Summary
El presente protocolo describe la siembra y tinción de mitocondrias neuronales en cámaras microfluídicas. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras permite el tratamiento selectivo de las mitocondrias en los axones para analizar sus propiedades en respuesta a desafíos farmacológicos sin afectar el compartimento del cuerpo celular.
Abstract
Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. La disfunción mitocondrial es un fenotipo común en muchas enfermedades neurodegenerativas. Dada la elaborada arquitectura y la longitud extrema de algunos axones, no es sorprendente que las mitocondrias en los axones puedan experimentar diferentes entornos en comparación con sus contrapartes del cuerpo celular. Curiosamente, la disfunción de las mitocondrias axonales a menudo precede a los efectos en el cuerpo celular. Para modelar la disfunción mitocondrial axonal in vitro, los dispositivos microfluídicos permiten el tratamiento de las mitocondrias axonales sin afectar a las mitocondrias somales. El gradiente de presión fluídica en estas cámaras evita la difusión de moléculas contra el gradiente, lo que permite el análisis de las propiedades mitocondriales en respuesta a los desafíos farmacológicos locales dentro de los axones. El protocolo actual describe la siembra de neuronas disociadas del hipocampo en dispositivos microfluídicos, la tinción con un tinte sensible al potencial de membrana, el tratamiento con una toxina mitocondrial y el posterior análisis microscópico. Este método versátil para estudiar la biología axonal se puede aplicar a muchas perturbaciones farmacológicas y lecturas de imágenes, y es adecuado para varios subtipos neuronales.
Introduction
Las mitocondrias son los principales proveedores de ATP (trifosfato de adenosina) en las neuronas. Como la salud neuronal está íntimamente ligada a la función mitocondrial, no es sorprendente que la regulación disfuncional de estos orgánulos se haya asociado con la aparición de diversas enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Parkinson1. Además, la intoxicación mitocondrial se ha utilizado con éxito para modelar los síntomas parkinsonianos en animales2. Tanto en modelos animales como en enfermedades humanas, la desaparición de las neuronas comienza en las partes distales3,4, lo que sugiere que las mitocondrias axonales podrían ser más susceptibles a los insultos. Sin embargo, la biología de las mitocondrias en los axones no se comprende bien debido a las dificultades asociadas con el tratamiento dirigido y el análisis de las mitocondrias axonales sin perturbación simultánea de los procesos del cuerpo celular.
Los recientes avances en las técnicas de cultivo de neuronas disociadas in vitro permiten ahora la separación fluídica de axones y cuerpos celulares a través de dispositivos microfluídicos5. Como se muestra en la Figura 1A, estos dispositivos cuentan con cuatro pozos de acceso (a/h y c/i), con dos canales que conectan cada par (d y f). Los canales grandes están conectados entre sí por una serie de microcanales de 450 μm de largo (e). Las diferencias intencionales en los niveles de llenado entre las dos cámaras crean un gradiente de presión de fluido (Figura 1B) que evita la difusión de moléculas pequeñas desde el canal con un nivel de fluido más bajo hacia el otro lado (Figura 1C, ilustrada con colorante azul de tripano).
Recientemente utilizamos dispositivos microfluídicos para estudiar los requisitos de traducción local en la mitofagia axonal, la eliminación selectiva de las mitocondrias dañadas6. En el presente protocolo, se presentan diferentes pasos para inducir daño mitocondrial local a través del tratamiento selectivo de los axones utilizando el inhibidor del complejo mitocondrial III Antimicina A 6,7.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo las directrices y reglamentos pertinentes del Gobierno de Alta Baviera. Las neuronas primarias se prepararon a partir de embriones de ratón de tipo salvaje E16.5 C57BL / 6 de ambos sexos siguiendo los métodos estándar descritos anteriormente6.
1. Montaje del dispositivo microfluídico
- Cubra una placa de cultivo de tejido con fondo de vidrio de seis pocillos con una concentración final de 20 μg/ml de poli-D-lisina y 3,4 μg/ml de laminina en PBS (solución salina tamponada con fosfato) (consulte la Tabla de materiales).
- Incubar la placa recubierta durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
NOTA: El recubrimiento también se puede realizar a 37 °C durante 1-2 h. La elección del recubrimiento depende del tipo de célula utilizada. - Después del recubrimiento, lleve las placas de seis pocillos a la campana estéril y lávelas dos veces con ddH2O estéril.
NOTA: No lave con tampones que contengan sal como PBS, ya que los cristales de sal interferirán con la formación del sello. - Deje que la placa se seque en una posición inclinada durante 3-5 min. Elimine el exceso de agua mediante succión al vacío o pipeteo.
