transfeksiyon verimliliği azalmadan 12 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
    4. Elektroporasyon gününde, her plazmidin 2 μL'sini bir pipet ucu kullanarak steril bir santrifüj tüpünde iyice karıştırın. Plazmid karışımının ortaya çıkan 6 μL hacmi, üç düzine yumurtayı elektroporat etmek için yeterlidir. Elektroporasyon sırasında plazmidin görselleştirilmesine yardımcı olmak için, plazmid karışımını maviye çeviren her 6 μL DNA karışımı26için 1 μL% 0.1 hızlı yeşil (steril ddH2 O'da hazırlanmış) ekleyin.

2. Ovo elektroporasyonunda

  1. Yumurta pencereleme ve embriyo tanımlama
    1. Elektroporasyon gününde, yumurtaları inkübatörden, bir seferde bir düzine yumurtadan çıkarın. Yumurtaları kuluçka makinesinden 1 saatten fazla uzak tutmak, gelişimsel varyasyonlara neden olur ve canlılığı azaltır.
    2. Tüm ameliyat aletlerini% 75 etanol içeren gazlı bezle silin.
    3. Her yumurtayı ısmarlama bir köpük tutucuya yerleştirin. Bantla kaplı alanı% 75 etanol ile silin ve küçük bir makas çifti kullanarak kalem işaretinin çevresine bir pencere (1-2 cm2) kesin (Şekil 1A). Keserken, altındaki embriyoya zarar vermemek için makası düz tutun.
    4. Pencereli yumurtayı 10x göz merceği ve 2x zoom ile bir stereomikroskop altına yerleştirin ve embriyoyu tanımlayın. Daha iyi görselleştirme için ışık kaynağının açısını ve parlaklığını ayarlayın.
      NOT: Bu aşamada embriyoyu görselleştirmek ve nöral tüpü tanımlamak pratik ve deneyim gerektirir.
      1. Yeni başlayanlar için, embriyo tanımlamayı kolaylaştırmak için aşağıdaki isteğe bağlı mürekkep enjeksiyonunu kullanın. 0,01 M fosfat tamponlu salin (PBS) ve otoklavda %10 Hint mürekkep çözeltisini önceden hazırlayın. 1 mL'lik bir şırıngayı mürekkep çözeltisiyle doldurun ve ardından 27G'lik bir iğne takın. Forseps ile iğneyi 45° açıyla bükün.
      2. Mikroskop altında, opaka alanının kenarından dikkatlice dürtün ve iğneyi embriyonun altına yerleştirin. Embriyo görselleştirme için pellucida alanının altına yayılacak ~ 50 μL mürekkep enjekte edin. Mürekkep, embriyonun net bir şekilde görselleştirilmesi için koyu renkli bir arka plan oluşturacaktır.
        NOT: Yerleştirmeden ve enjeksiyondan önce havayı şırıngadan dışarı atın. Görselleştirme konusunda yetenekli olduğunuzda, hayatta kalma oranını azalttığı için mürekkep enjeksiyonu adımından kaçının.
  2. Nöral tüp enjeksiyonu ve elektroporasyon
    NOT: Bu prosedür, beyin sapındaki NM nöronlarını transfekte etmek için HH12'de gerçekleştirilir.
    1. Bir pipet çektirici kullanarak cam kılcal damarları (~1 mm çapında ve 100 mm uzunluğunda) pipetlere çekin. Diseksiyon yapan bir mikroskop altında, kılcal iğnenin ucunu forseps ile çapı 10-20 μm'ye dikkatlice açın. Pipetleri (genellikle bir seferde 5-10 adet) kullanana kadar bir saklama kutusunda saklayın.
    2. Bir kılcal pipeti, pipetin ucundaki kauçuk bir tüpten negatif basınç uygulayarak plazmid karışımının 0,5-1 μL'si ile doldurun. Bu bir şırınga veya hava pompası ile sağlanabilir.
    3. Yumurtayı mikroskop altına yerleştirin, böylece embriyo size yakın kuyrukla dikey olarak yönlendirilir (veya üç eksenli bir manipülatör kullanarak kılcal pipetleri enjekte etmek için yatay olarak). Kılcal pipeti tek elinizle veya üç eksenli manipülatörle tutun ve pipetin ucunu kuyruktan başa doğru r5/6'ya doğru sürün.
      NOT: En ön arka beyin bölgesi r1'dir ve nöral tüp boyunca sonraki her çıkıntı bireysel bir eşkenar dörtgendir. R5/6, kolayca tanınabilir fincan benzeri bir yapı olan otokist ile aynı anteroposterior seviyededir (Şekil 1B-C).
    4. Ucu nazikçe vitelin membrandan ve dorsal nöral tüpün içine sokun ve ardından pipeti biraz çekin, böylece uç nöral tüpün lümeninde olur. Plazmid karışımını, renkli plazmid tamamen r5/6'ya yayılana ve r3 ve r4'e uzayana kadar hava basıncı uygulayarak enjekte edin.
      NOT: Enjeksiyon için vitelin membran üzerinde bir yuva yapılması gerekli değildir.
    5. Mavi plazmid çözeltisi sızıntı yapmadan nöral tüpten hızla aşağı yayıldığında elde edilen başarılı bir enjeksiyon olup olmadığını kontrol edin (Şekil 1B-C). Sızıntı meydana geldiğinde, mavi hızla kaybolur.
    6. Enjeksiyondan hemen sonra, nöral tüpün her iki tarafına bir platin bipolar elektrot yerleştirin (Şekil 1D). Bir elektroporatör ile 12 V ve 50 ms süreli iki darbe verin. Bipolar elektrotun uçlarındaki hava kabarcıklarını, negatif tarafta daha fazlası ile gözlemleyin.
    7. Renkli plazmid karışımı elektrotun pozitif tarafına yakın nöral tüp dokusuna girdiğinde elde edilen başarılı elektroporasyonu kontrol edin. Elektroporasyondan sonra, bipolar elektrodu dikkatlice çıkarın.
    8. Yumurta kabuğundaki pencereyi, kareler halinde 2'ye önceden kesilmiş ve% 75 etanol ile püskürtülen şeffaf bir film parçasıyla örtün. Yumurtayı tekrar inkübatörüne yerleştirin.
    9. Bir sonraki yumurtaya geçmeden önce tuzlu suda 12 V ve 50 ms süreli 10-20 darbe vererek bipolar elektrodu temizleyin.
  3. Otokist enjeksiyonu ve elektroporasyon
    NOT: Bu prosedür, iç kulaktaki saç hücrelerini ve AG nöronlarını transfekte etmek için HH13'te gerçekleştirilir.
    1. HH13'te (~ embriyonik gün 2.5), embriyo başın sağ tarafı yukarı bakacak şekilde döndü. Mikroskop altında, yumurtayı embriyo dikey olacak şekilde, kuyruğu size yakın olacak şekilde yerleştirin. Kılcal pipeti tutun ve sağ otokisti dorsolateral yönde hafifçe dürtün (Şekil 2A).
      NOT: Bu aşamada, otokist vücudun üst kısmında r5/6 ile aynı anteroposterior seviyede küçük dairesel bir yapı olarak görünür.
    2. Plazmid karışımını, otokist mavi çözelti27 ile doldurulana kadar hava basıncı ile enjekte edin. Mavi plazmid karışımı otokist içinde hapsedildiğinde ve sızıntı yapmadığında elde edilen başarılı bir enjeksiyon olup olmadığını kontrol edin.
    3. Enjeksiyondan hemen sonra, bipolar elektrodu Şekil 2B'de gösterildiği gibi otokist üzerine yerleştirin. Pozitif ve negatif tarafları sırasıyla otokistin ön ve arka taraflarını konumlandırın. Elektroporatör ile 12 V ve 50 ms süreli iki darbe verin.
    4. Mavi plazmid karışımı elektrotun pozitif tarafına yakın otokistin dokusuna girdiğinde elde edilen başarılı elektroporasyonu kontrol edin. Elektroporasyondan sonra, bipolar elektrodu dikkatlice çıkarın. Yumurta kabuğundaki pencereyi şeffaf bir filmle örtün ve yumurtayı inkübatöre geri koyun.

