Summary
Die Infektion mit dem Influenza-A-Virus (IAV) aktiviert die Caspasen, die Wirts- und Virusproteine spalten, die wiederum pro- und antivirale Funktionen haben. Durch den Einsatz von Inhibitoren, RNA-Interferenz, ortsgerichteter Mutagenese und Western Blotting und RT-qPCR-Techniken wurden Caspasen in infizierten Säugetierzellen identifiziert, die Wirtscortactin- und Histon-Deacetylasen spalten.
Abstract
Caspasen, eine Familie von Cysteinproteasen, orchestrieren den programmierten Zelltod als Reaktion auf verschiedene Reize, einschließlich mikrobieller Infektionen. Ursprünglich als Apoptose beschrieben, ist heute bekannt, dass der programmierte Zelltod drei miteinander verbundene Wege umfasst: Pyroptose, Apoptose und Nekroptose, die zusammen als ein Prozess, PANoptose, bezeichnet werden. Einfluss Eine Virusinfektion (IAV) induziert PANoptose in Säugetierzellen, indem sie die Aktivierung verschiedener Caspasen induziert, die wiederum verschiedene Wirts- und virale Proteine spalten, was zu Prozessen wie der Aktivierung der angeborenen antiviralen Antwort des Wirts oder dem Abbau antagonistischer Wirtsproteine führt. In dieser Hinsicht wurde eine Caspase-3-vermittelte Spaltung von Wirtscortactin, Histon-Deacetylase 4 (HDAC4) und Histon-Deacetylase 6 (HDAC6) sowohl in tierischen als auch in menschlichen Epithelzellen als Reaktion auf die IAV-Infektion entdeckt. Um dies zu demonstrieren, wurden Inhibitoren, RNA-Interferenz und ortsgerichtete Mutagenese eingesetzt, und anschließend wurden die Spaltung oder Resistenz gegen Spaltung und die Erholung von Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptiden durch Western Blotting gemessen. Diese Methoden bilden in Verbindung mit der RT-qPCR eine einfache, aber effektive Strategie, um den Wirt sowie virale Proteine zu identifizieren, die während einer Infektion mit IAV oder anderen menschlichen und tierischen Viren eine Caspase-vermittelte Spaltung durchlaufen. Das vorliegende Protokoll erarbeitet die repräsentativen Ergebnisse dieser Strategie, und es werden auch die Möglichkeiten diskutiert, sie wirksamer zu gestalten.
Introduction
Das Influenza-A-Virus (IAV) ist das prototypische Mitglied der Familie der Orthomyxoviridae und ist dafür bekannt, globale Epidemien und unvorhersehbare Pandemien zu verursachen. IAV verursacht menschliche Atemwegserkrankungen, Influenza, allgemein bekannt als "Grippe". Die Grippe ist eine akute Erkrankung, die zur Induktion wirtspro- und entzündungshemmender angeborener Immunantworten und zum Absterben von Epithelzellen in den menschlichen Atemwegen führt. Beide Prozesse werden von einem Phänomen gesteuert, das als programmierter Zelltodbezeichnet wird 1. Die Signalisierung für den programmierten Zelltod wird induziert, sobald verschiedene Erregererkennungsrezeptoren die ankommenden Viruspartikel in Wirtszellen wahrnehmen. Dies führt zur Programmierung des Todes infizierter Zellen und zur Signalisierung an die benachbarten gesunden Zellen durch drei miteinander verbundene Signalwege, die Pyroptose, Apoptose und Nekroptose genannt werden - kürzlich als ein Prozess, PANoptose1, geprägt.
