Summary
이 논문은 동양 초파리 박트로세라 등쪽의 CRISPR/Cas9 돌연변이 유발에 대한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 표준화 된 프로토콜에 의해 제공되는 상세한 단계는 B. dorsalis에서 기능적 유전자 연구를위한 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.
Abstract
동양 초파리인 박트로세라 등파리 는 감귤류와 전 세계적으로 150종 이상의 다른 과일 작물에 피해를 주는 매우 침습적이고 적응력이 뛰어난 해충 종입니다. 성인 초파리는 비행 능력이 뛰어나고 암컷은 과일 껍질 아래에 알을 낳기 때문에 해충과 직접 접촉해야하는 살충제는 일반적으로 현장에서 제대로 작동하지 않습니다. 분자 생물학적 도구와 고처리량 시퀀싱 기술의 개발로 많은 과학자들이 환경 친화적인 해충 관리 전략을 개발하려고 시도하고 있습니다. 여기에는 다양한 해충에서 검색 행동에 관여하는 후각 유전자와 같은 유전자 (분자 표적)를 하향 조절하거나 침묵시키는 RNAi 또는 유전자 편집 기반 살충제가 포함됩니다. 동양 초파리 방제에 대한 이러한 전략을 적용하려면 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법이 필요합니다. B. dorsalis의 생존과 번식에 중요한 기능을 가진 유전자는 유전자 녹다운 및/또는 침묵을 위한 좋은 분자 표적 역할을 합니다. CRISPR/Cas9 시스템은 특히 곤충에서 유전자 편집에 사용되는 신뢰할 수 있는 기술입니다. 이 논문은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝을 포함하여 B. dorsalis의 CRISPR / Cas9 돌연변이 유발에 대한 체계적인 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 B. dorsalis의 기능적 유전자 연구에 관심이있는 연구자에게 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.
Introduction
동양 초파리인 박트로세라 등파리 는 구아바, 망고, 유지니아 종, 수리남 체리, 감귤류, 비파, 파파야1을 포함한 150종 이상의 과일 작물에 피해를 입히는 국제적인 해충 종입니다. 광둥성(중국)에서만 발생한 피해액은 2억 위안 이상으로 추산된다. 성체 암컷은 숙성 또는 익은 과일의 껍질 아래에 알을 삽입하여 과일의 부패와 이탈을 유발하여 과일의 품질과 작물의 전체 수확량을 감소시킵니다2. 성인 초파리는 비행 능력이 뛰어나고 유충이 과일 피부에 구멍을 뚫기 때문에 해충과 직접 접촉해야하는 살충제는 현장에서 제대로 작동하지 않습니다. 또한 살충제의 광범위한 사용으로 인해 다양한 농약에 대한 B. dorsalis 의 저항성이 증가하여 이러한 해로운 해충의 방제가 더욱 어려워졌습니다3. 따라서 효과적이고 환경 친화적 인 해충 관리 전략의 개발이 절실히 필요합니다.
최근 분자생물학적 도구와 고처리량 염기서열분석 기술의 발달로 과학자들은 다양한 해충의 중요한 유전자(분자 표적)의 기능을 표적으로 하는 RNAi와 같은 환경 친화적인 해충 관리 전략을 개발하려고 시도하고 있습니다. 해충의 생존과 번식에 중요한 유전자는 기능적 유전자 연구를 통해 확인할 수 있으며 특정 표적화되고 환경 친화적 인 해충 관리 도구4의 개선을위한 잠재적 인 분자 표적 역할을합니다. 이러한 전략을 동양 초파리 방제에 적용하려면 기능적 유전자 연구를위한 효과적인 방법이 필요합니다.