- Remoje la cámara microfluídica en etanol al 80%.
NOTA: La cámara microfluídica se obtuvo de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). - Deje que la cámara microfluídica se seque durante 3-5 minutos en posición inclinada. Elimine el exceso de etanol por vacío, succión o pipeteo.
- Cuando esté completamente seco, coloque la cámara microfluídica en el centro del pozo.
NOTA: La formación del sello se puede observar como un cambio en las propiedades reflectantes al excluir el aire de la interfaz entre la placa y el dispositivo de silicona. Tanto la placa como la cámara microfluídica deben estar completamente secas antes del montaje para crear un buen sellado. Sin embargo, el tiempo de secado debe minimizarse tanto como sea posible para garantizar una adherencia adecuada a las células. Por lo tanto, los pozos y cámaras deben inspeccionarse visualmente en busca de gotas líquidas restantes. Si no hay gotas visibles, monte inmediatamente las cámaras. - Golpee suavemente la cámara microfluídica en sus bordes y la sección de microranura en el centro para una fijación adecuada a la placa de vidrio.
2. Siembra y mantenimiento de neuronas
- Recoja el número deseado de neuronas disociadas del hipocampo por cámara en un tubo de reacción de 1,5 ml.
NOTA: Para el presente estudio, se sembraron 1.5 x 105 neuronas por dispositivo para aplicaciones basadas en imágenes. - Centrifugar neuronas a 1000 x g durante 4 min a temperatura ambiente.
- Desechar el sobrenadante con una pipeta y resuspender el pellet en 8 μL de medio B27-Neurobasal (ver Tabla de materiales).
- Pipetear la solución celular en la entrada del canal de la cámara microfluídica (b en la Figura 1A).
- Toque la parte posterior de la placa para ayudar a fluir a través del canal.
NOTA: El tapping se puede hacer con bastante fuerza sin preocuparse de que el sello se rompa. - Aspirar con una pipeta cualquier suspensión celular restante a la salida del canal (g en la figura 1A) para disminuir el número de células fuera del canal.
- Incubar la cámara microfluídica con células durante 15-20 min a 37 °C y 5% deCO2.
- Llene el pocillo axonal superior con 50 μL de medios B27-Neurobasales en (c en la Figura 1A).
- Toque la parte posterior de la placa para ayudar a fluir a través del canal.
- Llene los pocillos en el lado soma (a y h en la Figura 1A) con 150 μL de medios B27-Neurobasales cada uno, creando una burbuja de tensión en la parte superior. El volumen de la burbuja es de aproximadamente 20 μL.
NOTA: La creación de una burbuja de tensión no es necesaria para lograr el aislamiento fluídico, pero proporciona una visión clara del volumen más alto en el lado del soma. - Llenar ambos pocillos del lado axonal (c e i en la Figura 1A) con 100 μL de medios B27-Neurobasales cada uno.
NOTA: Para promover el crecimiento axonal a través de los microsurcos, se recomienda que los pocillos en el lado soma contengan más medios que los pocillos en el lado del axón. Sin embargo, los axones crecerán por casualidad a través de los microsurcos incluso sin diferencias de volumen. - Incubar la cámara microfluídica a 37 °C y 5% deCO2 durante 7-8 días.
NOTA: El crecimiento de los axones en la cámara axonal generalmente se puede observar a partir del día in vitro (DIV) 5. Los tiempos de cultivo más largos son posibles si se desean culturas más maduras. - Alimente las neuronas cada 2-3 días eliminando el medio de los dos pocillos superiores (a y c) y reemplazándolo con medio fresco B27-Neurobasal hasta que se forme una burbuja de tensión.
3. Tinción con colorante sensible al potencial de la membrana mitocondrial
- En DIV 7-8, evalúe que los axones han crecido a través de los microsurcos y se extienden hacia el compartimiento axonal debajo de un microscopio óptico.
NOTA: También son posibles diferentes etapas DIV dependiendo de la edad deseada. - Realice dos lavados con medio de imagen precalentado (37 °C) eliminando el medio B27-neurobasal de todos los pocillos y agregando aproximadamente 100 μL del medio de imagen a los pocillos superiores de los canales axonal y soma (a y c). Deje que el medio fluya a través de los pozos inferiores (h e i).
- Retire el medio de los pocillos inferiores y cualquier medio sobrante en los pocillos superiores, y repita con medio fresco, dejando los pocillos vacíos al final del lavado.