Die PANoptose beinhaltet die proteolytische Verarbeitung vieler Wirts- und Virusproteine von der Induktion bis zur Ausführung. Diese Verarbeitung von Proteinen wird hauptsächlich von einer Familie von Cysteinproteasen angeführt, die Caspasen 1,2 genannt werden. Bis zu 18 Caspasen (von Caspase 1 bis Caspase 18) sind bekannt3. Die meisten Caspasen werden als Pro-Caspasen exprimiert und durch ihre eigene proteolytische Verarbeitung entweder durch Autokatalyse oder andere Caspasen4 als Reaktion auf einen Reiz wie eine Virusinfektion aktiviert. Die PANoptose von IAV-infizierten Zellen wurde als Abwehrmechanismus des Wirts angesehen, aber IAV hat Wege entwickelt, um sie zu umgehen und auszunutzen, um ihre Replikation zu erleichtern 1,2,5,6. Eine davon besteht darin, die Wirtsfaktoren durch Caspase-vermittelte Spaltung oder Abbau zu antagonisieren, die entweder inhärent antiviral sind oder einen der Schritte des IAV-Lebenszyklus stören. Zu diesem Zweck wurde entdeckt, dass die Wirtsfaktoren Cortactin, HDAC4 und HDAC6 in IAV-infizierten Epithelzellen eine Caspase-vermittelte Spaltung oder Degradation durchlaufen 7,8,9. HDAC4 und HDAC6 sind Anti-IAV-Faktoren 8,10, und Cortactin stört die IAV-Replikation in einem späteren Stadium der Infektion, möglicherweise während der viralen Assemblierung und Knospung 11.
Darüber hinaus werden auch verschiedene Caspasen aktiviert, die wiederum mehrere Proteine spalten, um die Entzündungsreaktion des Wirts während der IAV-Infektion zu aktivieren 1,2. Darüber hinaus durchlaufen Nukleoprotein (NP), Ionenkanal-M2-Protein von IAV 12,13,14 und verschiedene Proteine anderer Viren 3,15,16 während der Infektion ebenfalls eine Caspase-vermittelte Spaltung, die die virale Pathogenese beeinflusst. Daher besteht ein kontinuierlicher Bedarf, die Caspase-vermittelte Spaltung oder den Abbau von Wirts- und Virusproteinen während IAV- und anderer Virusinfektionen zu untersuchen, um die molekularen Grundlagen der viralen Pathogenese zu verstehen. Hierin werden die Verfahren vorgestellt, um (1) die Spaltung oder den Abbau solcher Proteine durch Caspasen zu bewerten, (2) diese Caspasen zu identifizieren und (3) die Spaltstellen zu lokalisieren.
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Protocol
Die behördlichen Genehmigungen wurden vom University of Otago Institutional Biological Safety Committee für die Arbeit mit IAV- und Säugetierzellen eingeholt. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) oder humane alveoläre Lungenepithelzellen A549 und IAV H1N1 Subtypen wurden für die vorliegende Studie verwendet. IAV wurde in Hühnereiern gezüchtet, wie an anderer Stellebeschrieben 17. Für die Arbeit mit Säugetierzellen wurden sterile und aseptische Bedingungen verwendet, und eine Biosicherheitseinrichtung der Stufe 2 (oder Physical Containment 2) und eine Biosicherheitswerkbank der Klasse II wurden verwendet, um mit IAV-Subtypen zu arbeiten.
1. Beurteilung der Spaltung oder des Abbaus von Proteinen in IAV-infizierten Zellen durch Caspasen
- Samen Sie 3 x 105 MDCK- oder A549-Zellen pro Vertiefung in einer 12-Well-Zellkulturplatte.
HINWEIS: Wenn Sie MDCK-Zellen verwenden, stellen Sie sicher, dass der Antikörper gegen das interessierende Protein seine Hundeart erkennt. - Saaten Sie die Vertiefungen paarweise, d. h. ein Kontrollpaar - eine Vertiefung für die nicht infizierte Scheinprobe und eine für die infizierte Scheinprobe - und ein Testpaar - eine Vertiefung für die nicht infizierte Inhibitor-A-Probe und eine für die infizierte Inhibitor-A-Probe. Erhöhen Sie die Anzahl der Paare mit jedem zusätzlichen Inhibitor (siehe Referenzen 7,8).
- Die Zellen werden über Nacht bei 37 °C unter 5%CO2-Atmosphäre inkubiert.
- Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen mit IAV (einem H1N1-Subtyp oder einem anderen Subtyp).
- Bereiten Sie dazu das Virusinokulum vor, indem Sie den Virusbestand in 400 μL serumfreies minimum essential medium (MEM) (siehe Materialtabelle) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,5-3,0 plaquebildenden Einheiten (pfu)/Zelle 7,11 (ein Faktor der Verdoppelung der Zellzahl bei der Berechnung des MOI) verdünnen.
HINWEIS: Um MDCK-Zellen zu infizieren, ergänzen Sie das Virusinokulum mit Tosylphenylalanylchlormethylketon (TPCK)-Trypsin in einer Endkonzentration von 1 μg / ml.
