Summary
Influensa A-virus (IAV) -infektion aktiverar de caspaser som klyver värd- och virusproteiner, som i sin tur har pro- och antivirala funktioner. Genom att använda hämmare, RNA-interferens, platsriktad mutagenes och western blotting- och RT-qPCR-tekniker identifierades kaspaser i infekterade däggdjursceller som klyver värdkortaktin och histondeacetylaser.
Abstract
Caspaser, en familj av cysteinproteaser, orkestrerar programmerad celldöd som svar på olika stimuli, inklusive mikrobiella infektioner. Ursprungligen beskrivet att inträffa genom apoptos, är programmerad celldöd nu känd för att omfatta tre sammankopplade vägar: pyroptos, apoptos och nekroptos, tillsammans myntade som en process, PANoptosis. Påverkan A-virusinfektion (IAV) inducerar PANoptos i däggdjursceller genom att inducera aktivering av olika caspaser, som i sin tur klyver olika värd- såväl som virala proteiner, vilket leder till processer som aktivering av värdens medfödda antivirala svar eller nedbrytning av antagonistiska värdproteiner. I detta avseende har kaspas-3-medierad klyvning av värdkortatin, histondeacetylas 4 (HDAC4) och histondeacetylas 6 (HDAC6) upptäckts i både djur- och humanepitelceller som svar på IAV-infektionen. För att demonstrera detta användes hämmare, RNA-interferens och platsriktad mutagenes, och därefter mättes klyvningen eller motståndet mot klyvning och återvinning av kortattin-, HDAC4- och HDAC6-polypeptider med western blotting. Dessa metoder, i kombination med RT-qPCR, bildar en enkel men effektiv strategi för att identifiera värden såväl som virala proteiner som genomgår kaspasmedierad klyvning under en infektion av IAV eller andra mänskliga och djurvirus. I detta protokoll utvecklas de representativa resultaten av denna strategi, och sätten att göra den mer effektiv diskuteras också.
Introduction
Influensa A-virus (IAV) är den prototypiska medlemmen i familjen Orthomyxoviridae och är känd för att orsaka globala epidemier och oförutsägbara pandemier. IAV orsakar mänsklig andningssjukdom, influensa, allmänt känd som "influensa". Influensan är en akut sjukdom som resulterar i induktion av värdpro- och antiinflammatoriska medfödda immunsvar och död av epitelceller i människans luftvägar. Båda processerna styrs av ett fenomen som kallas programmerad celldöd1. Signaleringen för programmerad celldöd induceras så snart olika patogenigenkänningsreceptorer känner av de inkommande viruspartiklarna i värdceller. Detta leder till programmering av infekterade cellers död och signalering till de närliggande friska cellerna genom tre sammankopplade vägar som kallas pyroptos, apoptos och nekroptos - nyligen myntade som en process, PANoptosis1.
PANoptos involverar proteolytisk bearbetning av många värd- och virusproteiner från induktion till utförande. Sådan bearbetning av proteiner leds främst av en familj av cysteinproteaser som kallas caspaser 1,2. Upp till 18 caspaser (från caspase 1 till caspase 18) är kända3. De flesta caspaser uttrycks som pro-caspaser och aktiveras genom att genomgå sin egen proteolytiska bearbetning antingen genom autokatalys eller andra caspaser4 som svar på en stimulans som en virusinfektion. PANoptosen av IAV-infekterade celler ansågs vara en värdförsvarsmekanism, men IAV har utvecklat sätt att undvika och utnyttja den för att underlätta dess replikation 1,2,5,6. En av dem är att motverka värdfaktorerna via kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning som antingen i sig är antivirala eller stör ett av stegen i IAV-livscykeln. För detta ändamål har värdfaktorer, kortatin, HDAC4 och HDAC6 upptäckts genomgå kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning i IAV-infekterade epitelceller 7,8,9. HDAC4 och HDAC6 är anti-IAV-faktorer 8,10, och kortaktin stör IAV-replikation i ett senare infektionsstadium, potentiellt under viral montering och spirande 11.
