Summary
Cet article présente les protocoles étape par étape pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de la mouche orientale des fruits Bactrocera dorsalis. Les étapes détaillées fournies par ce protocole normalisé serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.
Abstract
La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis, est une espèce de ravageur très envahissante et adaptative qui cause des dommages aux agrumes et à plus de 150 autres cultures fruitières dans le monde. Étant donné que les mouches des fruits adultes ont une grande capacité de vol et que les femelles pondent leurs œufs sous la peau des fruits, les insecticides nécessitant un contact direct avec le ravageur donnent généralement de mauvais résultats au champ. Avec le développement d’outils de biologie moléculaire et de technologie de séquençage à haut débit, de nombreux scientifiques tentent de développer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement. Il s’agit notamment de pesticides basés sur l’ARNi ou l’édition de gènes qui régulent à la baisse ou réduisent au silence les gènes (cibles moléculaires), tels que les gènes olfactifs impliqués dans la recherche du comportement, chez divers insectes nuisibles. Pour adapter ces stratégies à la lutte contre la mouche orientale des fruits, des méthodes efficaces de recherche de gènes fonctionnels sont nécessaires. Les gènes ayant des fonctions critiques dans la survie et la reproduction de B. dorsalis servent de bonnes cibles moléculaires pour l’élimination et/ou le silençage des gènes. Le système CRISPR/Cas9 est une technique fiable utilisée pour l’édition de gènes, en particulier chez les insectes. Cet article présente une méthode systématique pour la mutagénèse CRISPR / Cas9 de B. dorsalis, y compris la conception et la synthèse d’ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage des mutants. Ces protocoles serviront de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs intéressés par les études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.
Introduction
La mouche orientale des fruits, Bactrocera dorsalis , est une espèce d’insecte ravageur cosmopolite qui cause des dommages à plus de 150 espèces de cultures fruitières, dont la goyave, la mangue, Eugenia spp., la cerise du Surinam, les agrumes, le nèfle et la papaye1. Les dégâts causés dans la seule province du Guangdong (Chine) sont estimés à plus de 200 millions de yuans. Les femelles adultes insèrent leurs œufs sous la peau des fruits mûrs ou mûrs, provoquant la pourriture et l’abscission du fruit, ce qui diminue la qualité des fruits et le rendement global de la culture2. Étant donné que les mouches des fruits adultes ont une grande capacité de vol et que leurs larves pénètrent dans la peau du fruit, les insecticides nécessitant un contact direct avec le ravageur donnent de mauvais résultats au champ. De plus, l’utilisation intensive d’insecticides a accru la résistance de B. dorsalis à divers produits chimiques agricoles, rendant la lutte contre ces ravageurs nuisibles encore plus difficile3. Par conséquent, l’élaboration de stratégies de lutte antiparasitaire efficaces et respectueuses de l’environnement est désespérément nécessaire.
Récemment, avec le développement d’outils de biologie moléculaire et de technologies de séquençage à haut débit, les scientifiques tentent de développer des stratégies de lutte antiparasitaire respectueuses de l’environnement, telles que l’ARNi, qui ciblent la fonctionnalité de gènes importants (cibles moléculaires) de divers insectes nuisibles. Les gènes essentiels à la survie et à la reproduction de l’organisme nuisible peuvent être identifiés au moyen d’études de gènes fonctionnels et servir en outre de cibles moléculaires potentielles pour l’amélioration d’outils de lutte antiparasitaire spécifiquement ciblés et respectueux de l’environnement4. Pour adapter ces stratégies à la lutte contre la mouche orientale des fruits, des méthodes efficaces de recherche de gènes fonctionnels sont nécessaires.