- Bereiten Sie dazu das Virusinokulum vor, indem Sie den Virusbestand in 400 μL serumfreies minimum essential medium (MEM) (siehe Materialtabelle) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,5-3,0 plaquebildenden Einheiten (pfu)/Zelle 7,11 (ein Faktor der Verdoppelung der Zellzahl bei der Berechnung des MOI) verdünnen.
- Entfernen Sie das alte Kulturmedium aus den Zellen (Schritt 1.3) und waschen Sie die Zellen mit 1 ml/Vertiefung serumfreiem MEM 2x.
- 400 μL Virusinokulum (Schritt 1.4.1) in die Zellen geben und 1 h bei 35 °C unter 5%CO2-Atmosphäre inkubieren.
- In der Zwischenzeit verdünnen Sie einen Caspase-Inhibitor (z. B. Z-DEVD-FMK), einen Lysosom-Inhibitor (z. B. NH4Cl) oder einen Proteasom-Inhibitor (z. B. MG132) (siehe Materialtabelle) bei einer Endkonzentration von 40 μM, 20 mM bzw. 10 μM in serumfreiem MEM7 (siehe Materialtabelle). Die beiden letztgenannten Inhibitoren dienen als Kontrolle. Verdünnen Sie ein gleiches Volumen des Lösungsmittels (falls nicht Wasser), das verwendet wird, um einen der Inhibitoren in serumfreiem Medium als Mock zu rekonstituieren.
- Entfernen Sie das Virusinokulum und waschen Sie die Zellen wie in Schritt 1.5 (1x).
- Geben Sie das serumfreie MEM, 1 ml/Well, mock oder ergänzt mit einem Inhibitor, zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen wie in Schritt 1.6. Dieser Zeitpunkt wird als 0 h Infektion betrachtet.
- Nach 24 h ernten Sie die Zellen, indem Sie sie mit einem 1-ml-Spritzenkolben (Gummiseite) abkratzen und in ein 1,5-ml-Polypropylenröhrchen überführen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 12.000 x g für 1-2 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand mit einer Pipette.
HINWEIS: Dieser Überstand könnte verworfen oder für einen Plaque-Assay8 verwendet werden, um den Titer der freigesetzten Virusnachkommen zu messen. - Das Zellpellet wird mit 250 μL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch Rezentrifugation wie in Schritt 1.11 gewaschen.
- Entfernen Sie den Überstand und lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 80-100 μL Zelllysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5% Natriumdesoxycholat, 1% Triton X-100 und 1x Proteaseinhibitor-Cocktail, siehe Materialtabelle) und Vortexing.
- Erhitzen Sie das Röhrchen bei 98 °C für 10 min, um das gesamte Zelllysat vollständig zu lysieren und vorzubereiten. Lagern Sie die Lysate bei 4 °C, um die Schritte 1.15-1.17 am nächsten Tag durchzuführen, aber beenden Sie diese Schritte am selben Tag, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
- Schätzen Sie die Proteinmenge in jeder Probe mit einem BCA-Assay-Kit (siehe Materialtabelle).
- Gleiche Mengen an Protein aus nicht infizierten und infizierten Proben werden durch Standard-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)11 zusammen mit Molekulargewichtsmarkern11 aufgelöst.
- Übertragen Sie das Protein auf eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidendifluorid-Membran (PVDF) (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: PVDF-Membran kann bei einigen Western Blot-Imagern einen hohen Hintergrund erzeugen. Überprüfen Sie die Kompatibilität. - Führen Sie Western Blotting durch, um das interessierende Protein unter Verwendung der an anderer Stelle beschriebenen Methodenachzuweisen. 11.
- Vergleichen Sie die Proteinspiegel in den simuliert behandelten und inhibitorbehandelten infizierten Probenbahnen.
HINWEIS: Wenn sich der Proteingehalt in der mit Caspase-Inhibitoren behandelten infizierten Probenbahn erholt hat, wird das Protein durch Caspasen gespalten oder abgebaut. Andernfalls wird es entweder durch Lysosom oder Proteasom abgebaut. - Quantifizieren Sie die Proteinrückgewinnung, indem Sie ihre Bandenintensität in jeder Spur aus mindestens drei Wiederholungen desselben Experiments messen und mit dem entsprechenden Belastungskontrollband normalisieren.
