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Biology

ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई बैक्ट्रोसेरा डोरसेलिस के CRISPR/Cas9 म्यूटेनेसिस के लिए प्रोटोकॉल

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64195

Summary

यह पेपर ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई बैक्ट्रोसेरा डोरसेलिस के सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 म्यूटेनेसिस के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस मानकीकृत प्रोटोकॉल द्वारा प्रदान किए गए विस्तृत कदम बी डोरसैलिस में कार्यात्मक जीन अध्ययन के लिए उत्परिवर्ती मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए एक उपयोगी मार्गदर्शिका के रूप में काम करेंगे।

Abstract

ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई, बैक्ट्रोसेरा डोरसैलिस, एक अत्यधिक आक्रामक और अनुकूली कीट प्रजाति है जो साइट्रस और दुनिया भर में 150 से अधिक अन्य फलों की फसलों को नुकसान पहुंचाती है। चूंकि वयस्क फल मक्खियों में महान उड़ान क्षमता होती है और मादाएं फलों की खाल के नीचे अपने अंडे देती हैं, कीट के साथ सीधे संपर्क की आवश्यकता वाले कीटनाशक आमतौर पर खेत में खराब प्रदर्शन करते हैं। आणविक जैविक उपकरण और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के विकास के साथ, कई वैज्ञानिक पर्यावरण के अनुकूल कीट प्रबंधन रणनीतियों को विकसित करने का प्रयास कर रहे हैं। इनमें आरएनएआई या जीन संपादन-आधारित कीटनाशक शामिल हैं जो विभिन्न कीट कीटों में जीन (आणविक लक्ष्य) को डाउनरेगुलेट या मौन करते हैं, जैसे कि खोज व्यवहार में शामिल घ्राण जीन। ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई कंट्रोल के लिए इन रणनीतियों को अनुकूलित करने के लिए, कार्यात्मक जीन अनुसंधान के लिए प्रभावी तरीकों की आवश्यकता है। पृष्ठीय के अस्तित्व और प्रजनन में महत्वपूर्ण कार्यों वाले जीन जीन वध और / या साइलेंसिंग के लिए अच्छे आणविक लक्ष्य के रूप में काम करते हैं। CRISPR / Cas9 प्रणाली जीन संपादन के लिए उपयोग की जाने वाली एक विश्वसनीय तकनीक है, खासकर कीड़ों में। यह पेपर बी डोरसैलिस के सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 म्यूटेनेसिस के लिए एक व्यवस्थित विधि प्रस्तुत करता है, जिसमें गाइड आरएनए का डिजाइन और संश्लेषण, भ्रूण एकत्र करना, भ्रूण इंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग शामिल है। ये प्रोटोकॉल बी डोरसेलिस में कार्यात्मक जीन अध्ययन में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए उत्परिवर्ती मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए एक उपयोगी मार्गदर्शिका के रूप में काम करेंगे।

Introduction

ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई, बैक्ट्रोकेरा डोरसैलिस, एक महानगरीय कीट कीट प्रजाति है जो अमरूद, आम, यूजेनिया एसपीपी, सूरीनाम चेरी, साइट्रस, लोकाट और पपीता 1 सहित फलों की फसलों की150 से अधिक प्रजातियों को नुकसान पहुंचाती है। अकेले गुआंग्डोंग प्रांत (चीन) में 200 मिलियन युआन से अधिक की क्षति का अनुमान है। वयस्क मादाएं पकने या पके हुए फलों की त्वचा के नीचे अपने अंडे डालती हैं, जिससे फल का क्षय और अवशोषण होता है, जिससे फल की गुणवत्ता और फसल की समग्र उपज कम होजाती है। चूंकि वयस्क फल मक्खियों में बड़ी उड़ान क्षमता होती है और उनके लार्वा फलों की त्वचा में बोर होते हैं, इसलिए कीट के साथ सीधे संपर्क की आवश्यकता वाले कीटनाशक क्षेत्र में खराब प्रदर्शन करते हैं। इसके अतिरिक्त, कीटनाशकों के व्यापक उपयोग ने विभिन्न कृषि रसायनों के खिलाफ बी डोरसैलिस के प्रतिरोध को बढ़ा दिया है, जिससे इन हानिकारक कीटों का नियंत्रण और भी कठिन होगया है। इसलिए, प्रभावी और पर्यावरण के अनुकूल कीट प्रबंधन रणनीतियों के विकास की सख्त जरूरत है।

हाल ही में, आणविक जैविक उपकरणों और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के विकास के साथ, वैज्ञानिक पर्यावरण के अनुकूल कीट प्रबंधन रणनीतियों को विकसित करने का प्रयास कर रहे हैं, जैसे कि आरएनएआई, जो विभिन्न कीट कीटों के महत्वपूर्ण जीन (आणविक लक्ष्य) की कार्यक्षमता को लक्षित करते हैं। कीट के अस्तित्व और प्रजनन के लिए महत्वपूर्ण जीन को कार्यात्मक जीन अध्ययन के माध्यम से पहचाना जा सकता है और आगे विशेष रूप से लक्षित और पर्यावरण के अनुकूल कीट प्रबंधनउपकरणों के सुधार के लिए संभावित आणविक लक्ष्यों के रूप में काम किया जा सकता है। ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई कंट्रोल के लिए ऐसी रणनीतियों को अनुकूलित करने के लिए, कार्यात्मक जीन अनुसंधान के लिए प्रभावी तरीकों की आवश्यकता है।

