Summary
Dette papir beskriver en protokol for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af normal og afvigende cytosinmethylering i intakte zebrafiskembryoner.
Abstract
Cytosinmethylering er stærkt bevaret på tværs af hvirveldyrarter og spiller som en vigtig drivkraft for epigenetisk programmering og kromatintilstand en kritisk rolle i tidlig embryonal udvikling. Enzymatiske modifikationer driver aktiv methylering og demethylering af cytosin til 5-methylcytosin (5-mC) og efterfølgende oxidation af 5-mC til 5-hydroxymethylcytosin, 5-formylcytosin og 5-carboxylcytosin. Epigenetisk omprogrammering er en kritisk periode under in utero-udvikling , og moderens eksponering for kemikalier har potentialet til at omprogrammere epigenomet inden for afkom. Dette kan potentielt forårsage negative resultater såsom umiddelbare fænotypiske konsekvenser, langsigtede virkninger på voksensygdomsfølsomhed og transgenerationelle virkninger af arvelige epigenetiske mærker. Selvom bisulfitbaseret sekventering gør det muligt for efterforskere at forhøre cytosinmethylering ved baseparopløsning, er sekventeringsbaserede tilgange omkostningsoverkommelige og udelukker som sådan evnen til at overvåge cytosinmethylering på tværs af udviklingsstadier, flere koncentrationer pr. kemikalie og replikere embryoner pr. Behandling. På grund af den lette automatiserede in vivo-billeddannelse , genetiske manipulationer, hurtig ex utero-udviklingstid og opdræt under embryogenese anvendes zebrafiskembryoner fortsat som en fysiologisk intakt model til afdækning af xenobiotisk-medierede veje, der bidrager til negative resultater under tidlig embryonal udvikling. Derfor beskriver vi ved hjælp af kommercielt tilgængelige 5-mC-specifikke antistoffer en omkostningseffektiv strategi for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af cytosinmethylering inden for individuelle, intakte zebrafiskembryoner ved at udnytte helmonteret immunhistokemi, automatiseret billeddannelse med højt indhold og effektiv databehandling ved hjælp af programmeringssprog forud for statistisk analyse. Ifølge den nuværende viden er denne metode den første, der med succes detekterer og kvantificerer 5-mC-niveauer in situ i zebrafiskembryoner under tidlig udvikling. Metoden muliggør påvisning af DNA-methylering i cellemassen og har også evnen til at detektere cytosinmethylering af æggeblomme-lokaliserede maternel mRNA'er under den moderlige-til-zygotiske overgang. Samlet set vil denne metode være nyttig til hurtig identifikation af kemikalier, der har potentiale til at forstyrre cytosinmethylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Introduction
Enzymatiske modifikationer driver aktiv methylering og demethylering af cytosin til 5-methylcytosin (5-mC) og efterfølgende oxidation af 5-mC til 5-hydroxymethylcytosin, 5-formylcytosin og 5-carboxylcytosin 1,2. Tris(1,3-dichlor-2-propyl)phosphat (TDCIPP) er et meget anvendt flammehæmmende middel i USA, der tidligere har vist sig at ændre cytosinmethyleringens bane efter tidlig embryonal eksponering fra 0,75 timer efter befrugtning (hpf) gennem tidlig gastrulation (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Inden for hvirveldyr er 5 mC og dets modificerede derivater afgørende for regulering af tidlig embryonal udvikling9. Befrugtning af et embryo udløser demethylering af forældrenes DNA efterfulgt af moderens mRNA-nedbrydning, zygotisk genomaktivering og remethylering af det zygotiske genom9. Biologisk relevante processer, der anvender cytosinmethylering, omfatter histonmodifikation, rekruttering af transkriptionsmaskiner, RNA-methylering, epigenetisk omprogrammering og bestemmelse af kromatinstruktur10,11. Cytosinmethylering bevares også blandt hvirveldyrarter, hvilket understreger vigtigheden af at forstå og undersøge, hvordan afvigende cytosinmethylering kan påvirke banen for en organismes udvikling11. Desuden er udviklingen i utero følsom over for moderens eksponering og har potentiale til at forårsage negative resultater såsom umiddelbare fænotypiske konsekvenser, langsigtede virkninger på voksensygdomsmodtagelighed og transgenerationelle virkninger af arvelige epigenetiske mærker12,13,14.
