Summary
O presente protocolo descreve a semeadura e coloração de mitocôndrias neuronais em câmaras microfluídicas. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras permite o tratamento seletivo de mitocôndrias em axônios para analisar suas propriedades em resposta a desafios farmacológicos sem afetar o compartimento do corpo celular.
Abstract
As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. A disfunção mitocondrial é um fenótipo comum em muitas doenças neurodegenerativas. Dada a arquitetura elaborada e o comprimento extremo de alguns axônios, não é surpreendente que as mitocôndrias nos axônios possam experimentar ambientes diferentes em comparação com suas contrapartes do corpo celular. Curiosamente, a disfunção das mitocôndrias axonais muitas vezes precede os efeitos no corpo celular. Para modelar a disfunção mitocondrial axonal in vitro, os dispositivos microfluídicos permitem o tratamento das mitocôndrias axonais sem afetar as mitocôndrias somais. O gradiente de pressão fluídica nessas câmaras impede a difusão de moléculas contra o gradiente, permitindo assim a análise das propriedades mitocondriais em resposta a desafios farmacológicos locais dentro dos axônios. O protocolo atual descreve a semeadura de neurônios hipocampais dissociados em dispositivos microfluídicos, coloração com um corante sensível ao potencial de membrana, tratamento com uma toxina mitocondrial e a subsequente análise microscópica. Este método versátil para estudar a biologia axonal pode ser aplicado a muitas perturbações farmacológicas e leituras de imagem, e é adequado para vários subtipos neuronais.
Introduction
As mitocôndrias são os principais fornecedores de ATP (trifosfato de adenosina) nos neurônios. Como a saúde neuronal está intimamente ligada à função mitocondrial, não é de surpreender que a regulação disfuncional dessas organelas tenha sido associada ao aparecimento de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson1. Além disso, a intoxicação mitocondrial tem sido utilizada com sucesso para modelar sintomas parkinsonianos em animais2. Tanto em modelos animais quanto em doenças humanas, o desaparecimento dos neurônios começa nas partes distais3,4, sugerindo que as mitocôndrias axonais podem ser mais suscetíveis a insultos. No entanto, a biologia das mitocôndrias nos axônios não é bem compreendida devido às dificuldades associadas ao tratamento direcionado e à análise das mitocôndrias axonais sem perturbação simultânea dos processos do corpo celular.
Avanços recentes em técnicas de cultura de neurônios dissociados in vitro agora permitem a separação fluídica de axônios e corpos celulares através de dispositivos microfluídicos5. Conforme mostrado na Figura 1A, esses dispositivos apresentam quatro poços de acesso (a/h e c/i), com dois canais conectando cada par (d e f). Os grandes canais estão conectados uns com os outros por uma série de microcanais de 450 μm de comprimento (e). Diferenças intencionais nos níveis de enchimento entre as duas câmaras criam um gradiente de pressão do fluido (Figura 1B) que impede a difusão de pequenas moléculas do canal com um nível de fluido mais baixo para o outro lado (Figura 1C, ilustrada com corante azul de Trypan).
Recentemente, utilizamos dispositivos microfluídicos para estudar os requisitos de tradução local na mitofagia axonal, a remoção seletiva de mitocôndrias danificadas6. No presente protocolo, diferentes etapas são apresentadas para induzir dano mitocondrial local por meio do tratamento seletivo de axônios utilizando o inibidor do complexo mitocondrial III Antimicina A 6,7.
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram realizados seguindo as diretrizes e regulamentos relevantes do Governo da Alta Baviera. Os neurônios primários foram preparados a partir de embriões de camundongos do tipo selvagem E16.5 C57BL/6 de ambos os sexos, seguindo métodos padrão, conforme descrito anteriormente6.
1. Montagem do dispositivo microfluídico
- Revestir uma placa de cultura de tecido com fundo de vidro de seis poços com uma concentração final de 20 μg/mL de poli-D-lisina e 3,4 μg/mL de laminina em PBS (solução salina tamponada com fosfato) (ver Tabela de Materiais).
- Incubar a placa revestida durante a noite no escuro à temperatura ambiente.
NOTA: O revestimento também pode ser realizado a 37 °C por 1-2 h. A escolha do revestimento depende do tipo de célula utilizada. - Após o revestimento, leve as placas de seis poços para o exaustor estéril e lave-as duas vezes com ddH2O estéril.
