Summary
Het huidige protocol beschrijft het zaaien en kleuren van neuronale mitochondriën in microfluïdische kamers. De vloeiende drukgradiënt in deze kamers maakt de selectieve behandeling van mitochondriën in axonen mogelijk om hun eigenschappen te analyseren als reactie op farmacologische uitdagingen zonder het cellichaamcompartiment te beïnvloeden.
Abstract
Mitochondriën zijn de primaire leveranciers van ATP (adenosinetrifosfaat) in neuronen. Mitochondriale disfunctie is een veel voorkomend fenotype bij veel neurodegeneratieve ziekten. Gezien de uitgebreide architectuur en extreme lengte van sommige axonen, is het niet verrassend dat mitochondriën in axonen verschillende omgevingen kunnen ervaren in vergelijking met hun tegenhangers van het cellichaam. Interessant is dat disfunctie van axonale mitochondriën vaak voorafgaat aan effecten op het cellichaam. Om axonale mitochondriale disfunctie in vitro te modelleren, maken microfluïdische apparaten behandeling van axonale mitochondriën mogelijk zonder de somale mitochondriën te beïnvloeden. De fluïde drukgradiënt in deze kamers voorkomt diffusie van moleculen tegen de gradiënt, waardoor analyse van mitochondriale eigenschappen mogelijk is als reactie op lokale farmacologische uitdagingen binnen axonen. Het huidige protocol beschrijft het zaaien van gedissocieerde hippocampusneuronen in microfluïdische apparaten, kleuring met een membraanpotentiaal gevoelige kleurstof, behandeling met een mitochondriaal toxine en de daaropvolgende microscopische analyse. Deze veelzijdige methode om axonale biologie te bestuderen kan worden toegepast op veel farmacologische verstoringen en beeldvormingsuitlezingen en is geschikt voor verschillende neuronale subtypen.
Introduction
Mitochondriën zijn de belangrijkste leveranciers van ATP (adenosinetrifosfaat) in neuronen. Aangezien neuronale gezondheid nauw verbonden is met mitochondriale functie, is het niet verrassend dat disfunctionele regulatie van deze organellen in verband is gebracht met het ontstaan van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson1. Bovendien is mitochondriale intoxicatie met succes gebruikt om parkinsonsymptomen bij dieren 2 temodelleren. In zowel diermodellen als menselijke ziekten begint de ondergang van neuronen bij de distale delen 3,4, wat erop wijst dat axonale mitochondriën mogelijk vatbaarder zijn voor beledigingen. De biologie van mitochondriën in axonen is echter niet goed begrepen vanwege de moeilijkheden die gepaard gaan met gerichte behandeling en analyse van axonale mitochondriën zonder gelijktijdige verstoring van cellichaamsprocessen.
Recente ontwikkelingen in kweektechnieken van gedissocieerde neuronen in vitro maken nu de vloeiende scheiding van axonen en cellichamen mogelijk via microfluïdische apparaten5. Zoals afgebeeld in figuur 1A, hebben deze apparaten vier toegangsputten (a / h en c / i), met twee kanalen die elk paar verbinden (d en f). De grote kanalen zijn met elkaar verbonden door een reeks van 450 μm lange microkanalen (e). Opzettelijke verschillen in de vulniveaus tussen de twee kamers creëren een vloeistofdrukgradiënt (figuur 1B) die de diffusie van kleine moleculen van het kanaal met een lager vloeistofniveau naar de andere kant voorkomt (figuur 1C, geïllustreerd met Trypan blauwe kleurstof).
We hebben onlangs microfluïdische apparaten gebruikt om lokale vertaalvereisten in axonale mitofagie te bestuderen, de selectieve verwijdering van beschadigde mitochondriën6. In dit protocol worden verschillende stappen gepresenteerd om lokale mitochondriale schade te induceren door selectieve behandeling van axonen met behulp van de mitochondriale complex III-remmer Antimycine A 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en voorschriften van de regering van Opper-Beieren. De primaire neuronen werden bereid uit E16.5 C57BL/6 wild-type muisembryo's van beide geslachten volgens standaardmethoden zoals eerder beschreven6.