Dessutom aktiveras olika caspaser, som i sin tur klyver flera proteiner för att aktivera värdens inflammatoriska svar under IAV-infektion 1,2. Vidare genomgår nukleoprotein (NP), jonkanal M2-protein av IAV 12,13,14 och olika proteiner från andra virus 3,15,16 också kaspasmedierad klyvning under infektion, vilket påverkar viral patogenes. Därför finns det ett kontinuerligt behov av att studera kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning av värd- och virusproteiner under IAV och andra virusinfektioner för att förstå den molekylära grunden för viral patogenes. Häri presenteras metoderna för att (1) bedöma klyvningen eller nedbrytningen av sådana proteiner genom caspaser, (2) identifiera dessa caspaser och (3) lokalisera klyvningsställena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Myndighetsgodkännanden erhölls från University of Otago Institutional Biological Safety Committee för att arbeta med IAV- och däggdjursceller. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) eller humana lungalveolära epitelceller A549 och IAV H1N1-subtyper användes för denna studie. IAV odlades i kycklingägg, som beskrivs på andra ställen17. Sterila och aseptiska förhållanden användes för att arbeta med däggdjursceller, och en biosäkerhetsnivå 2 (eller fysisk inneslutning 2) och klass II biosäkerhetsskåp användes för att arbeta med IAV-undertyper.
1. Bedömning av klyvning eller nedbrytning av proteiner i IAV-infekterade celler med kaspaser
- Frö 3 x 105 MDCK- eller A549-celler per brunn i en 12-brunns cellodlingsplatta.
OBS: Om du använder MDCK-celler, se till att antikroppen mot proteinet av intresse känner igen dess hundarter. - Frö brunnarna i par, dvs. ett kontrollpar-en brunn för det oinfekterade-mock-provet och en för det infekterade-mock-provet-och ett testpar-en brunn för oinfekterad-hämmare A-prov och en för det infekterade inhibitor-A-provet. Öka antalet par med varje ytterligare hämmare (se referenserna 7,8).
- Inkubera cellerna vid 37 °C under en 5% CO2-atmosfär över natten.
- Nästa dag, infektera cellerna med IAV (en H1N1-subtyp eller annan subtyp).
- Bered virusinokulum för detta ändamål genom att späda ut virusstammen i 400 μl serumfritt minsta essentiella medium (MEM) (se materialförteckning) vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 0,5–3,0 plackbildande enheter (pfu)/cell 7,11 (en faktor för fördubbling av cellantalet vid beräkning av MOI).
OBS: För att infektera MDCK-celler, komplettera virusinokulum med tosylfenylalanylklormetylketon (TPCK) -trypsin i en slutlig koncentration av 1 μg / ml.
- Bered virusinokulum för detta ändamål genom att späda ut virusstammen i 400 μl serumfritt minsta essentiella medium (MEM) (se materialförteckning) vid en multiplicitet av infektion (MOI) på 0,5–3,0 plackbildande enheter (pfu)/cell 7,11 (en faktor för fördubbling av cellantalet vid beräkning av MOI).
- Ta bort det gamla odlingsmediet från cellerna (steg 1.3) och tvätta cellerna med 1 ml/brunn serumfritt MEM 2x.
- Tillsätt 400 μl virusinokulum (steg 1.4.1) till cellerna och inkubera dem i 1 timme vid 35 °C under en 5 % CO2-atmosfär .
- Under tiden späds en kaspashämmare (t.ex. Z-DEVD-FMK), en lysosomhämmare (t.ex.NH4Cl) eller en proteasomhämmare (t.ex. MG132) (se materialtabell) vid en slutlig koncentration av 40 μM, 20 mM respektive 10 μM i serumfritt MEM7 (se materialtabell). De två senare hämmarna fungerar som en kontroll. Späd en lika stor volym av lösningsmedlet (om annat än vatten) som används för att rekonstituera en av hämmarna i serumfritt medium som ett hån.
- Ta bort virusinokulum och tvätta cellerna som i steg 1.5 (1x).