NOTA: Não lave com tampões contendo sal, como PBS, pois os cristais de sal interferirão na formação da vedação. - Deixe a placa secar em uma posição inclinada por 3-5 min. Remova o excesso de água por sucção a vácuo ou pipetagem.
- Mergulhe a câmara microfluídica em etanol a 80%.
NOTA: A câmara microfluídica foi obtida de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). - Deixe a câmara microfluídica secar por 3-5 minutos em uma posição inclinada. Remova o excesso de etanol a vácuo, sucção ou pipetagem.
- Quando completamente seco, coloque a câmara microfluídica no centro do poço.
NOTA: A formação da vedação pode ser observada como uma mudança nas propriedades reflexivas após a exclusão do ar da interface entre a placa e o dispositivo de silicone. Tanto a placa quanto a câmara microfluídica devem estar completamente secas antes da montagem para criar uma boa vedação. No entanto, o tempo de secagem precisa ser minimizado o máximo possível para garantir a aderência adequada às células. Portanto, os poços e câmaras devem ser inspecionados visualmente quanto às gotículas líquidas restantes. Se nenhuma gotícula for visível, monte imediatamente as câmaras. - Bata suavemente na câmara microfluídica em suas bordas e na seção de microsulco no meio para fixação adequada à placa de vidro.
2. Semeadura e manutenção de neurônios
- Coletar o número desejado de neurônios do hipocampo dissociados por câmara em um tubo de reação de 1,5 mL.
NOTA: Para o presente estudo, 1,5 x 105 neurônios foram semeados por dispositivo para aplicações baseadas em imagens. - Centrífuga de neurônios a 1000 x g por 4 min à temperatura ambiente.
- Rejeitar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender o pellet em 8 μL de meio B27-Neurobasal (ver Tabela de Materiais).
- Pipetar a solução celular para a entrada do canal da câmara microfluídica (b na figura 1A).
- Toque na parte de trás da placa para ajudar a fluir através do canal.
NOTA: O toque pode ser feito com bastante força, sem se preocupar que o selo se quebre. - Aspirar com uma pipeta qualquer suspensão celular remanescente à saída do canal (g na figura 1A) para diminuir o número de células fora do canal.
- Incubar a câmara microfluídica com células durante 15-20 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Preencher o poço axonal superior com 50 μL de B27-Neurobasal em (c na Figura 1A).
- Toque na parte de trás da placa para ajudar a fluir através do canal.
- Encher poços no lado da soma (a e h na Figura 1A) com 150 μL de meios B27-Neurobasal cada, criando uma bolha de tensão no topo. O volume da bolha é de cerca de 20 μL.
NOTA: A criação de uma bolha de tensão não é necessária para alcançar o isolamento fluídico, mas fornece uma visão clara do volume mais alto no lado do soma. - Preencher ambos os poços do lado axonal (c e i na Figura 1A) com 100 μL de B27-Neurobasal médios cada.
NOTA: Para promover o crescimento axonal através dos microsulcos, recomenda-se que os poços no lado do soma contenham mais meios do que os poços no lado do axônio. No entanto, os axônios por acaso crescerão através dos microsulcos, mesmo sem diferenças de volume. - Incubar a câmara microfluídica a 37 °C e 5% de CO2 durante 7-8 dias.
NOTA: O crescimento dos axônios para a câmara axonal geralmente pode ser observado a partir do dia in vitro (DIV) 5. Tempos de cultivo mais longos são possíveis se culturas mais maduras forem desejadas. - Alimente os neurônios a cada 2-3 dias, removendo o meio dos dois poços superiores (a e c) e substituindo-o por um meio fresco B27-Neurobasal até que uma bolha de tensão seja formada.
3. Coloração com corante sensível ao potencial de membrana mitocondrial
- No DIV 7-8, avalie se os axônios cresceram através dos microsulcos e se estendem para o compartimento axonal sob um microscópio de luz.
NOTA: Diferentes estágios de DIV também são possíveis, dependendo da idade desejada. - Realizar duas lavagens com meio de imagem pré-aquecido (37 °C), removendo o meio B27-Neurobasal de todos os poços e adicionando cerca de 100 μL do meio de imagem aos poços superiores dos canais axonal e soma (a e c). Deixe o meio fluir para os poços inferiores (h e i).
- Retire o meio dos poços inferiores e qualquer meio que sobra nos poços superiores, e repita com meio fresco, deixando os poços vazios no final da lavagem.