1. Montage van het microfluïdische apparaat
- Bekleed een weefselkweekplaat met zes putten met glazen bodem met een eindconcentratie van 20 μg/ml poly-D-lysine en 3,4 μg/ml laminine in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) (zie materiaaltafel).
- Incubeer de gecoate plaat een nacht in het donker bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Coating kan ook worden uitgevoerd bij 37 °C gedurende 1-2 uur. De keuze van de coating is afhankelijk van het gebruikte celtype. - Breng na het coaten de zesputtenplaten naar de steriele kap en was ze twee keer met steriel ddH2O.
OPMERKING: Was niet met zouthoudende buffers zoals PBS, omdat zoutkristallen de afdichtingsvorming zullen verstoren. - Laat de plaat 3-5 min in een gekantelde positie drogen. Verwijder overtollig water door vacuüm zuigen of pipetteren.
- Week de microfluïdische kamer in 80% ethanol.
OPMERKING: De microfluïdische kamer is verkregen uit commerciële bronnen (zie materiaaltabel). - Laat de microfluïdische kamer 3-5 minuten drogen in een gekantelde positie. Verwijder overtollige ethanol door vacuüm, afzuiging of pipetteren.
- Wanneer het volledig droog is, plaatst u de microfluïdische kamer in het midden van de put.
OPMERKING: De vorming van de afdichting kan worden waargenomen als een verandering in reflecterende eigenschappen bij uitsluiting van lucht uit de interface tussen de plaat en het siliconenapparaat. Zowel de plaat als de microfluïdische kamer moeten volledig droog zijn voordat ze worden gemonteerd om een goede afdichting te creëren. De droogtijd moet echter zoveel mogelijk worden geminimaliseerd om een goede hechting aan de cellen te garanderen. Daarom moeten de putten en kamers visueel worden geïnspecteerd op resterende vloeistofdruppels. Als er geen druppels zichtbaar zijn, monteer dan onmiddellijk de kamers. - Tik voorzichtig op de microfluïdische kamer aan de randen en het microgroove-gedeelte in het midden voor een goede bevestiging aan de glasplaat.
2. Zaaien en onderhouden van neuronen
- Verzamel het gewenste aantal gedissocieerde hippocampusneuronen per kamer in een reactiebuis van 1,5 ml.
OPMERKING: Voor de huidige studie werden 1,5 x 105 neuronen per apparaat gezaaid voor op beeldvorming gebaseerde toepassingen. - Centrifugeer neuronen bij 1000 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg met een pipet en resuspenseer de pellet in 8 μL B27-Neurobasale media (zie Materiaaltabel).
- Pipetteer de celoplossing in de kanaalingang van de microfluïdische kamer (b in figuur 1A).
- Tik op de achterkant van de plaat om de stroom door het kanaal te ondersteunen.
OPMERKING: Tikken kan vrij krachtig worden gedaan zonder dat u zich zorgen hoeft te maken dat de verzegeling zal breken. - Adem met een pipet de resterende celsuspensie aan de uitgang van het kanaal aan (g in figuur 1A) om het aantal cellen buiten het kanaal te verminderen.
- Incubeer de microfluïdische kamer met cellen gedurende 15-20 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
- Vul de bovenste axonale put met 50 μL B27-neurobasale media in (c in figuur 1A).
- Tik op de achterkant van de plaat om de stroom door het kanaal te ondersteunen.
- Vul putten aan de somazijde (a en h in figuur 1A) met elk 150 μL B27-neurobasale media, waardoor er een spanningsbel bovenop ontstaat. Het volume van de bel is ongeveer 20 μL.
