Summary
본 프로토콜은 미세유체 챔버에서 뉴런 미토콘드리아의 파종 및 염색을 기술한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 축삭에서 미토콘드리아를 선택적으로 처리하여 세포체 구획에 영향을 미치지 않고 약리학적 문제에 대응하여 특성을 분석할 수 있도록 합니다.
Abstract
미토콘드리아는 뉴런에서 ATP(아데노신 삼인산)의 주요 공급원입니다. 미토콘드리아 기능 장애는 많은 신경 퇴행성 질환에서 일반적인 표현형입니다. 일부 축삭의 정교한 구조와 극단적인 길이를 감안할 때 축삭의 미토콘드리아가 세포체와 비교하여 다른 환경을 경험할 수 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 흥미롭게도, 축삭 미토콘드리아의 기능 장애는 종종 세포체에 미치는 영향에 선행합니다. 시험관 내에서 축삭 미토콘드리아 기능 장애를 모델링하기 위해, 미세 유체 장치는 체멀 미토콘드리아에 영향을주지 않고 축삭 미토콘드리아의 치료를 가능하게한다. 이 챔버의 유체 압력 구배는 구배에 대한 분자의 확산을 방지하여 축삭 내의 국소 약리학적 문제에 대한 반응으로 미토콘드리아 특성을 분석할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 미세 유체 장치에서 해리 된 해마 뉴런의 파종, 막 전위에 민감한 염료로 염색, 미토콘드리아 독소로 처리 및 후속 현미경 분석을 설명합니다. 축삭 생물학을 연구하는이 다목적 방법은 많은 약리학 적 섭동 및 영상 판독에 적용될 수 있으며 여러 신경 아형에 적합합니다.
Introduction
미토콘드리아는 뉴런에서 ATP(아데노신 삼인산)의 주요 공급업체입니다. 신경 건강은 미토콘드리아 기능과 밀접한 관련이 있기 때문에 이러한 세포 기관의 기능 장애 조절이 파킨슨 병1을 포함한 다양한 신경 퇴행성 질환의 발병과 관련이 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 또한, 미토콘드리아 중독은 동물2에서 파킨슨 증상을 모델링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 동물 모델과 인간 질병 모두에서 뉴런의 소멸은 원위 부분 3,4에서 시작하여 축삭 미토콘드리아가 모욕에 더 취약 할 수 있음을 암시합니다. 그러나, 축삭에서 미토콘드리아의 생물학은 세포체 과정의 동시 교란없이 축삭 미토콘드리아의 표적 치료 및 분석과 관련된 어려움으로 인해 잘 이해되지 않는다.
시험관 내에서 해리된 뉴런의 배양 기술의 최근 발전은 이제 미세유체 장치5를 통해 축삭과 세포체의 유체 분리를 가능하게 한다. 그림 1A에 표시된 것처럼 이 장치에는 4개의 액세스 웰(a/h 및 c/i)이 있으며 각 쌍(d 및 f)을 연결하는 2개의 채널이 있습니다. 대형 채널은 일련의 450μm 길이의 마이크로 채널(e)에 의해 서로 연결됩니다. 두 챔버 사이의 충전 레벨의 의도적 인 차이는 유체 압력 구배 (그림 1B)를 생성하여 유체 레벨이 낮은 채널에서 다른쪽으로 작은 분자가 확산되는 것을 방지합니다 (그림 1C, Trypan blue 염료로 표시됨).
우리는 최근에 손상된 미토콘드리아6의 선택적 제거인 축삭 미토파지의 국소 번역 요구 사항을 연구하기 위해 미세 유체 장치를 사용했습니다. 본 프로토콜에서, 미토콘드리아 콤플렉스 III 억제제 안티마이신 A 6,7을 사용하는 축삭의 선택적 처리를 통해 국소 미토콘드리아 손상을 유도하는 상이한 단계가 제시된다.
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Protocol
모든 동물 실험은 어퍼 바이에른 정부의 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 1차 뉴런은앞서 기술된 바와 같은 표준 방법에 따라 남녀 모두의 E16.5 C57BL/6 야생형 마우스 배아로부터 제조하였다 6.
1. 미세유체 장치의 조립
- 최종 농도가 20μg/mL인 6웰 유리 바닥 조직 배양 플레이트 1개를 PBS(인산염 완충 식염수)에 20μg/mL의 Poly-D-라이신 및 3.4μg/mL의 라미닌으로 코팅합니다( 재료 표 참조).
- 코팅된 플레이트를 실온의 어두운 곳에서 밤새 배양한다.
알림: 코팅은 37 ° C에서 1-2 시간 동안 수행 할 수도 있습니다. 코팅의 선택은 사용 된 셀 유형에 따라 다릅니다. - 코팅 후, 6 웰 플레이트를 멸균 후드로 가져 와서 멸균 ddH2O로 두 번 세척한다.
알림: 소금 결정이 밀봉 형성을 방해하므로 PBS와 같은 염분 함유 완충액으로 세척하지 마십시오. - 플레이트를 기울인 위치에서 3-5분 동안 건조시키십시오. 진공 흡입 또는 피펫팅으로 과도한 물을 제거합니다.
- 미세유체 챔버를 80% 에탄올에 담근다.
참고: 미세유체 챔버는 상업적 공급원으로부터 수득되었다( 재료 표 참조). - 미세 유체 챔버를 기울인 위치에서 3-5분 동안 건조시킵니다. 진공, 흡입 또는 피펫팅으로 과도한 에탄올을 제거합니다.
- 완전히 건조되면 미세 유체 챔버를 우물 중앙에 놓습니다.
알림: 씰의 형성은 플레이트와 실리콘 장치 사이의 계면에서 공기를 배제할 때 반사 특성의 변화로 관찰할 수 있습니다. 플레이트와 미세 유체 챔버는 모두 좋은 밀봉을 만들기 위해 조립 전에 완전히 건조되어야 합니다. 그러나 세포에 대한 적절한 부착을 보장하기 위해 건조 시간을 최대한 최소화해야합니다. 따라서 우물과 챔버에 남아있는 액체 방울이 있는지 육안으로 검사해야합니다. 물방울이 보이지 않으면 즉시 챔버를 조립하십시오. - 유리판에 적절하게 부착하기 위해 경계와 중간의 미세 홈 섹션에서 미세 유체 챔버를 부드럽게 두드립니다.
2. 뉴런의 파종 및 유지
- 1.5mL 반응 튜브에서 챔버당 원하는 수의 해리된 해마 뉴런을 수집합니다.
참고: 본 연구에서는 이미징 기반 애플리케이션을 위해 장치당 1.5 x 105 개의 뉴런을 시드했습니다. - 실온에서 4분 동안 1000 x g 의 뉴런을 원심분리합니다.
- 피펫으로 상청액을 버리고 8μL의 B27-신경기저 배지에 펠릿을 재현탁합니다( 재료 표 참조).
- 세포 용액을 미세유체 챔버의 채널 입구 내로 피펫팅한다(도 1A의 b).
- 플레이트의 뒷면을 두드려 채널을 통한 흐름을 돕습니다.
알림: 씰이 파손될 염려 없이 태핑을 아주 세게 할 수 있습니다. - 채널 출구(도 1A의 g)에 남아 있는 임의의 세포 현탁액을 피펫으로 흡인하여 채널 외부의 세포 수를 감소시킨다.
- 마이크로유체 챔버를 37°C 및 5%CO2에서 15-20분 동안 세포와 함께 인큐베이션한다.
- 상단 축삭 웰을 50μL의 B27-신경기저 배지로 채웁니다(그림 1A의 c).
- 플레이트의 뒷면을 두드려 채널을 통한 흐름을 돕습니다.
- 소마 쪽(그림 1A의 a와 h)의 웰을 각각 150μL의 B27-신경기저 배지로 채우고 상단에 장력 거품을 만듭니다. 기포의 부피는 약 20 μL이다.
알림: 유체 분리를 달성하기 위해 인장 버블을 만들 필요는 없지만 체마 측의 더 높은 부피를 명확하게 볼 수 있습니다. - 축삭 쪽(그림 1A의 c 및 i)의 양쪽 웰을 각각 100μL의 B27-신경기저 배지로 채웁니다.
참고: 마이크로 홈을 통해 축삭 성장을 촉진하려면 소마 쪽의 웰에 축삭 쪽의 웰보다 더 많은 배지를 포함하는 것이 좋습니다. 그러나 축삭은 부피 차이없이 우연히 마이크로 홈을 통해 성장합니다. - 마이크로유체 챔버를 37°C 및 5%CO2 에서 7-8일 동안 인큐베이션한다.
참고: 축삭 챔버로의 축삭의 성장은 일반적으로 시험관 내 ( DIV) 5에서 시작하여 관찰 할 수 있습니다. 더 성숙한 배양이 필요한 경우 더 긴 배양 시간이 가능합니다. - 두 개의 상부 웰 (a 와 c)에서 배지를 제거하고 인장 기포가 형성 될 때까지 새로운 B27- 신경 기저 배지로 교체하여 2-3 일마다 뉴런을 공급하십시오.
3. 미토콘드리아 막 전위 과민성 염료로 염색
- DIV 7-8에서 축삭이 미세 홈을 통해 성장하여 광학 현미경 아래의 축삭 구획으로 확장되었는지 평가합니다.
참고: 원하는 연령에 따라 다른 DIV 단계도 가능합니다. - 모든 웰에서 B27-Neurobasal 배지를 제거하고 축삭 및 소마 채널(a 및 c)의 상단 웰에 약 100μL의 이미징 배지를 추가하여 예열된 이미징 배지(37°C)로 두 번 세척합니다. 매체가 하부 웰 (h 및 i)을 통해 흐르도록하십시오.
- 하부 웰에서 배지를 제거하고 상단 웰에서 남은 배지를 제거하고 새 배지로 반복하여 세척이 끝날 때 웰을 비워 둡니다.
알림: 채널(d 및 f)의 높은 모세관력으로 인해 뉴런이 건조되는 것을 방지하기 위해 제거해서는 안 되는 세척 매체가 채널에 남아 있습니다. 임의의 페놀-적색-없는 이미징 매체가 여기에 사용될 수 있다, 예를 들어, Hibernate E (재료 표 참조). 현미경이 CO2 공급 장치로 설정되지 않은 경우 이미징 매체가 탄산염/CO2(예: hepes)에 대한 대체 완충 시스템을 사용하는지 확인하십시오8.
- 하부 웰에서 배지를 제거하고 상단 웰에서 남은 배지를 제거하고 새 배지로 반복하여 세척이 끝날 때 웰을 비워 둡니다.
- 1 mM 테트라메틸로다민 에틸 에스테르(TMRE, 적색, 재료 표 참조) 스톡을 이미징 배지에서 5 nM로 희석합니다.
알림: 독성을 피하기 위해 최종 희석에서 1% DMSO를 초과하지 마십시오. - 체세포 및 축삭 상단 웰 (a 및 c) 모두에 5nM TMRE 희석액 100μL를 추가하고 모든 웰에 동일한 부피가 될 때까지 배지가 체세포 및 축삭 구획 모두를 통해 흐르도록합니다. TMRE 함유 배지로 채웁니다.
- 뉴런을 25분 동안 제어된 환경 챔버(37°C 및 5%CO2)에 다시 놓습니다.
- 앞서 설명한 대로 예열된 이미징 매체(37°C)로 2회 세척을 수행합니다(단계 3.2). 마지막 세척시 각 웰에 100μL를 채우고 체세포 웰 (a 및 c)에 배지의 인장 기포를 만듭니다.
4. 라이브 셀 이미징
참고: 표시된 정지 이미지는 40x NA 1.25 침지 대물렌즈를 사용하여 회전 디스크 컨포칼 현미경에서 획득한 것입니다( 재료 표 참조). 적색 채널의 경우 200ms 노출 시간 및 10% 레이저 출력, 명시야의 경우 500ms 노출 시간이 선택되었습니다. 그러나 일반 컨포칼 또는 광시야 도립 현미경을 사용하여 TMRE 강도를 연구할 수도 있습니다.
- 도립 현미경으로 세포를 이미지화합니다.
- 현미경에 스테이지 인큐베이터가 장착되어 있는지 확인하여 실험 내내 신경 세포 배양을 37°C로 유지합니다.
- 체세포 구획에서 관심 영역을 선택하고 미세 홈을 통해 축삭 구획으로 따라갑니다. 이미징된 마이크로홈이 체세포 및 축삭 구획의 마이크로홈과 일치하는지 확인합니다(더 쉬운 기준선 및 치료 후 비교를 위해).
- 적색 형광 신호에 대해 561nm에서 여기와 625nm에서 방출을 사용하여 형광 이미지를 캡처합니다.
- 이미지를 가져옵니다.
- 미토콘드리아 탈분극을 유도하려면 이미징 매체의 20μM Antimycin A ( 재료 표 참조)를 축삭 구획에 추가하십시오. 체세포와 축삭 챔버 사이의 부피 차이를 확인하려면 체세포면에 인장 기포가 있는지 확인하십시오 (부피 >110 μL와 동일).
- 채널 내부의 매체(f)를 제외한 축삭측(i)의 하부 웰에서 모든 이미징 매체를 제거합니다. 160μL의 20μM 안티마이신 A를 상단 축삭 웰(c)에 추가하고 두 축삭 웰에 동일한 부피가 될 때까지 채널을 통해 흐르게 합니다. 축삭 웰의 부피는 웰당 약 80μL입니다.
알림: 적절한 유체 압력을 보장하기 위해 축삭 웰의 부피가 체세포 웰보다 작은지 확인하십시오. 최소 10μL(웰 부피의 10%)의 차이가 권장되지만 더 높은 차이도 가능합니다.
- 채널 내부의 매체(f)를 제외한 축삭측(i)의 하부 웰에서 모든 이미징 매체를 제거합니다. 160μL의 20μM 안티마이신 A를 상단 축삭 웰(c)에 추가하고 두 축삭 웰에 동일한 부피가 될 때까지 채널을 통해 흐르게 합니다. 축삭 웰의 부피는 웰당 약 80μL입니다.
- 제어된 환경 챔버(37°C)에서 뉴런을 20-30분 동안 배양합니다.
- 위에서 설명한 대로 이미징을 반복합니다(단계 4.3-4.5). 기준선 획득 동안과 동일한 위치가 이미징(마이크로홈으로 쉽게 식별)되는지 확인합니다.
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Representative Results
1차 해마 뉴런은 미토콘드리아가 두 채널 모두에서 25분 동안 막 민감성 염료(TMRE)로 염색되기 전에 7-8일 동안 미세유체 장치에서 성장되었습니다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 이것은 마이크로홈의 양쪽에서 미토콘드리아의 균질한 염색을 산출했지만, 마이크로홈의 중간으로의 염색을 평형화하기에는 불충분하였다. 축삭 측에 안티마이신 A를 첨가했을 때, 소말 미토콘드리아는 TMRE 신호를 유지한 반면(그림 2B 및 비디오 1), 축삭 미토콘드리아에서 TMRE 형광이 손실되었습니다(그림 2C 및 비디오 1). 비디오는 완전히 통합된 디지털 광시야 현미경을 사용하여 캡처되었습니다(재료 표 참조).
그림 1: 미세유체 장치는 축삭의 유체 분리를 허용합니다. (A) 본 연구에 사용된 미세유체 장치의 개략도. 실리콘 디스크(직경 21mm)는 6웰 플레이트에 쉽게 맞습니다. a) 소마 쪽의 우물, b) 소마 쪽의 채널 입구, c) 축삭 쪽의 우물, d) 소마 쪽의 채널, e) 마이크로 홈, f) 축삭 쪽의 채널, g) 소마 쪽의 채널 출구, h) 소마 쪽의 잘, i) 축삭 쪽의 잘. (B) 다양한 유체 레벨이 마이크로 채널을 가로 질러 유체 압력 구배를 생성하는 방법을 자세히 설명하는 개략도. (c) 챔버의 한쪽에 트리판 블루를 첨가함으로써 유체 분리의 시연. 유체 압력 구배로 인해 파란색 염료는 마이크로 채널에서 평형을 이루지 못합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 축삭의 선택적 처리는 축삭을 탈분극하지만 세포체 미토콘드리아는 탈분극하지 않습니다. (A) 미세유체 장치에서 TMRE 염색의 유효성에 대한 개요를 제시하는 대표적인 현미경 사진. 스케일 바 = 100 μm. (B-C) 대표적인 현미경 사진은 축삭 구획에 20 μM Antimycin A (AA)를 첨가하기 전과 후의 세포체 및 축삭 구획의 동일한 영역을 보여준다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동영상 1: 축삭과 세포체에서 미토콘드리아에 대한 항마이신 A 치료의 효과. 안티마이신 A 첨가 시 TMRE 형광 손실의 라이브 셀 이미징 . 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 프로토콜은 해리된 해마 뉴런을 미세유체 장치에서 시드 및 배양하여 축삭 미토콘드리아를 별도로 처리하는 방법을 기술한다. 막 민감성 염료 TMRE 및 복합 III 억제제 안티마이신 A(이전에 입증된바와 같이7)에 대한 이 접근법의 유용성이 여기에서 입증되지만, 이 방법은 국부적 현미경 기반 판독을 허용하는 다른 미토콘드리아 염료 또는 미토콘드리아 기능의 유전적으로 암호화된 센서에 쉽게 적용할 수있습니다9. 다른 뉴런 세포 유형도 일차 피질 뉴런(10 ) 또는 유도만능줄기세포(ipSC) 유래 운동뉴런(11)과 같은 미세유체 챔버에서 성장할 수 있으므로, 이 플랫폼은 관심 뉴런 세포 유형의 신경퇴행에서 미토콘드리아 기능을 연구하는 다목적 도구입니다. 미세 유체 장치의 조립은 효율적인 밀봉을 달성하는 데 중요하며 숙련 된 연구원이 조립을 수행하는 것을 보면서 가장 쉽게 설명 할 수 있습니다. 여기에 설명된 다운스트림 라벨링 및 처리 절차는 예시적인 것이며, 유체 압력 구배를 유지하면서 각각의 실험실에서 현재 확립된 프로토콜에 적합하도록 조정될 수 있다.
여기에 설명된 파종 기술은 게시된 프로토콜 및 제조업체의 설명과 다르며, 조립된 장치의 제안된 세척을 건너뛰고 대신 해리된 뉴런을 건조 챔버에 직접 시드합니다(섹션 2). 이것은 채널 (e) 내의 뉴런 밀도를 증가시키고 마이크로 채널에서 멀리 떨어진 웰로 뉴런의 확산을 제한하기 때문에 필요한 뉴런의 수를 감소시키는 것으로 관찰되었습니다. 건식 파종은 플레이트의 바닥을 두드려서 도움을 받는데(단계 2.5), 이는 장치를 조립할 때 이전에 가해진 힘에 따라 필요할 수도 있고 필요하지 않을 수도 있습니다.
그러나 이 절차에는 특정 제한 사항이 있습니다. 조립 중에 가해지는 힘의 차이로 인해 씰의 견고성에 약간의 변동성이 있으며, 이는 마이크로 홈을 통한 성장을 제한할 수 있습니다. 또한 남아있는 수분은 씰 형성을 방해하고 축삭 성장 또는 장치 아래의 세포 이동을 허용 할 수 있습니다. 두 가지 문제 모두 염색 전에 쉽게 발견 할 수 있으므로 실험에서 결함이있는 챔버가 제외됩니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 독일 연구 재단 (HA 7728 / 2-1 및 EXC2145 프로젝트 ID 390857198)과 막스 플랑크 학회의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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