NOTA: Devido à alta força capilar nos canais (d e f), haverá um meio de lavagem restante nos canais que não deve ser removido para evitar que os neurônios sequem. Qualquer meio de imagem livre de vermelho de fenol pode ser usado aqui, por exemplo, Hibernar E (consulte Tabela de Materiais). Se o microscópio não estiver configurado com uma fonte de CO 2, certifique-se de que o meio de imagem usa um sistema de tamponamento alternativo ao carbonato/CO2 (por exemplo, HEPES)8.
- Retire o meio dos poços inferiores e qualquer meio que sobra nos poços superiores, e repita com meio fresco, deixando os poços vazios no final da lavagem.
- Diluir o stock de éster etílico tetrametilrodamina de 1 mM (TMRE, vermelho, ver Tabela de Materiais) até 5 nM no meio de imagem.
NOTA: Não exceda 1% de DMSO na diluição final para evitar toxicidade. - Adicionar 100 μL da diluição TMRE de 5 nM aos poços superiores somáticos e axonais (a e c) e deixar o meio fluir através dos compartimentos somático e axonal até que haja um volume igual em todos os poços. Encha com o meio contendo TMRE.
- Coloque os neurônios de volta em uma câmara de ambiente controlado (37 °C e 5% de CO2) por 25 min.
- Efectuar duas lavagens com o meio de imagem pré-aquecido (37 °C), conforme descrito anteriormente (passo 3.2). Na última lavagem, encha com 100 μL em cada poço e crie uma bolha de tensão do meio nos poços somáticos (a e c).
4. Imagem de células vivas
NOTA: As imagens estáticas mostradas foram adquiridas em um microscópio confocal de disco giratório, usando uma objetiva de imersão 40x NA 1,25 (ver Tabela de Materiais). Foram escolhidos 200 ms de tempo de exposição e 10% de potência do laser para o canal vermelho e 500 ms de tempo de exposição para o campo brilhante. No entanto, microscópios confocais regulares ou invertidos de campo largo também podem ser usados para estudar a intensidade da TMRE.
- Fotografe as células com um microscópio invertido.
- Certifique-se de que o microscópio esteja equipado com uma incubadora de estágio para manter a cultura neuronal a 37 °C durante todo o experimento.
- Selecione uma região de interesse no compartimento somático e siga-a através dos microsulcos até o compartimento axonal. Certifique-se de que os microsulcos fotografados correspondam aos dos compartimentos somático e axonal (para facilitar a comparação basal e pós-tratamento).
- Capture imagens de fluorescência usando excitação a 561 nm e emissão a 625 nm para sinal de fluorescência vermelho.
- Adquira as imagens.
- Para induzir a despolarização mitocondrial, adicione 20 μM de Antimicina A (ver Tabela de Materiais) no meio de imagem ao compartimento axonal. Para garantir uma diferença de volume entre as câmaras soma e axonal, verifique a presença de uma bolha de tensão no lado somático (igual ao volume >110 μL).
- Remova todos os meios de imagem do poço inferior do lado axonal (i), exceto o meio dentro do canal (f). Adicione 160 μL de 20 μM de Antimicina A ao poço axonal superior (c) e deixe-o fluir através do canal até que haja um volume igual em ambos os poços axonais. Os volumes em poços axonais são de aproximadamente 80 μL por poço.
NOTA: Certifique-se de que o volume nos poços axonais é menor do que nos poços somáticos para garantir a pressão adequada do fluido. Recomenda-se uma diferença de pelo menos 10 μL (10% do volume do poço), mas também diferenças mais altas são possíveis.
- Remova todos os meios de imagem do poço inferior do lado axonal (i), exceto o meio dentro do canal (f). Adicione 160 μL de 20 μM de Antimicina A ao poço axonal superior (c) e deixe-o fluir através do canal até que haja um volume igual em ambos os poços axonais. Os volumes em poços axonais são de aproximadamente 80 μL por poço.
- Incubar neurônios na câmara de ambiente controlado (37 °C) por 20-30 min.
- Repita a imagem conforme descrito acima (etapas 4.3-4.5). Certifique-se de que as mesmas posições sejam visualizadas (facilmente identificadas pelos microsulcos) como durante a aquisição da linha de base.
