Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrofluidik-assisteret selektiv depolarisering af aksonale mitokondrier

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64196
* These authors contributed equally

Summary

Den nuværende protokol beskriver såning og farvning af neuronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den flydende trykgradient i disse kamre muliggør selektiv behandling af mitokondrier i axoner for at analysere deres egenskaber som reaktion på farmakologiske udfordringer uden at påvirke cellelegemets rum.

Abstract

Mitokondrier er de primære leverandører af ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Mitokondrie dysfunktion er en almindelig fænotype i mange neurodegenerative sygdomme. I betragtning af nogle axoners udførlige arkitektur og ekstreme længde er det ikke overraskende, at mitokondrier i axoner kan opleve forskellige miljøer sammenlignet med deres cellekropsmodstykker. Interessant nok går dysfunktion af aksonale mitokondrier ofte forud for virkninger på cellekroppen. For at modellere aksonal mitokondriel dysfunktion in vitro tillader mikrofluidiske enheder behandling af aksonale mitokondrier uden at påvirke de somale mitokondrier. Den flydende trykgradient i disse kamre forhindrer diffusion af molekyler mod gradienten, hvilket muliggør analyse af mitokondrieegenskaber som reaktion på lokale farmakologiske udfordringer inden for axoner. Den nuværende protokol beskriver såning af dissocierede hippocampale neuroner i mikrofluidiske enheder, farvning med et membranpotentielt følsomt farvestof, behandling med et mitokondrietoksin og den efterfølgende mikroskopiske analyse. Denne alsidige metode til at studere aksonal biologi kan anvendes på mange farmakologiske forstyrrelser og billeddannelsesaflæsninger og er velegnet til flere neuronale undertyper.

Introduction

Mitokondrier er de vigtigste leverandører af ATP (adenosintrifosfat) i neuroner. Da neuronal sundhed er tæt forbundet med mitokondriefunktion, er det ikke overraskende, at dysfunktionel regulering af disse organeller har været forbundet med begyndelsen af forskellige neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom1. Desuden er mitokondriel forgiftning med succes blevet brugt til at modellere Parkinsons symptomer hos dyr2. I både dyremodeller og menneskelig sygdom starter neuronernes død ved de distale dele3,4, hvilket antyder, at aksonale mitokondrier kan være mere modtagelige for fornærmelser. Imidlertid er mitokondriernes biologi i axoner ikke godt forstået på grund af de vanskeligheder, der er forbundet med målrettet behandling og analyse af aksonale mitokondrier uden samtidig forstyrrelse af cellekropsprocesser.

Nylige fremskridt inden for dyrkningsteknikker af dissocierede neuroner in vitro tillader nu fluidisk adskillelse af axoner og cellelegemer gennem mikrofluidiske enheder5. Som vist i figur 1A har disse enheder fire adgangsbrønde (a/h og c/i), med to kanaler, der forbinder hvert par (d og f). De store kanaler er forbundet med hinanden med en serie på 450 μm lange mikrokanaler (e). Forsætlige forskelle i påfyldningsniveauerne mellem de to kamre skaber en væsketrykgradient (figur 1B), der forhindrer diffusion af små molekyler fra kanalen med et lavere væskeniveau til den anden side (figur 1C, illustreret med Trypan blåt farvestof).

Vi brugte for nylig mikrofluidiske enheder til at studere lokale oversættelseskrav i aksonal mitofagi, selektiv fjernelse af beskadigede mitokondrier6. I den nuværende protokol præsenteres forskellige trin for at inducere lokal mitokondrieskade gennem selektiv behandling af axoner ved anvendelse af mitokondriekomplekset III-hæmmeren Antimycin A 6,7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført efter de relevante retningslinjer og regler fra regeringen i Oberbayern. De primære neuroner blev fremstillet ud fra E16.5 C57BL/6 vildtype museembryoner af begge køn efter standardmetoder som tidligere beskrevet6.

