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Immunology and Infection

इन्फ्लुएंजा ए वायरस संक्रमण के दौरान प्रोटीन को छोड़ने वाले कैसपेस और उनके रूपांकनों की पहचान करना

Published: July 21, 2022 doi: 10.3791/64189
Automatic Translation
1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

Summary

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) संक्रमण कैसपेस को सक्रिय करता है जो मेजबान और वायरल प्रोटीन को छोड़ देता है, जो बदले में, प्रो-और एंटीवायरल कार्य करता है। अवरोधकों, आरएनए हस्तक्षेप, साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस, और पश्चिमी सोख्ता और आरटी-क्यूपीसीआर तकनीकों को नियोजित करके, संक्रमित स्तनधारी कोशिकाओं में कैसपेस की पहचान की गई जो मेजबान कोर्टैक्टिन और हिस्टोन डेसेटाइलेज़ को छोड़ देते हैं।

Abstract

कैसपेस, सिस्टीन प्रोटीज का एक परिवार, माइक्रोबियल संक्रमण सहित विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में क्रमादेशित कोशिका मृत्यु का आयोजन करता है। प्रारंभ में एपोप्टोसिस द्वारा वर्णित, क्रमादेशित कोशिका मृत्यु को अब तीन परस्पर जुड़े मार्गों को शामिल करने के लिए जाना जाता है: पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस, एक साथ एक प्रक्रिया के रूप में गढ़ा गया, पीएनोप्टोसिस। ए वायरस (आईएवी) संक्रमण स्तनधारी कोशिकाओं में विभिन्न कैसपेस की सक्रियता को प्रेरित करके पीएनोपोसिस को प्रेरित करता है, जो बदले में, विभिन्न मेजबान के साथ-साथ वायरल प्रोटीन को छोड़ देता है, जिससे मेजबान जन्मजात एंटीवायरल प्रतिक्रिया की सक्रियता या विरोधी मेजबान प्रोटीन के क्षरण जैसी प्रक्रियाएं होती हैं। इस संबंध में, आईएवी संक्रमण के जवाब में पशु और मानव उपकला कोशिकाओं दोनों में मेजबान कोर्टैक्टिन, हिस्टोन डेसेटाइलेज़ 4 (एचडीएसी 4), और हिस्टोन डेसेटाइलेज़ 6 (एचडीएसी 6) के कैसपेस 3-मध्यस्थता दरार की खोज की गई है। इसे प्रदर्शित करने के लिए, अवरोधकों, आरएनए हस्तक्षेप और साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस को नियोजित किया गया था, और, बाद में, दरार या दरार के प्रतिरोध और कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4 और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड्स की वसूली को पश्चिमी सोख्ता द्वारा मापा गया था। आरटी-क्यूपीसीआर के साथ संयोजन में ये विधियां, आईएवी या अन्य मानव और पशु वायरस के संक्रमण के दौरान कैसपेज़-मध्यस्थता दरार से गुजरने वाले मेजबान के साथ-साथ वायरल प्रोटीन की पहचान करने के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी रणनीति बनाती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल इस रणनीति के प्रतिनिधि परिणामों को विस्तृत करता है, और इसे और अधिक प्रभावी बनाने के तरीकों पर भी चर्चा की जाती है।

Introduction

इन्फ्लुएंजा ए वायरस (आईएवी) ऑर्थोमाइक्सोविरिडे परिवार का प्रोटोटाइप सदस्य है और इसे वैश्विक महामारी और अप्रत्याशित महामारी का कारण माना जाता है। आईएवी मानव श्वसन रोग, इन्फ्लूएंजा का कारण बनता है, जिसे आमतौर पर "फ्लू" के रूप में जाना जाता है। फ्लू एक तीव्र बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप मेजबान समर्थक और विरोधी भड़काऊ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का प्रेरण होता है और मानव श्वसन पथ में उपकला कोशिकाओं की मृत्यु हो जाती है। दोनों प्रक्रियाएं प्रोग्राम्ड सेल डेथ1 नामक एक घटना द्वारा नियंत्रित होती हैं। प्रोग्राम्ड सेल डेथ के लिए सिग्नलिंग को प्रेरित किया जाता है जैसे ही विभिन्न रोगज़नक़ पहचान रिसेप्टर्स मेजबान कोशिकाओं में आने वाले वायरस कणों को महसूस करते हैं। यह संक्रमित कोशिकाओं की मृत्यु की प्रोग्रामिंग की ओर जाता है और पड़ोसी स्वस्थ कोशिकाओं को पाइरोप्टोसिस, एपोप्टोसिस और नेक्रोप्टोसिस नामक तीन परस्पर मार्गों द्वारा संकेत देता है- जिसे हाल ही में एक प्रक्रिया के रूप में गढ़ा गया है, पीएनोप्टोसिस1।