OPMERKING: Het creëren van een spanningsbel is niet nodig om vloeiende isolatie te bereiken, maar het biedt een duidelijk beeld van het hogere volume aan de soma-kant. - Vul beide putjes van de axonale zijde (c en i in figuur 1A) met elk 100 μL B27-Neurobasale media.
OPMERKING: Om axonale groei door de microgrooves te bevorderen, wordt aanbevolen dat de putjes aan de somazijde meer media bevatten dan de putjes aan de axonzijde. Axonen zullen echter toevallig door de microgrooves groeien, zelfs zonder volumeverschillen. - Incubeer de microfluïdische kamer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 7-8 dagen.
OPMERKING: Groei van axonen in de axonale kamer kan meestal worden waargenomen vanaf dag in vitro (DIV) 5. Langere kweektijden zijn mogelijk als meer volwassen culturen gewenst zijn. - Voed neuronen om de 2-3 dagen door het medium uit de twee bovenste putten (a en c) te verwijderen en te vervangen door vers B27-Neurobasaal medium totdat een spanningsbel is gevormd.
3. Kleuring met mitochondriale membraan potentieel gevoelige kleurstof
- Beoordeel bij DIV 7-8 of de axonen door de microgrooves zijn gegroeid en zich uitstrekken tot in het axonale compartiment onder een lichtmicroscoop.
OPMERKING: Verschillende DIV-stadia zijn ook mogelijk, afhankelijk van de gewenste leeftijd. - Voer twee wasbeurten uit met voorverwarmd beeldvormend medium (37 °C) door het B27-Neurobasale medium uit alle putten te verwijderen en ongeveer 100 μL van het beeldvormende medium toe te voegen aan de bovenste putten van zowel de axonale als de somakanalen (a en c). Laat het medium doorstromen naar de onderste putten (h en i).
- Verwijder het medium uit de onderste putjes en eventueel overgebleven medium in de bovenste putjes en herhaal dit met vers medium, waarbij de putjes aan het einde van de wasbeurt leeg blijven.
OPMERKING: Vanwege de hoge capillaire kracht in de kanalen (d en f), zal er een overgebleven wasmedium in de kanalen zijn dat niet mag worden verwijderd om te voorkomen dat de neuronen uitdrogen. Elk fenolroodvrij beeldvormend medium kan hier worden gebruikt, bijvoorbeeld Hibernate E (zie Materiaaltabel). Als de microscoop niet is ingesteld met een CO2-voeding , zorg er dan voor dat het beeldvormende medium een alternatief buffersysteem gebruikt voor carbonaat/CO2 (bijv. HEPES)8.
- Verwijder het medium uit de onderste putjes en eventueel overgebleven medium in de bovenste putjes en herhaal dit met vers medium, waarbij de putjes aan het einde van de wasbeurt leeg blijven.
- Verdun 1 mM tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE, rood, zie Tabel van materialen) voorraad tot 5 nM in het beeldvormende medium.
OPMERKING: Niet meer dan 1% DMSO in de uiteindelijke verdunning om toxiciteit te voorkomen. - Voeg 100 μL van de 5 nM TMRE-verdunning toe aan zowel de somatische als de axonale bovenste putten (a en c) en laat het medium door zowel het somatische als het axonale compartiment stromen totdat er een gelijk volume in alle putten is. Vul met het TMRE-bevattende medium.
- Plaats de neuronen terug in een gecontroleerde omgevingskamer (37 °C en 5% CO2) gedurende 25 minuten.
- Voer twee wasbeurten uit met het voorverwarmde beeldvormende medium (37 °C) zoals eerder beschreven (stap 3.2). Vul bij de laatste wasbeurt 100 μL in elke put en creëer een spanningsbel van het medium op de somatische putten (a en c).
4. Live-cell beeldvorming
OPMERKING: De getoonde stilstaande beelden werden verkregen op een confocale microscoop van een draaiende schijf, met behulp van een 40x NA 1,25 onderdompelingsobjectief (zie Materiaaltabel). Er werd gekozen voor 200 ms belichtingstijd en 10% laservermogen voor het rode kanaal en 500 ms belichtingstijd voor brightfield. Reguliere confocale of widefield omgekeerde microscopen kunnen echter ook worden gebruikt om de TMRE-intensiteit te bestuderen.