CRISPR/Cas (नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट/सीआरआईएसपीआर-संबद्ध) एंडोन्यूक्लिज़ सिस्टम को शुरू में बैक्टीरिया और आर्किया में खोजा गया था और विदेशी इंट्रासेल्युलर डीएनए की पहचान और गिरावट में शामिल एक अनुकूली तंत्र पाया गया था, जैसे कि बैक्टीरियोफेज 5 को संक्रमित करके पेश कियागया था। टाइप II CRISPR प्रणाली में, Cas9 एंडोन्यूक्लिज़ को डीएनए 6,7,8 को छोड़ने के लिए छोटे संबद्ध आरएनए (सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए) द्वारा निर्देशित किया जाता है और यह जीन-संपादन के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले उपकरणों में से एक बन गया है। चूंकि CRISPR / Cas9 प्रणाली के कई फायदे हैं, जैसे कि जीन साइलेंसिंग की उच्च दक्षता और कम लागत, यह पहले से ही विभिन्न कीट प्रजातियों में जीन संपादन के लिए लागू किया गया है, जिसमें एडीज एजिप्टी13,14, लोकस्टा मिग्राटोरिया15 और बॉम्बिक्स मोरी16 शामिल हैं। पृष्ठीयता में, शरीर के रंग, पंख द्विरूपता और लिंग निर्धारण से संबंधित जीन को CRISPR / Cas917,18,19 का उपयोग करके सफलतापूर्वक बाहर कर दिया गया है। हालांकि, इस कीट में CRISPR / Cas9 आवेदन के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं अधूरी हैं। इसके अलावा, बी डोरसैलिस जीन संपादन के लिए शोधकर्ताओं द्वारा प्रदान किए गए कुछ कदम भी विविध हैं और मानकीकरण की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, कैस 9 के रूप प्रकाशितसंदर्भों 17,18,19 में अलग थे।

कैस 9 प्रणाली का उपयोग करके बी डोरसैलिस के म्यूटेनेसिस के लिए एक व्यवस्थित विधि प्रदान करता है, जिसमें गाइड आरएनए का डिजाइन और संश्लेषण, भ्रूण एकत्र करना, भ्रूण इंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग शामिल है। यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उत्परिवर्ती मक्खियों को उत्पन्न करने के लिए एक उपयोगी मार्गदर्शिका के रूप में काम करेगा जो बी डोरसैलिस में कार्यात्मक जीन अध्ययन में रुचि रखते हैं।

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Protocol

1. एसजीआरएनए के लक्ष्य डिजाइन और इन विट्रो संश्लेषण

  1. रुचि के लक्ष्य जीन की संरचना की भविष्यवाणी करें और बी डोरसैलिस जीनोम के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के माध्यम से एक्सॉन और इंट्रोन्स के बीच की सीमाओं को निर्धारित करें (यहां उपयोग किए जाने वाले सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं)।
    नोट: बीएलएटी20 का उपयोग जीनोम में संभावित जीन लोकी की खोज के लिए किया गया था। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए-सेक रीड्स (ट्रांसस्क्रिप्टम) को हिसैट 221 का उपयोग करके अधिग्रहित जीन लोकी के साथ संरेखित किया गया था। Samtools22 का उपयोग क्रमबद्ध BAM फ़ाइलों को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। क्रमबद्ध बाम फ़ाइलों को इकट्ठा प्रतिलिपि प्रदान करने के लिए स्ट्रिंग्टी2 23 में इनपुट किया गया था। ट्रांसडेकोडर24 द्वारा इकट्ठा प्रतिलेख और जीन लोकी जानकारी को जोड़ा गया था। ट्रांसडेकोडर से प्राप्त परिणामों को आईजीवी टूल25 में देखा गया था और एक्सॉन और इंट्रोन्स के बीच की सीमाओं को निर्धारित किया जा सकता था।
  2. उम्मीदवार लक्ष्य जीन साइट के भीतर उपयुक्त लक्ष्य क्षेत्रों की पहचान करें। अधिक सुविधाजनक अनुक्रमण के लिए कुल लंबाई 750 बीपी से कम होनी चाहिए (चित्रा 1 बी)। पीसीआर (चित्रा 1 बी) द्वारा जंगली प्रकार के जीनोमिक डीएनए से लक्ष्य क्षेत्र को बढ़ाने के लिए विशिष्ट प्राइमर डिजाइन करें (प्राइमर: एफ-प्राइमर: AACATTGAATCTGGAATCAATCAGGTAACT, R-प्राइमर: CCTCATTGTTGATTAATTCCCCACTTC)। पीसीआर उत्पादों को एक कुंद अंत-वेक्टर26 में क्लोन करें और अनुक्रमण के लिए 20 अलग-अलग जीवाणु कॉलोनियों का चयन करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि प्रयोगशाला कीट आबादी में लक्ष्य क्षेत्र कितना संरक्षित है।
  3. एक विशिष्ट लक्ष्य साइट में एक तीन-न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम आकृति (एनजीजी या सीसीएन) और एक 20 बीपी अनुक्रम होता है जो एनजीजी या सीसीएन रूपांकनों (20 बीपी-एनजीजी या सीसीएन -20 बीपी) से सटे होते हैं। पृष्ठीय जीनोम के खिलाफ उम्मीदवार लक्ष्य साइटों को विस्फोट करें और सुनिश्चित करें कि अनुमानित दक्षता काफी अधिक है और ऑफ-टारगेटिंग दर कम है; कई ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम स्वचालित रूप से इसकी भविष्यवाणी कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, SgRNAAcas9-AI27 का उपयोग इष्टतम लक्ष्यों का चयन और मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। उपयोग का विवरण इस सॉफ्टवेयर के लिए मैनुअल में पाया जा सकता है।
    नोट: लक्ष्य जीन के 5 'यूटीआर के लिए बंद संभावित लक्ष्य साइटें और 20 बीपी अनुक्रम की शुरुआत में 1-2 जी का पक्ष लिया जाता है। एक बड़े विलोपन को प्राप्त करने के लिए जिसे पीसीआर द्वारा पहचाना जाएगा, जिसके बाद अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन होगा, 100 बीपीसे अलग दो लक्ष्यों को डिजाइन करने की सिफारिश की जाती है (चित्रा 1 सी)।
  4. डिज़ाइन किए गए एसजीआरएनए उत्पन्न करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीआरएनए संश्लेषण किट का उपयोग करें। उपयोगकर्ता के मार्गदर्शिका के बाद प्रत्येक चरण निष्पादित करें। न्यूक्लियस-मुक्त पानी में जीआरएनए उत्पाद को पुन: निलंबित करें, यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें, और उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (यहां उपयोग की जाने वाली किट के साथ सफलतापूर्वक संश्लेषित एकल जीआरएनए [10 μL] की एकाग्रता लगभग 4000-6000 एनजी /
    नोट: यद्यपि उत्परिवर्ती मक्खियों को उत्पन्न करना प्रत्येक शोधकर्ता के लिए पहला कदम है, डाउनस्ट्रीम प्रयोग / विश्लेषण के लिए उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण महत्वपूर्ण है। म्यूटेंट के साथ इन नियंत्रणों को उत्पन्न करना शोधकर्ताओं के समय और प्रयास को बचाता है। उदाहरण के लिए, स्क्रैम्बल्ड एसजीआरएनए को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट करें।