Le système endonucléase CRISPR/Cas (clustered regular interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated) a été initialement découvert chez les bactéries et les archées et s’est avéré être un mécanisme adaptatif impliqué dans la reconnaissance et la dégradation de l’ADN intracellulaire étranger, tel que celui introduit par l’infection des bactériophages5. Dans le système CRISPR de type II, l’endonucléase Cas9 est guidée par de petits ARN associés (ARNcr et ARNtrac) pour cliver l’ADN 6,7,8 et est devenue l’un des outils les plus utilisés pour l’édition de gènes à ce jour9,10,11,12. Étant donné que le système CRISPR / Cas9 présente plusieurs avantages, tels qu’une efficacité élevée du silençage génique et un faible coût, il a déjà été appliqué à l’édition de gènes chez diverses espèces d’insectes, notamment Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 et Bombyx mori16. Chez B. dorsalis, les gènes liés à la couleur du corps, au dimorphisme des ailes et à la détermination du sexe ont été éliminés avec succès à l’aide de CRISPR / Cas917,18,19. Cependant, les procédures détaillées pour l’application de CRISPR/Cas9 chez cet insecte restent incomplètes. De plus, certaines étapes fournies par les chercheurs pour l’édition du gène B. dorsalis sont également variées et nécessitent une normalisation. Par exemple, les formes de Cas9 étaient différentes dans les références publiées17,18,19.
Cet article fournit une méthode systématique pour la mutagénèse de B. dorsalis en utilisant le système CRISPR / Cas9, y compris la conception et la synthèse d’ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage des mutants. Ce protocole servira de guide utile pour générer des mouches mutantes pour les chercheurs qui s’intéressent aux études de gènes fonctionnels chez B. dorsalis.
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Protocol
1. Conception de cibles et synthèse in vitro de l’ARNg
- Prédire la structure des gènes cibles d’intérêt et déterminer les limites entre les exons et les introns grâce à l’analyse bioinformatique du génome de B. dorsalis (les applications logicielles utilisées ici sont répertoriées dans le tableau des matériaux).
REMARQUE: BLAT20 a été utilisé pour rechercher des loci génétiques potentiels dans le génome. Les lectures de séquençage d’ARN de haute qualité (transcriptome) ont été alignées sur les loci génétiques acquis à l’aide de Hisat221. Samtools22 a été utilisé pour générer les fichiers bam triés. Les fichiers bam triés ont été entrés dans Stringtie223 pour fournir les transcriptions assemblées. Les transcriptions d’assemblage et les informations sur les loci géniques ont été combinées par Transdecoder24. Les résultats obtenus à partir de Transdecoder ont été visualisés dans les outils IGV25 et les limites entre exons et introns ont pu être déterminées. - Identifier les régions cibles appropriées dans le site du gène cible candidat. La longueur totale doit être inférieure à 750 pb pour un séquençage plus pratique (Figure 1B). Concevoir des amorces spécifiques pour amplifier la zone cible à partir de l’ADN génomique de type sauvage par PCR (Figure 1B) (Amorces : A-amorce : AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT, amorce R : CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). Cloner les produits de PCR en un vecteur final émoussé26 et sélectionner 20 colonies bactériennes individuelles pour le séquençage afin de déterminer le degré de conservation de la région cible dans les populations d’insectes de laboratoire.
- Un site cible typique contient un motif de séquence à trois nucléotides (NGG ou CCN) et une séquence de 20 pb adjacente aux motifs NGG ou CCN (20 pb-NGG ou CCN-20 pb). Faire exploser les sites cibles candidats contre le génome de B. dorsalis et s’assurer que l’efficacité prévue est suffisamment élevée et que le taux de ciblage hors ciblage est faible; Plusieurs logiciels open source peuvent automatiquement prédire cela. Dans ce protocole, sgRNAcas9 -AI27 est utilisé pour sélectionner et évaluer les cibles optimales. Les détails d’utilisation peuvent être trouvés dans le manuel de ce logiciel.
NOTE: Les sites cibles possibles fermés à l’UTR 5' du gène cible et 1-2 Gs au début de la séquence de 20 pb sont favorisés. Afin d’obtenir une délétion importante qui sera identifiée par PCR suivie d’une électrophorèse sur gel d’agarose, il est recommandé de concevoir deux cibles28 séparées par plus de 100 pb (Figure 1C). - Utilisez le kit de synthèse d’ARNg disponible dans le commerce pour générer le sgRNA conçu. Effectuez chaque étape en suivant le guide de l’utilisateur. Remettez en suspension le produit d’ARNg dans de l’eau sans nucléase, quantifiez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis et stockez à -80 °C avant utilisation (la concentration d’ARNg unique synthétisé avec succès [10 μL] avec le kit utilisé ici est d’environ 4000-6000 ng / μL, voire plus).