पीएनोप्टोसिस में प्रेरण से निष्पादन तक कई मेजबान और वायरल प्रोटीन के प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण शामिल हैं। प्रोटीन के इस तरह के प्रसंस्करण को मुख्य रूप से सिस्टीन प्रोटीज के एक परिवार द्वारा नेतृत्व किया जाता है जिसे कैसपेज़ 1,2 कहा जाता है। 18 कैसपेज़ (कैसपेज़ 1 से कैसपेज़ 18 तक) तक3 ज्ञात हैं। अधिकांश कैसपेस को प्रो-कैसपेज़ के रूप में व्यक्त किया जाता है और वायरस संक्रमण जैसी उत्तेजना के जवाब में ऑटोकैटालिसिस या अन्य कैसपेज़4 द्वारा अपने स्वयं के प्रोटियोलिटिक प्रसंस्करण से गुजरकर सक्रिय किया जाता है। आईएवी-संक्रमित कोशिकाओं के पीएनोप्टोसिस को एक मेजबान रक्षा तंत्र माना जाता था, लेकिन आईएवी ने इसकी प्रतिकृति 1,2,5,6 को सुविधाजनक बनाने के लिए इससे बचने और इसका फायदा उठाने के तरीके विकसित किए हैं। उनमें से एक कैसपेज़-मध्यस्थता दरार या गिरावट के माध्यम से मेजबान कारकों का विरोध करना है जो या तो स्वाभाविक रूप से एंटीवायरल हैं या आईएवी जीवन चक्र के चरणों में से एक में हस्तक्षेप करते हैं। इसके लिए, मेजबान कारक, कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4, और एचडीएसी 6 को आईएवी-संक्रमित उपकला कोशिकाओं 7,8,9 में कैसपेज़-मध्यस्थता दरार या गिरावट से गुजरने के लिए खोजा गया है। एचडीएसी 4 और एचडीएसी 6 एंटी-आईएवी कारक 8,10 हैं, और कोर्टैक्टिन संक्रमण के बाद के चरण में आईएवी प्रतिकृति में हस्तक्षेप करता है, संभवतः वायरल असेंबली और नवोदित11 के दौरान।

इसके अलावा, विभिन्न कैसपेस भी सक्रिय होते हैं, जो बदले में, आईएवी संक्रमण 1,2 के दौरान मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए कई प्रोटीन छोड़ देते हैं। इसके अलावा, न्यूक्लियोप्रोटीन (एनपी), आईएवी12,13,14 के आयन-चैनल एम 2 प्रोटीन, और अन्य वायरस 3,15,16 के विभिन्न प्रोटीन भी संक्रमण के दौरान कैसपेज़-मध्यस्थता दरार से गुजरते हैं, जो वायरल रोगजनन को प्रभावित करता है। इसलिए, वायरल रोगजनन के आणविक आधार को समझने के लिए आईएवी और अन्य वायरस संक्रमणों के दौरान कैसपेस-मध्यस्थता दरार या मेजबान और वायरल प्रोटीन के क्षरण का अध्ययन करने की निरंतर आवश्यकता है। इसमें, विधियों को प्रस्तुत किया जाता है (1) कैसपेस द्वारा ऐसे प्रोटीन की दरार या गिरावट का आकलन करना, (2) उन कैसपेस की पहचान करना, और (3) दरार साइटों का पता लगाना।

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Protocol

आईएवी और स्तनधारी कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए ओटागो संस्थागत जैविक सुरक्षा समिति विश्वविद्यालय से नियामक अनुमोदन प्राप्त किए गए थे। वर्तमान अध्ययन के लिए मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी (एमडीसीके) या मानव फेफड़े के वायुकोशीय उपकला ए 549 कोशिकाओं और आईएवी एच 1 एन 1 उपप्रकारों का उपयोग किया गया था। आईएवी चिकन अंडे में उगाया गया था, जैसा कि कहीं और वर्णितहै। स्तनधारी कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए बाँझ और सड़न रोकनेवाली स्थितियों का उपयोग किया गया था, और एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (या भौतिक रोकथाम 2) सुविधा और वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग आईएवी उपप्रकारों के साथ काम करने के लिए किया गया था।

1. कैसपेस द्वारा आईएवी संक्रमित कोशिकाओं में प्रोटीन की दरार या गिरावट का आकलन करना