CRISPR/Cas(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복/CRISPR 관련) 엔도뉴클레아제 시스템은 박테리아와 고세균에서 처음 발견되었으며 박테리오파지 감염에 의해 도입된 것과 같은 외래 세포 내 DNA의 인식 및 분해에 관여하는 적응 메커니즘으로 밝혀졌습니다.5. 유형 II CRISPR 시스템에서 Cas9 엔도뉴클레아제는 작은 관련 RNA(crRNA 및 tracrRNA)에 의해 유도되어 침입 DNA 6,7,8을 절단하며 현재까지 유전자 편집에 가장 널리 사용되는 도구 중 하나가 되었습니다 9,10,11,12. CRISPR/Cas9 시스템은 유전자 침묵의 높은 효율과 저렴한 비용과 같은 몇 가지 장점을 가지고 있기 때문에 이미 Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 및 Bombyx mori16을 포함한 다양한 곤충 종의 유전자 편집에 적용되었습니다. B. dorsalis에서 체색, 날개 이형성 및 성 결정과 관련된 유전자는 CRISPR / Cas917,18,19를 사용하여 성공적으로 녹아웃되었습니다. 그러나 이 곤충에 CRISPR/Cas9를 적용하기 위한 자세한 절차는 아직 불완전합니다. 또한 B. dorsalis 유전자 편집을 위해 연구자들이 제공하는 일부 단계도 다양하며 표준화가 필요합니다. 예를 들어, Cas9의 형태는 출판된 참고 문헌17,18,19에서 달랐습니다.
이 논문은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝을 포함하여 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 B. dorsalis 의 돌연변이 유발을 위한 체계적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 B. dorsalis의 기능적 유전자 연구에 관심이있는 연구자에게 돌연변이 파리를 생성하는 데 유용한 가이드 역할을합니다.
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Protocol
1. sgRNA의 표적 설계 및 시험관 내 합성
- 관심 표적 유전자의 구조를 예측하고 B. dorsalis 게놈의 생물 정보학 분석을 통해 엑손과 인트론 사이의 경계를 결정합니다 (여기에 사용 된 소프트웨어 응용 프로그램은 재료 표에 나열되어 있음).
참고: BLAT20 은 게놈에서 잠재적인 유전자 좌위를 검색하는 데 사용되었습니다. 고품질 RNA-seq 판독(전사체)을 Hisat221을 사용하여 획득한 유전자 좌위에 정렬하였다. Samtools22 는 정렬 된 bam 파일을 생성하는 데 사용되었습니다. 정렬된 bam 파일을 Stringtie223 에 입력하여 어셈블 성적표를 제공했습니다. 조립된 전사체 및 유전자 좌위 정보를 트랜스디코더24에 의해 조합하였다. 트랜스디코더로부터 획득된 결과는 IGV 툴(25 )에서 시각화되었고, 엑손과 인트론 사이의 경계가 결정될 수 있었다. - 후보 표적 유전자 부위 내에서 적합한 표적 영역을 확인한다. 보다 편리한 시퀀싱을 위해 총 길이는 750bp 미만이어야 합니다(그림 1B). PCR에 의해 야생형 게놈 DNA로부터 표적 영역을 증폭하기 위한 특이적 프라이머를 설계한다(도 1B)(프라이머: F-프라이머: AACATTGAATCTGGAATCAGGTAAACT, R-프라이머: CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC). PCR 산물을 무딘 말단 벡터 26으로 복제하고 시퀀싱을 위해20 개의 개별 박테리아 콜로니를 선택하여 실험실 곤충 개체군에서 표적 영역이 얼마나 보존되어 있는지 결정합니다.
- 전형적인 표적 부위는 3-뉴클레오티드 서열 모티프 (NGG 또는 CCN) 및 NGG 또는 CCN 모티프에 인접한 20 bp 서열 (20 bp-NGG 또는 CCN-20 bp)을 함유한다. B. dorsalis 게놈에 대해 후보 표적 부위를 폭파하고 예측 된 효율이 충분히 높고 오프 표적화 비율이 낮은지 확인하십시오. 여러 오픈 소스 소프트웨어 프로그램이 이를 자동으로 예측할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, sgRNAcas9-AI27 은 최적의 표적을 선택하고 평가하기 위해 사용된다. 사용에 대한 자세한 내용은이 소프트웨어의 설명서에서 찾을 수 있습니다.