- Tillsätt den serumfria MEM, 1 ml/brunn, mock eller kompletterad med en hämmare, till cellerna och inkubera cellerna som i steg 1.6. Denna tidpunkt betraktas som 0 h infektion.
- Efter 24 timmar, skörda cellerna genom att skrapa dem med en 1 ml sprutkolv (gummisidan) och överför dem till ett 1,5 ml polypropenrör.
- Centrifugera röret vid 12 000 x g i 1-2 min vid rumstemperatur. Samla supernatanten med en pipett.
OBS: Denna supernatant kan kasseras eller användas för en plackanalys8 för att mäta titer av den frigjorda virusavkomman. - Tvätta cellpelleten med 250 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom återcentrifugering enligt steg 1.11.
- Ta bort supernatanten och lysera cellerna genom att tillsätta 80-100 μL celllysbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5% natriumdeoxikolat, 1% Triton X-100 och 1x proteashämmare cocktail, se Materialtabell) och virvel.
- Värm röret vid 98 °C i 10 minuter för att helt lysera och förbereda det totala celllysatet. Förvara lysaterna vid 4 °C för att utföra steg 1.15–1.17 nästa dag, men för bästa resultat slutför du dessa steg samma dag.
- Uppskatta proteinmängden i varje prov med hjälp av ett BCA-analyskit (se Materialförteckning).
- Lös lika stora mängder protein från oinfekterade och infekterade prover med standard SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE)11 tillsammans med molekylviktmarkörer11.
- Överför proteinet till ett membran av nitrocellulosa eller polyvinylidendifluorid (PVDF) (se materialförteckning).
OBS: PVDF-membran kan ge en hög bakgrund i vissa western blot-bilder; kontrollera om det är kompatibelt. - Utför western blotting för att upptäcka proteinet av intresse med hjälp av den metod som beskrivs någon annanstans11.
- Jämför proteinnivåerna i de mock-behandlade och inhibitorbehandlade infekterade provbanorna.
OBS: Om proteinnivån har återhämtat sig i den caspashämmarebehandlade infekterade provbanan, klyvs eller bryts proteinet ned av caspaser. Annars bryts den ned av antingen lysosom eller proteasom. - Kvantifiera proteinåtervinningen genom att mäta dess bandintensitet i varje körfält från minst tre replikat av samma experiment och normalisera det med motsvarande belastningskontrollband.
- Använd någon samtida bildare och tillhörande programvara (se materialtabell) för att avbilda de västra fläckarna och kvantifiera proteinåtervinningen.
2. Bekräftelse av kaspasmedierad klyvning eller nedbrytning av proteiner i IAV-infekterade celler genom RNA-interferens
- Designa eller erhålla en fördesign av småstörande RNA (siRNA) som riktar sig mot antingen hund eller humant caspase 3, caspase 6 och caspase 7 (bödelkaspaser1) och ett icke-målinriktat kontroll-siRNA (se materialförteckning).
- Leverera varje siRNA till MDCK- eller A549-celler genom omvänd transfektion 8,11.
- För detta, späd i separata rör 100 nM kontroll-siRNA eller kaspas-siRNA eller en rekommenderad volym transfektionsreagens (se materialtabell) i 100 μl lämpligt medium (som OptiMEM, se materialtabell) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Förbered varje utspädning i två exemplar.
OBS: Denna duplikat innehåller en replik för att analysera knockdown av caspaseuttryck med RT-qPCR eller western blotting (om antikroppar mot caspaser finns tillgängliga) och en annan för att bedöma återhämtningen av proteinet av intresse genom western blotting. - Blanda 100 μl av varje siRNA-lösning med 100 μl transfektionsreagenslösning (steg 2.3) och inkubera i 20–45 minuter vid rumstemperatur för att bilda siRNA-transfektionsreagenskomplexet.
- Under tiden delar du upp och tillsätter 1 x 10 5 MDCK- eller A549-celler i 800 μl av det fullständiga tillväxtmediet, blandar med 200 μl siRNA-transfektionsreagenskomplex (steg2.5 ) och tillsätter 1 ml suspension till en brunn med en odlingsplatta med 12 brunnar. Denna utspädning ger den slutliga koncentrationen av kontroll-siRNA eller kaspas-siRNA till 10 nM.