2. भ्रूण संग्रह और तैयारी

  1. बी. डोरसेलिस प्यूपे को प्लास्टिक के पिंजरों में रखें। वयस्कों के बंद होने के बाद पानी के स्रोत के साथ भोजन के रूप में चीनी और खमीर (1: 1) का मिश्रण प्रदान करें (चित्रा 2 ए, बी)। पालन की स्थिति 55% सापेक्ष आर्द्रता (आरएच), 26.5 डिग्री सेल्सियस, और 14:10 एल / डी चक्र (सुबह छह बजे रोशनी चालू, शाम आठ बजे रोशनी बंद) है।
  2. अधिकांश वयस्क उभरने के 10 दिन बाद यौन परिपक्वता तक पहुंचते हैं। वयस्क मक्खियों को यथासंभव संभोग करने में मदद करने के लिए एक उपयुक्त वातावरण प्रदान करें। आदर्श रूप से, 30-50 लक्स की रोशनी के साथ एक हल्के स्टैंड का उपयोग करें। यह महिलाओं की उर्वरता में सुधार कर सकता है, इसलिए, भ्रूण संग्रह की दक्षता में सुधार कर सकता है।
    नोट: वयस्कों (उद्भव के बाद 5-6 दिनों की आयु) को मंद रोशनी (<100 लक्स) वातावरण में रखना संभोग को बढ़ावा दे सकता है। आम तौर पर, अंडाकार का शिखर दोपहर 03:00 बजे होता है (14:10/एल:डी, सुबह 06:00 बजे रोशनी, रात 08:00 बजे रोशनी बंद); पर्याप्त भ्रूण प्राप्त करने के लिए, 03:00 बजे से 30 मिनट पहले पिंजरों में अंडाकार कक्ष रखने की सिफारिश की जाती है।
  3. कक्ष के ढक्कन से 1-2 मिमी दूर, अंडाकार कक्ष में 200-जाल धुंध रखें। यह जितना संभव हो उतने भ्रूण प्राप्त करने में मदद करेगा।
    नोट: भ्रूण को संतरे के रस में भिगोने या धुंध के साथ रगड़ने से बचें, क्योंकि इससे भ्रूण की जीवित रहने की दर में काफी कमी आ सकती है।
  4. माइक्रोइंजेक्शन सेटअप तैयार होने पर पिंजरे में एक नया अंडाकार कक्ष रखें। एक महीन गीले ब्रश का उपयोग करके हर 10 मिनट में भ्रूण एकत्र करें, फिर उन्हें एक स्व-निर्मित इंजेक्शन प्लेट पर पंक्तिबद्ध करें (55 मिमी की लंबाई, 13.75 मिमी की चौड़ाई, और 5 मिमी की ऊंचाई के साथ प्लेक्सीग्लास, अंडे के प्लेसमेंट की सुविधा के लिए बीच में एक 45 मिमी x 5 मिमी x 0.3 मिमी उथला नाली खोली जाती है)। यदि भ्रूण में उच्च आंतरिक दबाव होता है, तो 10 मिनट के लिए <10% आरएच पर मामूली निर्जलीकरण वैकल्पिक है। आगे के निर्जलीकरण से बचने के लिए इंजेक्शन के दौरान भ्रूण को हेलोकार्बन तेल में डुबोएं (चित्रा 2 सी)।

3. भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन

  1. माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके ग्लास इंजेक्शन सुई तैयार करें।
    नोट: उपयोगकर्ता मार्गदर्शिका के बाद पैरामीटर सेट करना महत्वपूर्ण है। इन प्रोटोकॉल में, माइक्रोपिपेट पुलर के मैनुअल द्वारा सुझाए गए मापदंडों का उपयोग करके विभिन्न सुई आकार बनाए जा सकते हैं। धूल को सुई को बंद करने से रोकने के लिए ग्लास केशिका को जितना संभव हो उतना साफ होना चाहिए।
  2. काम का समाधान तैयार करें। कैस 9 प्रोटीन और संबंधित एसजीआरएनए को निम्नलिखित कामकाजी सांद्रता में मिलाएं: एसजीआरएनए, 300 एनजी / इंजेक्शन वाले भ्रूण को चिह्नित करने के लिए एक सुविधाजनक तरीके के रूप में काम करने के लिए मिश्रण में फिनोल लाल का 1 μL जोड़ें। एसजीआरएनए के क्षरण से बचने के लिए तैयार मिश्रण को बर्फ पर रखें।
    नोट: न्यूक्लियस-मुक्त पिपेट युक्तियों और पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करें। कैस 9 प्रोटीन की एकाग्रता 150 एनजी / μL से कम या बराबर होनी चाहिए; उच्च सांद्रता विषाक्त हैं और भ्रूण के जीवित रहने की दर को काफी कम कर देती है। कैस 9 को डीएनए या एमआरएनए प्रारूप में भी वितरित किया जा सकता है ताकि सफल जीन संपादन 17,19 प्राप्तकिया जा सके। इस प्रोटोकॉल में, कैस 9 प्रोटीन की सिफारिश की जाती है क्योंकि एमआरएनए क्षरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और प्लास्मिड डीएनए से सीएएस 9 प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए समय लेती है।
  3. इंजेक्टर के लिए पैरामीटर सेट करें। प्रारंभिक कार्यक्रम Pi-500 hPa, Ti-0.5 s और PC-200 hPa है। माइक्रोइंजेक्शन के दौरान आवश्यकतानुसार इन मापदंडों को आगे समायोजित करें।
  4. इंजेक्शन सुई में मिश्रण के 3 μL जोड़ें। हवा के बुलबुले पेश करने से बचें जो संभवतः सुई को रोक सकते हैं। माइक्रोग्रिंडर का उपयोग करके सुई खोलें।
  5. उपयोगकर्ता गाइड (चित्रा 2 ई) के अनुसार सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर से कनेक्ट करें।
  6. ऑब्जेक्टिव टेबल पर पंक्तिबद्ध भ्रूण के साथ प्लेट रखें। एक ठीक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोपिपेट की स्थिति को समायोजित करें, माइक्रोपिपेट और भ्रूण को एक ही विमान पर सेट करें। पेडल दबाकर बूंद की मात्रा समायोजित करें; 1/10 भ्रूण की मात्रा की सिफारिश की जाती है।
  7. सुई की नोक को भ्रूण के पीछे (वनस्पति ध्रुव) में डालें। इंजेक्टर से पेडल दबाकर मिश्रण को भ्रूण में वितरित करें। यदि फिनोल लाल जोड़ा जाता है, तो थोड़ा लाल रंग तुरंत देखा जाता है।
    नोट: पिनहोल से साइटोप्लाज्मिक बैकफ्लो की एक छोटी मात्रा भ्रूण की जीवित रहने की दर को कम नहीं करेगी। एक जीन के सफल म्यूटेनेसिस के लिए 200 भ्रूण का इंजेक्शन पर्याप्त है। भ्रूण को विसर्जित करने के लिए अधिक हेलोकार्बन तेल जोड़ने से आगे के निर्जलीकरण को रोका जा सकता है। पोल सेल गठन से पहले इंजेक्शन को करने की आवश्यकता होती है, जो यह सुनिश्चित करता है कि प्रत्येक उत्परिवर्तन कुशलता से विरासत में मिल सके।

4. इंजेक्शन के बाद कीट पालन

  1. इंजेक्शन भ्रूण के साथ इंजेक्शन प्लेट को एक कृत्रिम जलवायु कक्ष में रखें जो 55% आरएच, 26.5 डिग्री सेल्सियस और 14:10 एल / डी चक्र (सुबह छह बजे रोशनी चालू, शाम आठ बजे रोशनी बंद) पर रखा गया है।
  2. इंजेक्शन के बाद, भ्रूण के गठन को आमतौर पर पूरा होने में 24 घंटे और हैच करने में 36 घंटे लगते हैं। लार्वा को तैयार लार्वा आहार पर स्थानांतरित करने के लिए एक फाइन-टिप ब्रश का उपयोग करें। लार्वा को प्रतिदिन तीन या चार बार इकट्ठा करें जब तक कि कोई और लार्वा न निकले। आम तौर पर, लार्वा को 7 दिनों के भीतर अंडे सेने और प्यूपेट करने में 2-3 दिन लगते हैं।
    नोट: लार्वा को खिलाने के लिए मक्का आधारित आहार का उपयोग किया गया था। नुस्खा में 150 ग्राम मकई का आटा, 150 ग्राम केला, 0.6 ग्राम सोडियम बेंजोएट, 30 ग्राम खमीर, 30 ग्राम सुक्रोज, 30 ग्राम पेपर तौलिया, 1.2 एमएल हाइड्रोक्लोरिक एसिड और 300 एमएल पानी29 शामिल हैं। लार्वा को तेल में छोड़े जाने के समय को कम से कम करें (<2 घंटे)। लार्वा को जहां तक संभव हो, अंडे सेने के तुरंत बाद आहार पर ले जाएं। यह जीवित रहने और प्रजनन दर में काफी वृद्धि कर सकता है। बहुत अधिक आहार प्रदान न करें (90 मिमी पेट्री डिश के 2/3 के साथ एक आहार 30 लार्वा के लिए पर्याप्त है); अन्यथा, यह फफूंदी बन जाएगा और लार्वा जीवित रहने की दर को कम कर देगा।
  3. परिपक्व लार्वा को गीली रेत में डालने के लिए। प्यूपेशन चरण में लगभग 10 दिन लगते हैं। एक्लॉशन शुरू होने से पहले प्यूपे को प्लास्टिक के पिंजरों में ले जाएं।