NOTE: Bien que la génération des mouches mutantes soit la première étape pour chaque chercheur, le contrôle négatif approprié pour l’expérience / analyse en aval est essentiel. La génération de ces contrôles aux côtés des mutants permet aux chercheurs d’économiser du temps et des efforts. Par exemple, définissez scrambled sgRNA comme contrôle négatif.
2. Collecte et préparation des embryons
- Placer les pupes de B. dorsalis dans des cages en plastique. Fournir un mélange de sucre et de levure (1:1) comme nourriture avec une source d’eau après la fermeture des adultes (figure 2A, B). Les conditions d’élevage sont de 55 % d’humidité relative (HR), 26,5 °C et un cycle de 14h10 L/D (lumières allumées à six heures du matin, lumières éteintes à huit heures du soir).
- La plupart des adultes atteignent la maturité sexuelle 10 jours après l’émergence. Fournir un environnement approprié pour aider les mouches adultes à s’accoupler autant que possible. Idéalement, utilisez un support lumineux avec une lumière de 30-50 lux. Cela peut améliorer la fécondité des femelles, améliorant ainsi l’efficacité de la collecte d’embryons.
REMARQUE: Mettre les adultes (âgés de 5 à 6 jours après l’émergence) dans un environnement faiblement éclairé (<100 lux) peut favoriser l’accouplement. Généralement, le pic de ponte se produit à 15h00 (14h10/L:D, lumières allumées à 06h00, lumières éteintes à 20h00); Pour obtenir suffisamment d’embryons, il est recommandé de placer des chambres de ponte dans les cages 30 minutes avant 15h00. - Placez une gaze de 200 mailles dans la chambre de ponte, à 1-2 mm du couvercle de la chambre. Cela aidera à obtenir autant d’embryons que possible.
REMARQUE: Évitez de laisser les embryons trempés dans du jus d’orange ou frottés avec de la gaze, car cela peut réduire considérablement le taux de survie des embryons. - Placez une nouvelle chambre de ponte dans la cage lorsque la configuration de micro-injection est prête. Recueillir les embryons toutes les 10 minutes à l’aide d’une fine brosse humide, puis les aligner sur une plaque d’injection faite par vous-même (plexiglas d’une longueur de 55 mm, d’une largeur de 13,75 mm et d’une hauteur de 5 mm, Une rainure peu profonde de 45 mm x 5 mm x 0,3 mm est ouverte au milieu pour faciliter le placement des œufs). Si les embryons ont une pression interne élevée, une légère dessiccation à <10% HR pendant 10 min est facultative. Trempez les embryons dans de l’huile d’halocarbure pendant l’injection pour éviter toute dessiccation supplémentaire (Figure 2C).
3. Micro-injection de l’embryon
- Préparez l’aiguille d’injection de verre à l’aide d’un extracteur de micropipette.
REMARQUE: La définition des paramètres suivant le guide de l’utilisateur est importante. Dans ces protocoles, différentes formes d’aiguilles peuvent être réalisées en utilisant les paramètres suggérés par le manuel de l’extracteur de micropipettes. Le capillaire en verre doit être aussi propre que possible pour empêcher la poussière de boucher l’aiguille. - Préparez la solution de travail. Mélanger la protéine Cas9 et l’ARNg correspondant aux concentrations de travail suivantes : ARNs, 300 ng/μL; Protéine Cas9, 150 ng/μL. Ajouter 1 μL de rouge de phénol au mélange pour servir de moyen pratique de marquer les embryons injectés. Placer le mélange préparé sur de la glace pour éviter la dégradation de l’ARNg.
REMARQUE: Utilisez des embouts de pipette sans nucléase et des tubes PCR. La concentration de protéine Cas9 doit être inférieure ou égale à 150 ng/μL; Des concentrations plus élevées sont toxiques et diminuent considérablement le taux de survie de l’embryon. Cas9 pourrait également être livré au format ADN ou ARNm pour réussir l’édition de gènes17,19. Dans ce protocole, la protéine Cas9 est recommandée car les ARNm sont sensibles à la dégradation et l’expression de la protéine Cas9 à partir de l’ADN plasmidique prend du temps pour la transcription et la traduction. - Réglez les paramètres de l’injecteur. Le programme initial est Pi-500 hPa, Ti-0.5 s et PC-200 hPa. Ajustez davantage ces paramètres au besoin pendant la micro-injection.
