Summary
本文描述了一种快速有效地对完整斑马鱼胚胎内正常和异常胞嘧啶甲基化进行时空监测的方案。
Abstract
胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种中高度保守，并且作为表观遗传编程和染色质状态的关键驱动因素，在早期胚胎发育中起着关键作用。酶修饰驱动胞嘧啶的活性甲基化和去甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），随后将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。表观遗传重编程是 子宫发育 过程中的关键时期，母体接触化学物质有可能重新编程后代中的表观基因组。这可能会导致不良结局，例如直接表型后果、对成人疾病易感性的长期影响以及遗传表观遗传标记的跨代影响。尽管基于亚硫酸氢盐的测序使研究人员能够以碱基对分辨率询问胞嘧啶甲基化，但基于测序的方法成本过高，因此，无法监测胞嘧啶甲基化跨发育阶段、每种化学物质的多种浓度以及每次治疗复制胚胎的能力。由于自动化 体内 成像、遗传操作、快速宫 外 发育时间和胚胎发生过程中的饲养易于，斑马鱼胚胎继续被用作生理上完整的模型，用于揭示异生素介导的途径，这些途径在早期胚胎发育期间导致不良结果。因此，使用市售的5-mC特异性抗体，我们描述了一种具有成本效益的策略，通过利用全卡口免疫组织化学，自动高内涵成像和统计分析前使用编程语言的高效数据处理，对单个完整斑马鱼胚胎中的胞嘧啶甲基化进行快速有效的时空监测。就目前所知，该方法是第一个在早期发育过程中成功检测和定量斑马鱼 胚胎内 5-mC水平的方法。该方法能够检测细胞团内的DNA甲基化，并且还能够在母体到合子过渡期间检测卵黄定位母体mRNA的胞嘧啶甲基化。总体而言，该方法将有助于快速鉴定在表观遗传重编程过程中有可能原 位 破坏胞嘧啶甲基化的化学物质。
Introduction
酶修饰驱动胞嘧啶的活性甲基化和去甲基化为5-甲基胞嘧啶（5-mC），随后将5-mC氧化为5-羟甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶1，2。磷酸三（1，3-二氯-2-丙基）酯（TDCIPP）是美国广泛使用的阻燃剂，先前已被证明可以改变受精后0.75小时（hpf）到早期原肠胚形成（6 hpf）的早期胚胎暴露后胞嘧啶甲基化的轨迹3，4，5，6，7，8.在脊椎动物中，5-mC及其修饰的衍生物对于调节早期胚胎发育至关重要9。胚胎受精触发亲本DNA的去甲基化，随后是母体mRNA降解，合子基因组激活和合子基因组的再甲基化9。利用胞嘧啶甲基化的生物学相关过程包括组蛋白修饰、转录机制募集、RNA 甲基化、表观遗传重编程和染色质结构的测定10，11。胞嘧啶甲基化在脊椎动物物种中也是保守的，强调了理解和研究异常胞嘧啶甲基化如何影响生物体发育轨迹的重要性11。此外，子宫内发育对母体暴露敏感，并有可能引起不良后果，例如直接表型后果、对成人疾病易感性的长期影响以及遗传表观遗传标记的跨代效应12，13，14。
长段的胞嘧啶-鸟嘌呤对或CpG岛一直是研究人员的主要焦点，旨在表征整个基因组中胞嘧啶甲基化的动力学15，16，17。基于亚硫酸氢盐的策略，如全基因组亚硫酸氢盐测序、减少代表性亚硫酸氢盐测序和亚硫酸氢盐扩增子测序，代表了在碱基对分辨率下询问胞嘧啶甲基化的金标准。然而，基于测序的方法成本高昂，因此无法监测各个发育阶段的胞嘧啶甲基化、每种化学物质的多种浓度以及每次治疗复制胚胎的能力。此外，基于测序的方法不能提供有关空间定位的信息，这对于了解发育中的胚胎中可能受影响的细胞类型和区域至关重要。同样，全球 DNA 甲基化测定，例如甲基化依赖性限制性分析、5-mC 酶联免疫测定 （ELISA） 和 5-甲基-2'-脱氧胞苷 （5-mC） 液相色谱-质谱 （LC-MS） 依赖于细胞或组织匀浆，因此，无法监测完整标本12，18 内胞嘧啶甲基化随空间和时间的定位和大小。
由于自动化 体内 成像、遗传操作、快速宫 外 发育时间和胚胎发生过程中的饲养易于，斑马鱼胚胎继续被广泛用作生理上完整的模型，以揭示异生素介导的途径，这些途径在早期胚胎发育期间导致不良结果。因此，使用市售的针对5-mC的抗体，以下方案描述了一种经济高效的策略，通过利用全卡口免疫组织化学（IHC）、自动高内涵成像和统计分析前使用编程语言的高效数据处理，对单个完整斑马鱼胚胎中的胞嘧啶甲基化进行快速有效的时空监测。