- Verwenden Sie einen modernen Imager und zugehörige Software (siehe Materialtabelle), um die westlichen Blots abzubilden und die Proteinregeneration zu quantifizieren.
2. Bestätigung der Caspase-vermittelten Spaltung oder des Abbaus von Proteinen in IAV-infizierten Zellen durch RNA-Interferenz
- Entwerfen oder erhalten Sie eine Pre-Design-Small-interfering-RNA (siRNA), die entweder auf Hunde oder menschliche Caspase 3, Caspase 6 und Caspase 7 (Henker-Caspasen1) abzielt, und eine nicht-zielgerichtete Kontroll-siRNA (siehe Materialtabelle).
- Jede siRNA wird durch umgekehrte Transfektion 8,11 an MDCK- oder A549-Zellen abgegeben.
- Dazu werden 100 nM Kontroll-siRNA oder Caspase-siRNA oder ein empfohlenes Volumen Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) in 100 μL geeignetem Medium (wie OptiMEM, siehe Materialtabelle) in separaten Röhrchen verdünnt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
- Jede Verdünnung wird in zweifacher Ausfertigung vorbereitet.
HINWEIS: Dieses Duplikat enthält ein Replikat zur Analyse des Knockdowns der Caspase-Expression durch RT-qPCR oder Western Blotting (wenn Antikörper gegen Caspasen verfügbar sind) und ein weiteres zur Beurteilung der Erholung des interessierenden Proteins durch Western Blotting. - Mischen Sie 100 μL jeder siRNA-Lösung mit 100 μL Transfektionsreagenzlösung (Schritt 2.3) und inkubieren Sie für 20-45 min bei Raumtemperatur, um den siRNA-Transfektionsreagenzkomplex zu bilden.
- In der Zwischenzeit werden 1 x 10 5 MDCK- oder A549-Zellen in 800 μL des kompletten Wachstumsmediums aufgeteilt und hinzugefügt, mit 200 μL siRNA-Transfektionsreagenzkomplex gemischt (Schritt2.5 ) und 1 ml der Suspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte gegeben. Diese Verdünnung bringt die Endkonzentration der Kontroll-siRNA oder Caspase-siRNA auf 10 nM.
- Die Zellen werden 72 h lang bei 37 °C unter 5%CO2-Atmosphäre inkubiert.
- Ernten Sie die Zellen aus einem Replikat wie in Schritt 1.10 und verarbeiten Sie sie, um den Knockdown der Expression von Caspase 3, Caspase 6 und Caspase 7 entweder durch RT-qPCR bzw. Western Blotting unter Verwendung von Standardmethoden und Protokollen 8,11 zu validieren oder zu bestätigen.
- Infizieren Sie die Zellen in der anderen Replikation mit IAV, wie in den Schritten 1.4-1.9 (ohne Inhibitoren) beschrieben.
- Nach 24 Stunden Ernte, Verarbeitung und Analyse der Zellen durch Western Blotting und Messung und Quantifizierung der Proteinrückgewinnung wie in den Schritten 1.10-1.20 beschrieben.
3. Ortsgerichtete Mutagenese zur Lokalisierung der Caspase-Spaltstelle(n) im Polypeptid
- Klonen Sie das Gen-kodierende Protein von Interesse in einem Säugetierexpressionsplasmid11 oder beziehen Sie es aus einem Forschungslabor oder einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Es wird bevorzugt, wenn das Gen mit einem Epitop-Tag oder als GFP-Fusion kloniert wird, um das ektopisch exprimierte Polypeptid vom endogen exprimierten während des Western Blotting zu unterscheiden. - Unter Verwendung von Caspase-Substratdatenbanken4 oder Protein-Alignment-Tools können Sie die Konsens-Caspase-Spaltungsmotive XXXD und DXXD auf dem Polypeptid lokalisieren. Fast alle Caspase-Spaltungsmotive besitzen die Asparaginsäure an der Spaltstelle (P1)3,4.
- Mutieren Sie die mutmaßliche P1-Asparaginsäure zu Glutaminsäure oder einer unpolaren Aminosäure (Alanin, Valin) durch ortsgerichtete Mutagenese, gefolgt von DNA-Sequenzierung11 unter Verwendung von Standardmethoden und -protokollen.