참고: 표적 유전자의 5' UTR에 폐쇄된 가능한 표적 부위 및 20bp 서열의 시작시 1-2Gs가 선호된다. PCR에 이어 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인될 큰 결실을 달성하기 위해, 100 bp 이상으로 분리된 두 개의 표적(28 )을 설계하는 것이 권장된다(도 1C). - 시판되는 gRNA 합성 키트를 사용하여 설계된 sgRNA를 생성하십시오. 사용자 가이드에 따라 각 단계를 수행하십시오. gRNA 생성물을 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁시키고, UV-Vis 분광광도계를 사용하여 농도를 정량화하고, 사용하기 전에 -80°C에서 보관하십시오(여기에 사용된 키트로 성공적으로 합성된 단일 gRNA[10μL]의 농도는 약 4000-6000ng/μL 또는 그 이상).
참고 : 돌연변이 파리를 생성하는 것이 모든 연구자에게 첫 번째 단계이지만 다운 스트림 실험 / 분석을위한 적절한 음성 대조군이 중요합니다. 돌연변이와 함께 이러한 컨트롤을 생성하면 연구원의 시간과 노력을 절약할 수 있습니다. 예를 들어 스크램블된 sgRNA를 음성 대조군으로 설정합니다.
2. 배아 수집 및 준비
- B. 등쪽 번데기를 플라스틱 케이지에 넣습니다. 설탕과 효모의 혼합물 (1 : 1)을 음식으로 제공하고 성체가 가까워진 후 수원을 제공하십시오 (그림 2A, B). 사육 조건은 55% 상대 습도(RH), 26.5°C 및 14:10 L/D 주기(아침 6시에 점등, 저녁 8시에 소등)입니다.
- 대부분의 성인은 출현 후 10 일 후에 성적으로 성숙합니다. 성인 파리가 가능한 한 많이 짝짓기를 할 수 있도록 적절한 환경을 제공하십시오. 이상적으로는 30-50 럭스의 조명이있는 조명 스탠드를 사용하십시오. 이것은 암컷의 번식력을 향상시켜 배아 수집의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
알림: 성체 (출현 후 5-6 일)를 희미한 조명 (<100lux) 환경에 두면 짝짓기를 촉진 할 수 있습니다. 일반적으로 산란의 피크는 오후 03:00(14:10/L:D, 오전 06:00 점등, 오후 08:00 소등)에 발생합니다. 충분한 배아를 얻으려면 오후 03:00 30 분 전에 케이지에 산란실을 배치하는 것이 좋습니다. - 챔버 뚜껑에서 200-1mm 떨어진 산란 챔버에 2 메쉬 거즈를 놓습니다. 이것은 가능한 한 많은 배아를 얻는 데 도움이 될 것입니다.
알림: 배아를 오렌지 주스에 담그거나 거즈로 문지르면 배아의 생존율이 크게 떨어질 수 있으므로 피하십시오. - 미세 주입 설정이 준비되면 케이지에 새 산란실을 넣으십시오. 미세한 젖은 솔을 사용하여 10 분마다 배아를 수집 한 다음 자체 제작 한 주사 판 (길이 55mm, 너비 13.75mm, 높이 5mm의 플렉시 유리, 45mm x 5mm x 0.3mm의 얕은 홈이 중간에 열려 난자 배치를 용이하게합니다). 배아의 내부 압력이 높으면 <10 % RH에서 10 분 동안 약간의 건조가 선택 사항입니다. 추가 건조를 피하기 위해 주입하는 동안 배아를 할로 카본 오일에 담그십시오 (그림 2C).
3. 배아의 미세 주입
- 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 주입 바늘을 준비하십시오.
알림: 사용 설명서에 따라 매개 변수를 설정하는 것이 중요합니다. 이러한 프로토콜에서는 마이크로 피펫 풀러의 설명서에서 제안한 매개 변수를 사용하여 다른 바늘 모양을 만들 수 있습니다. 유리 모세관은 먼지가 바늘을 막히지 않도록 가능한 한 깨끗해야합니다. - 작업 솔루션을 준비하십시오. Cas9 단백질과 해당 sgRNA를 다음 작업 농도로 혼합하십시오 : sgRNA, 300 ng / μL; Cas9 단백질, 150 ng / μL. 주입 된 배아를 표시하는 편리한 방법으로 사용하기 위해 혼합물에 1 μL의 페놀 레드를 첨가하십시오. sgRNA의 분해를 피하기 위해 준비된 혼합물을 얼음 위에 놓습니다.
참고: 뉴클레아제가 없는 피펫 팁과 PCR 튜브를 사용하십시오. Cas9 단백질의 농도는 150ng/μL 이하여야 합니다. 더 높은 농도는 독성이 있으며 배아 생존율을 현저히 감소시킵니다. Cas9는 또한 성공적인 유전자 편집17,19를 달성하기 위해 DNA 또는 mRNA 형식으로 전달 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 mRNA가 분해되기 쉽고 플라스미드 DNA에서 Cas9 단백질의 발현은 전사 및 번역에 시간이 걸리기 때문에 Cas9 단백질을 권장합니다. - 인젝터의 매개 변수를 설정합니다. 초기 프로그램은 Pi-500 hPa, Ti-0.5 s 및 PC-200 hPa입니다. 미세 주입 중에 필요에 따라 이러한 매개 변수를 추가로 조정하십시오.
- 혼합물 3μL를 주사 바늘에 첨가한다. 바늘을 막을 수있는 기포를 도입하지 마십시오. 마이크로 그라인더를 사용하여 바늘을여십시오.
- 사용 설명서에 따라 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 연결합니다(그림 2E).
- 객관적인 테이블에 줄 지어있는 배아가있는 접시를 놓습니다. 미세 광학 현미경으로 마이크로 피펫의 위치를 조정하여 마이크로 피펫과 배아를 동일한 평면에 놓습니다. 페달을 밟아 물방울 볼륨을 조정하십시오. 배아의 1/10 부피가 권장됩니다.
- 바늘 끝을 배아의 뒤쪽 (식물 기둥)에 삽입하십시오. 인젝터에서 페달을 밟아 혼합물을 배아에 전달합니다. 페놀 레드가 첨가되면 약간 붉은 색이 즉시 관찰됩니다.
참고: 핀홀에서 나오는 소량의 세포질 역류는 배아의 생존율을 감소시키지 않습니다. 200 개의 배아를 주입하면 한 유전자의 성공적인 돌연변이 유발에 충분합니다. 배아를 담그기 위해 더 많은 할로 카본 오일을 첨가하면 더 이상의 건조를 방지 할 수 있습니다. 주사는 극 세포 형성 전에 수행되어야 하므로 모든 돌연변이가 효율적으로 유전될 수 있습니다.
4. 주사 후 곤충 사육
- 주입된 배아가 있는 주입판을 55% RH, 26.5°C, 14:10 L/D 주기(아침 6시 점등, 저녁 8시 소등)로 유지되는 인공 기후 챔버에 넣습니다.
- 주사 후 배아 형성은 일반적으로 완료하는 데 24 시간, 부화하는 데 36 시간이 걸립니다. 미세한 브러시를 사용하여 유충을 준비된 애벌레 식단으로 옮깁니다. 더 이상 유충이 부화하지 않을 때까지 매일 3-4 번 유충을 수집하십시오. 일반적으로 유충은 부화를 마치고 7 일 이내에 번데기를 완료하는 데 2-3 일이 걸립니다.
참고 : 옥수수 기반 식단을 사용하여 유충에게 먹이를주었습니다. 레시피에는 옥수수 가루 150g, 바나나 150g, 안식향산 나트륨 0.6g, 효모 30g, 자당 30g, 종이 타월 30g, 염산 1.2mL 및 물 300mL가 포함되어 있습니다29. 유충이 기름에 남아있는 시간을 최소화하십시오 (<2 시간). 가능한 한 부화 직후 유충을 식단으로 옮기십시오. 이것은 생존율과 번식률을 크게 증가시킬 수 있습니다. 너무 많은식이 요법을 제공하지 마십시오 (90mm 페트리 접시의 2/3를 가진식이 요법은 30 마리의 애벌레에게 충분합니다). 그렇지 않으면 곰팡이가 생겨 애벌레 생존율이 감소합니다. - 성숙한 애벌레를 젖은 모래에 넣어 번데기를하십시오. 번식 단계는 약 10 일이 걸립니다. eclosion이 시작되기 전에 번데기를 플라스틱 케이지로 옮깁니다.
5. 돌연변이 스크리닝
- 돌연변이체 스크리닝의 흐름도가 도 3A에 예시되어 있다. 이형접합체를 얻기 위해 야생형 성체와 함께 미세주사하여 얻은 G0 성체를 교차시킨다. 유전형 분석을 통해 자손 (G1)이 가지고있는 돌연변이 유형을 확인하십시오.