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Representative Results
Os neurônios primários do hipocampo foram cultivados em dispositivos microfluídicos por 7-8 dias antes que as mitocôndrias fossem coradas com o corante sensível à membrana (TMRE) por 25 minutos em ambos os canais. Como mostrado na Figura 2A, isso produziu coloração homogênea de mitocôndrias em ambos os lados dos microsulcos, mas foi insuficiente para equilibrar a coloração no meio dos microsulcos. Após a adição de Antimicina A ao lado axonal, as mitocôndrias sanais retiveram o sinal de TMRE (Figura 2B e Vídeo 1), enquanto a fluorescência de TMRE foi perdida das mitocôndrias axonais (Figura 2C e Vídeo 1). O vídeo foi capturado usando um microscópio digital de campo largo totalmente integrado (ver Tabela de Materiais).
Figura 1: Os dispositivos microfluídicos permitem o isolamento fluídico dos axônios . (A) Esquema do dispositivo microfluídico utilizado neste estudo. O disco de silicone (diâmetro 21 mm) se encaixa facilmente em uma placa de seis poços. a) Poço no lado soma, b) Entrada do canal no lado soma, c) Poço no lado do axônio, d) Canal no lado soma, e) Microsulcos, f) Canal no lado do axônio, g) Saída do canal no lado soma, h) Poço no lado soma, i) Poço no lado axônio. (B) Detalhamento esquemático de como os diferentes níveis de fluido criam um gradiente de pressão fluídica através dos microcanais. (C) Demonstração do isolamento fluídico pela adição de azul de tripano a um dos lados da câmara. Observe que, devido ao gradiente de pressão fluídica, o corante azul não se equilibra através dos microcanais. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O tratamento seletivo dos axônios despolariza as mitocôndrias axonais, mas não do corpo celular. (A) Micrografia representativa apresentando uma visão geral da efetividade da coloração TMRE em dispositivos microfluídicos. Barra de escala = 100 μm. (B-C) A micrografia representativa mostra a mesma área no corpo celular e no compartimento axonal antes e depois de adicionar 20 μM de antimicina A (AA) ao compartimento axonal. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1: Efeito do tratamento Antimicina A nas mitocôndrias em axônios e corpos celulares. Imagem de células ao vivo da perda de fluorescência TMRE ao adicionar Antimicina A. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
O presente protocolo descreve um método para semear e cultivar neurônios hipocampais dissociados em um dispositivo microfluídico para tratar mitocôndrias axonais separadamente. A utilidade dessa abordagem com o corante sensível à membrana TMRE e o inibidor do complexo III Antimicina A (como demonstrado anteriormente7) é demonstrada aqui, mas esse método pode ser facilmente adaptado a outros corantes mitocondriais ou sensores geneticamente codificados de funções mitocondriais que permitem leituras locais, baseadas em microscopia9. Outros tipos de células neuronais também podem ser cultivados em câmaras microfluídicas, como neurônios corticais primários10 ou neurônios motores derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (ipSC)11, tornando essa plataforma uma ferramenta versátil para estudar a função mitocondrial na neurodegeneração no tipo de célula neuronal de interesse. A montagem de dispositivos microfluídicos é crucial para alcançar uma vedação eficiente e é mais facilmente explicada observando um pesquisador experiente realizar a montagem. O procedimento de rotulagem e tratamento a jusante descrito aqui deve ser exemplar e pode ser ajustado para se adequar aos protocolos atualmente estabelecidos nos respectivos laboratórios, mantendo o gradiente de pressão fluídica.
A técnica de semeadura descrita aqui difere dos protocolos publicados e da descrição do fabricante, pois pulamos as lavagens sugeridas do dispositivo montado e, em vez disso, semeamos diretamente os neurônios dissociados na câmara seca (seção 2). Observou-se que isso reduz o número de neurônios necessários, pois aumenta a densidade de neurônios dentro do canal (e) e limita a disseminação de neurônios nos poços distantes dos microcanais. A semeadura a seco é auxiliada pela batida no fundo da placa (etapa 2.5), o que pode ou não ser necessário dependendo da força aplicada anteriormente ao montar o dispositivo.
No entanto, existem algumas limitações neste procedimento. Existe alguma variabilidade na estanqueidade da vedação devido a diferenças na força aplicada durante a montagem que podem levar a um crescimento restrito através dos microsulcos. Além disso, a umidade restante pode perturbar a formação da vedação e permitir o crescimento axonal ou mesmo a migração celular sob o dispositivo. Ambos os problemas podem ser facilmente detectados antes da coloração, levando à exclusão de câmaras defeituosas do experimento.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (HA 7728/2-1 e EXC2145 Project ID 390857198) e pela Sociedade Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