Lange strækninger af cytosin-guaninpar eller CpG-øer har været de primære fokus for efterforskere, der sigter mod at karakterisere dynamikken i cytosinmethylering på tværs af genomet15,16,17. Bisulfitbaserede strategier såsom helgenombisulfitsekventering, reduceret repræsentation af bisulfitsekventering og bisulfitamplicon-sekventering repræsenterer guldstandarden til forhør af cytosinmethylering ved baseparopløsning. Sekventering baseret på metoder er imidlertid omkostningsoverkommelige og udelukker som sådan muligheden for at overvåge cytosinmethylering på tværs af udviklingsstadier, flere koncentrationer pr. kemikalie og replikere embryoner pr. behandling. Derudover giver sekventeringsbaserede tilgange ikke information om rumlig lokalisering, hvilket er afgørende for at forstå potentielt berørte celletyper og områder inden for et embryo, der udvikler sig. Tilsvarende er globale DNA-methyleringsassays såsom methyleringsafhængig restriktionsanalyse, 5-mC enzymbundne immunoassays (ELISA'er) og 5-methyl-2'-deoxycytidin (5-mC) væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) afhængige af celle- eller vævshomogenater og udelukker som sådan evnen til at overvåge lokaliseringen og størrelsen af cytosinmethylering over rum og tid inden for intakte prøver12,18.
På grund af den lette automatiserede in vivo-billeddannelse , genetiske manipulationer, hurtig ex utero-udviklingstid og opdræt under embryogenese anvendes zebrafiskembryoner fortsat i vid udstrækning som fysiologisk intakte modeller til at afdække xenobiotisk-medierede veje, der bidrager til negative resultater under tidlig embryonal udvikling. Derfor beskriver nedenstående protokol ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer, der er specifikke for 5 mC, en omkostningseffektiv strategi for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af cytosinmethylering inden for individuelle, intakte zebrafiskembryoner ved at udnytte helmonteret immunhistokemi (IHC), automatiseret billeddannelse med højt indhold og effektiv databehandling ved hjælp af programmeringssprog forud for statistisk analyse.
Efter den nuværende viden er denne metode den første til at overvåge 5 mC inden for intakte zebrafiskembryoner. Metoden muliggør påvisning af DNA-methylering i cellemassen og har også evnen til at detektere cytosinmethylering af æggeblomme-lokaliserede maternel mRNA'er under den moderlige-til-zygotiske overgang. Samlet set vil denne metode være nyttig til hurtig identifikation af kemikalier, der har potentiale til at forstyrre cytosinmethylering in situ under epigenetisk omprogrammering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voksne opdrættere blev håndteret og behandlet i overensstemmelse med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkendt dyrebrugsprotokol (#20180063) ved University of California, Riverside.
1. Indsamling af zebrafiskembryoner og kemisk eksponering
- Tilsæt opdrætsfælder i tanken til tanke, der indeholder seksuelt modne og reproduktivt levedygtige voksne mandlige og kvindelige zebrafisk. Tilføj mindst tre fælder pr. 6 L tank mindst 12 timer før indsamling kl. ~ 9:00, hvilket er det omtrentlige tidspunkt for befrugtning og gydning af æg i tanke.
- Forbered en frisk eksponeringsopløsning om morgenen for indsamling. Eksponeringsopløsningen fremstilles ved hjælp af en 5 ml pipette og tilsættes 5,0 ml partikelfrit systemvand til en 60 mm glas petriskål.
- Brug derefter en 10 μL glasmikrokapillærpipette til at overføre 10 μL køretøj (dimethylsulfoxid eller DMSO) eller kemisk stamopløsning til systemvand i glasskålen.
- Hvirvl glaspetriskålen for at sikre, at stamopløsningen forsvinder. Tilsæt yderligere 5,0 ml systemvand til glaspetriskålen. Hvirvl glaspetriskålen for at homogenisere eksponeringsopløsningen.
- Gentag for hver behandlingsgruppe i replikater på fire for at give fire replikater pr. behandling.