- G1을 동일한 돌연변이 유전자형으로 자가 교차시켜 G2에서 동형접합체를 얻습니다. G1에서 돌연변이 체의 유전자형이 완전히 다른 경우, 이형 접합체를 야생형 파리와 교차시킵니다. 동형 접합 선은 일반적으로 G3에서 얻습니다. 후속 표현형 실험을 위해 2 개 또는 3 개의 동형 접합 라인을 유지하십시오.
- 신선한 번데기 또는 개별 성인의 단일 중간 다리에서 게놈 DNA를 사용하여 유전형 분석을 수행합니다. 표적 영역을 증폭하기 위해 특정 프라이머를 설계하고; 프라이머는 표적 부위의 상류 및 하류에 최소 50bps를 설정해야 합니다. 입문서에 대한 자세한 내용은 1.2단계를 참조하십시오.
참고: 번데기의 DNA 양이 매우 적기 때문에 시중에서 판매되는 DNA 추출 키트를 사용하는 것이 좋습니다. - 다음 사이클링 조건을 사용하여 PCR을 수행합니다: 98°C에서 3분, 이어서 98°C에서 10초, 설계된 프라이머에 적합한 어닐링 온도에서 15초, 72°C에서 35초, 이어서 10분 동안 72°C의 최종 연장.
- 정제된 PCR 산물을 서열분석한다. 표적 부위에 인접한 여러 개의 겹치는 피크가 검출되면 (그림 3B) 성공적인 돌연변이 유발이 발생한 것입니다. 정제된 PCR 산물을 무딘 말단 벡터로 서브클로닝하고 시퀀싱을 위해 10개의 개별 박테리아 콜로니를 선택하여 돌연변이체의 유전자형을 확인합니다. 프레임 시프트 변형 및 조기 변환 종료로 라인을 유지합니다(그림 3C).
참고: G0 개체의 유전자형을 확인하기 위해 단일 클론 시퀀싱을 수행할 필요가 없습니다. PCR 산물의 염기서열을 분석하고 표적 부위에 인접한 명백한 다중 중첩 피크가 있는 개체를 유지하기만 하면 됩니다. 초기 주입 후 게놈 DNA를 추출할 10개의 배아를 선택하고 5.3단계의 표준에 따라 PCR 산물을 시퀀싱하는 것이 좋습니다. 이것은 돌연변이율을 미리 예측하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 유전자형을 결정하기 위한 생어 시퀀싱을 시퀀싱 회사에서 수행했습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 gDNA 선택, 배아 및 미세 주입 수집, 곤충 유지 관리 및 돌연변이 스크리닝의 대표 결과를 포함하여 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 B. dorsalis 돌연변이를 개발하는 자세한 단계를 제공합니다.
선택된 유전자의 표적 부위의 예는 세 번째 엑손에 위치한다(도 1C). 이 부위는 고도로 보존되어 있고, 단일 밴드는 합성 gRNA (도 1D) 및 시험관 내 전사에 의해 수득 된 gRNA (도 1E)에 대한 DNA 주형에 대한 겔 전기 영동에 의해 검출되었다.
200개의 갓 수확한 알에 주사하는 것은 섹션 3에 설명된 대로 수행되었습니다. 배아는 단계 4.1-4.3에 기재된 프로토콜에 따라 유지되었다. PCR 산물을 시퀀싱하여 검출된 바와 같이, G0 개체의 80%는 모자이크 돌연변이체이다(표 1). 여기서, G1에서 아미노산 번역의 조기 종료를 초래하는 8 bp 결실을 갖는 돌연변이체가 선택되었다(도 3C). 이것은 B. dorsalis에서이 유전자 산물의 해당 기능의 변화로 이어져야합니다. 선택된 G1을 야생형과 교차시켜 G2 이형접합체를 얻었다. G2 이형 접합체와 동형 접합체를자가 교차 한 다음 세대에서 회수하여이 계획이 B. dorsalis 돌연변이 체를 개발하는 데 성공적이며이 종과 밀접하게 관련된 종의 기능적 유전자 연구에보다 널리 적용될 수 있음을 입증했습니다.