- Ajouter 3 μL du mélange dans l’aiguille d’injection. Évitez d’introduire des bulles d’air qui peuvent éventuellement obstruer l’aiguille. Ouvrez l’aiguille à l’aide d’un microbroyeur.
- Connectez l’aiguille au micromanipulateur conformément au guide de l’utilisateur (Figure 2E).
- Placez l’assiette avec des embryons alignés sur la table objective. Ajustez la position de la micropipette sous un microscope optique fin, en plaçant la micropipette et l’embryon sur le même plan. Ajustez le volume des gouttelettes en appuyant sur la pédale; 1/10 du volume d’embryons est recommandé.
- Insérez l’extrémité de l’aiguille dans la partie postérieure (pôle végétal) de l’embryon. Administrer les mélanges dans l’embryon en appuyant sur la pédale de l’injecteur. Si du rouge phénol est ajouté, une couleur légèrement rougeâtre est observée instantanément.
REMARQUE: Un petit volume de reflux cytoplasmique du trou d’épingle ne diminuera pas le taux de survie de l’embryon. L’injection de 200 embryons est suffisante pour réussir la mutagénèse d’un gène. L’ajout de plus d’huile d’halocarbure pour immerger les embryons peut empêcher une dessiccation supplémentaire. L’injection doit être effectuée avant la formation des cellules polaires, ce qui garantit que chaque mutation peut être héritée efficacement.
4. Élevage d’insectes après injection
- Placez la plaque d’injection avec les embryons injectés dans une chambre climatique artificielle maintenue à 55% HR, 26,5 ° C et un cycle de 14h10 L / D (lumières allumées à six heures du matin, lumières éteintes à huit heures du soir).
- Après l’injection, la formation de l’embryon prend généralement 24 heures pour compléter et 36 heures pour éclore. Utilisez une brosse à pointe fine pour transférer les larves dans un régime larvaire préparé. Ramassez les larves trois ou quatre fois par jour jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de larves. Généralement, les larves prennent 2-3 jours pour terminer l’éclosion et se nymphosent dans les 7 jours.
NOTE: Un régime à base de maïs a été utilisé pour nourrir les larves. La recette contient 150 g de farine de maïs, 150 g de banane, 0,6 g de benzoate de sodium, 30 g de levure, 30 g de saccharose, 30 g d’essuie-tout, 1,2 mL d’acide chlorhydrique et 300 mL d’eau29. Minimiser le temps de laissage des larves dans l’huile (<2 h). Déplacez les larves dans le régime alimentaire immédiatement après l’éclosion autant que possible. Cela peut augmenter considérablement les taux de survie et de nymphose. Ne donnez pas trop de nourriture (un régime avec 2/3 d’une boîte de Petri de 90 mm suffit pour 30 larves); Sinon, il moisira et diminuera le taux de survie des larves. - Mettez les larves matures dans le sable humide pour les nymphoser. La phase de nymphose dure environ 10 jours. Déplacez les pupes dans des cages en plastique avant le début de l’éclosion.
5. Dépistage des mutants
- Un organigramme du dépistage des mutants est illustré à la figure 3A. Croisement d’adultes G0 obtenus par micro-injection avec des adultes de type sauvage pour obtenir des lignées hétérozygotes. Vérifier le type de mutations que la progéniture (G1) porte par génotypage.
- Auto-croisement G1 avec le même génotype mutant pour obtenir des lignées homozygotes dans G2. Si les génotypes des mutants de G1 sont entièrement différents, croiser les hétérozygotes avec des mouches de type sauvage. Les lignées homozygotes sont généralement obtenues en G3. Maintenir deux ou trois lignées homozygotes pour les expériences de phénotypage ultérieures.
- Utilisez l’ADN génomique d’un puparium frais ou d’une seule jambe médiane d’adultes individuels pour effectuer le génotypage. Concevoir des amorces spécifiques pour amplifier la zone cible; Les amorces doivent fixer au moins 50 points de base en amont et en aval du site cible. Reportez-vous à l’étape 1.2 pour les détails de l’amorce.
REMARQUE: Étant donné que la quantité d’ADN dans un puparium est extrêmement faible, les kits d’extraction d’ADN disponibles dans le commerce sont recommandés. - Effectuer la PCR dans les conditions de cyclage suivantes : 98 °C pendant 3 min, suivi de 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 15 s à une température de recuit appropriée pour les amorces conçues, 72 °C pendant 35 s, suivi d’une extension finale de 72 °C pendant 10 min.