1. Samling af den mikrofluidiske enhed

  1. Belæg en seks-brønds glasbundet vævskulturplade med en endelig koncentration på 20 μg/ml Poly-D-lysin og 3,4 μg/ml Laminin i PBS (fosfatbufferet saltvand) (se materialetabel).
  2. Inkuber den belagte plade natten over i mørket ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Belægning kan også udføres ved 37 °C i 1-2 timer. Valget af belægningen afhænger af den anvendte celletype.
  3. Efter belægning bringes de seks brøndplader til den sterile hætte og vaskes to gange med steril ddH2O.
    BEMÆRK: Vask ikke med saltholdige buffere såsom PBS, da saltkrystaller vil forstyrre tætningsdannelsen.
  4. Lad pladen tørre i en vippet position i 3-5 min. Fjern overskydende vand ved vakuumsugning eller pipettering.
  5. Sug det mikrofluidiske kammer i 80% ethanol.
    BEMÆRK: Det mikrofluidiske kammer blev opnået fra kommercielle kilder (se Materialetabel).
  6. Lad det mikrofluidiske kammer tørre i 3-5 minutter i en vippet position. Fjern overskydende ethanol ved vakuum, sugning eller pipettering.
  7. Når det er helt tørt, skal du placere det mikrofluidiske kammer i midten af brønden.
    BEMÆRK: Dannelsen af tætningen kan observeres som en ændring i reflekterende egenskaber ved udelukkelse af luft fra grænsefladen mellem pladen og silikoneanordningen. Både pladen og mikrofluidkammeret skal være helt tørt inden montering for at skabe en god tætning. Tørretiden skal dog minimeres så meget som muligt for at sikre korrekt vedhæftning af cellerne. Derfor skal brønde og kamre inspiceres visuelt for resterende væskedråber. Hvis der ikke er synlige dråber, skal du straks samle kamrene.
  8. Bank forsigtigt på mikrofluidkammeret ved dets grænser og mikrorillesektionen i midten for korrekt fastgørelse til glaspladen.

2. Såning og vedligeholdelse af neuroner

  1. Saml det ønskede antal dissocierede hippocampale neuroner pr. kammer i et 1,5 ml reaktionsrør.
    BEMÆRK: I denne undersøgelse blev 1,5 x 105 neuroner podet pr. Enhed til billeddannelsesbaserede applikationer.
  2. Centrifugeneuroner ved 1000 x g i 4 minutter ved stuetemperatur.
  3. Supernatanten kasseres med en pipette, og pelleten gensuspenderes i 8 μL B27-neurobasal media (se Materialetabel).
  4. Celleopløsningen pipetteres ind i kanalindgangen til det mikrofluidiske kammer (b i figur 1A).
  5. Tryk på bagsiden af pladen for at hjælpe strømmen gennem kanalen.
    BEMÆRK: Aflytning kan udføres ganske kraftigt uden bekymring for, at forseglingen går i stykker.
  6. Aspirér med en pipette enhver resterende cellesuspension ved udgangen af kanalen (g i figur 1A) for at reducere antallet af celler uden for kanalen.
  7. Inkuber det mikrofluidiske kammer med celler i 15-20 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
  8. Fyld den øverste aksonale brønd med 50 μL B27-neurobasalmedier i (c i figur 1A).
  9. Tryk på bagsiden af pladen for at hjælpe strømmen gennem kanalen.
  10. Fyld brønde på soma-siden (a og h i figur 1A) med 150 μL B27-neurobasale medier hver, hvilket skaber en spændingsboble ovenpå. Boblens volumen er ca. 20 μL.
    BEMÆRK: Oprettelse af en spændingsboble er ikke nødvendig for at opnå fluid isolering, men det giver et klart billede af det højere volumen på somasiden.
  11. Fyld begge brønde på den aksonale side (c og i i figur 1A) med 100 μL B27-neurobasale medier hver.
    BEMÆRK: For at fremme axonal vækst gennem mikrorillerne anbefales det, at brøndene på soma-siden indeholder flere medier end brøndene på axonsiden. Axoner vil dog ved en tilfældighed vokse gennem mikrorillerne, selv uden volumenforskelle.
  12. Det mikrofluidiske kammer inkuberes ved 37 °C og 5 % CO2 i 7-8 dage.
    BEMÆRK: Vækst af axoner ind i det aksonale kammer kan normalt observeres fra dag in vitro (DIV) 5. Længere dyrkningstider er mulige, hvis der ønskes mere modne kulturer.
  13. Foder neuroner hver 2-3 dage ved at fjerne mediet fra de to øvre brønde (a og c) og erstatte det med frisk B27-neurobasalt medium, indtil der dannes en spændingsboble.