- Når eksponeringsopløsninger er blevet fremstillet, skal du dække glasskålene med glaslåg for at minimere fordampningen.
- Mens du fjerner avlsfælderne fra hver tank, skal du forsigtigt lade vandet i hver fælde løbe ud i tanken, før det fjernes fra tankene. Sørg for, at fælderne forbliver med højre side opad.
- Overfør avlsfælderne til laboratorievasken og skyl dem ved hjælp af en sprøjteflaske fyldt med omvendt osmose (RO) vand i et fiskenet, der tidligere var gennemblødt i 10% blegemiddel og skyllet med vand. Skyl embryonerne, indtil alt affald er ryddet, og der kun er rene embryoner tilbage.
- Overfør embryonerne fra fiskenettet ved hjælp af en RO-vandfyldt sprøjteflaske til en 100 mm petriskål af plast. Sorter tilfældigt 50 levende embryoner ved 0,75 timer efter befrugtning (hpf) og fjern overskydende RO-vand.
- Brug en mikrospatel til at placere sorterede embryoner i behandlingsopløsningen. Alle embryoner skal være i køretøjet eller behandlingsløsningen tidligst kl. 9.45. Hvirvl glasskålene for at sikre, at embryonerne er jævnt belagt i behandlingsopløsningen.
- Når der er opstillet fire replikatretter (N = 50 pr. replikat) for hver behandlingsgruppe, anbringes glaslåget oven på eksponeringsskålene, og alle retter overføres til en temperaturstyret inkubator, der er indstillet til 28 °C indtil 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf eller 10 hpf.
- Der fremstilles frisk 4% paraformaldehyd (PFA) mindst 4 timer før eksponeringsophør, og opbevares ved 4 °C.
- Tænd kogepladen til 115 °C, lav 20 ml 1x fosfatbufferet saltvand (PBS) (2 ml 10x PBS + 18 ml RO-vand) i et 50 ml centrifugerør, og vægt 800 mg paraformaldehyd.
- Inden for en kemisk røghætte overføres 1x PBS-opløsning til en 250 ml Erlenmeyer-kolbe, tilsættes 800 mg paraformaldehyd, og derefter tilsættes 2 μL 10 N NaOH. Anbring et termometer inde i kolben, læg kolben på kogepladen, og hold øje med temperaturen under omrøring.
- Når temperaturen når 62-65 °Cfjern 4% PFA fra kogepladen, og lad den køle af til stuetemperatur (RT). De 4 % PFA opbevares ved 4 °C.
- Når eksponeringsvarigheden er afsluttet, fjernes embryonerne fra inkubatoren, og alle levende embryoner overføres til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Aspirat resteksponeringsopløsning ved hjælp af en 1 ml pipette. Aspirer ikke embryoner.
- Tilsæt 500 μL kølet 4% PFA til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og bland embryonerne i 4% PFA ved at vende om flere gange. Lad embryonerne fiksere i 4% PFA natten over.
OBS: Det anbefales ikke at lade embryoner opholde sig i PFA i mere end 12 timer.
2. Dekorionering af embryoner
- Den følgende dag suges 4% PFA af, embryonerne resuspenderes i 1x PBS, og pipetteres forsigtigt op og ned i 30 s. Hvis det er nødvendigt, skal protokollen stoppes på dette trin, og embryonerne opbevares i 1x PBS ved 4 °C i op til 48 timer.
- Brug en plastoverførselspipette til forsigtigt at overføre faste embryoner til en RO-vandfyldt glasskål og hvirvle forsigtigt i 30 sekunder. Gentag dette trin endnu en gang.
- Brug sprøjtenåle under 5,0x forstørrelse ved hjælp af et standard stereomikroskop til manuelt at dechorionere alle embryoner. Gør dette ved at bruge nålespidsen til at punktere chorionen og forsigtigt skrælle den væk fra æggeblommen og cellemassen4.
- Når embryonerne er blevet dekorioneret, skal du bruge en glasmikrokapillærpipette til at overføre op til 25 intakte embryoner til en immunokemi (IHC) kurv og placere IHC-kurven i en 96-brøndsplade. Brug en 1 ml pipette til at opsuge RO-vandet fra hver brønd.