- Liefern Sie die Wildtyp- (WT) und mutierte Plasmid-DNA an MDCK- oder A549-Zellen durch umgekehrte Transfektion11.
- Dazu werden 2 μg Plasmid-DNA oder ein empfohlenes Volumen des Transfektionsreagenz in 100 μL eines geeigneten Mediums (siehe Schritt 2.3 und Materialtabelle) in separaten Röhrchen verdünnt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert.
- Mischen Sie 100 μL jeder Plasmid-DNA-Lösung mit 100 μL der Transfektionsreagenzlösung und inkubieren Sie für 20-45 min bei Raumtemperatur, um den DNA-Transfektionsreagenzkomplex zu bilden.
- In der Zwischenzeit werden 3 x 105 MDCK- oder A549-Zellen zu 800 μL des gesamten Wachstumsmediums gespalten und hinzugefügt, mit 200 μL DNA-Transfektionsreagenzkomplex gemischt und die 1-ml-Suspension in eine Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte gegeben.
- Die Zellen werden bei 37 °C unter 5%CO2-Atmosphäre inkubiert.
- Nach 48 h infizieren Sie die Zellen mit IAV, wie in den Schritten 1.4-1.9 beschrieben (ohne Zugabe der Inhibitoren).
- Nach 24 h Ernte, Verarbeitung und Analyse der Zellen durch Western Blotting (falls zutreffend mit dem Antikörper gegen einen Epitop-Tag oder GFP). Messen und quantifizieren Sie dann die Proteinrückgewinnung wie in den Schritten 1.10-1.20 beschrieben.
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Representative Results
Behandlung mit Caspase-3-Hemmer
Es wurde entdeckt, dass Wirts-Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptide als Reaktion auf eine IAV-Infektion sowohl in Hunde- (MDCK) als auch in menschlichen (A549, NHBE) Zellen abgebaut werden 7,8,9. Mit den oben genannten Ansätzen wurde aufgedeckt, dass IAV-induzierte Wirtskaspasen, insbesondere Caspase 3, deren Abbauverursachen 7,8,9. Das Cortactin wurde in einer infektionsdosis- und zeitabhängigen Weise und einer wirtszell- und IAV-Stamm-unabhängigen Weise abgebaut7. Ähnliche Ergebnisse wurden für HDAC48 und HDAC69 erzielt. Interessanterweise fiel der Abbau aller drei Wirtsproteine mit der Spaltung des viralen NP 7,8,9 zusammen, von dem bekannt ist, dass es eine Caspase-vermittelte Spaltung durchläuft14. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass Cortactin, HDAC4 und HDAC6 auch eine Caspase-vermittelte Spaltung und anschließenden Abbau erfahren. Um dies zu testen, wurden zunächst die IAV-infizierten Zellen mit einem Caspase-3-Inhibitor behandelt und die Rettung von Cortactin-, HDAC4- und HDAC6-Polypeptiden durch Western Blotting analysiert. Alle drei Polypeptide (sowie viraler NP) erholten sich vom IAV-infektionsinduzierten Abbau nach Caspase-3-Inhibitor-Behandlung 7,8,9. Die repräsentativen Daten7 für Cortactin sind in Abbildung 1A dargestellt. Diese Erholung wurde quantifiziert, indem die Intensität der Proteinbanden gemessen und der Wert der Cortactinbande durch den Wert der entsprechenden Aktinbande (Belastungskontrolle) normalisiert wurde. Anschließend wurde der normalisierte Wert von Cortactin in den entsprechenden nicht infizierten Proben als 100% betrachtet, um seinen Wert in den infizierten Proben zu bestimmen. Diese Quantifizierungsmethode berücksichtigte die Erholung von Cortactin-Polypeptid in Caspase-3-Inhibitor-behandelten infizierten Zellen als 78,8% von 20,7% in unbehandelten infizierten Zellen7 (Abbildung 1B).