3. Farvning med mitokondriemembran potentielt følsomt farvestof

  1. Ved DIV 7-8 skal du vurdere, at axonerne er vokset gennem mikrorillerne og strækker sig ind i det aksonale rum under et lysmikroskop.
    BEMÆRK: Forskellige DIV-stadier er også mulige afhængigt af den ønskede alder.
  2. Udfør to vaske med forvarmet billeddannelsesmedium (37 °C) ved at fjerne B27-neurobasalmediet fra alle brønde og tilføje ca. 100 μL billedmediet til de øverste brønde i både axonal- og somakanalerne (a og c). Lad mediet strømme igennem til de nederste brønde (h og i).
    1. Fjern mediet fra de nederste brønde og eventuelle rester i de øverste brønde, og gentag med frisk medium, så brøndene efterlades tomme i slutningen af vasken.
      BEMÆRK: På grund af den høje kapillærkraft i kanalerne (d og f) vil der være et resterende vaskemedium i kanalerne, som ikke bør fjernes for at forhindre neuronerne i at tørre. Ethvert phenol-rødfrit billeddannelsesmedium kan bruges her, for eksempel Hibernate E (se Materialetabel). Hvis mikroskopet ikke er konfigureret med en CO 2 -forsyning, skal du sikre dig, at billeddanneren bruger et alternativt buffersystem til karbonat / CO2 (f.eks. HEPES)8.
  3. Fortynd 1 mM tetramethylrhodaminethylester (TMRE, rød, se Materialetabel) til 5 nM i billeddannermediet.
    BEMÆRK: Overskrid ikke 1% DMSO i den endelige fortynding for at undgå toksicitet.
  4. Tilsæt 100 μL af 5 nM TMRE-fortyndingen til både de somatiske og aksonale topbrønde (a og c), og lad mediet strømme gennem både det somatiske og det aksonale rum, indtil der er et lige stort volumen i alle brønde. Fyld op med det TMRE-holdige medium.
  5. Placer neuronerne tilbage i et kontrolleret miljøkammer (37 °C og 5% CO2) i 25 min.
  6. Der udføres to vaske med det forvarmede billeddannermedium (37 °C) som beskrevet før (trin 3.2). Ved den sidste vask fyldes op med 100 μL i hver brønd og skaber en spændingsboble af mediet på de somatiske brønde (a og c).

4. Billeddannelse med levende celler

BEMÆRK: De viste stillbilleder blev erhvervet på et konfokalt mikroskop med roterende disk ved hjælp af et 40x NA 1.25-nedsænkningsmål (se Materialetabel). Der blev valgt 200 ms eksponeringstid og 10 % lasereffekt for den røde kanal og 500 ms eksponeringstid for brightfield. Imidlertid kan regelmæssige konfokale eller widefield inverterede mikroskoper også bruges til at studere TMRE-intensitet.