就目前所知，这种方法是第一个监测完整斑马鱼胚胎内5-mC的方法。该方法能够检测细胞团内的DNA甲基化，并且还能够在母体到合子过渡期间检测卵黄定位母体mRNA的胞嘧啶甲基化。总体而言，该方法将有助于快速鉴定在表观遗传重编程过程中有可能原 位 破坏胞嘧啶甲基化的化学物质。
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Protocol
成年饲养员按照加州大学河滨分校机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的动物使用协议 （#20180063） 进行处理和治疗。
1. 斑马鱼胚胎采集和化学暴露
- 在含有性成熟和生殖能力强壮的成年雄性和雌性斑马鱼的水箱中添加水箱内繁殖陷阱。在~9：00 AM收集前至少12小时，每个6 L水箱至少添加三个陷阱，这是水箱内受精和产卵的大致时间。
- 在收集的早晨准备新鲜的暴露溶液。使用5 mL移液管制备暴露溶液，并将5.0 mL无颗粒系统水加入60 mm玻璃培养皿中。
- 然后，使用 10 μL 玻璃微毛细管移液器将 10 μL 载体（二甲基亚砜或 DMSO）或化学储备溶液转移到玻璃培养皿中的系统水中。
- 旋转玻璃培养皿以确保储备溶液消散。向玻璃培养皿中再加入 5.0 mL 系统水。旋转玻璃培养皿以使暴露溶液均质化。
- 对每个处理组重复四个重复，每个处理产生四个重复。
- 准备好暴露溶液后，用玻璃盖盖住玻璃培养皿，以尽量减少蒸发。
- 从每个水箱中取出繁殖陷阱时，小心地让每个陷阱中的水排入水箱，然后再从水箱中取出。确保陷阱保持右侧朝上。
- 将繁殖陷阱转移到实验室水槽中，并使用装有反渗透（RO）水的喷瓶将其冲洗到先前浸泡在10%漂白剂中并用水冲洗的鱼网中。冲洗胚胎，直到清除所有碎片，只剩下干净的胚胎。
- 使用RO充满水的喷瓶将胚胎从鱼网转移到100毫米塑料培养皿中。在受精后 50 小时 （hpf） 随机分选 50 个活胚胎并去除多余的 RO 水。
- 使用微刮刀，将分选的胚胎放入处理溶液中。所有胚胎必须在不早于上午9：45的载体或治疗溶液中。旋转玻璃培养皿以确保胚胎均匀地涂覆在处理溶液中。
- 在每个处理组设置四个重复培养皿（N = 50 每个重复）后，将玻璃盖放在暴露培养皿的顶部，并将所有培养皿转移到设置为 28 °C 的温控培养箱中，直到 2 hpf、4 hpf、6hpf、8 hpf 或 10 hpf。
- 在暴露终止前至少4小时准备新鲜的4%多聚甲醛（PFA），并储存在4°C。
- 将加热板打开至115°C，在50 mL离心管中制备20 mL 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（2 mL 10x PBS + 18 mL RO水），并称出800 mg多聚甲醛。
- 在化学通风橱中，将 1x PBS 溶液转移到 250 mL 锥形瓶中，加入 800 mg 多聚甲醛，然后加入 2 μL 10 N NaOH。将温度计放在烧瓶内，将烧瓶放在热板上，搅拌时观察温度。
- 当温度达到62-65°C时，从热板上除去4%的PFA，使其冷却至室温（RT）。将4%PFA储存在4°C。
- 暴露持续时间结束后，从培养箱中取出胚胎并将所有活胚胎转移到 1.5 mL 微量离心管中。使用 1 mL 移液器吸出残留暴露溶液。不要吸出任何胚胎。
- 将 500 μL 冷冻的 4% PFA 加入 1.5 mL 微量离心管中，并通过倒置数次将胚胎与 4% PFA 混合。让胚胎在4%PFA中固定过夜。
注意：不建议让胚胎在PFA中停留超过12小时。
2. 胚胎去皮
- 第二天，吸出4%的PFA，将胚胎重悬于1x PBS中，然后轻轻上下移液30秒。如果需要，在此步骤停止协议并将胚胎在4°C的1x PBS中储存长达48小时。
- 使用塑料移液管，小心地将固定胚胎转移到充满RO水的玻璃盘中，轻轻旋转30秒。再次重复此步骤。
- 使用标准体视显微镜在5.0倍放大镜下使用注射器针头手动去皮所有胚胎。为此，使用针尖刺穿绒毛膜并将其从蛋黄和细胞团上轻轻剥离4.