3. Immunohistokemi ved anvendelse af 5-mC-specifikt antistof
- Embryonerne gensuspenderes i 500 μL blokerende buffer (1x PBST + 2% fåreserum + 2 mg/ml bovin serumalbumin) pr. boring, og pladen pakkes ind med parafilm og aluminiumsfolie for at beskytte dem mod lys. Inkuberes ved 4 °C i 4 timer på en orbital shaker (100 o / min).
- Fjern parafilmindpakningen og aluminiumet, og brug en 1 ml pipette til at aspirere blokeringsbufferen fra hver brønd. Udskift det med 500 μL af en 1:100 fortynding af monoklonalt museanti-5-mC antistof i blokeringsbufferen. Inkubere alle embryoner med primære antistoffer med undtagelse af en delmængde af køretøjskontrolembryoner, som vil blive inkuberet med blokeringsbufferen for at tage højde for baggrundsstøj. Pas på ikke at forstyrre embryonernes integritet eller at aspirere embryoner under dette trin.
- Pak pladen ind i parafilm og aluminiumsfolie, og lad pladen inkubere ved 4 °C natten over på en orbital shaker (100 o / min).
- Den følgende dag fjernes den primære antistofopløsning fra hver brønd og erstattes med 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Vask hver brønd tre gange med 1x PBST i 15 minutter pr. vask på en orbital shaker (100 o / min).
- Udskift 1x PBST med en 1:500 fortynding af gedeantimus IgG-antistof i blokerende buffer og inkuber alle embryoner med det sekundære antistof. Pladen inkuberes ved 4 °C natten over på en orbital shaker (100 o / min).
- Den følgende dag fjernes det sekundære antistof, og restopløsningen vaskes tre gange med 1x PBST i 15 minutter pr. vask på en orbital shaker (100 o / min).
BEMÆRK: Protokollen kan stoppes her i op til 48 timer, hvis IHC-kurvene opbevares i rene brønde fyldt med 1x PBS. - Brug en 1 ml pipette til at aspirere 1x PBST fra hver brønd og læg IHC-kurven i en glas petriskål fyldt med RO-vand. Under et standard stereomikroskop sorteres tilfældigt intakte embryoner i en 96-brøndsplade, hvilket resulterer i et embryo pr. Brønd.
- Brug en 1 ml pipette til at fjerne alt RO-vand fra individuelle brønde og udskift det med 200 μL 1x PBS. Centrifuger pladen i 3 minutter ved 1 x g.
4. Automatiseret billeddannelse af embryoner inden for 96-brøndsplader
- Billede embryonerne med et 2x mål under transmitteret lys og FITC ved hjælp af et screeningssystem med højt indhold (materialetabel).
BEMÆRK: Et fluorescerende billede af hvert embryo blev taget automatisk ved hjælp af ovennævnte forstørrelse og et FITC-filter19.- Vælg Autofokus for at sikre, at kameraets fokus er på bunden af pladen og forskudt af bundtykkelsen.
- Vælg en FITC-bølgelængde med en eksponeringsvarighed på 100 ms, og indstil Autofokus til laser med en Z-offset. Overhold og bekræft korrekt billedoptagelse i flere brønde, inden pladens optagelse påbegyndes.
BEMÆRK: Instrumentet henter automatisk billeder fra alle udvalgte brønde, der indeholder embryoner. En plade med 96 brønde krævede ca. 30 minutter til billedindsamling og datalagring. I løbet af erhvervelsesperioden blev den interne temperatur i billeddannelsessystemet opretholdt ved RT.
- Efter billedindsamling skal du udføre dataanalyse ved hjælp af screeningssystemet med højt indhold og en brugerdefineret automatiseret billedanalyseprocedure. Vælg hvert embryo på 96-brøndspladen, der skal analyseres for det samlede areal og integreret intensitet af fluorescens.
BEMÆRK: Analysen omfattede levering af billeder, der indeholdt overlejringer af datapunkter fra analysen. - Derefter skal du tabulere datapunkterne og eksportere dem fra screeningssystemet med højt indhold ved at gå under Måling og vælge Åbn datalog til et regneark. Pladeindsamlings- og dataanalysedelene er afbildet i figur 1.