  1. बीज 3 x 105 एमडीसीके या ए 549 कोशिकाएं प्रति 12-वेल सेल कल्चर प्लेट में।
    नोट: एमडीसीके कोशिकाओं का उपयोग करते समय, सुनिश्चित करें कि रुचि के प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी अपनी कैनाइन प्रजातियों को पहचानता है।
  2. कुओं को जोड़े में बीज दें, यानी, एक नियंत्रण जोड़ी - एक असंक्रमित-मॉक नमूने के लिए कुआं और एक संक्रमित-मॉक नमूने के लिए - और एक परीक्षण जोड़ी - एक असंक्रमित-अवरोधक ए नमूने के लिए और एक संक्रमित-अवरोधक ए नमूने के लिए। प्रत्येक अतिरिक्त अवरोधक के साथ जोड़े की संख्या बढ़ाएं (संदर्भ 7,8 देखें)।
  3. रात भर 5% सीओ2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, कोशिकाओं को आईएवी (एक एच 1 एन 1 उपप्रकार या एक अन्य उपप्रकार) के साथ संक्रमित करें।
    1. इसके लिए, 0.5-3.0 प्लेक बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू)/सेल 7,11 (एमओआई की गणना करते समय सेल संख्या के दोगुना होने का एक कारक) की बहुलता पर सीरम-मुक्त न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) (सामग्री की तालिका देखें) के 400 μL में वायरस स्टॉक को पतला करके वायरस इनोकुलम तैयार करें।
      नोट: एमडीसीके कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, वायरस इनोकुलम को टोसिल फेनिलएलनिल क्लोरोमेथिल कीटोन (टीपीसीके)-ट्रिप्सिन के साथ 1 μg / mL की अंतिम सांद्रता पर पूरक करें।
  5. कोशिकाओं (चरण 1.3) से पुराने संस्कृति माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को सीरम मुक्त एमईएम 2 एक्स के 1 एमएल / वेल के साथ धोएं।
  6. कोशिकाओं में 400 μL वायरस इनोकुलम (चरण 1.4.1) जोड़ें और उन्हें 5%CO2 वातावरण के तहत 35 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. इस बीच, सीरम-मुक्त एमईएम7 में क्रमशः40μM, 20 mM, या 10 μM की अंतिम सांद्रता पर एक कैसपेज़ अवरोधक (जैसे, Z-DEVD-FMK), एक लाइसोसोम अवरोधक (जैसे, NH 4 Cl), या एक प्रोटीसम अवरोधक (जैसे, MG132) (सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें। बाद के दो अवरोधक एक नियंत्रण के रूप में काम करते हैं। विलायक (यदि पानी के अलावा अन्य) की एक समान मात्रा को पतला करें जिसका उपयोग मॉक के रूप में सीरम-मुक्त माध्यम में अवरोधकों में से एक को पुनर्गठित करने के लिए किया जाता है।
  8. वायरस इनोकुलम को हटा दें और चरण 1.5 (1x) के रूप में कोशिकाओं को धो लें।
  9. कोशिकाओं में सीरम-मुक्त एमईएम, 1 एमएल / वेल, मॉक या अवरोधक के साथ पूरक जोड़ें और चरण 1.6 में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इस समय बिंदु को 0 एच संक्रमण माना जाता है।
  10. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 1 एमएल सिरिंज प्लंजर (रबर साइड) के साथ स्क्रैप करके काट लें और उन्हें 1.5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  11. कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट के लिए ट्यूब को 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट एकत्र करें।
    नोट: इस सतह पर तैरने वाले को छोड़ दिया जा सकता है या जारी वायरस संतान के टिटर को मापने के लिए पट्टिका परख8 के लिए उपयोग किया जा सकता है।
  12. चरण 1.11 में पुन: सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सेल पेलेट को फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 250 μL से धोएं।
  13. सेल लाइसिस बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल, पीएच 7.4, 150 एमएम एनएसीएल, 0.5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट, 1% ट्राइटन एक्स -100, और 1 एक्स प्रोटीज इनहिबिटर, सामग्री की तालिका देखें) और भंवर के 80-100 μL को जोड़कर कोशिकाओं को हटा दें।
  14. ट्यूब को 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें ताकि कुल सेल लाइसेट तैयार हो सके। अगले दिन चरण 1.15-1.17 करने के लिए लाइसेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, लेकिन, सर्वोत्तम परिणामों के लिए, इन चरणों को उसी दिन समाप्त करें।
  15. बीसीए परख किट का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में प्रोटीन की मात्रा का अनुमान लगाएं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  16. आणविकभार मार्कर 11 के साथ मानक एसडीएस-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज)11 द्वारा असंक्रमित और संक्रमित नमूनों से प्रोटीन की समान मात्रा को हल करें।
  17. प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज या पॉलीविनाइलडिडेन डाइफ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: पीवीडीएफ झिल्ली कुछ पश्चिमी धब्बा इमेजर्स में एक उच्च पृष्ठभूमि दे सकती है; संगतता की जाँच करें.
  18. कहीं और वर्णित विधि का उपयोग करके रुचि के प्रोटीन का पता लगाने के लिए पश्चिमीसोख्ता करें 11.
  19. मॉक-उपचारित और अवरोधक-उपचारित संक्रमित नमूना लेन में प्रोटीन के स्तर की तुलना करें।
    नोट: यदि प्रोटीन का स्तर कैसपेज़ अवरोधक-उपचारित संक्रमित नमूना लेन में ठीक हो गया है, तो प्रोटीन कैसपेस द्वारा क्लीवर या अवक्रमित हो जाता है। अन्यथा, यह लाइसोसोम या प्रोटीसम द्वारा नीचा दिखाया जाता है।
  20. एक ही प्रयोग के कम से कम तीन प्रतिकृतियों से प्रत्येक लेन में इसकी बैंड तीव्रता को मापकर और संबंधित लोडिंग नियंत्रण बैंड के साथ इसे सामान्य करके प्रोटीन वसूली की मात्रा निर्धारित करें।
  21. पश्चिमी धब्बों की छवि बनाने और प्रोटीन वसूली को निर्धारित करने के लिए किसी भी समकालीन इमेजर और संबंधित सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।

2. आरएनए हस्तक्षेप द्वारा आईएवी-संक्रमित कोशिकाओं में कैसपेस-मध्यस्थता दरार या प्रोटीन के क्षरण की पुष्टि