- Séquencer les produits PCR purifiés. Lorsque plusieurs pics de chevauchement adjacents au site cible sont détectés (Figure 3B), une mutagénèse réussie s’est produite. Sous-cloner les produits de PCR purifiés en un vecteur émoussé et sélectionner 10 colonies bactériennes individuelles pour le séquençage afin de vérifier le génotype des mutants. Maintenir les lignes présentant des mutations de décalage d’image et des terminaisons de translation prématurées (Figure 3C).
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’effectuer le séquençage d’un seul clone pour vérifier le génotype des individus G0. Il suffit de séquencer les produits de PCR et de maintenir les individus avec des pics de chevauchement multiples évidents adjacents au site cible. Après l’injection initiale, il est recommandé de sélectionner 10 embryons pour extraire l’ADN génomique et de séquencer les produits PCR conformément aux normes de l’étape 5.3. Cela peut aider à prédire les taux de mutation à l’avance. Dans cette étude, le séquençage de sanger pour déterminer le génotype a été effectué par une société de séquençage.
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Representative Results
Ce protocole présente des étapes détaillées pour le développement de mutants de B. dorsalis à l’aide de la technologie CRISPR / Cas9, y compris des résultats représentatifs de la sélection de l’ADNg, de la collecte d’embryons et de la micro-injection, de l’entretien des insectes et du dépistage des mutants.
L’exemple du site cible du gène sélectionné est situé dans le troisième exon (Figure 1C). Ce site est hautement conservé, et une seule bande a été détectée par électrophorèse sur gel pour le modèle d’ADN pour l’ARNg synthétique (Figure 1D) et l’ARNg obtenu par transcription in vitro (Figure 1E).
L’injection dans 200 œufs fraîchement récoltés a été effectuée comme décrit à la section 3. Les embryons ont été maintenus en suivant les protocoles décrits aux étapes 4.1 à 4.3. Comme détecté par séquençage des produits PCR, 80% des individus G0 sont des mutants mosaïques (Tableau 1). Ici, les mutants avec une délétion de 8 pb qui a entraîné l’arrêt prématuré de la traduction des acides aminés dans G1 ont été sélectionnés (Figure 3C). Cela devrait entraîner des modifications des fonctions correspondantes de ce produit génique chez B. dorsalis. Les G1 sélectionnés ont été croisés avec des hétérozygotes de type sauvage pour obtenir des hétérozygotes G2. Les hétérozygotes et les homozygotes G2 autocroisés ont été récupérés dans la génération suivante, démontrant que ce schéma est efficace pour développer des mutants de B. dorsalis et pourrait être plus largement appliqué dans les études de gènes fonctionnels chez cette espèce et des espèces étroitement apparentées.
Figure 1: Préparation de l’ARNg. (A) Procédures générales pour la préparation de l’ARNg. (B) Zone cible amplifiée par PCR à partir d’ADNg (100 pb). (C) Exemple de structure du gène cible et du site de clivage cible par Cas9. (D) Assemblage PCR de sgRNA (~100 pb). (E) Synthèse de l’ARNg par transcription et purification in vitro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Micro-injection d’embryons. (A) Le processus et la méthode d’injection. B) Dispositif de prélèvement d’embryons, pondant des œufs sur de la gaze. (C) Aligner les embryons avec de l’eau et les couvrir d’huile d’halocarbure. D) Extracteur de micropipettes. (E) L’ensemble de la configuration du système de micro-injection. Microscope (à gauche), microinjecteur et micromanipulateur (au milieu) et pompe à air automatique (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Dépistage des mutants. (A) Accouplement des mutants et acquisition d’homozygotes. (B) Produits de PCR du génome mutant qui génèrent un ensemble distinct de pics à la cible. (C) L’un des types de mutation et les changements d’acides aminés. Les mutations de délétion entraînent l’arrêt prématuré de la traduction. Abréviations : HE = hétérozygotes, HO = homozygotes. Contrôle: embryon injecté avec des sgRNA brouillés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Mélange d’injection | Embryons injectés | Larves écloses | Nymphes | Mosaïque G0 | ||
| (Mosaïque/Total adultes) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Rouge de phénol (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled ARNg1 (300 ng/μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled ARNg2 (300 ng/μL) | ||||||
| Cas9 (150 ng/μL) | ||||||
| Rouge de phénol (1 μL) | ||||||
Tableau 1 : Survie et mutagénèse de B. dorsalis après micro-injections.