그림 1: sgRNA의 제조 . (A) sgRNA 준비를 위한 일반적인 절차. (b) gDNA (100 bp)로부터 PCR에 의해 증폭 된 표적 영역. (c) Cas9에 의한 표적 유전자 구조 및 표적 절단 부위의 예. (D) sgRNA의 PCR 어셈블리 (~ 100 bp). (e) 시험관내 전사 및 정제에 의한 sgRNA의 합성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 배아 미세 주입. (A) 주입 과정 및 방법. (B) 거즈에 알을 낳는 배아 수집 장치. (C) 배아를 물로 정렬하고 할로 카본 오일로 덮습니다. (D) 마이크로피펫 풀러. (E) 미세 주입 시스템의 전체 설정. 현미경(왼쪽), 마이크로 인젝터 및 마이크로 매니퓰레이터(가운데), 자동 공기 펌프(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 돌연변이 스크리닝 . (A) 돌연변이의 짝짓기 및 동형 접합체의 획득. (B) 표적에서 뚜렷한 피크 세트를 생성하는 돌연변이 게놈으로부터의 PCR 산물. (c) 하나의 돌연변이 유형 및 아미노산 변화. 결실 돌연변이는 번역의 조기 종료로 이어집니다. 약어 : HE = 이형 접합체, HO = 동형 접합체. 대조군: 스크램블된 sgRNA를 주입한 배아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 주입 믹스 | 주입 된 배아 | 부화 한 애벌레 | 번데기 | 모자이크 G0 | ||
| (모자이크/전체 성인) | ||||||
| BdorOrco_gRNA1 (300 ng / μL) | 200 | 83 | 66 | 49/60 (81%) | ||
| BdorOrco_gRNA2 (300 ng / μL) | ||||||
| 카스9 (150 ng / μL) | ||||||
| 페놀 레드 (1 μL) | ||||||
| BdorOrco_scrambled gRNA1 (300 ng / μL) | 200 | 78 | 76 | 0/70 (0%) | ||
| BdorOrco_scrambled gRNA2 (300 ng / μL) | ||||||
| 카스9 (150 ng / μL) | ||||||
| 페놀 레드 (1 μL) | ||||||
표 1 : B. 미세 주사 후 등쪽 생존 및 돌연변이 유발.
| 문제 | 잠재적 원인 | 솔루션 | |
| 비효율적인 배아 수집 | 1. 성인의 상태가 좋지 않습니다. | 1. 음식과 물, 특히 음식의 설탕 함량의 가용성을 확인하십시오. | |
| 2. 불충분 한 짝짓기 | 2. 30-50 럭스 희미한 조건 하에서 미리 짝짓기. 12-15 일 된 짝짓기 성인을 선택하는 것이 가장 좋습니다. | ||
| 주사 후 알의 부화 가능성 불량 | 1. 품질이 좋지 않은 배아 | 1. 신선하고 통통한 계란을 골라 물에 적신 브러시로 부드럽게 닦습니다. | |
| 2. 바늘이 맞지 않습니다 | 2. 주사 중 난자의 손상을 최소화하기 위해 바늘 끝을 가능한 한 작게 만듭니다. | ||
| 3. 주사 후 부적절한 난자 사육 | 3. 계란은 탈수가 마르지 않도록 주사 후 수분을 유지해야합니다. 계란은 주사 후 음식으로 직접 옮길 수도 있습니다. | ||
| 낮은 애벌레 생존율 | 1. 곰팡이가 핀 음식은 유충 성장에 적합하지 않습니다. | 1. 새로 부화 한 유충의 경우 소량의 음식을 첨가하십시오. 너무 많은 음식은 곰팡이가 생기거나 말라서 유충의 성장에 영향을 미칩니다. | |
| 2. 새로 부화 한 유충은 오랫동안 기름에 담갔다. | 2. 새로 부화 한 유충은 제 시간에 유충 음식으로 옮겨야하거나 주사 후 알을 음식에 직접 골라야합니다. | ||
| 성인 돌연변이율이 낮습니다. | 1. gRNA의 낮은 품질 | 1. 분해를 방지하기 위해 고품질 gRNA를 합성하기위한 엄격한 실험 작업. | |
| 2. 비효율적인 목표는 목표를 벗어남으로 이어집니다. | 2. 논의에서 언급한 대로 고효율 타겟을 스크리닝합니다. | ||
표 2: 돌연변이 구성과 관련된 가능한 문제, 잠재적 원인 및 솔루션.