- 胚胎去皮后，使用玻璃微毛细管移液管将多达25个完整胚胎转移到一个免疫化学（IHC）篮中，并将IHC篮放入96孔板中。使用 1 mL 移液器从每个孔中吸出 RO 水。
3. 使用 5 mC 特异性抗体进行免疫组织化学
- 将胚胎重悬于每孔 500 μL 封闭缓冲液（1x PBST + 2% 绵羊血清 + 2 mg/mL 牛血清白蛋白）中，并用封口膜和铝箔包裹板以保护它们免受光照。在轨道振荡器（100rpm）上在4°C孵育4小时。
- 取出封口膜包装和铝，并使用 1 mL 移液器从每个孔中吸出封闭缓冲液。用封闭缓冲液中 500 μL 1：100 稀释的单克隆小鼠抗 5-mC 抗体替换它。用一抗孵育所有胚胎，但载体对照胚胎的子集除外，该胚胎将与封闭缓冲液一起孵育以考虑背景噪音。注意不要破坏胚胎的完整性，也不要在此步骤中吸出胚胎。
- 用封口膜和铝箔重新包裹板，并使板在轨道振荡器（100rpm）上在4°C孵育过夜。
- 第二天，从每个孔中取出一抗溶液，并用1x PBS + 0.1%吐温-20（1x PBST）替换。用1x PBST在轨道振荡器（100rpm）上洗涤每个孔三次，每次洗涤15分钟。
- 在封闭缓冲液中用1：500稀释的山羊抗小鼠IgG抗体替换1x PBST，并将所有胚胎与二抗孵育。让板在4°C下在轨道振荡器（100rpm）上孵育过夜。
- 第二天，除去二抗，并在轨道振荡器（100rpm）上用1x PBST洗涤残留溶液三次，每次洗涤15分钟。
注意：如果将IHC篮子储存在充满1x PBS的清洁孔中，则可以在此处停止协议长达48小时。 - 使用 1 mL 移液管从每个孔中吸出 1x PBST，并将 IHC 篮放入装有 RO 水的玻璃培养皿中。在标准体视显微镜下，将完整的胚胎随机分类到96孔板中，每孔产生一个胚胎。
- 使用 1 mL 移液器，从单个孔中取出所有 RO 水，并用 200 μL 1x PBS 替换。以1 x g 离心板3分钟。
4. 96孔板内胚胎的自动成像
- 使用高内涵筛选系统在透射光和FITC下用2倍物镜对胚胎进行成像（材料表）。
注意：使用上述放大倍率和FITC滤光片19自动捕获每个胚胎的荧光图像。- 选择 自动对焦 以确保相机的焦点位于板的底部并偏移底部厚度。
- 选择曝光持续时间为 100 毫秒的 FITC 波长，并将 自动对焦 设置为具有 Z 偏移的激光。在开始板采集之前，观察并确认几个孔中的正确图像采集。
注意：仪器会自动从所有包含胚胎的选定孔中获取图像。96孔板大约需要30分钟用于图像采集和数据存储。在采集期间，成像系统的内部温度保持在室温。
- 图像采集后，使用高内涵筛选系统和定制的自动图像分析程序进行数据分析。在96孔板上选择要分析总面积和荧光综合强度的每个胚胎。
注意：分析包括提供包含分析数据点叠加的图像。 - 然后，将数据点制成表格，并通过在 “测量 ”下选择 “打开数据日志 ”到电子表格，将其从高内涵筛选系统中导出。板采集和数据分析部分如图 1所示。
5. 数据分析
- 将导出的电子表格上传到计算机程序中，其中部署程序 （dplyr） 包用于对每个孔的数据进行排序、汇总以及按孔号进行过滤。然后使用 writexl 包将汇总的数据导出到电子表格中。5mC程序代码显示在 补充文件1中。
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Representative Results
该协议的总体目的是通过评估固定和标记斑马鱼胚胎中荧光的总面积和相对强度来确定处理是否影响5-mC的相对丰度。完成方案后，可以使用荧光体视显微镜首先确定整个安装IHC是否成功。当在FITC或GFP过滤器下观察标记的胚胎时，阳性结果由胚胎内的正FITC信号指示，而阴性结果由对照胚胎内没有荧光表示。使用高内涵筛选系统，这些结果也可以在使用FITC滤光片的图像采集过程中得到确认。此外，在数据分析过程中，自定义模块将识别和量化荧光的总面积和综合强度。成功结果的代表性图像如图1所示，其中通过自定义模块 成功测量了采集的图像，并采集了总面积和积分强度的单个数据点（显示为蓝色叠加）。
在数据提取过程中，自定义模块内的阈值严格性是一个额外的变量，需要对其进行优化，以最大限度地提高信噪比，并提高检测到5 mC丰度中显著的治疗特异性差异的概率。在优化过程中，该最终阈值在对照组和治疗组的中位数之间提供了最显着的分离（例如，最大的信噪比）。 图2显示了影响信噪比的不同自定义模块阈值下的代表性结果。