RNA-Interferenz-vermittelter Knockdown der Caspase-3-Expression
Als nächstes wurde ein genetisches Werkzeug, RNA-Interferenz (RNAi), eingesetzt, gefolgt von Western Blotting, um die Rolle von Caspasen beim IAV-infektionsinduzierten Abbau von Cortactin11 und HDAC48 zu bestätigen. In Caspase-3-depletierten Zellen (Abbildung 2C)11 erholten sich sowohl Cortactin (Abbildung 2A)11 als auch HDAC48-Polypeptide aus dem IAV-infektionsinduzierten Abbau. In Caspase-6- oder Caspase-7-depletierten Zellen (Abbildung 2C)11 wurde jedoch keine signifikante Erholung der Cortactin-Polypeptidspiegel beobachtet (Abbildung 2A)11. Insbesondere bei Quantifizierung und Vergleich mit ihren Spiegeln in entsprechenden nicht infizierten Zellen, wie oben erwähnt, erholte sich der Cortactin-Polypeptidspiegel in infizierten Zellen mit erschöpfter Caspase-3-Expression von 28,6% in infizierten Zellen mit normaler Caspase-3-Expression auf 83% (Abbildung 2B)11.
Caspase-Spaltungsmotive in Cortactin- und HDAC6-Polypeptiden
Schließlich wurde die Aminosäuresequenz in Cortactin und HDAC6-Polypeptiden gescreent und in mutmaßlichen Caspase-Spaltungsmotiven wurde die Asparaginsäure an der P1-Position zu Glutaminsäure 9,11 mutiert. Dieser Ansatz identifizierte die Asparaginsäure 116 in Cortactin-Polypeptid11 und die Asparaginsäure 1088 in HDAC6-Polypeptid9 als Caspase-Spaltstelle. Die Mutation beider Asparaginsäurereste zu Glutaminsäure machte die Polypeptide Cortactin (Abbildung 3A)11 und HDAC69 resistent gegen den durch IAV-Infektionen induzierten Abbau. Insbesondere betrug das Niveau des plasmidexprimierten mutierten Cortactin-Polypeptids in infizierten Zellen 77,9%, während das Niveau des plasmidexprimierten Wildtyp-Cortactin-Polypeptids in infizierten Zellen 23,6% betrug (Abbildung 3B)11.
Abbildung 1: Cortactin-Polypeptid erfährt Caspase-3-vermittelten Abbau in IAV-infizierten Zellen. (A) MDCK-Zellen wurden mit dem Influenzavirus A/New Caledonia/20/1999/H1N1-Stamm bei einem MOI von 0,5 infiziert und anschließend als Mock oder mit Caspase-3-Inhibitor (Cas3-I, 40 μM) behandelt. Nach 24 h wurden die Cortactin-, viralen NP- und Aktinpolypeptide in Gesamtzelllysaten durch Western Blotting nachgewiesen. UNI, nicht infiziert; INF, infiziert. Pfeile zeigen auf den durchgehenden und gespaltenen NP. (B) Die Intensität der Cortactin- und Aktinbanden wurde quantifiziert. Dann wurde der Wert von Cortactin mit dem Wert von Aktin normalisiert. Die normalisierte Menge an Cortactin in UNI-Proben wurde als 100% betrachtet, um ihre Menge in den entsprechenden INF-Proben zu bestimmen. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte ± SE von drei biologischen Replikaten. P = 0,0006, berechnet mit Zwei-Wege-ANOVA. ns, nicht signifikant. Diese Abbildung wurde von Chen et al.7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Knockdown der Caspase-3-Expression rettete den Abbau von Cortactin-Polypeptiden in IAV-infizierten Zellen. (A) A549-Zellen wurden in Duplikaten mit 10 nM Kontrolle (Ctrl), Caspase 3 (Cas3), Caspase 6 (Cas6) oder Caspase 7 (Cas7) siRNA transfiziert. Nach 72 h wurden die Zellen in einem Replikat geerntet und verarbeitet, um die Gesamt-RNA zu extrahieren. Die Zellen im anderen Replikat waren mit dem Subtyp Influenzavirus A/WSN/1933/H1N1 bei einem MOI von 3,0 infiziert. Nach 24 h wurden die Cortactin-, viralen NP- und Aktin-Polypeptide durch Western Blotting nachgewiesen. UNI, nicht infiziert; INF, infiziert. (B) Die Intensität von Cortactin- und Aktinbanden wurde quantifiziert, und der Wert von Cortactin wurde mit dem Wert von Aktin normalisiert. Dann wurde die normalisierte Menge an Cortactin in den UNI-Proben als 100% betrachtet, um ihre Menge in den entsprechenden INF-Proben zu bestimmen. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte ± SE von drei biologischen Replikaten. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, berechnet mit Zwei-Wege-ANOVA. ns, nicht signifikant. (C) Die oben extrahierte Gesamt-RNA wurde in cDNA umgewandelt, die dann als Vorlage zum Nachweis von Caspase 3, Caspase 6, Caspase 7 und Aktin-mRNA-Spiegeln mittels RT-qPCR verwendet wurde. Der Aktin-mRNA-Spiegel wurde als Referenz verwendet, und der mRNA-Spiegel jeder Caspase in Kontroll-siRNA (Ctrl) und entsprechenden Caspase-siRNA (Cas)-transfizierten Zellen wurde mit der Standard-2−ΔΔCT-Methode berechnet. P < 0,0001, berechnet mit Zwei-Wege-ANOVA. Diese Abbildung wurde von Chen et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Mutation von Asparaginsäure 116 zu Glutaminsäure machte das Cortactin-Polypeptid resistent gegen IAV-infektionsinduzierten Abbau . (A) MDCK-Zellen wurden mit einem Plasmid transfiziert, das die Wildtyp- (WT) oder mutierte (D116E) GFP-Cortactin-Fusion exprimiert. Nach 48 h wurden die Zellen mit dem Subtyp Influenzavirus A/WSN/1933/H1N1 bei einem MOI von 3,0 infiziert. Nach 24 h wurden die GFP-Cortactin-, viralen NP- und Aktin-Polypeptide durch Western Blotting nachgewiesen. UNI, nicht infiziert; INF, infiziert. (B) Die Intensität von Cortactin- und Aktinbanden wurde quantifiziert, und der Wert von Cortactin wurde mit dem Wert von Aktin normalisiert. Dann wurde die normalisierte Menge an Cortactin in UNI-Proben als 100% betrachtet, um ihre Menge in den entsprechenden INF-Proben zu bestimmen. Die dargestellten Daten sind Mittelwerte ± SE von drei biologischen Replikaten. **P = 0,001, berechnet mit Zwei-Wege-ANOVA. ns, nicht signifikant. Diese Abbildung wurde von Chen et al.11 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Es ist erwiesen, dass Viren die Wirtsfaktoren und -wege zu ihrem Vorteil anpassen. Die Wirtszellen wiederum wehren sich dagegen, indem sie verschiedene Strategien anwenden. Eine dieser Strategien ist die PANoptose, die Wirtszellen als antivirale Strategie gegen Virusinfektionen einsetzen. Viren wie IAV haben jedoch ihre eigenen Strategien entwickelt, um der PANoptose entgegenzuwirken und sie zu ihrem Vorteil auszunutzen 1,3,6. Dieses Zusammenspiel beinhaltet die Spaltung verschiedener Wirts- und Virusproteine durch Caspasen. Die Identifizierung dieser Caspasen und ihrer Spaltstellen in Substratproteinen ist wichtig, um die Mechanismen und die Bedeutung eines solchen Zusammenspiels aufzuklären.
Zu diesem Zweck wurden biochemische und molekulare Standardmethoden verwendet, um die Caspasen und ihre Spaltstellen in Wirtscortactin, HDAC4 und HDAC6 7,8,9,11 zu identifizieren. Die oben beschriebenen Protokolle können für solche Studien mit Influenzaviren, anderen Säugetierviren, anderen Mikroben und externen Reizen wie Toxinen und Chemikalien verwendet werden. Darüber hinaus können diese Methoden in einem Standardlabor für Molekularbiologie mit entsprechenden Fähigkeiten repliziert werden und erfordern keine spezielle Ausrüstung und Softwareschulung. Das 12-Well-Zellkulturplattenformat wurde für diese und ähnliche Studien erfolgreich angepasst, um ausreichende Probenmengen für Downstream-Analysen mittels Western Blotting und RT-qPCR zu generieren. Dennoch kann dieses Format bei Bedarf entsprechend verkleinert oder hochskaliert werden. Wenn ein Experiment mit einem Caspase-Inhibitor zum ersten Mal durchgeführt wird, wird empfohlen, einen Pan-Caspase-Inhibitor (Z-VAD-FMK) neben einem Lysosom- und Proteasom-Inhibitor zu verwenden, um zu beurteilen, ob das interessierende Protein einen Caspase-vermittelten Abbau erfährt. Darüber hinaus können neben NH4Cl und MG132 andere Lysosom- und Proteasom-Inhibitoren wie Bafilomycin A bzw. Epoxomicin verwendet werden. Nach positiven Ergebnissen mit einem Pan-Caspase-Inhibitor können entweder spezifische Inhibitoren einzelner Caspasen verwendet oder RNA-Interferenz eingesetzt werden. Für Erstere ist es wichtig, die wirksamen Hemmkonzentrationen zu optimieren, um Toxizität für den Zielzelltyp und unspezifische Ergebnisse zu vermeiden.