| Problème | Cause(s) potentielle(s) | Solutions | |
| Collecte d’embryons inefficace | 1. Les adultes sont en mauvais état | 1.Assurer la disponibilité de la nourriture et de l’eau, en particulier la teneur en sucre de la nourriture. | |
| 2. Accouplement insuffisant | 2. Accouplement à l’avance dans des conditions sombres de 30 à 50 Lux. Il est préférable de sélectionner des adultes accouplés âgés de 12 à 15 jours. | ||
| Faible éclosion des œufs après injection | 1. Embryons de mauvaise qualité | 1. Cueillez des œufs frais et dodus et badigeonnez-les doucement avec une brosse imbibée d’eau. | |
| 2. L’aiguille ne convient pas | 2. La pointe de l’aiguille est aussi petite que possible pour minimiser les dommages à l’œuf pendant l’injection. | ||
| 3. Élevage inadéquat des œufs après injection | 3. Les œufs doivent être maintenus hydratés après l’injection pour éviter que la déshydratation ne se dessèche. Les œufs peuvent également être transférés directement dans les aliments après l’injection. | ||
| Faible taux de survie larvaire | 1. Les aliments moisis ne conviennent pas à la croissance des larves | 1. Pour les larves nouvellement écloses, ajoutez une petite quantité de nourriture. Trop de nourriture moisira ou se desséchera et affectera la croissance des larves. | |
| 2. Larves nouvellement écloses imbibées d’huile pendant une longue période | 2.Les larves nouvellement écloses doivent être transférées à temps dans la nourriture larvaire ou les œufs doivent être cueillis directement dans la nourriture après l’injection. | ||
| Le taux de mutation chez l’adulte est faible | 1. Faible qualité de l’ARNg | 1. Opération expérimentale rigoureuse pour synthétiser des ARNg de haute qualité afin de prévenir la dégradation. | |
| 2. Des cibles inefficaces mènent à des cibles hors cibles | 2. Examiner les cibles de haute efficacité en les parvenant, comme nous l’avons mentionné. | ||
Tableau 2 : Problèmes possibles liés à la construction de mutants, causes potentielles et solutions.
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Discussion
Le système CRISPR/Cas9 est l’outil d’édition de gènes le plus largement utilisé et a diverses applications, telles que la sélection génique30, la sélection des cultures31 et les études fondamentales des fonctions génétiques32. Ce système a déjà été appliqué à l’édition de gènes chez diverses espèces d’insectes et a servi d’outil efficace pour les études de gènes fonctionnels chez les ravageurs. Les protocoles que nous présentons ici normalisent la procédure de conception et de synthèse des ARN guides, la collecte d’embryons, l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et le dépistage mutant. De plus, un tableau de dépannage a été ajouté pour résumer le problème potentiel de chaque étape, et leurs solutions ont été fournies pour alléger la charge de travail et améliorer l’efficacité (tableau 2). Cette procédure fournit un moyen fiable de modifier les gènes d’intérêt et améliore les études génomiques fonctionnelles chez B. dorsalis.
Tout d’abord, la sélection des gènes cibles est essentielle pour augmenter l’efficacité du système CRISPR / Cas9, et plusieurs logiciels open source tels que ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 et CRISPR optimal target finder 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) peuvent générer automatiquement des cibles et prédire les taux potentiels hors cible. Étant donné que le taux de fécondité élevé de B. dorsalis facilite la collecte d’embryons, les taux de mutants peuvent être prédits en sacrifiant une partie des embryons pour l’extraction de l’ADN et le séquençage de la région cible. Si le séquençage n’est pas disponible en laboratoire, il est également recommandé d’utiliser l’endonucléase T7 I pour prédire les tauxde mutation 37. Les sites cibles avec des taux de délétion génomique élevés peuvent être sélectionnés par ces trois méthodes, et par conséquent, l’efficacité de l’édition de gènes chez B. dorsalis pourrait être augmentée.