  1. कैनाइन या मानव कैसपेज़ 3, कैसपेज़ 6, और कैसपेज़ 7 (निष्पादनकर्ता कैसपेज़1) और एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण सीआरएनए ( सामग्री की तालिका देखें) को लक्षित करने वाले एक पूर्व-डिजाइन छोटे-हस्तक्षेप आरएनए (सीआरएनए) को डिजाइन या प्राप्त करें।
  2. रिवर्स अभिकर्मक 8,11 द्वारा एमडीसीके या ए 549 कोशिकाओं को प्रत्येक सीआरएनए वितरित करें।
  3. इसके लिए, अलग-अलग ट्यूबों में 100 एनएम नियंत्रण सीआरएनए या कैसपेस सीआरएनए या अभिकर्मक अभिकर्मक की अनुशंसित मात्रा ( सामग्री की तालिका देखें) को उपयुक्त माध्यम के 100 μL में पतला करें (जैसे ऑप्टिमेम, सामग्री की तालिका देखें), और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. डुप्लिकेट में प्रत्येक कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
    नोट: इस डुप्लिकेट में आरटी-क्यूपीसीआर या वेस्टर्न ब्लॉटिंग (यदि कैसपेस के एंटीबॉडी उपलब्ध हैं) द्वारा कैसपेस अभिव्यक्ति के वध का विश्लेषण करने के लिए एक प्रतिकृति शामिल है और दूसरी पश्चिमी सोख्ता द्वारा रुचि के प्रोटीन की वसूली का आकलन करने के लिए है।
  5. प्रत्येक सीआरएनए घोल के 100 μL को अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान (चरण 2.3) के 100 μL के साथ मिलाएं और सीआरएनए-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 20-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. इस बीच, विभाजित करें और पूर्ण विकास माध्यम के 800 μL में 1 x 105 MDCK या A549 कोशिकाओं को जोड़ें, 200 μL siRNA-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर (चरण 2.5) के साथ मिलाएं, और 12-वेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में निलंबन के 1 एमएल जोड़ें। यह कमजोर पड़ने से नियंत्रण सीआरएनए या कैसपेस सीआरएनए की अंतिम एकाग्रता 10 एनएम तक आ जाती है।
  7. कोशिकाओं को72 घंटे के लिए 5% सीओ 2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  8. चरण 1.10 में एक प्रतिकृति से कोशिकाओं को काटें, और मानक विधियों और प्रोटोकॉल 8,11 का उपयोग करके क्रमशः आरटी-क्यूपीसीआर या वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा कैस्पेस 3, कैसपेज़ 6 और कैसपेज़ 7 की अभिव्यक्ति के वध को मान्य या पुष्टि करने के लिए उन्हें संसाधित करें।
  9. चरण 1.4-1.9 (अवरोधकों के बिना) में वर्णित आईएवी के साथ दूसरे प्रतिकृति में कोशिकाओं को संक्रमित करें।
  10. 24 घंटे के बाद, पश्चिमी सोख्ता द्वारा कोशिकाओं की कटाई, प्रक्रिया और विश्लेषण करें और चरण 1.10-1.20 में वर्णित प्रोटीन वसूली को मापें और मात्रा निर्धारित करें।

3. पॉलीपेप्टाइड में कैसपेस क्लीवेज साइट (ओं) का पता लगाने के लिए साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस

  1. स्तनधारी अभिव्यक्ति प्लास्मिड11 में रुचि के जीन-एन्कोडिंग प्रोटीन को क्लोन करें या इसे अनुसंधान प्रयोगशाला या वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: यह पसंद किया जाता है यदि जीन को एपिटोप टैग के साथ या जीएफपी संलयन के रूप में क्लोन किया जाता है ताकि एक्टोपिक रूप से व्यक्त पॉलीपेप्टाइड को पश्चिमी सोख्ता के दौरान अंतर्जात रूप से व्यक्त किया जा सके।
  2. कैसपेज़ सब्सट्रेट डेटाबेस4 या प्रोटीन संरेखण उपकरण का उपयोग करके, पॉलीपेप्टाइड पर आम सहमति कैसपेज़ क्लीवेज रूपांकनों, XXXD और DXXD का पता लगाएं। लगभग सभी कैसपेस क्लीवेज रूपांकनों में दरार साइट (पी 1) 3,4 पर एस्पार्टिक एसिड होता है।
  3. मानक तरीकों और प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीएनए अनुक्रमण 11 के बाद साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस द्वारा ग्लूटामिक एसिड या एक गैर-ध्रुवीय अमीनो एसिड (एलानिन, वैलिन) में कथित पी1 एस्पार्टिक एसिड को उत्परिवर्तित करें।
  4. रिवर्स अभिकर्मक11 द्वारा एमडीसीके या ए 549 कोशिकाओं को जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) और उत्परिवर्ती प्लास्मिड डीएनए वितरित करें।
    1. इसके लिए, अलग-अलग ट्यूबों में एक उपयुक्त माध्यम (चरण 2.3 और सामग्री की तालिका देखें) के 100 μL में प्लास्मिड डीएनए के 2 μg या अभिकर्मक अभिकर्मक की अनुशंसित मात्रा को पतला करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. प्रत्येक प्लास्मिड डीएनए समाधान के 100 μL को अभिकर्मक अभिकर्मक समाधान के 100 μL के साथ मिलाएं और डीएनए-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 20-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. इस बीच, विभाजित करें और पूर्ण विकास माध्यम के800 μL में 3 x 10 5 MDCK या A549 कोशिकाओं को जोड़ें, डीएनए-अभिकर्मक अभिकर्मक परिसर के 200 μL के साथ मिलाएं, और 12-वेल कल्चर प्लेट के कुएं में 1 एमएल निलंबन जोड़ें।
  6. 5%CO2 वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  7. 48 घंटे के बाद, चरण 1.4-1.9 (अवरोधकों को जोड़े बिना) में वर्णित आईएवी के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें।
  8. 24 घंटे के बाद, पश्चिमी सोख्ता द्वारा कोशिकाओं की कटाई, प्रक्रिया और विश्लेषण करें (यदि लागू हो, तो एंटीबॉडी को एपिटोप टैग या जीएफपी में उपयोग करना)। फिर, चरण 1.10-1.20 में वर्णित प्रोटीन वसूली को मापें और मात्रा निर्धारित करें।