5. म्यूटेंट स्क्रीनिंग

  1. उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग का एक प्रवाह चार्ट चित्रा 3 ए में चित्रित किया गया है। विषम रेखाओं को प्राप्त करने के लिए जंगली प्रकार के वयस्कों के साथ माइक्रोइंजेक्शन द्वारा प्राप्त क्रॉस जी 0 वयस्क। जीनोटाइपिंग द्वारा संतान (जी 1) के उत्परिवर्तन के प्रकार को सत्यापित करें।
  2. जी 2 में होमोजीगोस लाइनों को प्राप्त करने के लिए एक ही उत्परिवर्ती जीनोटाइप के साथ स्व-क्रॉस जी 1। यदि जी 1 में उत्परिवर्ती के जीनोटाइप पूरी तरह से अलग हैं, तो जंगली प्रकार की मक्खियों के साथ हेटरोजाइगोट को पार करें। होमोजीगस लाइनें आमतौर पर जी 3 में प्राप्त की जाती हैं। बाद के फेनोटाइपिंग प्रयोगों के लिए दो या तीन होमोजीगस लाइनों को बनाए रखें।
  3. जीनोटाइपिंग करने के लिए एक ताजा प्यूपेरियम या व्यक्तिगत वयस्कों के एकल मध्य-पैर से जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें। लक्ष्य क्षेत्र को बढ़ाने के लिए विशिष्ट प्राइमर डिजाइन करें; प्राइमरों को लक्ष्य स्थल के ऊपर और नीचे की ओर कम से कम 50 बीपीएस सेट करना होगा। प्राइमर विवरण के लिए चरण 1.2 देखें।
    नोट: चूंकि प्यूपेरियम में डीएनए की मात्रा बेहद कम है, इसलिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट की सिफारिश की जाती है।
  4. निम्नलिखित साइकिल िंग स्थितियों का उपयोग करके पीसीआर करें: 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, डिजाइन किए गए प्राइमरों के लिए उपयुक्त एनीलिंग तापमान पर 15 सेकंड, 35 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस का अंतिम विस्तार।
  5. शुद्ध पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करें। जब लक्ष्य स्थल से सटे कई अतिव्यापी चोटियों का पता लगाया जाता है (चित्रा 3 बी), सफल म्यूटेनेसिस हुआ है। शुद्ध पीसीआर उत्पादों को एक ब्लंट-एंड वेक्टर में उप-क्लोन करें और उत्परिवर्ती के जीनोटाइप को सत्यापित करने के लिए अनुक्रमण के लिए 10 अलग-अलग जीवाणु उपनिवेशों का चयन करें। फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन और समय से पहले अनुवाद समाप्ति (चित्रा 3 सी) के साथ लाइनों को बनाए रखें।
    नोट: जी 0 व्यक्तियों के जीनोटाइप को सत्यापित करने के लिए एकल क्लोन अनुक्रमण करने की कोई आवश्यकता नहीं है। बस पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करें और लक्ष्य स्थल से सटे स्पष्ट कई ओवरलैप चोटियों वाले व्यक्तियों को बनाए रखें। प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद, जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए 10 भ्रूण का चयन करना और चरण 5.3 में मानकों के आधार पर पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करने की सिफारिश की जाती है। यह पहले से उत्परिवर्तन दरों की भविष्यवाणी करने में मदद कर सकता है। इस अध्ययन में, जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए सेंगर अनुक्रमण एक अनुक्रमण कंपनी द्वारा किया गया था।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 तकनीक का उपयोग करके बी डोरसैलिस उत्परिवर्ती के विकास के लिए विस्तृत कदम प्रस्तुत करता है, जिसमें जीडीएनए चयन, भ्रूण और माइक्रोइंजेक्शन एकत्र करने, कीट रखरखाव और उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग से प्रतिनिधि परिणाम शामिल हैं।

चयनित जीन की लक्ष्य साइट का उदाहरण तीसरे एक्सॉन (चित्रा 1 सी) में स्थित है। यह साइट अत्यधिक संरक्षित है, और सिंथेटिक जीआरएनए (चित्रा 1 डी) और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (चित्रा 1 ई) द्वारा प्राप्त जीआरएनए के लिए डीएनए टेम्पलेट के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा एक एकल बैंड का पता लगाया गया था।