3. Plazmid transkripsiyonunu başlatmak ve sürdürmek için Dox uygulaması

  1. Dox çözeltisinin hazırlanması
    1. Kimyasal bir başlık altında 100 mg Dox tozu ölçün ve 1 mg / mL'lik bir çalışma çözeltisi yapmak için 100 mL steril PBS içinde çözün. Çözeltiyi 0,22 μm filtre ile filtreleyin ve -20 °C'de 1 mL alikot saklayın. Işıktan koruyun20,28.
  2. Dox'un Yönetimi
    1. Tam güçlü gen düzenlemesi için, istenen yaştan 24 saat önce, buz üzerinde bir Dox aliquot çözülür. Şeffaf filme nüfuz eden bir şırınga kullanarak doğrudan yumurtanın koryoallantoik zarına 50 μL Dox bırakın. Enjeksiyondan sonra iğne deliğini şeffaf film veya bantla kapatın.
    2. Nakavt etkisini korumak için, istenen gelişim aşamasında doku hasadına kadar her gün Dox'u uygulayın.

4. Doku diseksiyonu ve kesitleme

  1. Beyin sapı
    1. Embriyonik evre 3 (E3) ve E6'daki embriyolar için, yumurta kabuğunu açın ve ilgili zarı makasla kesin. Embriyoyu kaşıklayın ve 0.1 M fosfat tamponunda% 4 paraformaldehit (PFA) içine batırın.
    2. E9 embriyoları için yumurta kabuğunu açın, embriyonun kafasını makasla kesin ve kafayı PBS ile doldurulmuş silikon tabanlı bir plakaya aktarın. Kafayı yörüngelerden aşağı doğru sabitleyin ve kafatasının üstünü ayırın. Forsepsleri her iki taraftan da beynin altına dikkatlice yerleştirin ve tüm beyni forsepslerin omuzlarıyla kafatasından yükseltin. Beyni% 4 PFA'ya batırın.
    3. E15 ve E19 embriyoları için yumurta kabuğunu açın, embriyonun kafasını makasla kesin ve kafayı PBS ile doldurulmuş silikon tabanlı bir plakaya yerleştirin. Kafatasını ortaya çıkarmak için başın üstündeki cildi kesin.
    4. Ön beyni ve kaudal beyni ayırmak için kafatasını dikey olarak bir tıraş bıçağı ile kesin. Kaudal bloğu PBS'ye batırın, kafatasının üstünü çıkarın ve ardından beyni kafatasından çıkarın.
    5. Beyni optik lobdan aşağı doğru sabitleyin ve beyincik ile beyin sapını ayırın. Beyinciğin hemen altında bulunan işitsel beyin sapına zarar vermemeye dikkat edin. Beyin sapından mümkün olduğunca fazla dura çıkarın ve% 4 PFA'ya batırın.
    6. Embriyoları ve beyin dokularını, 24 saat boyunca aynı durumda tutulması gereken E19 beyin sapları hariç, gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da tutun.
    7. Fiksasyonu takiben, çökene kadar% 30 sakkaroz içeren PBS'deki dokuyu dehidre edin, bu da yaşa bağlı olarak genellikle 1-3 gün sürer.
    8. Beyin sapını (E15 ve E19) kayan bir mikrotom kullanarak koronal düzlemde 30 μm'de kesitleyin. PBS'deki bölümleri toplayın ve immün boyama işleminden önce 4 ° C'de saklayın.
    9. E3 ve E6 embriyoları ve E9 beyin sapları için, enine 50 μm'de kesit. PBS'deki bölümleri toplayın ve 4 °C'de saklayın. İmmün boyamadan önce bölümleri jelatin kaplı mikroskop slaytlarına monte edin. Bu yaşlar için daha kalın kesitlerin toplanması doku kullanımını kolaylaştırır.
  2. İşitme kanalı
    1. Beyin sapları E9, E15 ve E19 embriyolarından çıkarıldıktan sonra, temporal kemiğe gömülü olan işitme kanalı, kafatasının altında yatan kolayca tanımlanabilir ve temporal kemik, çevredeki kafatasından kolayca ayrılabilir. E9 embriyoları için, tüm temporal kemiği% 4 PFA'da sabitleyin. Daha yaşlı embriyolar için, işitme kanalını izole etmek ve işitme kanalını% 4 PFA'da sabitlemek için temporal kemiğin kemikli yapısını çıkarın.
    2. Tüm temporal kemikleri ve işitme kanallarını, doku gömülmeden önce gece boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da tutun.
    3. Açıklandığı gibi doku gömme işlemini gerçekleştirin. Gömme çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın:% 10 jelatini (sığır derisinden) jelatin granülleri şişene ve çökene kadar (yaklaşık 30 dakika) soğuk suda bekletin. Jelatini çözmek için karışımı ~ 50 ° C'ye ısıtın ve jelatin çözeltisine% 20 sakkaroz ekleyin ve çözünmesi için karıştırın. Jelatin-sakkaroz çözeltisini 4 ° C'de bir aya kadar saklayın.
    4. Kullanım için, jelatin-sakkaroz çözeltisini 37 ° C'de ısıtın. Zamansal kemikleri / işitsel kanalları, genellikle 30-60 dakika yerleşene kadar 37 ° C'de 96 delikli bir plaka üzerindeki ılık jelatin-sakkaroz çözeltisine batırın.
    5. 12 delikli bir plakanın kuyularının dibini şeffaf bir film şeridi ile hizalayın. Bir kat ılık jelatin-sakkaroz çözeltisi ekleyin ve katılaşana kadar bekleyin. Her bir kuyucuğa zamansal bir kemik / işitsel kanal aktarın.
    6. Dokuyu ikinci bir sıcak jelatin-sakkaroz çözeltisi tabakası ile implante edin. Dokunun pozisyonunu, jelin merkezinde olacak ve işitme kanalı yatay olarak yönlendirilecek şekilde ayarlayın. Plakayı dikkatlice 4 ° C'lik bir buzdolabına taşıyın ve jel sertleşene kadar bekleyin.
    7. Jel doku bloğunu kuyudan çıkarmak için şeffaf film şeridini çekin. Ekstra jeli kare bir bloğa kesin ve yönü tanımlamak için bloğun bir köşesini kesin. Jelatin bloğu bir parça folyo ile sarın, kuru buz üzerinde dondurun ve ardından kesitleyene kadar -80 ° C'de saklayın.
    8. Bloğu bir kriyostat ile işitme kanalının boylamı boyunca 20 μm'de kesitleyin. Bölümleri doğrudan jelatin kaplı mikroskop slaytlarına monte edin. İmmün boyamadan önce slaytları -80 ° C'de saklayın.
    9. İmmün boyamadan önce, jelatini eritmek için slaytları önceden ısıtılmış PBS'ye (45 ° C) 5 dakika batırın ve ardından artık jelatini çıkarmak için slaytları oda sıcaklığında PBS ile 3 kat yıkayın.

5. İmmün boyama ve mikroskop görüntüleme

NOT: Kesitlerin slaytlara mı yoksa PBS'de serbest yüzer mi monte edildiğine bağlı olarak iki tip immün boyama yapılır.