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Representative Results

कैसपेज़ 3 अवरोधक के साथ उपचार
यह पता चला है कि मेजबान कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4, और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड्स कैनाइन (एमडीसीके) और मानव (ए 549, एनएचबीई) कोशिकाओं 7,8,9 दोनों में आईएवी संक्रमणके जवाब में गिरावट से गुजरते हैं। उपरोक्त दृष्टिकोणों का उपयोग करके, यह पता चला कि आईएवी-प्रेरित मेजबान कैसपेस, विशेष रूप से कैसपेज़ 3, उनके क्षरण 7,8,9 का कारण बनते हैं। कोर्टैक्टिन को संक्रमण की खुराक और समय-निर्भर तरीके से और एक मेजबान सेल- और आईएवी स्ट्रेन-स्वतंत्र तरीके से अवक्रमितकिया गया था। इसी तरह के परिणाम एचडीएसी 48 और एचडीएसी 69 के लिए प्राप्त किए गए थे। दिलचस्प बात यह है कि सभी तीन मेजबान प्रोटीनों का क्षरण वायरल एनपी 7,8,9 के दरार के साथ मेल खाता है, जिसे कैसपेज़-मध्यस्थता दरार14 से गुजरने के लिए जाना जाता है। इस प्रकार, यह अनुमान लगाया गया था कि कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4, और एचडीएसी 6 भी कैसपेज़-मध्यस्थता दरार और बाद में गिरावट से गुजरते हैं। इसका परीक्षण करने के लिए, सबसे पहले, आईएवी-संक्रमित कोशिकाओं को कैसपेज़ 3 अवरोधक के साथ इलाज किया गया था, और पश्चिमी सोख्ता द्वारा कोर्टैक्टिन, एचडीएसी 4 और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड्स के बचाव का विश्लेषण किया गया था। सभी तीन पॉलीपेप्टाइड्स (साथ ही वायरल एनपी) कैसपेज़ 3 अवरोधक उपचार 7,8,9 के बाद आईएवी संक्रमण-प्रेरित गिरावट से उबर गए। कोर्टैक्टिन के लिए प्रतिनिधि डेटा7 चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। इस वसूली को प्रोटीन बैंड की तीव्रता को मापकर और संबंधित एक्टिन (लोडिंग नियंत्रण) बैंड के मूल्य से कोर्टाक्टिन बैंड के मूल्य को सामान्य करके निर्धारित किया गया था। इसके बाद, संक्रमित नमूनों में इसके मूल्य को निर्धारित करने के लिए संबंधित असंक्रमित नमूनों में कोर्टाक्टिन के सामान्यीकृत मूल्य को 100% माना गया। इस मात्रा निर्धारण विधि ने कैस्पेज़ 3 अवरोधक-उपचारित संक्रमित कोशिकाओं में कोर्टाक्टिन पॉलीपेप्टाइड की वसूली को अनुपचारित संक्रमित कोशिकाओं में 20.7% से 78.8% के रूप में जिम्मेदारठहराया (चित्रा 1 बी)।

कैसपेज़ 3 अभिव्यक्ति के आरएनए हस्तक्षेप-मध्यस्थता वध
इसके बाद, एक आनुवंशिक उपकरण, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) को नियोजित किया गया था, इसके बाद कॉर्टैक्टिन11 और एचडीएसी 4 8 के आईएवी संक्रमण-प्रेरित गिरावट में कैसपेस की भूमिका की पुष्टि करने के लिए पश्चिमीसोख्ता का उपयोग किया गया था। कैसपेज़ 3-क्षीण कोशिकाओं (चित्रा 2 सी) 11 में, कॉर्टैक्टिन (चित्रा 2 ए) 11 और एचडीएसी 48 पॉलीपेप्टाइड्स दोनों आईएवी संक्रमण-प्रेरित गिरावट से ठीक हो गए। हालांकि, कैसपेज़ 6- या कैसपेज़ 7-क्षीण कोशिकाओं (चित्रा 2 सी) 11 में, कोर्टाक्टिन पॉलीपेप्टाइड स्तरों में कोई महत्वपूर्ण वसूली नहीं देखी गई (चित्रा 2 ए)11)। विशेष रूप से, जब मात्रा निर्धारित की जाती है और ऊपर उल्लिखित संबंधित असंक्रमित कोशिकाओं में उनके स्तर की तुलना की जाती है, तो कम कैसपेस 3 अभिव्यक्ति के साथ संक्रमित कोशिकाओं में कोर्टाक्टिन पॉलीपेप्टाइड स्तर सामान्य कैसपेज़ 3 अभिव्यक्ति (चित्रा 2 बी) 11 के साथ संक्रमित कोशिकाओं में 28.6% से 83% तक ठीक हो गया।

कोर्टैक्टिन और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड्स में कैसपेस क्लीवेज रूपांकन
अंत में, कोर्टैक्टिन और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड्स में अमीनो एसिड अनुक्रम की जांच की गई और, कथित कैसपेस क्लीवेज रूपांकनों में, पी 1 स्थिति पर एस्पार्टिक एसिड को ग्लूटामिक एसिड 9,11 में उत्परिवर्तित किया गया था। इस दृष्टिकोण ने कॉर्टैक्टिन पॉलीपेप्टाइड 11 में एस्पार्टिक एसिड116 और एचडीएसी 6 पॉलीपेप्टाइड9 में एस्पार्टिक एसिड 1088 को कैसपेस क्लीवेज साइट के रूप में पहचाना। ग्लूटामिक एसिड के लिए एस्पार्टिक एसिड अवशेषों दोनों के उत्परिवर्तन ने कोर्टैक्टिन (चित्रा 3 ए) 11 और एचडीएसी 69 पॉलीपेप्टाइड्स को आईएवी संक्रमण-प्रेरित गिरावट के लिए प्रतिरोधी बना दिया। विशेष रूप से, जब मात्रा निर्धारित की गई और ऊपर उल्लिखित संबंधित असंक्रमित कोशिकाओं में उनके स्तर की तुलना की गई, तो संक्रमित कोशिकाओं में प्लास्मिड-व्यक्त उत्परिवर्ती कोर्टैक्टिन पॉलीपेप्टाइड का स्तर 77.9% था, जबकि संक्रमित कोशिकाओं में प्लास्मिड-व्यक्त जंगली-प्रकार कॉर्टैक्टिन पॉलीपेप्टाइड का स्तर 23.6% था (चित्रा 3 बी)11।

Figure 1
चित्र 1: कोर्टाक्टिन पॉलीपेप्टाइड आईएवी-संक्रमित कोशिकाओं में कैसपेज़ 3-मध्यस्थता गिरावट से गुजरता है। (A) एमडीसीके कोशिकाओं को 0.5 के MOI पर इन्फ्लूएंजा वायरस A/ न्यू कैलेडोनिया / 20/1999 / H1N1 तनाव से संक्रमित किया गया था और बाद में नकली या कैस्पेस 3 अवरोधक (Cas3-I, 40 μM) के साथ इलाज किया गया था। 24 घंटे के बाद, पश्चिमी सोख्ता द्वारा कुल सेल लाइसेट में कोर्टैक्टिन, वायरल एनपी और एक्टिन पॉलीपेप्टाइड्स का पता लगाया गया था। यूएनआई, असंक्रमित; आईएनएफ, संक्रमित। तीर पूर्ण लंबाई और क्लीवर एनपी को इंगित करते हैं। (बी) कोर्टैक्टिन और एक्टिन बैंड की तीव्रता निर्धारित की गई थी। फिर, कोर्टाक्टिन के मूल्य को एक्टिन के मूल्य के साथ सामान्यीकृत किया गया था। यूएनआई नमूनों में कोर्टाक्टिन की सामान्यीकृत मात्रा को संबंधित आईएनएफ नमूनों में इसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए 100% माना गया था। प्रस्तुत डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों के एसई ± साधन हैं। पी = 0.0006, दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके गणना की जाती है। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। इस आंकड़े को चेन एट अल.7 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: कैसपेज़ 3 अभिव्यक्ति के वध ने IAV-संक्रमित कोशिकाओं में कॉर्टैक्टिन पॉलीपेप्टाइड क्षरण को बचाया। (A) A549 कोशिकाओं को 10 nM नियंत्रण (Ctrl), Caspase 3 (Cas3), Caspase 6 (Cas6), या Caspase 7 (Cas7) SIRNA के साथ डुप्लिकेट में स्थानांतरित किया गया था। 72 घंटे के बाद, एक प्रतिकृति में कोशिकाओं को काटा गया और कुल आरएनए निकालने के लिए संसाधित किया गया। अन्य प्रतिकृति में कोशिकाएं 3.0 के एमओआई पर इन्फ्लूएंजा वायरस ए / डब्ल्यूएसएन / 1933 / एच 1 एन 1 उपप्रकार से संक्रमित थीं। 24 घंटे के बाद, पश्चिमी सोख्ता द्वारा कोर्टैक्टिन, वायरल एनपी और एक्टिन पॉलीपेप्टाइड्स का पता लगाया गया था। यूएनआई, असंक्रमित; आईएनएफ, संक्रमित। (बी) कोर्टाक्टिन और एक्टिन बैंड की तीव्रता को निर्धारित किया गया था, और कोर्टाक्टिन के मूल्य को एक्टिन के मूल्य के साथ सामान्यीकृत किया गया था। फिर, यूएनआई नमूनों में कोर्टाक्टिन की सामान्यीकृत मात्रा को संबंधित आईएनएफ नमूनों में इसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए 100% माना गया था। प्रस्तुत डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों के एसई ± साधन हैं। P < 0.0001, ***P = 0.0007, ***P = 0.0002, दो-तरफ़ा ANOVA का उपयोग करके गणना की जाती है। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। (सी) ऊपर निकाले गए कुल आरएनए को सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था, जिसे तब आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा कैसपेज़ 3, कैसपेज़ 6, कैसपेज़ 7 और एक्टिन एमआरएनए स्तरों का पता लगाने के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया गया था। एक्टिन एमआरएनए स्तर का उपयोग एक संदर्भ के रूप में किया गया था, और नियंत्रण सीआरएनए (सीटीआरएल) और संबंधित कैसपेज़ सीआरएनए (सीएएस) ट्रांसक्रिप्टेड कोशिकाओं में प्रत्येक कैसपेज़ के एमआरएनए स्तर की गणना मानक 2-3सीटी विधि का उपयोग करके की गई थी। पी < 0.0001, दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके गणना की गई। इस आंकड़े को चेन एट अल.11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एस्पार्टिक एसिड 116 से ग्लूटामिक एसिड के उत्परिवर्तन ने कॉर्टैक्टिन पॉलीपेप्टाइड को आईएवी संक्रमण-प्रेरित गिरावट के लिए प्रतिरोधी बना दिया। (A) एमडीसीके कोशिकाओं को जंगली-प्रकार (WT) या उत्परिवर्तित (D116E) GFP-cortactin संलयन को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड के साथ स्थानांतरित किया गया था। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 3.0 के एमओआई पर इन्फ्लूएंजा वायरस ए / डब्ल्यूएसएन / 1933 / एच 1 एन 1 उपप्रकार से संक्रमित किया गया था। 24 घंटे के बाद, पश्चिमी सोख्ता द्वारा जीएफपी-कोर्टैक्टिन, वायरल एनपी और एक्टिन पॉलीपेप्टाइड्स का पता लगाया गया था। यूएनआई, असंक्रमित; आईएनएफ, संक्रमित। (बी) कोर्टाक्टिन और एक्टिन बैंड की तीव्रता को निर्धारित किया गया था, और कोर्टाक्टिन के मूल्य को एक्टिन के मूल्य के साथ सामान्यीकृत किया गया था। फिर, यूएनआई नमूनों में कोर्टैक्टिन की सामान्यीकृत मात्रा को संबंधित आईएनएफ नमूनों में इसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए 100% माना गया था। प्रस्तुत डेटा तीन जैविक प्रतिकृतियों के एसई ± साधन हैं। ** पी = 0.001, दो-तरफा एनोवा का उपयोग करके गणना की जाती है। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। इस आंकड़े को चेन एट अल.11 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह स्थापित किया गया है कि वायरस अपने लाभ के लिए मेजबान कारकों और मार्गों को तैयार करते हैं। बदले में, मेजबान कोशिकाएं विभिन्न रणनीतियों को नियोजित करके इसका विरोध करती हैं। उन रणनीतियों में से एक पीएनोप्टोसिस है, जिसे मेजबान कोशिकाएं वायरस संक्रमण के खिलाफ एंटीवायरल रणनीति के रूप में उपयोग करती हैं। हालांकि, आईएवी जैसे वायरस ने पीएनोप्टोसिस का मुकाबला करने और इसे अपने लाभके लिए फायदा उठाने के लिए अपनी रणनीतियों को विकसित किया है। इस अंतःक्रिया में कैसपेस द्वारा विभिन्न मेजबान और वायरल प्रोटीन की दरार शामिल है। सब्सट्रेट प्रोटीन में उन कैसपेस और उनके दरार साइटों की पहचान करना इस तरह के अंतःक्रिया के तंत्र और महत्व को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है।

इसके लिए, मेजबान कोर्टाक्टिन, एचडीएसी 4 और एचडीएसी 6 7,8,9,11 में कैसपेस और उनके दरार साइटों की पहचान करने के लिए मानक जैव रासायनिक और आणविक तरीकों का उपयोग किया गया था। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग इन्फ्लूएंजा वायरस, अन्य स्तनधारी वायरस, अन्य रोगाणुओं और विषाक्त पदार्थों और रसायनों जैसे बाहरी उत्तेजनाओं से जुड़े ऐसे अध्ययनों के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इन विधियों को प्रासंगिक कौशल के साथ एक मानक आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में दोहराया जा सकता है और विशेष उपकरण और सॉफ्टवेयर प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है। वेस्टर्न ब्लॉटिंग और आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना मात्रा उत्पन्न करने के लिए 12-वेल सेल कल्चर प्लेट प्रारूप को इन और इसी तरह के अध्ययनों के लिए सफलतापूर्वक अनुकूलित किया गया था। फिर भी, आवश्यकतानुसार, इस प्रारूप को तदनुसार कम या उन्नत किया जा सकता है। पहली बार कैसपेज़ अवरोधक को शामिल करने वाला एक प्रयोग करते समय, लाइसोसोम और प्रोटीसम अवरोधक के साथ पैन-कैसपेज़ अवरोधक (जेड-वीएडी-एफएमके) का उपयोग करके यह आकलन करने का सुझाव दिया जाता है कि क्या रुचि का प्रोटीन कैसपेज़-मध्यस्थता गिरावट से गुजरता है। इसके अलावा, एनएच4सीएल और एमजी 132 के अलावा, क्रमशः बाफिलोमाइसिन ए और एपॉक्सोमिसिन जैसे अन्य लाइसोसोम और प्रोटीसम अवरोधकों का उपयोग किया जा सकता है। पैन-कैसपेज़ अवरोधक के साथ सकारात्मक परिणामों के बाद, या तो व्यक्तिगत कैसपेस के विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग किया जा सकता है, या आरएनए हस्तक्षेप को नियोजित किया जा सकता है। पूर्व के लिए, लक्ष्य सेल प्रकार और गैर-विशिष्ट परिणामों के लिए विषाक्तता से बचने के लिए प्रभावी निरोधात्मक सांद्रता को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।

कैसपेस की भागीदारी की पुष्टि करने के लिए आरएनए हस्तक्षेप या सीआरआईएसपीआर जैसे आनुवंशिक उपकरण को नियोजित किया जाना चाहिए क्योंकि अवरोधक क्रॉस-रिएक्शन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, सभी ज्ञात कैसपेस को लक्षित करने वाले आरएनए हस्तक्षेप या सीआरआईएसपीआर स्क्रीन को व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है। सभी ज्ञात कैसपेस के लिए सीआरएनए, जीआरएनए और आरटी-क्यूपीसीआर प्राइमर जोड़े को ऑनलाइन टूल का उपयोग करके पूर्व-डिज़ाइन या डिज़ाइन के रूप में खरीदा जा सकता है। इसके अलावा, पॉलीपेप्टाइड्स के अनुक्रमिक या सहकारी दरार का आकलन करने के लिए दो या दो से अधिक कैसपेस को एक साथ समाप्त किया जा सकता है (इस रणनीति का उपयोग हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में किया गया था)। माना जाता है कि आरएनए हस्तक्षेप वायरस-होस्ट सेल इंटरैक्शन अनुसंधान के लिए एक आदर्श उपकरण है। उत्तरार्द्ध को मेजबान जीन अभिव्यक्ति के नियंत्रित हेरफेर की आवश्यकता होती है ताकि मेजबान कोशिकाएं वायरस संक्रमण के लिए अपेक्षाकृत व्यवहार्य रहें और उस हेरफेर के फेनोटाइप को प्रदर्शित करने के लिए जीवन चक्र को पूरा करें। हालांकि, बाद के संक्रमण के लिए इष्टतम वध और व्यवहार्यता अनुपात के लिए प्रत्येक सेल प्रकार के लिए एक प्रभावी सीआरएनए एकाग्रता और सीआरएनए-अभिकर्मक अभिकर्मक संयोजन को अनुकूलित करना आवश्यक है।

कथित कैसपेस दरार रूपांकनों का पता लगाने के लिए, कई डेटाबेस जैसे CASBAH18, CaspDB19, CutDB20, DegraBase21, MEROPS22, और TopFIND23,24 विकसित किए गए हैं। एचडीएसी 6 पॉलीपेटाइड9 पर इन रूपांकनों का पता लगाने के लिए एक दृश्य स्क्रीनिंग की गई थी, लेकिन कोर्टैक्टिन11 के लिए, कैस्पडीबी का उपयोग किया गया था (हालांकि कैस्पडीबी वेबसाइट हाल ही में दुर्गम रही है)। पी 1 एस्पार्टिक एसिड को ग्लूटामिक एसिड में परिवर्तित करके उन रूपांकनों को कैसपेस क्लीवेज साइटों के रूप में सफलतापूर्वक पुष्टि की गई थी। हालांकि, एस्पार्टिक एसिड को पहले एक गैर-ध्रुवीय अमीनो एसिड जैसे एलानिन या वैलिन में परिवर्तित करने का सुझाव दिया जाता है क्योंकि कुछ कैसपेस पी 1 ग्लूटामिक एसिड4 के बाद छोड़ सकते हैं। इस अभ्यास के परिणामस्वरूप तुरंत कैसपेस क्लीवेज साइट (ओं) की पहचान हो सकती है, लेकिन यदि लक्ष्य पॉलीपेप्टाइड एस्पार्टिक एसिड में समृद्ध है और कथित लक्ष्य रूपांकन गैर-कैननिकल हैं तो दसियों उत्परिवर्ती उत्पन्न करने की आवश्यकता हो सकती है। कोशिकाओं को प्लास्मिड (और सीआरएनए) के वितरण के लिए, रिवर्स के बजाय आगे, अभिकर्मक किया जा सकता है। इसके अलावा, संक्रमण की खुराक और समय कैनेटीक्स को पॉलीपेप्टाइड्स के क्षरण कैनेटीक्स का आकलन करने और किसी भी छोटे आकार के दरार उत्पादों की पहचान करने के लिए पश्चिमी सोख्ता के लिए 4% -20% ग्रेडिएंट एसडीएस-पेज का उपयोग करके किया जाना चाहिए। अंत में, प्रत्यक्ष कैसपेज़ सब्सट्रेट के रूप में रुचि के प्रोटीन की पुष्टि करने के लिए, शुद्ध कैसपेस और लक्ष्य प्रोटीन (डब्ल्यूटी या उत्परिवर्ती) और किसी भी कोफ़ैक्टर्स वाले इन विट्रो जैव रासायनिक परख विकसित किए जा सकते हैं।

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Disclosures

लेखक के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक जेनिफर टिपर, बिलन ली, जेसी वैनवेस्ट्रिनेन, केविन हैरोड, दा-युआन चेन, फरजाना अहमद, सोन्या मोरोस, केनेथ यामादा, रिचर्ड वेबबी, बीईआई रिसोर्सेज (एनआईएआईडी), न्यूजीलैंड की स्वास्थ्य अनुसंधान परिषद, मौरिस और फिलिस पेकेल ट्रस्ट (न्यूजीलैंड), एचएस और जेसी एंडरसन ट्रस्ट (डुनेडिन), और माइक्रोबायोलॉजी और इम्यूनोलॉजी विभाग और बायोमेडिकल साइंसेज (ओटागो विश्वविद्यालय) को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 185
इन्फ्लुएंजा ए वायरस संक्रमण के दौरान प्रोटीन को छोड़ने वाले कैसपेस और उनके रूपांकनों की पहचान करना
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Husain, M. Identifying Caspases and… More

Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

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