धारा 3 में वर्णित 200 ताजा काटे गए अंडों में इंजेक्शन किया गया था। चरण 4.1-4.3 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करके भ्रूण को बनाए रखा गया था। जैसा कि पीसीआर उत्पादों को अनुक्रमित करके पता लगाया गया है, जी 0 व्यक्तियों में से 80% मोज़ेक उत्परिवर्ती हैं (तालिका 1)। यहां, 8 बीपी विलोपन वाले उत्परिवर्ती, जिसके परिणामस्वरूप जी 1 में अमीनो एसिड अनुवाद की समय से पहले समाप्ति हुई, का चयन किया गया (चित्रा 3 सी)। इससे बी डोरसेलिस में इस जीन उत्पाद के संबंधित कार्यों में परिवर्तन होना चाहिए। चयनित जी 1 को जी 2 हेटरोजाइगोट प्राप्त करने के लिए जंगली प्रकार के साथ पार किया गया था। अगली पीढ़ी में जी 2 हेटरोजाइगोट्स और होमोजीगोट्स को सेल्फ-क्रॉस किया गया, यह दर्शाता है कि यह योजना बी डोरसैलिस उत्परिवर्ती विकसित करने के लिए सफल है और इस और निकटता से संबंधित प्रजातियों में कार्यात्मक जीन अध्ययन में अधिक व्यापक रूप से लागू किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: एसजीआरएनए की तैयारी( ) एसजीआरएनए तैयारी के लिए सामान्य प्रक्रियाएं। (बी) जीडीएनए (100 बीपी) से पीसीआर द्वारा प्रवर्धित लक्ष्य क्षेत्र। (सी) कैस 9 द्वारा लक्ष्य जीन संरचना और लक्ष्य दरार साइट का उदाहरण। (डी) एसजीआरएनए की पीसीआर असेंबली (~ 100 बीपी)। () इन विट्रो प्रतिलेखन और शुद्धिकरण द्वारा एसजीआरएनए का संश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन। () इंजेक्शन की प्रक्रिया और विधि। (बी) भ्रूण संग्रह उपकरण, धुंध पर अंडे देना। (सी) भ्रूण को पानी के साथ पंक्तिबद्ध करें और हेलोकार्बन तेल के साथ कवर करें। (डी) माइक्रोपिपेट पुलर। () माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम का पूरा सेटअप। माइक्रोस्कोप (बाएं), माइक्रोइंजेक्टर और माइक्रोमैनिपुलेटर (मध्य), और स्वचालित वायु पंप (दाएं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग () उत्परिवर्ती का संभोग और होमोजीगोट्स का अधिग्रहण। (बी) उत्परिवर्ती जीनोम से पीसीआर उत्पाद जो लक्ष्य पर चोटियों का एक अलग सेट उत्पन्न करता है। (सी) उत्परिवर्तन प्रकारों और अमीनो एसिड परिवर्तनों में से एक। विलोपन उत्परिवर्तन अनुवाद की समय से पहले समाप्ति का कारण बनता है। संक्षेप: एचई = हेटरोजाइगोट्स, एचओ = होमोजीगोट्स। नियंत्रण: भ्रूण को स्क्रैम्बल एसजीआरएनए के साथ इंजेक्ट किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इंजेक्शन मिश्रण इंजेक्शन भ्रूण हैच्ड लार्वा Pupae मोज़ेक G0
(मोज़ेक / कुल वयस्क)
BdorOrco_gRNA1 (300 ng/μL) 200 83 66 49/60 (81%)
BdorOrco_gRNA2 (300 ng/μL)
Cas9 (150 ng/μL)
फिनोल लाल (1 μL)
BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng/μL) 200 78 76 0/70 (0%)
BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng/μL)
Cas9 (150 ng/μL)
फिनोल लाल (1 μL)

माइक्रोइंजेक्शन के बाद पृष्ठीय अस्तित्व और म्यूटेनेसिस।

समस्या संभावित कारण (ओं) समाधान
अक्षम भ्रूण संग्रह 1. वयस्क खराब स्थिति में हैं 1. भोजन और पानी की उपलब्धता सुनिश्चित करें, विशेष रूप से भोजन की चीनी सामग्री।
2. अपर्याप्त संभोग 2. 30-50 लक्स मंद परिस्थितियों में अग्रिम संभोग। 12-15 दिन के वयस्कों का चयन करना सबसे अच्छा है।
इंजेक्शन के बाद अंडे की खराब हैच क्षमता 1. खराब गुणवत्ता वाले भ्रूण 1. ताजा और मोटे अंडे चुनें और धीरे से उन्हें पानी से भिगोए हुए ब्रश से ब्रश करें।
2. सुई फिट नहीं होती है 2. इंजेक्शन के दौरान अंडे को होने वाले नुकसान को कम करने के लिए सुई की नोक जितनी संभव हो उतनी छोटी होती है।
3. इंजेक्शन के बाद अंडे का अनुचित पालन 3. निर्जलीकरण को सूखने से रोकने के लिए इंजेक्शन के बाद अंडे को हाइड्रेटेड रखने की आवश्यकता होती है। इंजेक्शन के बाद अंडे को सीधे भोजन में भी स्थानांतरित किया जा सकता है।
कम लार्वा जीवित रहने की दर 1. लार्वा के विकास के लिए मोल्डी भोजन उपयुक्त नहीं है 1. नए हैच किए गए लार्वा के लिए, थोड़ी मात्रा में भोजन जोड़ें। बहुत अधिक भोजन मोल्ड या सूख जाएगा और लार्वा के विकास को प्रभावित करेगा।
2. नए हैच किए गए लार्वा को लंबे समय तक तेल में भिगोया जाता है 2. नए हैच किए गए लार्वा को समय पर लार्वा भोजन में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है या अंडे को इंजेक्शन के बाद सीधे भोजन में उठाया जाना चाहिए।
वयस्क उत्परिवर्तन दर कम है 1. जीआरएनए की कम गुणवत्ता 1. गिरावट को रोकने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले जीआरएनए को संश्लेषित करने के लिए कठोर प्रयोगात्मक ऑपरेशन।
2. अकुशल लक्ष्य ऑफ-टारगेट की ओर ले जाते हैं 2. जैसा कि हमारी चर्चा में उल्लेख किया गया है, उच्च दक्षता वाले लक्ष्यों की जांच करना।