NOTA: Debido a la alta fuerza capilar en los canales (d y f), habrá un medio de lavado restante en los canales que no debe eliminarse para evitar que las neuronas se sequen. Aquí se puede usar cualquier medio de imagen libre de rojo fenol, por ejemplo, Hibernate E (consulte la Tabla de materiales). Si el microscopio no está configurado con un suministro deCO2 , asegúrese de que el medio de obtención de imágenes utilice un sistema de amortiguación alternativo al carbonato/CO2 (por ejemplo, HEPES)8.
- Retire el medio de los pocillos inferiores y cualquier medio sobrante en los pocillos superiores, y repita con medio fresco, dejando los pocillos vacíos al final del lavado.
- Diluir 1 mM de éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE, rojo, consulte la Tabla de materiales) hasta 5 nM en el medio de imagen.
NOTA: No exceda el 1% de DMSO en la dilución final para evitar toxicidad. - Agregue 100 μL de dilución TMRE de 5 nM a los pocillos superiores somáticos y axonales (a y c), y deje que el medio fluya a través de los compartimentos somático y axonal hasta que haya un volumen igual en todos los pocillos. Llene con el medio que contiene TMRE.
- Vuelva a colocar las neuronas en una cámara de ambiente controlado (37 °C y 5% deCO2) durante 25 min.
- Realice dos lavados con el medio de imagen precalentado (37 °C) como se describió anteriormente (paso 3.2). En el último lavado, llene con 100 μL en cada pocillo y cree una burbuja de tensión del medio en los pocillos somáticos (a y c).
4. Imágenes de células vivas
NOTA: Las imágenes fijas mostradas fueron adquiridas en un microscopio confocal de disco giratorio, utilizando un objetivo de inmersión 40x NA 1.25 (ver Tabla de materiales). Se eligieron un tiempo de exposición de 200 ms y una potencia láser del 10% para el canal rojo y un tiempo de exposición de 500 ms para campo claro. Sin embargo, los microscopios confocales regulares o de campo amplio invertido también se pueden usar para estudiar la intensidad de TMRE.
- Imagen de las células con un microscopio invertido.
- Asegúrese de que el microscopio esté equipado con una incubadora de etapas para mantener el cultivo neuronal a 37 °C durante todo el experimento.
- Seleccione una región de interés en el compartimento somático y sígala a través de los microsurcos hasta el compartimiento axonal. Asegúrese de que los microsurcos fotografiados coincidan con los de los compartimentos somático y axonal (para facilitar la comparación inicial y posterior al tratamiento).
- Capture imágenes de fluorescencia utilizando excitación a 561 nm y emisión a 625 nm para señal de fluorescencia roja.
- Adquiere las imágenes.
- Para inducir la despolarización mitocondrial, agregue 20 μM de antimicina A (consulte la Tabla de materiales) en el medio de imagen al compartimiento axonal. Para asegurar una diferencia de volumen entre el soma y las cámaras axonales, compruebe la presencia de una burbuja de tensión en el lado somático (igual al volumen >110 μL).
- Retire todo el medio de obtención de imágenes del pocillo inferior del lado axonal (i), excepto el medio dentro del canal (f). Añadir 160 μL de 20 μM de antimicina A al pocillo axonal superior (c) y dejar que fluya a través del canal hasta que haya un volumen igual en ambos pocillos axonales. Los volúmenes en los pocillos axonales son de aproximadamente 80 μL por pocillo.
NOTA: Asegúrese de que el volumen en los pocillos axonales sea menor que en los pocillos somáticos para garantizar la presión adecuada del fluido. Se recomienda una diferencia de al menos 10 μL (10% del volumen del pozo), pero también son posibles diferencias más altas.
- Retire todo el medio de obtención de imágenes del pocillo inferior del lado axonal (i), excepto el medio dentro del canal (f). Añadir 160 μL de 20 μM de antimicina A al pocillo axonal superior (c) y dejar que fluya a través del canal hasta que haya un volumen igual en ambos pocillos axonales. Los volúmenes en los pocillos axonales son de aproximadamente 80 μL por pocillo.
- Incubar las neuronas en la cámara de ambiente controlado (37 °C) durante 20-30 min.
- Repita las imágenes como se describió anteriormente (pasos 4.3-4.5). Asegúrese de que se obtengan las mismas imágenes de las posiciones (fácilmente identificables por las microranuras) que durante la adquisición de referencia.