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Discussion
CRISPR/Cas9 시스템은 가장 널리 사용되는 유전자 편집 도구이며 유전자 렙기(30), 작물 육종(31) 및 유전자 기능(32)의 기초 연구와 같은 다양한 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 시스템은 이미 다양한 곤충 종의 유전자 편집에 적용되었으며 해충의 기능적 유전자 연구에 효과적인 도구로 사용되었습니다. 여기에서 제시하는 프로토콜은 가이드 RNA의 설계 및 합성, 배아 수집, 배아 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 스크리닝 절차를 표준화합니다. 또한 각 단계에서 발생할 수 있는 문제를 요약하기 위해 문제 해결 테이블을 추가했으며, 워크로드를 줄이고 효율성을 개선하기 위해 솔루션을 제공했습니다(표 2). 이 절차는 관심 유전자를 편집하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공하고 B. dorsalis의 기능적 게놈 연구를 개선합니다.
첫째, 표적 유전자 선택은 CRISPR/Cas9 시스템의 효율성을 높이는 데 중요하며, ChopChop 33,34 (http://chopchop.cbu.uib.no/), sgRNAcas9 (V3.0)35 및 CRISPR 최적 표적 파인더 36 (http://targetfinder.flycrispr.neuro.brown.edu)과 같은 여러 오픈 소스 소프트웨어 프로그램은 자동으로 표적을 생성하고 잠재적인 표적 이탈 비율을 예측할 수 있습니다. B. dorsalis의 높은 생산력은 배아 수집을 용이하게하기 때문에, 표적 영역의 DNA 추출 및 시퀀싱을 위해 배아의 일부를 희생함으로써 돌연변이 속도를 예측할 수있다. 실험실에서 시퀀싱을 사용할 수 없는 경우 T7 엔도뉴클레아제 I을 사용하여 돌연변이율을 예측하는 것도 권장됩니다37. 이 세 가지 방법을 통해 게놈 결실률이 높은 표적 부위를 선택할 수 있으므로 B. dorsalis에서 유전자 편집 효율을 높일 수 있습니다.
배아의 발달 단계는 돌연변이가 유전되는지 여부를 결정합니다. 유전된 돌연변이를 얻으려면 생식 세포에서 유전자 편집이 이루어져야 합니다. 일반적으로 sgRNA와 Cas9의 혼합물은 극 세포 형성이 발생한 후 생식 세포로 전달 될 수 없습니다. B. dorsalis에서 극 세포 형성은 알을 낳은 후3 시간에 38 시간에 발생하는 반면, B. dorsalis에 대해 여기에 자세히 설명 된 프로토콜은 배아 수집에서 미세 주입이 끝날 때까지 30 분이 걸립니다. 주사하는 동안 배아의 식물 끝에는 극 세포가 거의 형성되지 않습니다. 따라서 G0에서 얻은 유전자 돌연변이는 효율적으로 유전되어야합니다. 미세 주입에 소요되는 시간도 이전에 발표 된 논문 (일반적으로 1-3 시간)18,19에서 언급 한 방법보다 적습니다.
배아 수집 및 취급 과정에서 기계적 또는 화학적 손상을 최소화하는 것이 중요합니다. 미세한 브러시를 사용하여 주사판에 배아를 부드럽게 정렬합니다. 주사 위치는 이전에 Drosophila (Methods - Nicolas Gompel의 실험실, http://gompel.org/methods) 및 Ceratitis capitata39에서 수행 된 작업을 반영해야합니다. 식물 극에 배아를 주입하십시오. 동물 기둥에 바늘을 삽입하지 마십시오. 마이크로 피펫 풀러 가이드에 따라 바늘을 준비하십시오. 과도한 세포질 역류를 피하기 위해 바늘의 개방은 가능한 한 작아야합니다. B. dorsalis에 발표 된 연구에서 언급 된 방법은 일반적으로 나트륨 hypochorite17,18,19로 배아를 탈 증화했습니다. 이것은 화학적 손상을 일으키고 배아의 생존율을 감소시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서 배아는 탈육종되지 않으며 주사는 여전히 잘 작동합니다. 배아에 대한 화학적 손상은 최소화 될 수 있습니다.