तालिका 2: उत्परिवर्ती, संभावित कारणों और समाधानों के निर्माण के साथ संभावित समस्याएं।

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Discussion

CRISPR / Cas9 प्रणाली सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला जीन संपादन उपकरण है और इसमें विभिन्न अनुप्रयोग हैं, जैसे कि जीन थ्रेपी30, फसल प्रजनन31, और जीन फ्यूक्शन32 के बुनियादी अध्ययन। यह प्रणाली पहले से ही विभिन्न कीट प्रजातियों में जीन संपादन के लिए लागू की गई है और कीटों में कार्यात्मक जीन अध्ययन के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में कार्य किया है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल गाइड आरएनए के डिजाइन और संश्लेषण की प्रक्रिया को मानकीकृत करते हैं, भ्रूण एकत्र करना, भ्रूण इंजेक्शन, कीट पालन और उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग। इसके अलावा, प्रत्येक चरण से संभावित समस्या को संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए एक समस्या निवारण तालिका जोड़ी गई थी, और उनके समाधान कार्यभार को हल्का करने और दक्षता में सुधार करने के लिए प्रदान किए गए थे (तालिका 2)। यह प्रक्रिया रुचि के जीन को संपादित करने का एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करती है और बी डोरसेलिस में कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन में सुधार करती है।

सबसे पहले, लक्ष्य जीन चयन CRISPR / Cas9 प्रणाली की दक्षता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है, और कई ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर प्रोग्राम जैसे ChopChop33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAAcas9 (V3.0)35, और CRISPR इष्टतम लक्ष्य खोजक36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu) स्वचालित रूप से लक्ष्य उत्पन्न कर सकते हैं और संभावित ऑफ-टारगेट दरों की भविष्यवाणी कर सकते हैं। चूंकि बी डोरसैलिस की उच्च प्रजनन दर भ्रूण संग्रह की सुविधा प्रदान करती है, इसलिए डीएनए निष्कर्षण और लक्ष्य क्षेत्र के अनुक्रमण के लिए भ्रूण के एक हिस्से का त्याग करके उत्परिवर्ती दरों की भविष्यवाणी की जा सकती है। यदि प्रयोगशाला में अनुक्रमण उपलब्ध नहीं है, तो उत्परिवर्तन दरों की भविष्यवाणी करने के लिए टी 7 एंडोन्यूक्लिज़ आई का उपयोगकरने की भी सिफारिश की जाती है। उच्च जीनोमिक विलोपन दर वाले लक्ष्य साइटों को इन तीन तरीकों के माध्यम से चुना जा सकता है, और इसलिए, बी डोरसैलिस में जीन संपादन की दक्षता बढ़ाई जा सकती है।

भ्रूण का विकास चरण यह निर्धारित करता है कि उत्परिवर्तन विरासत में मिलेगा या नहीं। वंशानुगत उत्परिवर्तन प्राप्त करने के लिए, जीन संपादन रोगाणु कोशिकाओं में होना चाहिए। आम तौर पर, ध्रुव कोशिका गठन होने के बाद एसजीआरएनए और कैस 9 के मिश्रण को रोगाणु कोशिकाओं में वितरित नहीं किया जा सकता है। पृष्ठीय में, ध्रुव कोशिका का गठन अंडे देने के 3 घंटे बाद3 घंटे में हुआ, जबकि बी डोरसैलिस के लिए यहां विस्तृत प्रोटोकॉल भ्रूण संग्रह से माइक्रोइंजेक्शन के अंत तक 30 मिनट लेता है। इंजेक्शन के दौरान, भ्रूण के वनस्पति छोर में लगभग कोई ध्रुव कोशिकाएं नहीं बनती हैं; इसलिए, जी 0 में प्राप्त जीन उत्परिवर्तन कुशलतापूर्वक विरासत में मिलना चाहिए। माइक्रोइंजेक्शन द्वारा खपत समय भी पहले प्रकाशित पत्रों (आमतौर पर 1-3 घंटे) 18,19 में उल्लिखित विधि से कम है।

भ्रूण संग्रह और हैंडलिंग की प्रक्रिया के दौरान यांत्रिक या रासायनिक क्षति को कम करना महत्वपूर्ण है। इंजेक्शन प्लेट पर भ्रूण को धीरे से लाइन करने के लिए एक ठीक ब्रश का उपयोग करें। इंजेक्शन की स्थिति को ड्रोसोफिला (मेथड्स - निकोलस गोम्पेल की प्रयोगशाला, http://gompel.org/methods) और सेराटाइटिस कैपिटा39 में पहले किए गए काम को प्रतिबिंबित करना चाहिए। वनस्पति ध्रुव पर भ्रूण इंजेक्ट करें; कभी भी सुई को जानवरों के खंभे में न डालें। माइक्रोपिपेट पुलर गाइड के बाद सुई तैयार करें; अत्यधिक साइटोप्लाज्मिक बैकफ्लो से बचने के लिए सुई का उद्घाटन जितना संभव हो उतना छोटा होना चाहिए। पृष्ठीयता में प्रकाशित अध्ययनों में उल्लिखित विधि ने आम तौर पर सोडियम हाइपोकोराइट17,18,19 के साथ भ्रूण को विकृत कर दिया; यह रासायनिक क्षति का कारण बन सकता है और भ्रूण की जीवित रहने की दर को कम कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, भ्रूण को डिकोरियोनेटेड नहीं किया जाता है, और इंजेक्शन अभी भी अच्छी तरह से काम करता है। भ्रूण को रासायनिक क्षति न्यूनतम हो सकती है।