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Representative Results
Las neuronas primarias del hipocampo se cultivaron en dispositivos microfluídicos durante 7-8 días antes de que las mitocondrias se tiñeran con el tinte sensible a la membrana (TMRE) durante 25 minutos en ambos canales. Como se muestra en la Figura 2A, esto produjo una tinción homogénea de las mitocondrias en ambos lados de los microsurcos, pero fue insuficiente para equilibrar la tinción en el medio de los microsurcos. Tras la adición de antimicina A al lado axonal, las mitocondrias somales retuvieron la señal TMRE (Figura 2B y Video 1), mientras que la fluorescencia TMRE se perdió de las mitocondrias axonales (Figura 2C y Video 1). El video fue capturado usando un microscopio digital de campo amplio totalmente integrado (ver Tabla de materiales).
Figura 1: Los dispositivos microfluídicos permiten el aislamiento fluídico de los axones . (A) Esquema del dispositivo microfluídico utilizado en este estudio. El disco de silicona (diámetro 21 mm) encaja fácilmente en una placa de seis pocillos. a) Pozo en el lado del soma, b) Entrada del canal en el lado del soma, c) Pozo en el lado del axón, d) Canal en el lado del soma, e) Microsurcos, f) Canal en el lado del axón, g) Salida del canal en el lado del soma, h) Pozo en el lado del soma, i) Pozo en el lado del axón. (B) Esquema que detalla cómo los diferentes niveles de fluido crean un gradiente de presión fluídica a través de los microcanales. (C) Demostración del aislamiento fluídico mediante la adición de azul de tripano a un lado de la cámara. Tenga en cuenta que debido al gradiente de presión fluídica, el tinte azul no se equilibra a través de los microcanales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El tratamiento selectivo de los axones despolariza las mitocondrias axonales pero no del cuerpo celular. (A) Micrografía representativa que presenta una visión general de la efectividad de la tinción TMRE en dispositivos microfluídicos. Barra de escala = 100 μm. (B-C) La micrografía representativa muestra la misma área en el cuerpo celular y el compartimiento axonal antes y después de agregar 20 μM de antimicina A (AA) al compartimiento axonal. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Efecto del tratamiento con antimicina A sobre las mitocondrias en axones y cuerpos celulares. Imágenes de células vivas de la pérdida de fluorescencia TMRE al agregar antimicina A. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
El presente protocolo describe un método para sembrar y cultivar neuronas disociadas del hipocampo en un dispositivo microfluídico para tratar las mitocondrias axonales por separado. La utilidad de este enfoque con el colorante sensible a la membrana TMRE y el inhibidor del complejo III Antimicina A (como se demostró anteriormente7) se demuestra aquí, pero este método puede adaptarse fácilmente a otros colorantes mitocondriales o sensores codificados genéticamente de funciones mitocondriales que permiten lecturas locales basadas en microscopía9. Otros tipos de células neuronales también se pueden cultivar en cámaras microfluídicas, como las neuronas corticales primarias10 o las motoneuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (ipSC)11, lo que convierte a esta plataforma en una herramienta versátil para estudiar la función mitocondrial en la neurodegeneración en el tipo de interés de la célula neuronal. El ensamblaje de dispositivos microfluídicos es crucial para lograr un sellado eficiente y se explica más fácilmente observando a un investigador experimentado realizar el ensamblaje. El procedimiento de etiquetado y tratamiento aguas abajo descrito aquí está destinado a ser ejemplar y puede ajustarse para adaptarse a los protocolos actualmente establecidos en los respectivos laboratorios, manteniendo el gradiente de presión fluídica.
La técnica de siembra descrita aquí difiere de los protocolos publicados y la descripción del fabricante, ya que omitimos los lavados sugeridos del dispositivo ensamblado y, en su lugar, sembramos directamente las neuronas disociadas en la cámara seca (sección 2). Se ha observado que esto reduce el número de neuronas necesarias, ya que aumenta la densidad de las neuronas dentro del canal (e) y limita la propagación de las neuronas en los pozos alejados de los microcanales. La siembra en seco se ayuda golpeando la parte inferior de la placa (paso 2.5), que puede o no ser necesaria dependiendo de la fuerza aplicada previamente al ensamblar el dispositivo.
Sin embargo, existen ciertas limitaciones en este procedimiento. Existe cierta variabilidad en la estanqueidad del sello debido a las diferencias en la fuerza aplicada durante el montaje que pueden conducir a un crecimiento restringido a través de las microranuras. Además, la humedad restante puede perturbar la formación del sello y permitir el crecimiento axonal o incluso la migración celular debajo del dispositivo. Ambos problemas se pueden detectar fácilmente antes de la tinción, lo que lleva a la exclusión de cámaras defectuosas del experimento.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación (HA 7728/2-1 y EXC2145 Project ID 390857198) y la Sociedad Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
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