- Inkubera cellerna vid 37 °C under en 5% CO2-atmosfär i72 timmar.
- Skörda cellerna från ett replikat som i steg 1.10 och bearbeta dem för att validera eller bekräfta knockdown av uttrycket av caspase 3, caspase 6 och caspase 7 antingen genom RT-qPCR respektive western blotting med hjälp av standardmetoder och protokoll 8,11.
- Infektera cellerna i det andra replikatet med IAV enligt beskrivningen i steg 1.4-1.9 (utan hämmare).
- Efter 24 timmar, skörda, bearbeta och analysera cellerna genom western blotting och mäta och kvantifiera proteinåtervinningen enligt beskrivningen i steg 1.10-1.20.
3. Platsstyrd mutagenes för lokalisering av kaspasklyvningsstället i polypeptid
- Klona det genkodande proteinet av intresse i en däggdjursuttrycksplasmid11 eller få det från ett forskningslaboratorium eller en kommersiell källa (se materialförteckning).
OBS: Det är att föredra om genen klonas med en epitoptagg eller som GFP-fusion för att skilja den ektopiskt uttryckta polypeptiden från den endogent uttryckta under western blotting. - Använd hjälp av caspassubstratdatabaser4 eller proteinjusteringsverktyg, lokalisera konsensuskaspasklyvningsmotiven, XXXD och DXXD, på polypeptid. Nästan alla klyvningsmotiv för kaspasen har asparaginsyran vid klyvningsstället (P1)3,4.
- Mutera den förmodade P1-asparaginsyran till glutaminsyra eller en icke-polär aminosyra (alanin, valin) genom platsstyrd mutagenes följt av DNA-sekvensering11 med hjälp av standardmetoder och protokoll.
- Leverera vildtyps- (WT) och mutantplasmid-DNA till MDCK- eller A549-celler genom omvänd transfektion11.
- Späd därför 2 μg plasmid-DNA eller en rekommenderad volym av transfektreagenset i 100 μl av ett lämpligt medium (se steg 2.3 och materialtabellen) i separata rör och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda 100 μl av varje plasmid-DNA-lösning med 100 μl av transfektreagenslösningen och inkubera i 20–45 minuter vid rumstemperatur för att bilda DNA-transfektionsreagenskomplexet.
- Under tiden delar du upp och tillsätter 3 x 105 MDCK- eller A549-celler till 800 μL av det fullständiga tillväxtmediet, blandar med 200 μL DNA-transfektionsreagenskomplex och tillsätter 1 ml suspension till en brunn av en 12-brunns odlingsplatta.
- Inkubera cellerna vid 37 °C under en 5% CO2-atmosfär .
- Efter 48 timmar, infektera cellerna med IAV enligt beskrivningen i steg 1.4-1.9 (utan att tillsätta hämmarna).