इंजेक्शन के बाद कीट पालन बहुत महत्वपूर्ण है। यहां प्रदान किया गया मानकीकृत पालन प्रोटोकॉल अन्य फल मक्खी प्रजातियों, विशेष रूप से बैक्ट्रोसेरा प्रजातियों के पालन के लिए एक संदर्भ के रूप में काम कर सकता है। भ्रूण को हमारे स्व-निर्मित इंजेक्शन प्लेट का उपयोग करके इंजेक्शन के दौरान निर्जलीकरण से बचने के लिए तेल में डुबोया जा सकता है। 50% से ऊपर जी 0 में जीवित रहने की दर प्राप्त करने के लिए तेल (<2 घंटे) में लार्वा खर्च करने वाले समय को कम से कम करें।

उत्परिवर्ती का पता लगाने के लिए जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण की एक गैर-इनवेसिव विधि की सिफारिश की जाती है। उदाहरण के लिए, कुछ लेपिडोप्टेरान शोधकर्ताओं का सुझाव है कि अंतिम इनस्टार लार्वा के एक्सुविएट्स का उपयोग आगे जीनोटाइपिंग के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए किया जा सकता है। पृष्ठीय के लिए, एक गैर-इनवेसिव विधि में एक ताजा प्यूपेरियम से जीनोमिक डीएनए निकालना शामिल है। एक मार्कर जीन और रुचि के जीन को लक्षित करने वाले कई एसजीआरएनए के इंजेक्शन से उत्परिवर्ती की पहचान में भी सुधार हो सकता है। उदाहरण के लिए, आंखों के रंग (केमो) और किशोर हार्मोन रिसेप्टर (मेट) को लक्षित करने वाले सह-इंजेक्शन एसजीआरएनए मच्छरों में दोहरे उत्परिवर्तन के साथ 75% संतान पैदा कर सकते हैं। लार्वा 37 की आंखों के रंग के आधार पर मेट म्यूटेंट की प्रारंभिक जांच की गई। CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग करके इस कीट प्रजातियों में जीन संपादन की प्रभावकारिता में और सुधार करने के लिए भविष्य में बी डोरसैलिस में इसका मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

निष्कर्ष में, सीआरएसआईपीआर / सीएएस 9 प्रणाली बी डोरसैलिस में कार्यात्मक जीनोमिक्स में एक शक्तिशाली उपकरण है। हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को कुशल भ्रूण संग्रह, लार्वा की आदर्श उत्तरजीविता दर और वांछित संपादन दक्षता प्राप्त करने में मदद करने के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान करते हैं। यह बी डोरसेलिस में म्यूटेनेसिस प्राप्त करने के लिए शोधकर्ताओं की मदद करने का एक सरल और त्वरित तरीका हो सकता है। इस तकनीक को घातक जीन के कार्यात्मक अध्ययन में लागू नहीं किया जा सकता है क्योंकि विरासत में मिले उत्परिवर्तन को सफल क्रॉस-ब्रीडिंग की आवश्यकता होती है। भविष्य के अध्ययन इस सीमा को तोड़ने के लिए चरण या ऊतक-विशिष्ट सीआरआईएसपीआर तत्वों को व्यक्त करने के लिए ट्रांसजेनिक उपकरण विकसित करने पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (अनुदान संख्या KQTD20180411143628272) और शेन्ज़ेन दापेंग न्यू डिस्ट्रिक्ट (अनुदान संख्या पीटी 202101-02) के विज्ञान प्रौद्योगिकी नवाचार और औद्योगिक विकास के लिए विशेष धन द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6x DNA Loading Buffer TransGen Biotech GH101-01
Artificial climate chamber ShangHai BluePard MGC-350P
AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit Axygen AP-MN-MS-GDNA-250G
BLAT NA NA For searching potential gene loci in the genome
Capillary Glass WPI  1B100F-4
Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf InjectMan 4
GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific A29377
Hisat2 NA NA For aligning the transcriptome to the acquired gene loci
IGV NA NA For visualizing the results from Transdecoder
Microgrinder NARISHIGE EG-401
Olympus Microscope Olympus Corporation SZ2-ILST
pEASY-Blunt Cloning Kit TransGen Biotech CB101-02 https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290-100ML
Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers Instrument Company  https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf
PrimeSTAR HS (Premix) Takara Biomedical Technology R040A
SAMtools NA NA For generating the sorted bam files
sgRNAcas9-AI NA NA sgRNA design
http://123.57.239.141:8080/home
Sutter Micropipette Puller Sutter  Instrument Company  P-97
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech BM101-02
Transdecoder NA NA For combining the results of assemble transcripts and gene loci information
https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0
TrueCut Cas9 Protein v2 Thermo Fisher Scientific A36498
Ultra-trace biological detector Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000C

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References

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जीव विज्ञान अंक 187
ओरिएंटल फ्रूट फ्लाई <em>बैक्ट्रोसेरा डोरसेलिस</em> के CRISPR/Cas9 म्यूटेनेसिस के लिए प्रोटोकॉल
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Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y.,More

Yuan, J., Zhang, J., Zhang, Y., QiQiGe, W., Liu, W., Yan, S., Wang, G. Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis. J. Vis. Exp. (187), e64195, doi:10.3791/64195 (2022).

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