- Beeld de cellen af met een omgekeerde microscoop.
- Zorg ervoor dat de microscoop is uitgerust met een stadiumincubator om de neuronale cultuur gedurende het hele experiment op 37 °C te houden.
- Selecteer een interessegebied in het somatische compartiment en volg het door de microgrooves naar het axonale compartiment. Zorg ervoor dat de afgebeelde microgrooves overeenkomen met die in de somatische en de axonale compartimenten (voor een eenvoudiger vergelijking van de uitgangswaarde en na de behandeling).
- Leg fluorescentiebeelden vast met excitatie bij 561 nm en emissie bij 625 nm voor rood fluorescentiesignaal.
- Verkrijg de afbeeldingen.
- Om mitochondriale depolarisatie te induceren, voegt u 20 μM Antimycine A (zie Materiaaltabel) in het beeldvormende medium toe aan het axonale compartiment. Om een volumeverschil tussen de soma- en axonale kamers te garanderen, controleert u de aanwezigheid van een spanningsbel aan de somatische kant (gelijk aan volume >110 μL).
- Verwijder alle beeldvormende mediums uit de onderste put van de axonale zijde (i), behalve het medium in het kanaal (f). Voeg 160 μL 20 μM Antimycine A toe aan de bovenste axonale put (c) en laat het door het kanaal stromen totdat er een gelijk volume in beide axonale putten is. Volumes in axonale putten zijn ongeveer 80 μL per put.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het volume in de axonale putten kleiner is dan in de somatische putten om de juiste vloeistofdruk te garanderen. Een verschil van minimaal 10 μL (10% van het putvolume) wordt aanbevolen, maar ook hogere verschillen zijn mogelijk.
- Verwijder alle beeldvormende mediums uit de onderste put van de axonale zijde (i), behalve het medium in het kanaal (f). Voeg 160 μL 20 μM Antimycine A toe aan de bovenste axonale put (c) en laat het door het kanaal stromen totdat er een gelijk volume in beide axonale putten is. Volumes in axonale putten zijn ongeveer 80 μL per put.
- Incubeer neuronen in de gecontroleerde omgevingskamer (37 °C) gedurende 20-30 minuten.
- Herhaal beeldvorming zoals hierboven beschreven (stappen 4.3-4.5). Zorg ervoor dat dezelfde posities worden afgebeeld (gemakkelijk te identificeren door de microgrooves) als tijdens de basisacquisitie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primaire hippocampusneuronen werden gekweekt in microfluïdische apparaten gedurende 7-8 dagen voordat mitochondriën gedurende 25 minuten in beide kanalen werden gekleurd met de membraangevoelige kleurstof (TMRE). Zoals te zien is in figuur 2A, leverde dit homogene kleuring van mitochondriën aan beide zijden van de microgrooves op, maar het was onvoldoende om de kleuring in het midden van de microgrooves in evenwicht te brengen. Na toevoeging van Antimycine A aan de axonale zijde behielden somale mitochondriën het TMRE-signaal (figuur 2B en video 1), terwijl TMRE-fluorescentie verloren ging uit axonale mitochondriën (figuur 2C en video 1). De video is gemaakt met behulp van een volledig geïntegreerde digitale widefield microscoop (zie Tabel van Materialen).