Ein genetisches Werkzeug wie RNA-Interferenz oder CRISPR muss als nächstes verwendet werden, um die Beteiligung von Caspasen zu bestätigen, da Inhibitoren kreuzreagieren. Alternativ kann ein RNA-Interferenz- oder CRISPR-Screen durchgeführt werden, der individuell auf alle bekannten Caspasen abzielt. Die siRNA-, gRNA- und RT-qPCR-Primer-Paare zu allen bekannten Caspasen könnten als vorgefertigt oder mit Online-Tools entworfen werden. Darüber hinaus können zwei oder mehr Caspasen gleichzeitig entladen werden, um die sequentielle oder kooperative Spaltung von Polypeptiden zu beurteilen (diese Strategie wurde kürzlich in einer noch nicht veröffentlichten Studie verwendet). Es wird angenommen, dass RNA-Interferenz ein ideales Werkzeug für die Erforschung der Virus-Wirtszell-Interaktion ist. Letzteres erfordert eine kontrollierte Manipulation der Wirtsgenexpression, so dass die Wirtszellen für eine Virusinfektion relativ lebensfähig bleiben und den Lebenszyklus abschließen, um den Phänotyp dieser Manipulation anzuzeigen. Die Optimierung einer effektiven siRNA-Konzentration und siRNA-Transfektionsreagenz-Kombination ist jedoch für jeden Zelltyp erforderlich, um ein optimales Knockdown- und Lebensfähigkeitsverhältnis für eine nachfolgende Infektion zu erzielen.
Um die mutmaßlichen Caspase-Spaltungsmotive zu lokalisieren, wurden viele Datenbanken wie CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase21, MEROPS 22 und TopFIND23,24 entwickelt. Ein visuelles Screening wurde durchgeführt, um diese Motive auf HDAC6-Polypetid9 zu lokalisieren, aber für Cortactin11 wurde die CaspDB verwendet (obwohl die CaspDB-Website in letzter Zeit nicht zugänglich war). Diese Motive wurden erfolgreich als Caspase-Spaltstellen bestätigt, indem die P1-Asparaginsäure zu Glutaminsäure mutiert wurde. Es wird jedoch empfohlen, die Asparaginsäure zuerst zu einem unpolaren aminosäureähnlichen Alanin oder Valin zu mutieren, da einige Caspasen nach P1-Glutaminsäure4 spalten können. Diese Übung kann sofort zur Identifizierung von Caspase-Spaltstellen führen, könnte jedoch die Erzeugung von Dutzenden von Mutanten erfordern, wenn das Zielpolypeptid reich an Asparaginsäuren ist und die mutmaßlichen Zielmotive nicht kanonisch sind. Für die Abgabe von Plasmiden (und siRNA) an Zellen kann eine Transfektion vorwärts statt umgekehrt durchgeführt werden. Darüber hinaus sollten die Infektionsdosis und die Zeitkinetik unter Verwendung einer 4%-20% Gradienten-SDS-PAGE für Western Blotting durchgeführt werden, um die Abbaukinetik der Polypeptide zu beurteilen und kleinere Spaltprodukte zu identifizieren. Um das Protein von Interesse als direktes Caspase-Substrat zu bestätigen, könnten schließlich biochemische In-vitro-Assays entwickelt werden, die gereinigte Caspasen und Zielproteine (WT oder Mutanten) sowie beliebige Cofaktoren enthalten.
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Disclosures
Der Autor hat keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Der Autor dankt Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, den BEI Resources (NIAID), dem Health Research Council of New Zealand, dem Maurice and Phyllis Paykel Trust (Neuseeland), dem H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin) und dem Department of Microbiology and Immunology und der School of Biomedical Sciences (University of Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
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