图 1：流程图提供了 6 hpf 斑马鱼胚胎的 5-甲基胞嘧啶暴露和原位检测方案的图形表示。流程图的方向用黑色箭头提供。暴露发生在每个处理的四个重复培养皿和每个重复培养皿50个胚胎的重复中。缩写：cm = 细胞质量;ys = 卵黄囊。请点击此处查看此图的大图。
图 2：自定义模块的优化。 图A-D通过评估6 hpf下斑马鱼胚胎内5 mC特定总面积和综合强度的中位数和分布，显示了定制模块的优化。（一，二）测试的不同阈值列在右侧的图例中（每个阈值之间的差异为 100），并按严格程度排序，其中 1500 和 2500 分别表示测试的最小和最严格的阈值。（中，四）测试的不同阈值列在右侧的图例中（每个阈值之间的差异为 250），并按严格程度排序，其中 1500 和 2500 分别表示测试的最低和最严格的阈值。C，D中的（*）表示阈值与载体处理的胚胎显着不同（p < 0.05）。对于A，B，所有测试的阈值都与车辆控制有关。x轴表示暴露于载体（0.1%DMSO）或0.78μM TDCIPP（阳性对照）。y 轴表示相对荧光。图A显示胚胎内检测到的5-mC的总面积作为治疗的函数，而图B显示同一区域内5-mC的综合强度。一个胚胎由单个数据点表示，每个治疗组总共N = 96。所有暴露均以每次处理四个培养皿的重复进行，每个玻璃培养皿50个胚胎。请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：5mC程序代码。请点击此处下载此文件。
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Discussion
在此协议中，有几个步骤至关重要。首先，在对胚胎进行去皮时，重要的是将针头指向远离胚胎/卵黄囊/细胞团的组织，因为发育中的胚胎的这些部分非常脆弱且易于刺穿。其次，将标记的胚胎转移到单个孔中时，请使用玻璃移液管转移胚胎，因为它们会粘附在塑料移液器上。第三，在进行整体安装IHC时，请确保板免受光照。最后，在完成全安装IHC方案后，在成像前让板在4°C的1x PBS中孵育过夜，因为这将最大限度地减少可能干扰成像的自发荧光。
如果有胚胎在去皮或IHC过程中被切断，请将这些胚胎从方案的其余部分排除。如果未检测到荧光，则可以通过孵育更长时间（最多16小时）来解决。由于这是一种5 mC特异性抗体，因此DNA和RNA都可以被标记。对空间定位的一般了解很重要。
此方法存在一些限制。首先，它是一种非靶向技术，这意味着它不会提供5 mC的确切数量，而是基于荧光总面积和综合强度的相对丰度。此外，该协议仅在分割前在胚胎上进行了测试，因此如果测试发育的后期阶段，可能需要一些额外的优化。此外，由于该方法是基于IHC的，因此可能容易受到非特异性结合;因此，不确定只染色定位于DNA的5-mC，也可能染色定位于RNA的5-mC。最后，可能需要优化数据分析阈值，具体取决于首选条件的化学和严格程度。
总体而言，该方法可在多个开发阶段和化学浓度中快速且经济高效地检测 5-mC3。因此，它为成本高昂的基于亚硫酸氢盐测序的方法提供了一种替代方案。通过提供该协议，研究人员可以使用这种方法快速筛选化学物质并评估在早期胚胎发育过程中如何影响5-mC的丰度。此外，该方法可用作预筛选工具，以确定目标化学品影响5 mC丰度的浓度范围、发展期和/或灵敏度窗口。或者，可以将相同的方法用于不同的生物标志物和抗体，尽管需要进一步优化。通过利用这种方法，研究人员可以在投资劳动密集型亚硫酸氢盐测序方法之前，快速、高效且经济高效地筛选和鉴定改变斑马鱼胚胎中 5-mC 相对丰度的化学物质。然而，这种方法是斑马鱼特异性的，需要进一步的研究来确定是否可以在其他模式生物的早期胚胎中原位检测到5-mC。
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Disclosures
作者声明，他们没有已知的相互竞争的经济利益或个人关系，这些利益或个人关系似乎会影响本文中报告的工作。
Acknowledgments
研究支持由 UCR 研究生部奖学金提供给 SAB、NRSA T32 培训计划奖学金 （T32ES018827） 提供给 SAB 以及美国国立卫生研究院赠款 （R01ES027576） 和美国农业部国家粮食和农业研究所孵化项目 （1009609） 提供给 DCV。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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