5. Dataanalyse
- Upload det eksporterede regneark til et computerprogram, hvor dplyr-pakken (deployer) bruges til at sortere, opsummere data for hvert brønd og filtrere efter brøndnummer. Writexl-pakken bruges derefter til at eksportere de opsummerede data til et regneark. 5mC-programkoden vises i supplerende fil 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det overordnede formål med denne protokol er at afgøre, om en behandling påvirker den relative forekomst af 5 mC ved at vurdere det samlede areal og den relative intensitet af fluorescens i faste og mærkede zebrafiskembryoner. Efter afslutningen af protokollen kan et fluorescensstereomikroskop bruges til først at afgøre, om hele IHC var vellykket. Når mærkede embryoner observeres under et FITC- eller GFP-filter, indikeres et positivt resultat med et positivt FITC-signal i embryonet, mens et negativt resultat indikeres ved fravær af fluorescens i kontrolembryoner. Ved hjælp af et screeningssystem med højt indhold kan disse resultater også bekræftes under billedoptagelse ved hjælp af et FITC-filter. Derudover vil det brugerdefinerede modul under dataanalyse identificere og kvantificere det samlede areal og den integrerede intensitet af fluorescens. Repræsentative billeder af vellykkede resultater er vist i figur 1, hvor erhvervede billeder blev målt med succes af det brugerdefinerede modul, og individuelle datapunkter (vist som blå overlay) blev erhvervet for både samlet areal og integreret intensitet.
Under dataudtrækning er tærskelstrengheden i det brugerdefinerede modul en yderligere variabel, der skal optimeres for at maksimere signal-støj-forholdet og øge sandsynligheden for at detektere en betydelig behandlingsspecifik forskel i 5-mC overflod. Under optimeringen gav denne endelige tærskel den mest signifikante adskillelse mellem medianer af kontrol- og behandlingsgrupper (f.eks. det største signal-støj-forhold). Repræsentative resultater ved forskellige brugerdefinerede modultærskler, der påvirker signal-støj-forhold, er vist i figur 2.
Figur 1: Et flowdiagram, der giver en grafisk gengivelse af protokollen for eksponering og in situ-detektion af 5-methylcytosin til 6 hpf zebrafiskembryoner. Strømningsdiagrammets retning er forsynet med sorte pile. Eksponeringer forekom i replikater af fire replikatretter pr. behandling og 50 embryoner pr. replikatskål. Forkortelser: cm = cellemasse; ys = æggeblomme sæk. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Optimering af det brugerdefinerede modul. Paneler A-D viser optimering af det brugerdefinerede modul ved at vurdere medianen og fordelingen af 5-mC-specifikt samlet areal og integreret intensitet inden for zebrafiskembryoner ved 6 hpf. (A,B) Forskellige testede tærskler er angivet i forklaringen til højre (forskel på 100 mellem hver tærskel) og er ordnet efter strenghed, hvor 1500 og 2500 repræsenterer henholdsvis de mindst og strengeste tærskler, der er testet. (C,D) Forskellige testede tærskler er angivet i forklaringen til højre (forskel på 250 mellem hver tærskel) og ordnet efter strenghed, hvor 1500 og 2500 repræsenterer henholdsvis de mindst og strengeste tærskler, der er testet. (*) i C,D angiver tærskler, der adskiller sig væsentligt fra køretøjsbehandlede embryoner (p < 0,05). For A,B var alle de testede tærskler signifikante i forhold til køretøjets kontrol. X-aksen angiver eksponering for enten køretøj (0,1% DMSO) eller 0,78 μM TDCIPP (positiv kontrol). Y-aksen betegner relativ fluorescens. Panel A viser det samlede areal på 5 mC detekteret i embryoner som funktion af behandlingen, mens panel B viser den integrerede intensitet på 5 mC inden for det samme område. Et embryon repræsenteres af et enkelt datapunkt for i alt N = 96 for hver behandlingsgruppe. Alle eksponeringer blev udført i replikater af fire retter pr. behandling med 50 embryoner pr. glasskål. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: 5mC programkode. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under denne protokol er der et par trin, der er kritiske. For det første er det vigtigt at pege nålen væk fra embryonets/cellemassens væv, når embryonen afkobles/cellemassen afkobles, da disse dele af det udviklende embryo er meget skrøbelige og lette at punktere. For det andet, når du overfører mærkede embryoner til individuelle brønde, skal du bruge en glaspipette til at overføre embryoner, da de klæber til en plastpipette. For det tredje, når du udfører helmonteret IHC, skal du sikre dig, at pladen er beskyttet mod lys. Endelig, efter at have afsluttet hele IHC-protokollen, skal pladen inkuberes i 1x PBS ved 4 ° C natten over før billeddannelse, da dette vil minimere autofluorescens, der kan forstyrre billeddannelsen.