- Efter 24 timmar, skörda, bearbeta och analysera cellerna genom western blotting (om tillämpligt, med hjälp av antikroppen mot en epitoptagg eller GFP). Mät och kvantifiera sedan proteinåtervinningen enligt beskrivningen i steg 1.10-1.20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling med caspase 3-hämmare
Det har upptäckts att värdkortatin, HDAC4 och HDAC6 polypeptider genomgår nedbrytning som svar på IAV-infektion i både hund (MDCK) och humana (A549, NHBE) celler 7,8,9. Genom att använda ovanstående metoder avslöjades att IAV-inducerade värdkaspaser, särskilt caspase 3, orsakar deras nedbrytning 7,8,9. Kortaktinet försämrades på ett infektionsdos- och tidsberoende sätt och ett värdcells- och IAV-stamoberoende sätt7. Liknande resultat erhölls för HDAC48 och HDAC69. Intressant nog sammanföll nedbrytningen av alla tre värdproteinerna med klyvningen av viral NP 7,8,9, som är känd för att genomgå kaspasmedierad klyvning14. Således antogs det att kortatin, HDAC4 och HDAC6 också genomgår kaspasmedierad klyvning och efterföljande nedbrytning. För att testa detta behandlades först de IAV-infekterade cellerna med en caspase 3-hämmare, och räddningen av kortatin-, HDAC4- och HDAC6-polypeptider analyserades genom western blotting. Alla tre polypeptider (såväl som viral NP) återhämtade sig från den IAV-infektionsinducerade nedbrytningen efter kaspas 3-hämmare behandling 7,8,9. De representativa data7 för kortaktin visas i figur 1A. Denna återhämtning kvantifierades genom att mäta intensiteten hos proteinband och normalisera värdet på kortaktinbandet med värdet på motsvarande aktinband (lastkontroll). Därefter betraktades det normaliserade värdet av kortaktin i motsvarande oinfekterade prover 100% för att bestämma dess värde i de infekterade proverna. Denna kvantifieringsmetod redovisade återhämtningen av kortaktinpolypeptid i kaspas 3-hämmarebehandlade infekterade celler som 78,8% från 20,7% i obehandlade infekterade celler7 (figur 1B).
RNA-interferensmedierad knockdown av caspase 3-uttryck
Därefter användes ett genetiskt verktyg, RNA-interferens (RNAi), följt av western blotting för att bekräfta caspasernas roll i IAV-infektionsinducerad nedbrytning av kortaktin11 och HDAC48. I kaspas 3-utarmade celler (figur 2C)11 återhämtade sig både kortaktin (figur 2A)11 och HDAC48 polypeptider från den IAV-infektionsinducerade nedbrytningen. I kaspas- eller kaspas-7-utarmade celler (figur 2C)11 observerades dock ingen signifikant återhämtning i nivåerna av kortaktinpolypeptid (figur 2A)11. Specifikt, när den kvantifierades och jämfördes med deras nivåer i motsvarande oinfekterade celler som nämnts ovan, återhämtade sig kortaktinpolypeptidnivån i infekterade celler med utarmat caspase 3-uttryck till 83% från 28,6% i infekterade celler med normalt caspase 3-uttryck (Figur 2B)11.
Kaspalsklyvningsmotiv i kortaktin och HDAC6 polypeptider
Slutligen screenades aminosyrasekvensen i kortaktin- och HDAC6-polypeptider och i förmodade kaspasklyvningsmotiv muterades asparaginsyran vid P1-positionen till glutaminsyra 9,11. Detta tillvägagångssätt identifierade asparaginsyran 116 i kortaktinpolypeptid11 och asparaginsyran 1088 i HDAC6 polypeptid9 som ett kaspasklyvningsställe. Mutationen av båda asparaginsyraresterna till glutaminsyra gjorde kortaktinet (figur 3A)11 och HDAC69 polypeptider resistenta mot nedbrytning orsakad av IAV-infektion. Specifikt, när den kvantifierades och jämfördes med deras nivåer i motsvarande oinfekterade celler som nämnts ovan, var nivån av plasmiduttryckt mutant kortaktinpolypeptid i infekterade celler 77,9%, medan nivån av plasmiduttryckt kortaktinpolypeptid av vild typ i infekterade celler var 23,6% (Figur 3B)11.