Le stade de développement de l’embryon détermine si les mutations seront héritées. Afin d’obtenir des mutations héréditaires, l’édition de gènes doit se produire dans les cellules germinales. En général, le mélange d’ARNg et de Cas9 ne peut pas être livré dans les cellules germinales après la formation de cellules polaires. Chez B. dorsalis, la formation des cellules polaires s’est produite 3 h après la ponte 38, alors que le protocole détaillé ici pour B. dorsalis prend30 minutes entre la collecte des embryons et la fin de la micro-injection. Pendant l’injection, presque aucune cellule polaire ne se forme dans l’extrémité végétale de l’embryon; par conséquent, les mutations génétiques obtenues dans le G0 devraient être héritées efficacement. Le temps nécessaire à la microinjection est également inférieur à la méthode mentionnée dans des articles publiés précédemment (généralement 1-3 h)18,19.
Il est important de minimiser les dommages mécaniques ou chimiques pendant le processus de collecte et de manipulation des embryons. Utilisez une brosse fine pour aligner délicatement les embryons sur la plaque d’injection. La position d’injection doit refléter les travaux précédemment réalisés sur Drosophila (Méthodes - laboratoire de Nicolas Gompel, http://gompel.org/methods) et Ceratitis capitata39. Injecter des embryons au pôle végétal; N’insérez jamais l’aiguille dans le poteau de l’animal. Préparer l’aiguille en suivant le guide de l’extracteur de micropipette; L’ouverture de l’aiguille doit être aussi petite que possible pour éviter un reflux cytoplasmique excessif. La méthode mentionnée dans les études publiées chez B. dorsalis a généralement déchorionné les embryons avec de l’hypochorite de sodium17,18,19; Cela pourrait causer des dommages chimiques et diminuer les taux de survie des embryons. Dans ce protocole, les embryons ne sont pas déchorionnés et l’injection fonctionne toujours bien. Les dommages chimiques aux embryons pourraient être minimes.
L’élevage d’insectes post-injection est très important. Le protocole d’élevage standardisé fourni ici peut servir de référence pour l’élevage d’autres espèces de mouches des fruits, en particulier les espèces de Bactrocera . Les embryons peuvent être immergés dans l’huile pour éviter la dessiccation pendant l’injection à l’aide de notre plaque d’injection faite maison. Minimiser le temps que les larves passent dans l’huile (<2 h) pour atteindre des taux de survie dans le G0 supérieurs à 50%.
Une méthode non invasive d’extraction génomique de l’ADN est recommandée pour la détection des mutants. Par exemple, certains chercheurs sur les lépidoptères suggèrent que les exsudations des larves du dernier stade pourraient être utilisées pour extraire l’ADN génomique en vue d’un génotypage plus poussé. Pour B. dorsalis, une méthode non invasive consiste à extraire l’ADN génomique d’un puparier frais. L’injection de plusieurs sgRNA ciblant un gène marqueur et le gène d’intérêt pourrait également améliorer l’identification des mutants. Par exemple, les ARNg co-injectés ciblant la couleur des yeux (kmo) et le récepteur hormonal juvénile (Met) peuvent produire 75% de la progéniture avec des mutations doubles chez les moustiques. Les mutants rencontrés ont été préalablement examinés en fonction de la couleur des yeux des larves37. Cela devrait être évalué chez B. dorsalis à l’avenir afin d’améliorer encore l’efficacité de l’édition de gènes chez cette espèce d’insecte en utilisant le système CRISPR / Cas9.
En conclusion, le système CRSIPR/Cas9 est un outil puissant en génomique fonctionnelle chez B. dorsalis. Nos protocoles détaillés fournissent des informations utiles pour aider les chercheurs à obtenir une collecte efficace d’embryons, des taux de survie idéaux des larves et l’efficacité d’édition souhaitée. Cela pourrait être un moyen simple et rapide d’aider les chercheurs à obtenir une mutagénèse chez B. dorsalis. Cette technique n’a pas pu être appliquée dans les études fonctionnelles des gènes létaux car les mutations héréditaires nécessitent des croisements réussis. Les études futures pourraient se concentrer sur le développement d’outils transgéniques pour exprimer des éléments CRISPR spécifiques au stade ou aux tissus afin de briser cette limitation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le programme scientifique et technologique de Shenzhen (subvention n ° KQTD20180411143628272) et des fonds spéciaux pour l’innovation en science, la technologie et le développement industriel du nouveau district de Shenzhen Dapeng (subvention n ° PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
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