  1. Billede cellerne med et omvendt mikroskop.
  2. Sørg for, at mikroskopet er udstyret med en trininkubator for at opretholde neuronal kultur ved 37 ° C gennem hele eksperimentet.
  3. Vælg et område af interesse i det somatiske rum, og følg det gennem mikrorillerne ind i det aksonale rum. Sørg for, at de afbildede mikrogrooves matcher dem i det somatiske og det aksonale rum (for lettere sammenligning af baseline og efterbehandling).
  4. Tag fluorescensbilleder ved hjælp af excitation ved 561 nm og emission ved 625 nm for rødt fluorescenssignal.
  5. Anskaf billederne.
  6. For at inducere mitokondriel depolarisering tilsættes 20 μM Antimycin A (se Materialetabel) i billedmediet til det aksonale rum. For at sikre en volumenforskel mellem soma og aksonale kamre skal du kontrollere tilstedeværelsen af en spændingsboble på den somatiske side (lig med volumen >110 μL).
    1. Fjern alt billeddannende medium fra den nederste brønd på den aksonale side (i), undtagen mediet inde i kanalen (f). Tilsæt 160 μL 20 μM Antimycin A til den øverste aksonale brønd (c), og lad den strømme gennem kanalen, indtil der er et lige stort volumen i begge aksonale brønde. Volumener i aksonale brønde er ca. 80 μL pr. Brønd.
      BEMÆRK: Sørg for, at volumenet i de aksonale brønde er mindre end i de somatiske brønde for at sikre korrekt væsketryk. En forskel på mindst 10 μL (10% af brøndvolumenet) anbefales, men også højere forskelle er mulige.
  7. Inkubere neuroner i det kontrollerede miljøkammer (37 °C) i 20-30 min.
  8. Gentag billeddannelse som beskrevet ovenfor (trin 4.3-4.5). Sørg for, at de samme positioner er afbildet (let identificeret af mikrogrooves) som under den oprindelige anskaffelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primære hippocampale neuroner blev dyrket i mikrofluidiske enheder i 7-8 dage, før mitokondrier blev farvet med det membranfølsomme farvestof (TMRE) i 25 minutter i begge kanaler. Som vist i figur 2A gav dette homogen farvning af mitokondrier på begge sider af mikrorillerne, men det var utilstrækkeligt til at ligevægte farvningen i midten af mikrorillerne. Ved tilsætning af Antimycin A til den aksonale side bevarede somale mitokondrier TMRE-signalet (figur 2B og video 1), mens TMRE-fluorescens gik tabt fra aksonale mitokondrier (figur 2C og video 1). Videoen blev optaget ved hjælp af et fuldt integreret digitalt widefield-mikroskop (se Materialetabel).