주사 후 곤충 사육은 매우 중요합니다. 여기에 제공된 표준화 된 사육 프로토콜은 다른 초파리 종, 특히 Bactrocera 종을 사육하기위한 참고 자료가 될 수 있습니다. 배아는 자체 제작 주사판을 사용하여 주입 중 건조를 방지하기 위해 기름에 담글 수 있습니다. 유충이 기름에서 보내는 시간 (<2 시간)을 최소화하여 G0에서 생존율을 50 % 이상으로 달성하십시오.
돌연변이 검출을 위해 게놈 DNA 추출의 비침습적 방법이 권장됩니다. 예를 들어, 일부 나비목 연구자들은 최종 별 유충의 삼출물이 추가 유전형 분석을 위해 게놈 DNA를 추출하는 데 사용될 수 있다고 제안합니다. B. dorsalis의 경우 한 가지 비 침습적 방법은 신선한 번데기에서 게놈 DNA를 추출하는 것입니다. 마커 유전자와 관심 유전자를 표적으로 하는 여러 sgRNA를 주입하면 돌연변이 식별도 향상될 수 있습니다. 예를 들어, 눈 색깔 (kmo)과 청소년 호르몬 수용체 (Met)를 표적으로하는 동시 주입 된 sgRNA는 모기에서 이중 돌연변이가있는 자손의 75 %를 생산할 수 있습니다. Met 돌연변이체 는 유충37의 눈 색깔에 기초하여 예비 스크리닝되었다. 이것은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여이 곤충 종에서 유전자 편집의 효능을 더욱 향상시키기 위해 향후 B. dorsalis 에서 평가되어야합니다.
결론적으로, CRSIPR/Cas9 시스템은 B. dorsalis의 기능 유전체학에서 강력한 도구입니다. 당사의 상세한 프로토콜은 연구자가 효율적인 배아 수집, 유충의 이상적인 생존율 및 원하는 편집 효율성을 달성하는 데 도움이 되는 유용한 정보를 제공합니다. 이것은 연구자들이 B. dorsalis 에서 돌연변이 유발을 얻는 데 도움이되는 간단하고 빠른 방법 일 수 있습니다. 이 기술은 유전 된 돌연변이가 성공적인 교차 교배를 필요로하기 때문에 치명적인 유전자의 기능 연구에 적용될 수 없었습니다. 향후 연구는 이러한 한계를 돌파하기 위해 병기 또는 조직 특이적 CRISPR 요소를 발현하는 형질전환 도구를 개발하는 데 초점을 맞출 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 심천 과학 기술 프로그램 (보조금 번호. KQTD20180411143628272) 및 심천 Dapeng 신구의 과학 기술 혁신 및 산업 발전을위한 특별 기금 (보조금 번호. PT202101-02).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6x DNA Loading Buffer | TransGen Biotech | GH101-01 | |
| Artificial climate chamber | ShangHai BluePard | MGC-350P | |
| AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit | Axygen | AP-MN-MS-GDNA-250G | |
| BLAT | NA | NA | For searching potential gene loci in the genome |
| Capillary Glass | WPI | 1B100F-4 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf | InjectMan 4 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Hisat2 | NA | NA | For aligning the transcriptome to the acquired gene loci |
| IGV | NA | NA | For visualizing the results from Transdecoder |
| Microgrinder | NARISHIGE | EG-401 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZ2-ILST | |
| pEASY-Blunt Cloning Kit | TransGen Biotech | CB101-02 | https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290-100ML | |
| Pipette cookbook 2018 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers | Instrument Company | https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040A | |
| SAMtools | NA | NA | For generating the sorted bam files |
| sgRNAcas9-AI | NA | NA | sgRNA design http://123.57.239.141:8080/home |
| Sutter Micropipette Puller Sutter | Instrument Company | P-97 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech | BM101-02 | |
| Transdecoder | NA | NA | For combining the results of assemble transcripts and gene loci information https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0 |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36498 | |
| Ultra-trace biological detector | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000C |
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