Figur 1: Kortaktinpolypeptid genomgår kaspas 3-medierad nedbrytning i IAV-infekterade celler. (A) MDCK-celler infekterades med influensavirus A/Nya Kaledonien/20/1999/H1N1-stam vid en MOI på 0,5 och behandlades därefter som mock eller med kaspas 3-hämmare (Cas3-I, 40 μM). Efter 24 timmar detekterades kortattin, viral NP och aktinpolypeptider i totala celllysater genom western blotting. UNI, oinfekterad; INF, infekterad. Pilar pekar på fullängdaren och klyvde NP. (B) Intensiteten hos kortaktin- och aktinband kvantifierades. Därefter normaliserades värdet av kortaktin med värdet av aktin. Den normaliserade mängden kortaktin i UNI-prover ansågs vara 100% för att bestämma dess mängd i motsvarande INF-prover. Data som presenteras är medel ± SE av tre biologiska replikat. P = 0,0006, beräknat med tvåvägs ANOVA. ns, inte signifikant. Denna siffra har modifierats från Chen et al.7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Knockdown av caspase 3-uttryck räddade nedbrytning av kortaktinpolypeptid i IAV-infekterade celler. (A) A549-celler transfekterades i dubbletter med 10 nM kontroll (Ctrl), kaspas 3 (Cas3), caspase 6 (Cas6) eller caspase 7 (Cas7) siRNA. Efter 72 timmar skördades cellerna i ett replikat och bearbetades för att extrahera totalt RNA. Cellerna i det andra replikatet infekterades med influensavirus A/WSN/1933/H1N1 subtyp vid en MOI på 3,0. Efter 24 timmar detekterades kortattin, viral NP och aktinpolypeptider genom western blotting. UNI, oinfekterad; INF, infekterad. (B) Intensiteten hos kortaktin- och aktinband kvantifierades och värdet av kortaktin normaliserades med värdet av aktin. Därefter ansågs den normaliserade mängden kortaktin i UNI-proverna vara 100% för att bestämma dess mängd i motsvarande INF-prover. Data som presenteras är medel ± SE av tre biologiska replikat. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, beräknat med tvåvägs ANOVA. ns, inte signifikant. (C) Totalt RNA extraherat ovan omvandlades till cDNA, som sedan användes som en mall för att detektera caspase 3, caspase 6, caspase 7 och aktin-mRNA-nivåer med RT-qPCR. Aktin-mRNA-nivån användes som referens, och mRNA-nivån för varje kaspas i kontroll-siRNA (Ctrl) och respektive caspase siRNA (Cas) transfekterade celler beräknades med hjälp av standard 2-ΔΔCT-metoden. P < 0,0001, beräknat med tvåvägs ANOVA. Denna siffra har modifierats från Chen et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mutation av asparaginsyra 116 till glutaminsyra gjorde kortaktinpolypeptid resistent mot nedbrytning orsakad av IAV-infektion . (A) MDCK-celler transfekterades med en plasmid som uttrycker vildtyp (WT) eller muterad (D116E) GFP-kortaktinfusion. Efter 48 timmar infekterades celler med influensavirus A/WSN/1933/H1N1 subtyp vid en MOI på 3,0. Efter 24 timmar detekterades GFP-kortatin, viral NP och aktinpolypeptider genom western blotting. UNI, oinfekterad; INF, infekterad. (B) Intensiteten hos kortaktin- och aktinband kvantifierades och värdet av kortaktin normaliserades med värdet av aktin. Därefter ansågs den normaliserade mängden kortaktin i UNI-prover vara 100% för att bestämma dess mängd i motsvarande INF-prover. Data som presenteras är medel ± SE av tre biologiska replikat. **P = 0,001, beräknat med tvåvägs ANOVA. ns, inte signifikant. Denna siffra har modifierats från Chen et al.11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det är uppenbart att virus skräddarsyr värdfaktorerna och vägarna till deras fördel. I sin tur motstår värdcellerna det genom att använda olika strategier. En av dessa strategier är PANoptosis, som värdceller använder som en antiviral strategi mot virusinfektioner. Virus som IAV har dock utvecklat sina egna strategier för att motverka PANoptos och utnyttja det till sin fördel 1,3,6. Detta samspel involverar klyvning av olika värd- och virusproteiner av caspaser. Att identifiera dessa caspaser och deras klyvningsställen i substratproteiner är viktigt för att belysa mekanismerna och betydelsen av ett sådant samspel.