Figure 1
Figur 1: Mikrofluidiske anordninger tillader fluidisk isolering af axoner . (A) Skematisk over den mikrofluidiske anordning, der anvendes i denne undersøgelse. Silikoneskiven (diameter 21 mm) passer let ind i en seks-brøndsplade. a) Godt på soma side, b) Indgang af kanal på soma side, c) Godt på axon side, d) Kanal på soma side, e) Microgrooves, f) Kanal på axon side, g) Udgang af kanalen på soma side, h) Godt på soma side, i) Godt på axon side. (B) Skematisk detaljering af, hvordan de forskellige væskeniveauer skaber en fluidisk trykgradient på tværs af mikrokanalerne. (C) Påvisning af den flydende isolering ved tilsætning af Trypan blå til den ene side af kammeret. Bemærk, at på grund af den flydende trykgradient ekvilibrerer det blå farvestof ikke på tværs af mikrokanalerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Selektiv behandling af axoner depolariserer aksonale, men ikke cellelegeme mitokondrier. (A) Repræsentativ mikrograf, der giver et overblik over effektiviteten af TMRE-farvning i mikrofluidiske enheder. Skalabjælke = 100 μm. (B-C) Den repræsentative mikrograf viser det samme område i cellelegemet og det aksonale rum før og efter tilsætning af 20 μM Antimycin A (AA) til det aksonale rum. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Video 1: Effekt af Antimycin A-behandling på mitokondrier i axoner og cellelegemer. Levende cellebilleddannelse af tabet af TMRE-fluorescens ved tilføjelse af Antimycin A. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende protokol beskriver en metode til frø og kultur dissocierede hippocampus neuroner i en mikrofluidisk enhed til behandling af aksonale mitokondrier separat. Nytten af denne tilgang med det membranfølsomme farvestof TMRE og den komplekse III-hæmmer Antimycin A (som tidligere demonstreret7) demonstreres her, men denne metode kan let tilpasses andre mitokondriefarvestoffer eller genetisk kodede sensorer af mitokondriefunktioner, der tillader lokale, mikroskopibaserede udlæsninger9. Andre neuronale celletyper kan også dyrkes i mikrofluidiske kamre, såsom primære kortikale neuroner10 eller inducerede pluripotente stamceller (ipSC) -afledte motorneuroner11, hvilket gør denne platform til et alsidigt værktøj til at studere mitokondriefunktion i neurodegeneration i neuronal celletype af interesse. Samlingen af mikrofluidiske enheder er afgørende for at opnå en effektiv tætning og forklares lettest ved at se en erfaren forsker udføre samlingen. Nedstrøms mærknings- og behandlingsproceduren beskrevet her er beregnet til at være eksemplarisk og kan justeres for at passe til de protokoller, der i øjeblikket er etableret i de respektive laboratorier, samtidig med at væsketrykgradienten opretholdes.

Den her beskrevne såteknik adskiller sig fra offentliggjorte protokoller og producentens beskrivelse, da vi springer over de foreslåede vaske af den samlede enhed og i stedet direkte frø de dissocierede neuroner i tørkammeret (afsnit 2). Det er blevet observeret, at dette reducerer antallet af neuroner, der er nødvendige, da det øger tætheden af neuroner i kanalen (e) og begrænser spredningen af neuroner i brøndene langt væk fra mikrokanalerne. Den tørre såning understøttes ved at trykke på bunden af pladen (trin 2.5), hvilket måske eller måske ikke er nødvendigt afhængigt af den kraft, der tidligere er påført ved montering af enheden.

Der findes dog visse begrænsninger i denne procedure. Der er en vis variation i tætningens tæthed på grund af forskelle i den kraft, der påføres under samlingen, hvilket kan føre til begrænset vækst gennem mikrorillerne. Resterende fugt kan også forstyrre tætningsdannelsen og tillade aksonal vækst eller endda cellemigration under enheden. Begge problemer kan let opdages inden farvning, hvilket fører til udelukkelse af defekte kamre fra eksperimentet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af den tyske forskningsfond (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well Glass bottom plate Cellvis P06.1.5H-N Silicone device
Antimycin A Sigma A8674
B27 Gibco 17504044
EVOS M5000 widefield microscope Thermofischer Scientific EVOS M5000 fully integrated digital widefield microscope
Hibernate E BrainBits HE500
Inverted spinning disk confocal Nikon TI2-E + CSU-W1 With incubator chamber
Laminin Invitrogen L2020
Microfluidic devices XONA microfluidics RD450
Neurobasal medium Gibco 21103049
Poly-D-Lysine Sigma P2636
TMRE Sigma 87917

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
  2. Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
  3. Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
  4. Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
  5. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
  6. Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
  7. Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
  8. Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
  9. Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
  10. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
  11. Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).

Tags

Neurovidenskab udgave 186 Axon mitokondrier mikrofluidik neurodegeneration
Mikrofluidik-assisteret selektiv depolarisering af aksonale mitokondrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wanderoy, S., Rühmkorf, A.,More

Wanderoy, S., Rühmkorf, A., Harbauer, A. B. Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria. J. Vis. Exp. (186), e64196, doi:10.3791/64196 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter