Summary
Denne protokollen beskriver såing og farging av nevronale mitokondrier i mikrofluidiske kamre. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene muliggjør selektiv behandling av mitokondrier i aksoner for å analysere deres egenskaper som svar på farmakologiske utfordringer uten å påvirke cellekroppen.
Abstract
Mitokondrier er de primære leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Mitokondriell dysfunksjon er en vanlig fenotype i mange nevrodegenerative sykdommer. Gitt noen aksoners forseggjorte arkitektur og ekstreme lengde, er det ikke overraskende at mitokondrier i aksoner kan oppleve forskjellige miljøer sammenlignet med deres cellekroppsmodeller. Interessant, dysfunksjon av aksonale mitokondrier går ofte foran effekter på cellekroppen. For å modellere aksonal mitokondriell dysfunksjon in vitro, tillater mikrofluidiske enheter behandling av aksonale mitokondrier uten å påvirke de somale mitokondriene. Den fluidiske trykkgradienten i disse kamrene forhindrer diffusjon av molekyler mot gradienten, og muliggjør dermed analyse av mitokondrielle egenskaper som svar på lokale farmakologiske utfordringer i aksoner. Den nåværende protokollen beskriver såing av dissosierte hippocampale nevroner i mikrofluidiske enheter, farging med et membranpotensial følsomt fargestoff, behandling med mitokondrielt toksin og den påfølgende mikroskopiske analysen. Denne allsidige metoden for å studere aksonal biologi kan brukes på mange farmakologiske forstyrrelser og bildeavlesninger, og er egnet for flere neuronale subtyper.
Introduction
Mitokondrier er de viktigste leverandørene av ATP (adenosintrifosfat) i nevroner. Siden nevronhelse er nært knyttet til mitokondriell funksjon, er det ikke overraskende at dysfunksjonell regulering av disse organellene har vært assosiert med utbruddet av ulike nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsonssykdom. Videre har mitokondriell forgiftning med hell blitt brukt til å modellere Parkinsonske symptomer hos dyr2. I både dyremodeller og menneskelig sykdom starter bortfallet av nevroner ved de distale delene3,4, noe som antyder at aksonale mitokondrier kan være mer utsatt for fornærmelser. Imidlertid er biologien til mitokondrier i axoner ikke godt forstått på grunn av vanskelighetene forbundet med målrettet behandling og analyse av aksonale mitokondrier uten samtidig forstyrrelse av cellekroppsprosesser.
Nylige fremskritt innen dyrkingsteknikker av dissosierte nevroner in vitro tillater nå fluidisk separasjon av aksoner og cellelegemer gjennom mikrofluidiske enheter5. Som vist i figur 1A, har disse enhetene fire tilgangsbrønner (a/h og c/i), med to kanaler som forbinder hvert par (d og f). De store kanalene er forbundet med hverandre med en serie på 450 μm lange mikrokanaler (e). Tilsiktede forskjeller i fyllingsnivåene mellom de to kamrene skaper en væsketrykkgradient (figur 1B) som forhindrer diffusjon av små molekyler fra kanalen med lavere væskenivå til den andre siden (figur 1C, illustrert med Trypan blått fargestoff).
Vi har nylig brukt mikrofluidiske enheter for å studere lokale oversettelseskrav i aksonal mitophagy, selektiv fjerning av skadede mitokondrier6. I denne protokollen presenteres forskjellige trinn for å indusere lokal mitokondriell skade gjennom selektiv behandling av aksoner ved bruk av mitokondriekomplekset III-hemmeren Antimycin A 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter fra regjeringen i Øvre Bayern. De primære nevronene ble fremstilt fra E16.5 C57BL/6 museembryoer av begge kjønn etter standardmetoder som tidligere beskrevet6.
1. Montering av mikrofluidisk enhet
- Belegg en seks-brønns glassbunnsvevskulturplate med en endelig konsentrasjon på 20 μg / ml Poly-D-lysin og 3,4 μg / ml Laminin i PBS (fosfatbufret saltvann) (se materialtabell).
- Inkuber den belagte platen over natten i mørket ved romtemperatur.
MERK: Belegget kan også utføres ved 37 °C i 1-2 timer. Valget av belegget avhenger av celletypen som brukes. - Etter belegging, ta seks-brønnsplatene til den sterile hetten og vask dem to ganger med steril ddH2O.
MERK: Ikke vask med saltholdige buffere som PBS, da saltkrystaller vil forstyrre tetningsdannelsen. - La platen tørke i vippet stilling i 3-5 minutter. Fjern overflødig vann ved vakuumsuging eller pipettering.
- Bløtlegg mikrofluidkammeret i 80% etanol.
MERK: Det mikrofluidiske kammeret ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell). - La det mikrofluidiske kammeret tørke i 3-5 minutter i vippet stilling. Fjern overflødig etanol ved vakuum, sug eller pipettering.
- Når det er helt tørt, plasser det mikrofluidiske kammeret i midten av brønnen.
MERK: Dannelsen av tetningen kan observeres som en endring i reflekterende egenskaper ved utelukkelse av luft fra grensesnittet mellom platen og silikonanordningen. Både platen og mikrofluidisk kammer må være helt tørt før montering for å skape en god tetning. Tørketiden må imidlertid minimeres så mye som mulig for å sikre riktig overholdelse av cellene. Derfor må brønnene og kamrene inspiseres visuelt for gjenværende væskedråper. Hvis ingen dråper er synlige, monter kamrene umiddelbart. - Bank forsiktig på mikrofluidkammeret ved grensene og mikrogrooveseksjonen i midten for riktig festing til glassplaten.
2. Såing og vedlikehold av nevroner
- Samle ønsket antall dissosierte hippocampale nevroner per kammer i et 1,5 ml reaksjonsrør.
MERK: For denne studien ble 1,5 x 105 nevroner sådd per enhet for bildebaserte applikasjoner. - Sentrifugeneuroner ved 1000 x g i 4 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten med en pipette og resuspend pelleten i 8 μL B27-Neurobasal media (se Materialtabell).
- Pipetter celleoppløsningen inn i kanalinngangen til mikrofluidkammeret (b i figur 1A).
- Trykk på baksiden av platen for å hjelpe strømmen gjennom kanalen.
MERK: Tapping kan gjøres ganske kraftig uten bekymring for at forseglingen vil gå i stykker. - Aspirer med en pipette eventuell gjenværende cellesuspensjon ved utgangen av kanalen (g i figur 1A) for å redusere antall celler utenfor kanalen.
- Inkuber mikrofluidkammeret med celler i 15-20 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Fyll den øverste aksonale brønnen med 50 μL B27-Neurobasal media i (c i figur 1A).
- Trykk på baksiden av platen for å hjelpe strømmen gjennom kanalen.
- Fyll brønner på soma-siden (a og h i figur 1A) med 150 μL B27-Neurobasal media hver, noe som skaper en spenningsboble på toppen. Volumet av boblen er ca. 20 μL.
MERK: Å skape en spenningsboble er ikke nødvendig for å oppnå fluidisk isolasjon, men det gir et klart visuelt bilde av det høyere volumet på soma-siden. - Fyll begge brønnene på aksonalsiden (c og i i figur 1A) med 100 μL B27-Neurobasal media hver.
MERK: For å fremme aksonal vekst gjennom mikrogroovene, anbefales det at brønnene på soma-siden inneholder flere medier enn brønnene på aksonsiden. Imidlertid vil aksoner ved en tilfeldighet vokse gjennom mikrogroovene selv uten volumforskjeller. - Inkuber mikrofluidkammeret ved 37 °C og 5 % CO2 i 7-8 dager.
MERK: Vekst av aksoner i aksonalkammeret kan vanligvis observeres fra dag in vitro (DIV) 5. Lengre dyrkingstider er mulig hvis mer modne kulturer er ønsket. - Fôr nevroner hver 2-3 dag ved å fjerne mediet fra de to øvre brønnene (a og c) og erstatte det med friskt B27-Neurobasal medium til en spenningsboble dannes.
3. Farging med mitokondriell membran potensielt følsomt fargestoff
- Ved DIV 7-8, vurder at aksonene har vokst gjennom mikrogroovene og strekker seg inn i aksonalrommet under et lysmikroskop.
MERK: Ulike DIV-stadier er også mulig avhengig av ønsket alder. - Utfør to vasker med forvarmet bildebehandlingsmedium (37 °C) ved å fjerne B27-Neurobasal-mediet fra alle brønner og tilsette ca. 100 μL av bildemediet til de øverste brønnene i både aksonal- og somakanalene (a og c). La mediet strømme gjennom til de nedre brønnene (h og i).
- Fjern mediet fra de nedre brønnene og eventuelt gjenværende medium i de øverste brønnene, og gjenta med nytt medium, slik at brønnene er tomme på slutten av vasken.
MERK: På grunn av den høye kapillærkraften i kanalene (d og f), vil det være et gjenværende vaskemedium i kanalene som ikke bør fjernes for å forhindre at nevronene tørker. Ethvert fenolrødt bildebehandlingsmedium kan brukes her, for eksempel Dvalemodus E (se materialtabell). Hvis mikroskopet ikke er satt opp med en CO 2-tilførsel, må du sørge for at bildemediet bruker et alternativt buffersystem til karbonat / CO2 (f.eks. HEPES)8.
- Fjern mediet fra de nedre brønnene og eventuelt gjenværende medium i de øverste brønnene, og gjenta med nytt medium, slik at brønnene er tomme på slutten av vasken.
- Fortynn 1 mM tetrametylrhodamin etylester (TMRE, rød, se tabell over materialer) lager til 5 nM i bildemediet.
MERK: Ikke overskrid 1% DMSO i den endelige fortynningen for å unngå toksisitet. - Tilsett 100 μL av 5 nM TMRE-fortynningen til både de somatiske og aksonale toppbrønnene (a og c), og la mediet strømme gjennom både somatiske og aksonale rom til det er like stort volum i alle brønner. Fyll opp med TMRE-holdig medium.
- Plasser nevronene tilbake i et kontrollert miljøkammer (37 °C og 5 % CO2) i 25 minutter.
- Utfør to vasker med det forvarmede bildemediet (37 °C) som beskrevet tidligere (trinn 3.2). På den siste vasken, fyll opp med 100 μL i hver brønn og lag en spenningsboble av mediet på de somatiske brønnene (a og c).
4. Live-celle bildebehandling
MERK: Stillbilder vist ble anskaffet på en spinnende disk confocal mikroskop, ved hjelp av en 40x NA 1,25 nedsenking mål (se tabell over materialer). 200 ms eksponeringstid og 10 % lasereffekt for den røde kanalen og 500 ms eksponeringstid for lysfelt ble valgt. Imidlertid kan vanlige konfokale eller vidvinkelinverterte mikroskoper også brukes til å studere TMRE-intensitet.
- Se for deg cellene med et omvendt mikroskop.
- Sørg for at mikroskopet er utstyrt med en sceneinkubator for å opprettholde nevronkulturen ved 37 °C gjennom hele forsøket.
- Velg et område av interesse i det somatiske rommet, og følg det gjennom mikrogroovene inn i det aksonale rommet. Sørg for at de avbildede mikrogroovene samsvarer med de i de somatiske og aksonale rommene (for enklere sammenligning av baseline og etter behandling).
- Ta fluorescensbilder ved hjelp av eksitasjon ved 561 nm og utslipp ved 625 nm for rødt fluorescenssignal.
- Skaff deg bildene.
- For å indusere mitokondriell depolarisering, tilsett 20 μM Antimycin A (se materialtabell) i bildemediet til aksonalrommet. For å sikre en volumforskjell mellom soma og aksonale kamre, kontroller tilstedeværelsen av en spenningsboble på den somatiske siden (tilsvarer volum >110 μL).
- Fjern alt bildemedium fra den nedre brønnen på aksonalsiden (i), bortsett fra mediet inne i kanalen (f). Tilsett 160 μL av 20 μM Antimycin A til den øverste aksonale brønnen (c) og la den strømme gjennom kanalen til det er like stort volum i begge aksonale brønner. Volumene i aksonale brønner er omtrent 80 μL per brønn.
MERK: Sørg for at volumet i de aksonale brønnene er mindre enn i de somatiske brønnene for å sikre riktig væsketrykk. En forskjell på minst 10 μL (10% av brønnvolumet) anbefales, men også høyere forskjeller er mulige.
- Fjern alt bildemedium fra den nedre brønnen på aksonalsiden (i), bortsett fra mediet inne i kanalen (f). Tilsett 160 μL av 20 μM Antimycin A til den øverste aksonale brønnen (c) og la den strømme gjennom kanalen til det er like stort volum i begge aksonale brønner. Volumene i aksonale brønner er omtrent 80 μL per brønn.
- Inkuber nevroner i det kontrollerte miljøkammeret (37 °C) i 20-30 minutter.
- Gjenta bildebehandlingen som beskrevet ovenfor (trinn 4.3-4.5). Sørg for at de samme posisjonene er avbildet (lett identifisert av mikrogroovene) som under grunnlinjeinnsamlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primære hippocampale nevroner ble dyrket i mikrofluidiske enheter i 7-8 dager før mitokondrier ble farget med det membranfølsomme fargestoffet (TMRE) i 25 minutter i begge kanalene. Som vist i figur 2A ga dette homogen farging av mitokondrier på begge sider av mikrogroovene, men det var likevel ikke tilstrekkelig til å likestille fargingen i midten av mikrogroovene. Ved tillegg av antimycin A til aksonal side beholdt somale mitokondrier TMRE-signalet (figur 2B og video 1), mens TMRE-fluorescens gikk tapt fra aksonale mitokondrier (figur 2C og video 1). Videoen ble tatt opp ved hjelp av et fullt integrert digitalt vidvinkelmikroskop (se Materialtabell).
Figur 1: Mikrofluidiske enheter tillater fluidisk isolasjon av aksoner . (A) Skjematisk av mikrofluidisk enhet som ble brukt i denne studien. Silikonskiven (diameter 21 mm) passer lett inn i en seks-brønns plate. a) Brønn på soma-siden, b) Inngang av kanal på soma-siden, c) Brønn på aksonsiden, d) Kanal på soma-siden, e) Microgrooves, f) Kanal på aksonsiden, g) Utgang av kanalen på soma-siden, h) Vel på soma-siden, i) Godt på aksonsiden. (B) Skjematisk detaljering av hvordan de forskjellige væskenivåene skaper en fluidisk trykkgradient over mikrokanalene. (C) Demonstrasjon av fluidisk isolasjon ved tilsetning av Trypan blå til den ene siden av kammeret. Merk at på grunn av den fluidiske trykkgradienten balanserer ikke det blå fargestoffet over mikrokanalene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Selektiv behandling av aksoner depolariserer aksonale, men ikke cellekroppens mitokondrier. (A) Representativ mikrografi som presenterer en oversikt over effektiviteten av TMRE-farging i mikrofluidiske enheter. Skala bar = 100 μm. (B-C) Den representative mikrografen viser det samme området i cellekroppen og det aksonale rommet før og etter tilsetning av 20 μM Antimycin A (AA) til aksonalrommet. Skala bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Effekt av Antimycin A behandling på mitokondrier i axoner og cellelegemer. Live celleavbildning av tap av TMRE-fluorescens ved tilsetning av Antimycin A. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å frø og dyrke dissosierte hippocampale nevroner i en mikrofluidisk enhet for å behandle aksonale mitokondrier separat. Nytten av denne tilnærmingen med det membranfølsomme fargestoffet TMRE og den komplekse III-hemmeren Antimycin A (som tidligere demonstrert7) er demonstrert her, men denne metoden kan enkelt tilpasses andre mitokondrielle fargestoffer eller genetisk kodede sensorer av mitokondrielle funksjoner som tillater lokale, mikroskopibaserte avlesninger9. Andre nevroncelletyper kan også dyrkes i mikrofluidiske kamre, for eksempel primære kortikale nevroner10 eller induserte pluripotente stamceller (ipSC) -avledede motorneuroner11, noe som gjør denne plattformen til et allsidig verktøy for å studere mitokondriell funksjon i nevrodegenerasjon i nevroncelletypen av interesse. Montering av mikrofluidiske enheter er avgjørende for å oppnå en effektiv tetning og forklares lettest ved å se en erfaren forsker utføre monteringen. Nedstrøms merking og behandlingsprosedyre beskrevet her er ment å være eksemplarisk og kan justeres for å passe til protokollene som for tiden er etablert i de respektive laboratoriene, samtidig som den fluidiske trykkgradienten opprettholdes.
Såteknikken som er beskrevet her, skiller seg fra publiserte protokoller og produsentens beskrivelse, da vi hopper over de foreslåtte vaskene til den monterte enheten og i stedet frøer de dissosierte nevronene direkte inn i tørrkammeret (avsnitt 2). Det har blitt observert at dette reduserer antall nevroner som trengs, da det øker tettheten av nevroner i kanalen (e) og begrenser spredningen av nevroner i brønnene langt borte fra mikrokanalene. Den tørre såingen blir hjulpet ved å tappe bunnen av platen (trinn 2.5), noe som kanskje eller ikke er nødvendig, avhengig av kraften som ble brukt tidligere ved montering av enheten.
Det finnes imidlertid visse begrensninger i denne prosedyren. Det er en viss variasjon i tetningens tetthet på grunn av forskjeller i kraften som påføres under montering som kan føre til begrenset vekst gjennom mikrogroovene. Gjenværende fuktighet kan også forstyrre tetningsformasjonen og tillate aksonal vekst eller til og med cellemigrasjon under enheten. Begge problemene kan lett oppdages før farging, noe som fører til utelukkelse av defekte kamre fra forsøket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av German Research Foundation (HA 7728/2-1 og EXC2145 Project ID 390857198) og Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