För detta ändamål användes standardbiokemiska och molekylära metoder för att identifiera kaspaserna och deras klyvningsställen i värdkortatin, HDAC4 och HDAC6 7,8,9,11. Protokollen som beskrivs ovan kan användas för sådana studier med influensavirus, andra däggdjursvirus, andra mikrober och yttre stimuli som toxiner och kemikalier. Dessutom kan dessa metoder replikeras i ett standardmolekylärbiologiskt laboratorium med relevanta färdigheter och kräver inte specialutrustning och mjukvaruutbildning. Cellodlingsplattans format med 12 brunnar anpassades framgångsrikt för dessa och liknande studier för att generera tillräckliga provmängder för nedströmsanalyser med western blotting och RT-qPCR. Efter behov kan dock detta format nedskalas eller uppskalas i enlighet därmed. När man gör ett experiment med en caspashämmare för första gången föreslås användning av en pan-caspase-hämmare (Z-VAD-FMK) tillsammans med en lysosom- och proteasomhämmare för att bedöma om proteinet av intresse genomgår kaspasmedierad nedbrytning. Vidare kan, förutomNH4Cl och MG132, andra lysosom- och proteasomhämmare som Bafilomycin A respektive Epoxomicin användas. Efter positiva resultat med en pan-caspase-hämmare kan antingen specifika hämmare av enskilda kaspaser användas, eller så kan RNA-interferens användas. För den förstnämnda är det viktigt att optimera de effektiva hämmande koncentrationerna för att undvika toxicitet för målcelltypen och icke-specifika resultat.
Ett genetiskt verktyg som RNA-interferens eller CRISPR måste användas bredvid för att bekräfta involveringen av kaspaser eftersom hämmare korsreagerar. Alternativt kan en RNA-interferens- eller CRISPR-skärm som individuellt riktar sig mot alla kända caspaser utföras. SiRNA-, gRNA- och RT-qPCR-primerparen till alla kända caspaser kan anskaffas som fördesignade eller utformade med hjälp av onlineverktyg. Dessutom kan två eller flera caspaser tömmas samtidigt för att bedöma sekventiell eller kooperativ klyvning av polypeptider (denna strategi användes nyligen i en ännu inte publicerad studie). RNA-interferens tros vara ett idealiskt verktyg för virus-värdcellsinteraktionsforskning. Det senare kräver en kontrollerad manipulation av värdgenuttryck så att värdcellerna förblir relativt livskraftiga för virusinfektion och slutförande av livscykeln för att visa fenotypen för den manipulationen. Optimering av en effektiv siRNA-koncentration och siRNA-transfektionsreagenskombination behövs dock för varje celltyp för ett optimalt knockdown- och viabilitetsförhållande för efterföljande infektion.
För att hitta de förmodade caspas-klyvningsmotiven har många databaser som CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 och TopFIND23,24 utvecklats. En visuell screening utfördes för att lokalisera dessa motiv på HDAC6 polypetide9, men för kortaktin11 användes CaspDB (även om CaspDB-webbplatsen har varit otillgänglig nyligen). Dessa motiv bekräftades framgångsrikt som kaspasklyvningsställen genom att mutera P1-asparaginsyran till glutaminsyra. Emellertid föreslås mutering av asparaginsyran till en icke-polär aminosyraliknande alanin eller valin först eftersom vissa kaspaser kan klyva efter P1-glutaminsyra4. Denna övning kan omedelbart resultera i identifiering av kaspasklyvningsställen men kan kräva att man genererar tiotals mutanter om målpolypeptid är rik på asparaginsyror och de förmodade målmotiven är icke-kanoniska. För leverans av plasmider (och siRNA) till celler, framåt, istället för omvänd, kan transfektion utföras. Vidare bör infektionsdosen och tidskinetiken utföras med hjälp av en 4%-20% gradient SDS-PAGE för western blotting för att bedöma nedbrytningskinetiken hos polypeptiderna och identifiera eventuella mindre klyvningsprodukter. Slutligen, för att bekräfta proteinet av intresse som ett direkt caspassubstrat, kan in vitro-biokemiska analyser innehållande renade caspaser och målproteiner (WT eller mutant) och eventuella kofaktorer utvecklas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författaren erkänner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice och Phyllis Paykel Trust (Nya Zeeland), H.S. och J.C. Anderson Trust (Dunedin) och Institutionen för mikrobiologi och immunologi och School of Biomedical Sciences (University of Otago).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
- Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).