Hvis der er embryoner, der er blevet afskåret under dechorionation eller IHC, skal du udelukke disse embryoner fra resten af protokollen. Hvis der ikke påvises fluorescens, kan dette løses ved at inkubere i længere tid (op til 16 timer). Da dette er et 5-mC-specifikt antistof, kan både DNA og RNA mærkes. En generel forståelse af rumlig lokalisering er vigtig.
Der er nogle begrænsninger i denne metode. For det første er det en ikke-målrettet teknik, hvilket betyder, at den ikke giver den nøjagtige mængde 5-mC, men snarere den relative overflod baseret på det samlede areal og den integrerede intensitet af fluorescens. Derudover er denne protokol kun blevet testet på embryoner før segmentering, så hvis der testes senere udviklingsstadier, kan der være behov for yderligere optimering. Da metoden desuden er IHC-baseret, kan den være modtagelig for ikke-specifik binding; derfor er det ikke sikkert, at det kun er farvning af 5-mC lokaliseret til DNA, men kan også farve 5-mC lokaliseret til RNA. Endelig kan optimering af dataanalysetærsklen være nødvendig afhængigt af kemikaliet og strengheden af de betingelser, der foretrækkes.
Samlet set giver denne metode hurtig og omkostningseffektiv detektion af 5 mC på tværs af flere udviklingsstadier og kemiske koncentrationer3. Det giver derfor et alternativ til omkostningsoverkommelige bisulfitsekventeringsbaserede tilgange. Ved at tilbyde denne protokol kan efterforskere bruge denne metode til hurtigt at screene kemikalier og vurdere, hvordan overfloden af 5 mC kan påvirkes under tidlig embryonal udvikling. Derudover kan denne metode anvendes som et præscreeningsværktøj til at identificere koncentrationsområdet, udviklingsperioden og / eller følsomhedsvinduet, hvor kemikaliet af interesse påvirker 5-mC overflod. Alternativt kan den samme metode anvendes til en anden biomarkør og antistof, omend der er behov for yderligere optimering. Ved at bruge denne metode kan en efterforsker hurtigt, effektivt og omkostningseffektivt screene og identificere et kemikalie, der ændrer den relative overflod af 5 mC inden for zebrafiskembryoner, inden der investeres i arbejdskrævende bisulfitsekventeringsbaserede tilgange. Denne metode er imidlertid zebrafiskspecifik, og der er behov for yderligere forskning for at afgøre, om 5 mC kan påvises in situ i tidlige embryoner af andre modelorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen kendte konkurrerende økonomiske interesser eller personlige forhold, der kunne have vist sig at påvirke det arbejde, der er rapporteret i dette papir.
Acknowledgments
Forskningsstøtte blev ydet af et UCR Graduate Division Fellowship til SAB, et NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) til SAB og et National Institutes of Health-tilskud (R01ES027576) og USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) til DCV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
- Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals. Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).
- Huang, W., et al. Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA. Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).
- Avila-Barnard, S., et al. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos. Environmental Research. 211, 113078 (2022).
- Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning. Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).
- Vliet, S. M. F., et al. Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).
- Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly. Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).
- Dasgupta, S., et al. Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish. Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).
- McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure. Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).
- Geiman, T. M., Muegge, K. DNA methylation in early development. Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).
- Wossidlo, M., et al. 5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming. Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).
- Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. DNA methylation-mediated epigenetic control. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).
- Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).
- Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. Mammalian cytosine methylation at a glance. Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).
- Baylin, S. B., Jones, P. A. A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications. Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).
- Robertson, K. D. DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).
- Robertson, K. D. DNA methylation and human disease. Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products. Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