Figuur 1: Microfluïdische apparaten maken de fluïde isolatie van axonen mogelijk. (A) Schematische weergave van het microfluïdische apparaat dat in deze studie wordt gebruikt. De siliconenschijf (diameter 21 mm) past gemakkelijk in een zesputtenplaat. a) Goed aan somazijde, b) Ingang van kanaal aan somazijde, c) Goed aan axonzijde, d) Kanaal aan somazijde, e) Microgrooves, f) Kanaal aan axonzijde, g) Uitgang van het kanaal aan somazijde, h) Wel aan somazijde, i) Goed aan axonzijde. (B) Schematische details over hoe de verschillende vloeistofniveaus een vloeiende drukgradiënt over de microkanalen creëren. (C) Demonstratie van de vloeistofisolatie door toevoeging van Trypan blauw aan één kant van de kamer. Merk op dat vanwege de vloeiende drukgradiënt de blauwe kleurstof niet in evenwicht is over de microkanalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Selectieve behandeling van axonen depolariseert axonale maar niet cellichaam mitochondriën. (A) Representatieve micrografie met een overzicht van de effectiviteit van TMRE-kleuring in microfluïdische apparaten. Schaalbalk = 100 μm. (B-C) De representatieve microfoto toont hetzelfde gebied in het cellichaam en het axonale compartiment voor en na toevoeging van 20 μM Antimycine A (AA) aan het axonale compartiment. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: Effect van Antimycine Een behandeling op mitochondriën in axonen en cellichamen. Live cell imaging van het verlies van TMRE fluorescentie bij het toevoegen van Antimycine A. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een methode om gedissocieerde hippocampale neuronen te zaaien en te kweken in een microfluïdisch apparaat om axonale mitochondriën afzonderlijk te behandelen. Het nut van deze aanpak met de membraangevoelige kleurstof TMRE en de complexe III-remmer Antimycine A (zoals eerder aangetoond7) wordt hier gedemonstreerd, maar deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere mitochondriale kleurstoffen of genetisch gecodeerde sensoren van mitochondriale functies die lokale, op microscopie gebaseerde uitlezingen mogelijk maken9. Andere neuronale celtypen kunnen ook worden gekweekt in microfluïdische kamers, zoals primaire corticale neuronen10 of geïnduceerde pluripotente stamcel (ipSC) -afgeleide motorneuronen11, waardoor dit platform een veelzijdig hulpmiddel is om mitochondriale functie in neurodegeneratie in het neuronale celtype van belang te bestuderen. De assemblage van microfluïdische apparaten is cruciaal voor het bereiken van een efficiënte afdichting en is het gemakkelijkst te verklaren door te kijken naar een ervaren onderzoeker die de assemblage uitvoert. De downstream etiketterings- en behandelingsprocedure die hier wordt beschreven, is bedoeld als voorbeeldig en kan worden aangepast aan de protocollen die momenteel in de respectieve laboratoria zijn vastgesteld met behoud van de vloeistofdrukgradiënt.
De hier beschreven zaaitechniek verschilt van gepubliceerde protocollen en de beschrijving van de fabrikant, omdat we de voorgestelde wasbeurten van het geassembleerde apparaat overslaan en in plaats daarvan de gedissocieerde neuronen rechtstreeks in de droge kamer zaaien (sectie 2). Er is waargenomen dat dit het aantal benodigde neuronen vermindert, omdat het de dichtheid van neuronen in het kanaal verhoogt (e) en de verspreiding van neuronen in de putten ver weg van de microkanalen beperkt. Het droge zaaien wordt geholpen door op de bodem van de plaat te tikken (stap 2.5), wat al dan niet nodig kan zijn, afhankelijk van de kracht die eerder is uitgeoefend bij het monteren van het apparaat.
Er zijn echter bepaalde beperkingen in deze procedure. Er is enige variabiliteit in de dichtheid van de afdichting als gevolg van verschillen in de kracht die tijdens de assemblage wordt uitgeoefend en die kunnen leiden tot beperkte groei door de microgrooves. Ook kan het resterende vocht de afdichtingsvorming verstoren en axonale groei of zelfs celmigratie onder het apparaat mogelijk maken. Beide problemen kunnen gemakkelijk worden opgemerkt voorafgaand aan kleuring, wat leidt tot de uitsluiting van defecte kamers van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (HA 7728/2-1 en EXC2145 Project ID 390857198) en de Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