  1. Slaytlarda immün boyama
    1. Slaytları PBS ile her biri 10 dakika boyunca 3 kat yıkayın. Boyama sırasında sıvı sızıntısını önlemek için bölümleri içeren bölgeyi bir yağ kalemi ile çevreleyin. Bölümleri PBS'de% 5 normal keçi serumu içeren bir bloke edici çözelti ile örtün ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    2. Birincil antikorları (kullanılan son konsantrasyon için Malzeme Tablosuna bakınız) PBS'de% 0.3 TritonX-100 ve% 5 normal keçi serumu içeren seyreltin. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve ardından bölümleri birincil antikor çözeltisi ile örtün. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de, altta damıtılmış su tabakası içeren bir kutuda inkübe edin.
    3. Slaytları PBS ile 10 dakika boyunca 3 kat durulayın. Slaytlara% 0.3 TritonX-100 içeren PBS'de 1:500'de seyreltilmiş floresan sekonder antikorlar uygulayın. Slaytları oda sıcaklığında 4 saat boyunca ışıktan korunmuş olarak inkübe edin.
    4. Slaytları PBS ile 3 kat yıkayın. Slaytların üzerine iki damla montaj ortamını yavaşça bırakın ve bölümleri kapak kapaklarıyla örtün. Kapak kayması ve kızak arasında hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.
  2. Tüm montajlı embriyolar ve serbest yüzen bölümler için immün boyama
    1. Embriyoları/kesitleri PBS 3x ile her biri bir kuyu plakasında 10 dakika boyunca yıkayın. Santrifüj tüplerde %0.3 TritonX-100 ve %5 normal keçi serumu içeren PBS'deki primer antikorları seyreltin. Her embriyoyu / bölümü cam kancalı bir tüpe aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca 60 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    2. Embriyoları/kesitleri PBS ile 3 kat daha iyi bir kuyu plakasında her biri 10 dakika yıkayın. Her embriyoyu/bölümü, floresan sekonder antikor çözeltisi ile doldurulmuş karanlık bir santrifüj tüpe aktarın ve çalkalayıcı üzerinde 4 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
    3. Embriyoları/bölümleri PBS ile 3x kuyucuk plakasında yıkayın. PBS içeren 15 cm'lik bir kapta jelatin kaplı mikroskop slaytları üzerindeki bölümleri monte etmek için bir fırça kullanın. Slaytlar hafifçe kuruduktan sonra (~ 5 dakika), iki damla montaj ortamı uygulayın ve bir kapak kayması yerleştirin. Kapak kayması ve kızak arasında hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Görüntüleme için tüm montaj dokularını PBS'de tutun.
  3. Görüntüleme
    1. PBS'deki tüm montaj dokularını, siyah bir arka plan sağlayan karbon tozu içeren silikon tabanlı bir kapta görüntüleyin. Daha önce açıklandığı gibi ticari bir görüntü işleme Olympus yazılım paketi kullanarak görüntüleri yakalayın ve işleyin29.
    2. Slaytlardaki bölümleri daha önce açıklandığı gibi bir konfokal mikroskoplagörüntüleyin 20. Bölümleri 10x, 20x ve 63x hedefleriyle tek bir odak düzleminde görüntüleyin. Aynı parametreleri kullanarak aynı hayvandan gelen tüm görüntüleri yakalayın. Sinyal doygunluğunu önlemek için lazer seviyesini ve görüntüleme alma ayarlarını yapmaya özen gösterin.
    3. Fiji yazılımını kullanarak görüntü işleme gerçekleştirin. Örnek olarak, profesyonel bir görüntü düzenleme yazılımı kullanarak görüntü parlaklığını, kontrastı ve gamayı ayarlayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ovo elektroporasyonunda farklı bölgelerde ve farklı gelişim aşamalarında gerçekleştirerek, işitsel çevrede veya işitsel beyin sapında seçici FMRP nakavtı sağladık.

NM'de FMRP nakavtı
Tavuk Fmr1'e karşı küçük saç tokası RNA'sı (shRNA), daha önce20'de açıklandığı gibi Tet-On vektör sistemine tasarlanmış ve klonlanmıştır. In ovo elektroporasyon için kurulum Şekil 1A'da gösterilmiştir. Hızlı yeşil renkteki plazmid DNA'sı, HH12'de r5/r6 seviyesinde nöral tüpe enjekte edildi (Şekil 1B-C). Nöral tüpün her iki tarafına r5/6 seviyesinde platin bipolar elektrot yerleştirildi (Şekil 1D). Plazmidi elektrotun pozitif tarafına yakın dokuya sürmek için 12 V'ta iki darbe verildi. Dox, Fmr1 shRNA ve EGFP ekspresyonunu tetiklemek için koryoallantoik membrana uygulandı. 24 saatlik Dox tedavisinden sonra, EGFP floresan stereomikroskop altında belirgindi. Şekil 1E-F, Dox'un E2'de uygulandığı E3'teki bir örneği göstermektedir. Enine kesitler, EGFP eksprese eden (EGFP +) hücrelerin arka beynin bir tarafındaki yerini doğruladı (Şekil 1G-H). Ek olarak, otokistin önünde bir grup transfekte hücre bulundu; bunlar nöral tüpten ventrolateral olarak göç eden kraniyal nöral krest hücreleriydi (Şekil 1F). Elektroporrated embriyolar, daha sonraki aşamalarda devre oluşumunu incelemek için daha uzun süre inkübe edilebilir. E15'te, EGFP beyin sapında, ancak sadece transfekte tarafta gözlendi (Şekil 1I-J). Dorsal beyin sapı seviyesindeki enine kesitler, elektroporasyon tarafındaki NM'ye dağılmış bir avuç EGFP + nöronu göstermiştir (Şekil 1L). EGFP + liflerinin NM nöronlarının hedefine yansıdığı görüldü: ipsilateral tarafta dorsal çekirdek laminaris (NL) (Şekil 1L) ve karşıt tarafta ventral NL (Şekil 1K). Fmr1 shRNA'nın nakavt etkisi, transfekte olmayan komşu nöronlara kıyasla transfekte NM nöronlarında FMRP immünoreaktivitesinde belirgin azalmalar ile doğrulanmıştır (Şekil 1M-N). İşitsel ganglionda (AG), nöronlar transfekte edilmemiştir (EGFP-), ancak AG nöronlarını çevreleyen bazı glial hücreler, muhtemelen EGFP + kraniyal nöral krest hücrelerinden türetilen EGFP + (Şekil 1O-P) idi (bkz. Şekil 1F). Böylece, bu elektroporasyon stratejisi, AG-NM devresindeki postsinaptik nöronların seçici bir transfeksiyonunu sağlar.

İşitme kanalında FMRP nakavtı
Plazmid karışımı HH13'te otokist içine enjekte edildi (Şekil 2A), ardından elektrotun pozitif tarafı otokistin ön tarafını ve negatif tarafı otokiste posterior yerleştirerek elektroporasyon yapıldı (Şekil 2B). E6'daki tüm kafa kesitlerinde sağ otokistte güçlü EGFP floresansı görüldü, ancak beyin sapında görülmedi (Şekil 2C). E9'daki izole işitme kanalları, kanalın uzunluğu boyunca geniş EGFP floresansı sergiledi (Şekil 2D-E). Enine kesitlerde, koklear kanal duvarı boyunca baziler papillada (BP) ve AG'de EGFP+ hücreleri doğrulandı (Şekil 2F-G). Fmr1 shRNA'nın knockdown etkisi, transfekte olmayan saç hücrelerine kıyasla transfekte saç hücrelerinde FMRP immünoreaktivitesinde belirgin azalmalar ile doğrulanmıştır (*, Şekil 2H-J) (•, Şekil 2H-J). Destekleyici hücreler için, FMRP immünoreaktivitesi hem transfekte hem de transfekte olmayan hücrelerde zayıftı (Şekil 2H-J). Saç hücrelerine benzer şekilde, FMRP immünoreaktivitesi, transfekte AG nöronlarında, komşu transfekte olmayan nöronlara kıyasla büyük ölçüde azalmıştır (Şekil 2K-M).

Daha sonra transfekte AG nöronlarının işitme siniri yoluyla beyin sapına merkezi projeksiyonunu izledik. AG'deki Fmr1 shRNA transfeksiyonunun mozaik paterni, gelişmekte olan tavuk iç kulağı için bir belirteç olan Islet-1 immünoreaktivitesi (Şekil 3A) kullanılarak E6'da daha da doğrulanmıştır31. Diseksiyon sırasında AG'nin bir kısmı beyin sapı ile ekstrakte edildiğinde, izole edilmiş EGFP + AG nöronları ve beyin sapı içindeki lifleri aynı preparatlarda in situ olarak görselleştirildi (Şekil 3B-C). NM seviyesindeki enine kesitlerde, EGFP+ ANF'ler E9'da NM'ye ulaşmıştı (Şekil 3D) ve E15 ve E19'da sürekli olarak gözleniyordu (Şekil 3E-F). Yüksek büyütmeli görüntüler, E9'daki ANF'lerin büyüme konisi benzeri uçlarını ortaya çıkardı (Şekil 3H), E15'teki büyük avuç içi benzeri ampulü oluşturan E19'daki karmaşık dallara sahip Held morfolojisinin karakteristik uç ampulüne dönüşmeden önce (Şekil 3I-J). NM'nin ötesinde, başka bir birincil koklear çekirdek olan NA'da da geniş ANF dalları görülmüştür (Şekil 3E). Bu bekleniyordu, çünkü aynı ANF'ler tavuklarda hem NM'yi hem de NA'yı innerve etmek için çatallanıyordu32. Ayrıca, Şekil 3E'de gösterildiği gibi azalan vestibüler çekirdek (VeD) de dahil olmak üzere bitişik vestibüler hücre gruplarına giren EGFP + liflerini de gördük. AG'nin oluştuğu otokistin ön kısmını tercihen hedeflemek için elektroporasyon elektrodunun yerini optimize etmemize rağmen, bazı vestibüler ganglion nöronları da transfekte edildi. Tavuklarda ANF'ler için bir belirteç olan parvalbümin için immün boyama, beyin sapındaki işitsel ve vestibüler lifleri ayırt etmek için kullanılabilir (Şekil 3F-G).

Özetle, bu elektroporasyon stratejisi, AG-NM devresindeki presinaptik nöronların seçici bir transfeksiyonunu sağlar ve genetik manipülasyonları takiben bireysel terminal seviyelerde Held uç ampulünün gelişimini izlemek için kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1. Tavuk NM'de FMRP nakavt. (A) Elektroporasyon kurulumunun görüntüsü. (B) Bir HH12 tavuk embriyosunun eşkenar dörtgen r5/6 seviyesindeki mikroenjeksiyon bölgesini gösteren şematik çizim. Kısaltmalar: NT = nöral tüp; SO = somit. (C) Daha fazla görünürlük için, Hint mürekkebi (siyah) embriyonun altına bir şırınga ile enjekte edildi. Hızlı yeşil ile renklendirilmiş plazmid karışımı daha sonra nöral tüpün lümenine enjekte edildi. (D) Bipolar elektrotun elektroporasyon için konumlandırılması. + ve - sırasıyla olumlu ve olumsuz tarafları gösterir. Mavi plazmid karışımının elektroporasyondan sonra pozitif taraftaki nöral tüpe yayıldığını unutmayın. (E-F) Parlak alan (BF) görüntüsü (E), embriyonik gün 3'te (E3) elektroporated bir tavuk embriyosunun EGFP kanalı (F) ile birleşerek, otokistin aynı anteroposterior seviyesinde nöral tüpte transfeksiyonu gösterdi. Dox, elektroporasyonu takiben E2, 6 saatte uygulandı. Göç eden kranial nöral krest (CNC) hücreleri sarı okla gösterilir ve F'deki iç kısımda büyütülür. ölçek çubuğu = E'de 500 μm, E ve F için geçerlidir; Girişte 100 μm. (G-H) Transfekte bir E3 embriyosunun enine kesitinde Fmr1 shRNA ve EGFP ile transfekte hücreler. EGFP + hücreleri nöral tüpün bir tarafında sınırlıydı. Bölüm FMRP immünoreaktivitesi (gri) ile çift boyandı. Ölçek çubuğu = G'de 40 μm, E8'de Dox tedavisini takiben bir E15 beyin sapının EGFP kanalı (J) ile birleştirilmiş G ve H (I-J) BF görüntüsü (I) için geçerlidir. Ölçek çubuğu = I'de 1 mm, I ve J. (K-L) için geçerlidir Sadece transfekte (trans) tarafta EGFP + NM nöronları olan bir E15 beyin sapının enine kesiti. Kontralateral (kontra) tarafta (K), çekirdek laminarisin (NL) ventral kısmında EGFP+ aksonlar görüldü. (M-N) FMRP (kırmızı) ve SNAP25 (mavi) immün boyamanın çift etiketli E19'daki NM'nin yüksek büyütmeli görüntüleri. SNAP25, Held'in uç ampulünü etiketleyen presinaptik bir işaretleyicidir. Transfekte (yeşil; *) nöronlardaki FMRP immünoreaktivitesinin, komşu transfekte olmayan nöronlara (•) kıyasla belirgin bir şekilde azaldığını not edin. (O-P) FMRP immünoreaktivitesi ile E19'daki işitsel ganglionun (AG) yüksek büyütmeli görüntüleri. AG nöronları (AGN) transfekte edilmedi (EGFP-). F'de belirtilen CNC hücrelerinden türetilen bazı glial hücreler transfekte edildi. Ölçek çubuğu = M cinsinden 10 μm, M-P için geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Tavuk işitme kanalında FMRP nakavt. (A) HH13'te otokistin içine plazmidlerin mikroenjeksiyonunu gösteren parlak alan (BF) görüntüsü. Hint mürekkebi (siyah), daha fazla görünürlük için embriyonun altına enjekte edildi. (B) Elektroporasyon için bipolar elektrotun konumlandırılması. Pozitif taraf (artı sembolü ile etiketlenmiş, +) otokistin önüne yerleştirildi ve negatif taraf (eksi sembolü ile etiketlenmiş, -) otokistin arkasına yerleştirildi. (C) E6'daki bir tavuk kafasının enine kesiti, FMRP (kırmızı) ve nörofilament (NF; mavi) için immün boyanmıştır. Dox, elektroporasyonu takiben E3'te uygulandı. EGFP floresansı otokistte saptandı, ancak beyin sapında saptanmadı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (D-E) BF görüntüsü (D), E9'daki bir işitme kanalının EGFP kanalı (E) ile birleştirilmiştir. Ölçek çubuğu = 500 μm. (F-G) FMRP (kırmızı) ve NF (mavi) immün boyama ile bir E9 işitme kanalının enine kesiti. EGFP+ hücreleri koklear kanal duvarında, baziler papillada (BP) ve işitsel ganglionda (AG) görüldü. Ölçek çubuğu = F cinsinden 50 μm, F ve G için geçerlidir. (H-J) Transfekte saç hücrelerinde (HC'ler; *) transfekte olmayan HC'lere (•) kıyasla büyük ölçüde azalmış FMRP immünoreaktivitesi gösteren bir E9 BP'nin yüksek büyütme görüntüleri. NF-pozitif lifler (mavi), AG nöronlarından periferik innervasyondu. (K-M) FMRP immün boyama (kırmızı) ile E9'daki AG nöronlarının yüksek büyütmeli görüntüleri. FMRP immünoreaktivitesi transfekte olmayan nöronlarda (•) güçlüydü ve transfekte nöronlarda (EGFP +; *) saptanamadı. Ölçek çubuğu = H cinsinden 50 μm ve H-M için geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Beyin sapındaki transfekte AG nöronlarının aksonal takibi. Embriyolar, Fmr1 shRNA'nın otokist transfeksiyonu için HH13'te elektropoze edildi. Dox uygulaması E2'de başladı. (A) Bir E6 tavuk kafasının Islet-1 immün boyama ve DAPI karşı boyaması ile enine kesitleri. EGFP+ hücreleri işitsel ganglionda (AG) belirgindi. Yıldızlar* iç kısımdaki birkaç transfekte AG nöronunu gösterir. Ölçek çubuğu = A'da 100 μm ve iç kısımda 10 μm. (B-C) Parlak alan (BF) görüntüsü (B), bir E9 beyin sapının EGFP kanalı (C) ile birleşti. Bu durumda, AG'nin (beyaz oklar) bir kısmı işitsel beyin sapına bağlı bırakıldı. Sarı ok, iç kısımdaki transfekte AG nöronlarını (AGN) gösterir. EGFP + lifleri, beyin sapının transfekte tarafında belirgindi. Ölçek çubuğu = B'de 1 mm, B ve C için geçerlidir; Girişte 100 μm. (D) E9 beyin sapının kesitli çizgiyle C'de belirtilen seviyede kesiti. EGFP + işitme siniri lifleri (ANF; yeşil) beyin sapının dorsal marjı boyunca uzandı ve çekirdek magnoselülarisine (NM) yaklaştı. Ölçek çubuğu = 100 μm. (E-G) E15 (E) ve E19 (F-G)'deki EGFP+ lifleri. Bazı lifler çekirdek angularis (NA) ve inen vestibüler çekirdekte (VeD) de görüldü. E19 kesitleri, ANF'ler için bir belirteç olarak parvalbümin (PV) immünoreaktivitesi için boyandı. F'deki kesikli kutu, insets'te büyütülür ve PV immünoreaktif olan bir EGFP + ANF'yi gösterir. Ölçek çubuğu = E cinsinden 100 μm; F'de 50 μm, F ve G için geçerlidir; İç ağlarda 2 μm. (H-J) NM'deki ANF terminallerinin E9, E15 ve E19'daki yüksek büyütmeli görüntüleri, Held'in uç ampulünün oluşumunu ve ilerleyici olgunlaşmasını gösterir. Ölçek çubuğu = H cinsinden 5 μm, H-J için geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FMRP'nin hücre özerk işlevini belirlemek için, ekspresyonunu bireysel hücre gruplarında veya hücre tiplerinde manipüle etmek gerekir. FMRP'nin ana işlevlerinden biri sinaptik oluşumu ve plastisiteyi düzenlemek olduğundan, belirli bir devrenin her bir sinaptik bileşenini seçici olarak manipüle etmek, sinaptik iletişimde FMRP mekanizmasının tam olarak anlaşılması için ön koşuldur. Tavuk embriyolarının ovo elektroporasyonunda kullanarak, AG-NM devresinde, presinaptik AG nöronlarında veya postsinaptik NM nöronlarında FMRP ekspresyonunu hedeflemek için bir yöntem gösterdik. Bunu başarmak için, elektroporasyon için uygun gelişim aşamalarının seçilmesi ve elektroporasyon elektrodunun embriyo üzerinde doğru bir şekilde konumlandırılması kritik adımlardır. NM nöronları, HH1223'teki r5/6 seviyesindeki nöral tüpteki nöral progenitörlerden kaynaklanır. Aynı aşamada, kraniyal nöral krest hücreleri, gelecekteki AG nöronlarını sarmak için nöral tüpün dorsal ucundan kokleovestibüler gangliona göç eder33. Bu nedenle, hem NM nöronları hem de AG'deki glia hücreleri nöral tüp türemiştir. Buna karşılık, saç hücreleri ve AG nöronları ektoderm24'ten kaynaklanır. R5/6 seviyesine bitişik ektoderm HH10'da kalınlaşır ve daha sonra HH13'te otik kabı oluşturmak için invagine olur. Otik kap daha sonra otokisti oluşturmak için ektodermden kapanır ve ayrılır, ön kısım işitsel duyu organı haline gelir ve arka kısım vestibüler sisteme katkıda bulunur. Hem işitsel hem de vestibüler kısımlarda, otik kabın ventral kısmında bulunan nöroblast hücreleri delaminasyona uğrar ve kokleovestibüler ganglionu oluşturmak için göç eder. Bu kader haritalama çalışmalarına dayanarak, daha önce 26,28,34 olarak kurulmuş bir strateji olan HH12'deki nöral tüpü elektroporize ederek NM nöronlarının progenitörlerini transfekte ettik. Bu strateji beyin sapı ve AG'deki glial hücrelerin ek transfeksiyonuna yol açsa da, AG nöronlarının hiçbiri transfekte edilmedi. Nöronal-spesifik transfeksiyon, daha önceyaptığımız gibi Atoh1 promotor güdümlü bir strateji kullanılarak elde edilebilir. AG nöronlarının seçici transfeksiyonu için, otokisti HH13'te elektropolize ettik. Otik kabın içine enjekte edilen plazmidler, Şekil 2B'de gösterildiği gibi elektrotları konumlandırırken ağırlıklı olarak saç hücresi ve AG nöron transfeksiyonu için otokistin ön kısmına aynı anda girmiştir. AG nöronlarını saç hücreleri üzerinde tercihen hedeflemek için, plazmid çözeltisinin doğrudan delamine nöroblastların35'i bulduğu anterior otokistin bitişiğindeki bölgeye enjekte edilmesi mümkündür. Bununla birlikte, bu yöntem, otokist enjeksiyonuna kıyasla AG nöron transfeksiyonunun daha düşük bir verimliliğine sahiptir, çünkü plazmidler enjeksiyondan sonra hızla yayılır. Bu yöntem aynı zamanda çevredeki baş mezenkimal hücrelerinin ek transfeksiyonuna da yol açabilir. Saç hücrelerini AG nöronları üzerinden tercihen hedeflemenin bir yöntemi, nöroblastların çoğunluğu (AG nöron öncülleri) bu aşamada otokistten göç ettiğinden, otokist enjeksiyonunu ve elektroporasyonunu HH18'e (~ embriyonik gün 3) geciktirmektir24.

Değişikliklerle, bu yöntem vestibüler sistemi incelemek için genişletilebilir. Vestibüler ganglion transfeksiyonu için, işitsel ve vestibüler ganglion öncüllerinin farklı konumu nedeniyle otokistin arka kısmını transfekte etmek için Şekil 2B'de gösterilen elektrotların yönü tersine çevrilmelidir.

Ovo tavuk embriyolarının elektroporasyonu, gelişimin erken aşamalarını araştırmak için iyi kurulmuş bir tekniktir (inkübasyonun ilk haftasında). Uzun süreli çalışmalar için hayatta kalma oranı önemli bir endişe kaynağıdır. E8'de Dox tedavisine başlarken, burada bulunan hayatta kalma oranı E9'da ~% 60'tır, ancak E15'te% 30'a düşer ve E19'da daha da düşüktür. Elektroporated yumurtalardan yavrular mümkündür, ancak nadirdir ve çoğu durumda sadece birkaç gün hayatta kalabilirler. Hayatta kalma oranını artırmak için aşağıdakiler dikkate alınmalıdır: 1) keskin dalgalar yerine kare dalgalar sağlayan bir elektroporatör kullanın; 2) albümin tabakası elektrik iletkenliğini teşvik edecek kadar kalın değilse, embriyonun üstüne bir veya iki damla steril PBS uygulayın (bu, elektriksel travmayı azaltmaya yardımcı olacaktır); 3) embriyoyu enjeksiyon bölgesinde açığa çıkarmak için vitelin zarının açılması, başarılı bir transfeksiyon için gerekli değildir ve embriyoya zarar verebilir; 4) kontaminasyon riskini azaltmak için, parafilmi dürtmek için bir şırınga kullanın ve pencereyi yeniden açmak yerine Dox'u uygulayın. Enjeksiyondan sonra, şeffaf filmi% 75 etanol ile silin ve iğne açıklığını bantla örtün; 5) Otokist transfeksiyonu için, altındaki aort dorsalisin olası delinmesini önlemek için 45 ° açılı bir pipet ile otokistin içine dorsolateral olarak plazmidler enjekte edin. Aort dorsalis hasar görürse, kanama plazmidleri temizler ve hatta ölüme neden olur; 6) mümkünse, embriyoyu görselleştirmek için Hint mürekkebi kullanmaktan kaçının. Daha az kullanım ve daha az prosedür daha yüksek bir hayatta kalma oranı ile sonuçlanacaktır.

AG veya NM nöronlarını seçici olarak transfekte etme yeteneğine ek olarak, in ovo elektroporasyonu, veri analizleri için komşu karşılaştırmalara izin veren benzersiz bir sistem sağlar. Elektroporasyondan sonra, NM veya AG'deki hücrelerin sadece bir alt kümesi transfekte edilir ve aynı hücre grubundaki çevreleyen transfekte edilmemiş hücrelerin ideal bir kontrol20 olarak hizmet etmesine izin verilir. Komşu nöronlar arasındaki potansiyel etkileşim bir endişe ise, kulak ve beynin transfekte edilmemiş tarafındaki nöron meslektaşları ek bir kontrol görevi görebilir. Histolojik ve görüntüleme çalışmaları için bu sonuç, tek hücre veya tek fiber düzeyinde yüksek verimlilikle veri analizlerine olanak tanır. Moleküler analizler, floresan bazlı hücre sıralama ve kütle spektrometrisi ve yeni nesil dizileme gibi büyük ölçekli protein ve RNA analizleri ile birleştirildiğinde de mümkündür. Bununla birlikte, ovo elektroporasyonunda gen düzenleme aracı olarak kullanmak, fonksiyonel ve davranış çalışmaları için zor olabilir, çünkü bir hücre grubundaki transfekte hücrelerin yüzdesi, fonksiyonel sonuçlara yol açacak kadar büyük olmayabilir.

In ovo elektroporasyon yaklaşımını benimserken iki doğrulama analizi yapmak esastır. İlk olarak, gen düzenlemenin ilgilenilen protein üzerindeki etkisi doğrulanmalıdır. Ovo elektroporasyonunda, NM veya AG'deki nöronların sadece bir alt kümesini (yani mozaik bir desen) transfekte eder. Transfekte ve transfekte edilmemiş nöronların bir karışımını içeren homojenize dokular üzerinde batı lekesi yapmak, nakavt etkisini doğru bir şekilde yansıtacak kadar hassas değildir. Bu nedenle, validasyon, immünositokimya gibi yöntemler kullanılarak bireysel hücre düzeyinde yapılmalıdır. Bu amaçla, daha önce tavuk FMRP'yi tanıyan bir antikor ürettik. Bu antikorun özgüllüğü, önceki bir çalışmada immünositokimya ve batı lekesi ile doğrulandı30. Fmr1 shRNA'nın nakavt etkisi, transfekte olmayan komşu nöronlara kıyasla transfekte NM nöronlarında FMRP immünoreaktivitesinin yoğunluğunda önemli azalmalar gözlenerek kantitatif olarak doğrulandı. İkincisi, karıştırılmış RNA'lar veya diğer kontrol yapıları kullanan kontrol grupları, FMRP yanlış ekspresyonunun gözlemlenen hücresel etkilerinin özgüllüğünü doğrulamak için kullanılmalıdır20,21. Bu hedefe ulaşmak için, karıştırılmış bir shRNA tasarladık, aynı Tet-On vektör sistemine klonladık ve daha önce açıklandığı gibi NM öncüllerine elektroporate ettik20. Karıştırılmış shRNA ile transfekte edilen NM nöronlarındaki FMRP ekspresyonu, komşu transfekte olmayan nöronlara kıyasla FMRP immünoreaktivitesinin değişmemiş yoğunluğu ile kanıtlandığı gibi, etkilenmedi. Ayrıca Fmr1 shRNA transfeksiyonunun aksonal büyüme, dendritik budama, terminal oluşumu ve nörotransmisyon üzerindeki bir dizi etkisini de belirledik (Curnow ve Wang, 2022'de gözden geçirilmiştir)36. Bu etkilerin özellikle FMRP'nin hücre otonom kaybı ile indüklendiği sonucuna vardık, çünkü karıştırılmış shRNA benzer değişiklikleri indükleyemedi.

Sonuç olarak, in ovo elektroporasyon tekniği, işitsel kulak-beyin sapı devrelerinde zamansal kontrol ve bileşen özgüllüğü ile seçici Fmr1 gen düzenlemesini mümkün kılar ve vestibüler sistemi manipüle etmek için modifiye edilebilir. Gelişim biyolojisinde köklü bir model olan tavuk embriyosundaki bu ileri teknolojinin geliştirilmesi, FXS gibi normal ve anormal koşullar altında beyin gelişimini anlamamıza katkıda bulunmuştur ve olmaya devam edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma şu kişiler tarafından desteklenmiştir: Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibesi (No. 32000697); Guangzhou Bilim ve Teknoloji Programı (202102080139); Guangdong Doğa Bilimleri Vakfı (2019A1515110625, 2021A1515010619); Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (11620324); Rejeneratif Tıp Anahtar Laboratuvarı Araştırma Bursu, Eğitim Bakanlığı, Jinan Üniversitesi (No. ZSYXM202107); Çin Merkez Üniversiteleri için Temel Araştırma Fonları (21621054); ve Çin'in Guangdong Eyaleti Tıbbi Bilimsel Araştırma Vakfı (20191118142729581). Jinan Üniversitesi tıbbi deney merkezine teşekkür ederiz. Dr. Terra Bradley'e yazının dikkatli bir şekilde düzenlenmesi için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Tags

Nörobilim Sayı 185 Frajil X sendromu duyusal devre iç kulak koklear çekirdek sinaps oluşumu beyin gelişimi Held ampulü tavuk embriyosu
In Ovo Electroporation tarafından İşitsel Bir Devrede Kırılgan X Mental Retardasyon Proteininin Hücre <em>Otonom Fonksiyonunun</em> Diseksiyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang,… More

Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter