Summary
Mevcut protokol, nöronal mitokondrinin mikroakışkan odalarda tohumlanmasını ve boyanmasını tanımlamaktadır. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, aksonlardaki mitokondrilerin, hücre gövdesi bölmesini etkilemeden farmakolojik zorluklara yanıt olarak özelliklerini analiz etmek için seçici tedavisine izin verir.
Abstract
Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) birincil tedarikçileridir. Mitokondriyal disfonksiyon birçok nörodejeneratif hastalıkta sık görülen bir fenotiptir. Bazı aksonların ayrıntılı mimarisi ve aşırı uzunluğu göz önüne alındığında, aksonlardaki mitokondrilerin hücre gövdesindeki meslektaşlarına kıyasla farklı ortamlar yaşayabilmesi şaşırtıcı değildir. İlginç bir şekilde, aksonal mitokondrinin işlev bozukluğu genellikle hücre gövdesi üzerindeki etkilerden önce gelir. Aksonal mitokondriyal disfonksiyonu in vitro olarak modellemek için, mikroakışkan cihazlar somal mitokondrileri etkilemeden aksonal mitokondrinin tedavisine izin verir. Bu odalardaki akışkan basınç gradyanı, moleküllerin gradyana karşı difüzyonunu önler, böylece aksonlar içindeki lokal farmakolojik zorluklara yanıt olarak mitokondriyal özelliklerin analizine izin verir. Mevcut protokol, ayrışmış hipokampal nöronların mikroakışkan cihazlarda tohumlanmasını, membran potansiyeline duyarlı bir boya ile boyanmasını, mitokondriyal toksin ile tedaviyi ve ardından mikroskobik analizi açıklamaktadır. Aksonal biyolojiyi incelemek için bu çok yönlü yöntem, birçok farmakolojik pertürbasyona ve görüntüleme okumalarına uygulanabilir ve çeşitli nöronal alt tipler için uygundur.
Introduction
Mitokondri, nöronlardaki ATP'nin (adenozin trifosfat) ana tedarikçileridir. Nöronal sağlık mitokondriyal fonksiyonla yakından bağlantılı olduğundan, bu organellerin işlevsiz düzenlenmesinin Parkinson hastalığı1 de dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ile ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Ayrıca, mitokondriyal zehirlenme, hayvanlarda Parkinson semptomlarını modellemek için başarıyla kullanılmıştır2. Hem hayvan modellerinde hem de insan hastalığında, nöronların ölümü distal kısımlar 3,4'te başlar ve aksonal mitokondrinin hakaretlere daha duyarlı olabileceğini ima eder. Bununla birlikte, aksonlardaki mitokondrinin biyolojisi, hücre gövdesi süreçlerinin eşzamanlı olarak bozulması olmadan aksonal mitokondrinin hedeflenen tedavisi ve analizi ile ilgili zorluklar nedeniyle iyi anlaşılmamıştır.
Ayrışmış nöronların in vitro kültürleme tekniklerindeki son gelişmeler artık mikroakışkan cihazlar aracılığıyla aksonların ve hücre cisimlerinin akışkan olarak ayrılmasına izin vermektedir5. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, bu cihazlar her bir çifti (d ve f) birbirine bağlayan iki kanala sahip dört erişim kuyusuna (a / s ve c / i) sahiptir. Büyük kanallar birbirine 450 μm uzunluğundaki bir dizi mikro kanal (e) ile bağlanır. İki oda arasındaki dolum seviyelerindeki kasıtlı farklılıklar, küçük moleküllerin daha düşük sıvı seviyesine sahip kanaldan diğer tarafa difüzyonunu önleyen bir sıvı basınç gradyanı oluşturur (Şekil 1B) (Şekil 1C, Tripan mavisi boya ile gösterilmiştir).
Son zamanlarda, aksonal mitofajideki yerel çeviri gereksinimlerini, hasarlı mitokondri 6'nın seçici olarak uzaklaştırılmasını incelemek için mikroakışkan cihazlarkullandık. Bu protokolde, mitokondriyal kompleks III inhibitörü Antimisin A 6,7 kullanılarak aksonların seçici tedavisi yoluyla lokal mitokondriyal hasarı indüklemek için farklı adımlar sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Yukarı Bavyera Hükümeti'nin ilgili yönergeleri ve düzenlemeleri uyarınca gerçekleştirilmiştir. Primer nöronlar, daha önce tarif edildiği gibi standart yöntemler izlenerek her iki cinsiyetten E16.5 C57BL / 6 vahşi tip fare embriyolarından hazırlandı6.
1. Mikroakışkan cihazın montajı
- PBS'de (fosfat tamponlu salin) 20 μg / mL Poli-D-Lizin ve 3.4 μg / mL Laminin nihai konsantrasyonu ile altı kuyucuklu bir cam tabanlı doku kültürü plakasını kaplayın (bkz.
- Kaplanmış plakayı oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca inkübe edin.
NOT: Kaplama, 37 °C'de 1-2 saat boyunca da yapılabilir. Kaplamanın seçimi, kullanılan hücre tipine bağlıdır. - Kaplamadan sonra, altı delikli plakaları steril davlumbaza getirin ve steril ddH2O ile iki kez yıkayın.
NOT: PBS gibi tuz içeren tamponlarla yıkamayın, çünkü tuz kristalleri conta oluşumuna müdahale edecektir. - Plakanın 3-5 dakika boyunca eğimli bir konumda kurumasını bekleyin. Fazla suyu vakum emme veya pipetleme ile temizleyin.
- Mikroakışkan odasını %80 etanol ile ıslatın.
NOT: Mikroakışkan haznesi ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). - Mikroakışkan haznenin eğimli bir konumda 3-5 dakika kurumasını bekleyin. Fazla etanolün vakum, emme veya pipetleme yoluyla çıkarılması.
- Tamamen kuruduğunda, mikroakışkan odayı kuyunun ortasına yerleştirin.
NOT: Contanın oluşumu, plaka ile silikon cihaz arasındaki arayüzden havanın çıkarılması üzerine yansıtıcı özelliklerde bir değişiklik olarak gözlemlenebilir. Hem plaka hem de mikroakışkan hazne, iyi bir sızdırmazlık oluşturmak için montajdan önce tamamen kuru olmalıdır. Bununla birlikte, hücrelere uygun yapışmayı sağlamak için kuruma süresinin mümkün olduğunca en aza indirilmesi gerekir. Bu nedenle, kuyular ve odalar kalan sıvı damlacıkları için görsel olarak incelenmelidir. Hiçbir damlacık görünmüyorsa, odaları hemen monte edin. - Cam plakaya düzgün bir şekilde tutturulması için kenarlıklarındaki mikroakışkan haznesine ve ortasındaki mikro oluk bölümüne hafifçe dokunun.
2. Nöronların tohumlanması ve bakımı
- 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpünde oda başına istenen sayıda ayrışmış hipokampal nöron toplayın.
NOT: Bu çalışmada, görüntüleme tabanlı uygulamalar için cihaz başına 1.5 x 105 nöron tohumlanmıştır. - Nöronları oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj yapın.
- Süpernatantı bir pipetle atın ve peleti 8 μL B27-Nörobazal ortamda yeniden askıya alın (bkz.
- Hücre çözeltisini mikroakışkan haznenin kanal girişine pipetleyin (Şekil 1A'da b).
- Kanaldan akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun.
NOT: Dokunma, contanın kırılacağından endişe etmeden oldukça güçlü bir şekilde yapılabilir. - Kanal dışındaki hücre sayısını azaltmak için kanalın çıkışında kalan hücre süspansiyonunu (Şekil 1A'daki g) pipetle aspire edin.
- Mikroakışkan odasını hücrelerle 37 ° C'de 15-20 dakika ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Üst aksonal kuyuyu 50 μL B27-Nörobazal ortam ile doldurun (Şekil 1A'daki c).
- Kanaldan akışa yardımcı olmak için plakanın arkasına dokunun.
- Soma tarafındaki kuyucukları (Şekil 1A'daki a ve h) her biri 150 μL B27-Nörobazal medya ile doldurun ve üstte bir gerilim balonu oluşturun. Balonun hacmi yaklaşık 20 μL'dir.
NOT: Akışkan izolasyon elde etmek için bir gerilim kabarcığı oluşturmak gerekli değildir, ancak soma tarafındaki daha yüksek hacmin net bir görüntüsünü sağlar. - Aksonal tarafın her iki kuyusunu da (Şekil 1A'daki c ve i) her biri 100 μL B27-Nörobazal medya ile doldurun.
NOT: Mikro oluklar yoluyla aksonal büyümeyi teşvik etmek için, soma tarafındaki kuyucukların akson tarafındaki kuyulardan daha fazla ortam içermesi önerilir. Bununla birlikte, aksonlar tesadüfen hacim farklılıkları olmadan bile mikro oluklar boyunca büyüyeceklerdir. - Mikroakışkan odasını 7-8 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
NOT: Aksonların aksonal kamaraya doğru büyümesi genellikle in vitro (DIV) 5 gününden itibaren gözlemlenebilir. Daha olgun kültürler isteniyorsa daha uzun kültürleme süreleri mümkündür. - Her 2-3 günde bir, ortamı iki üst kuyucuktan (a ve c) çıkararak ve bir gerilim kabarcığı oluşana kadar taze B27-Nörobazal ortam ile değiştirerek nöronları besleyin.
3. Mitokondriyal membran potansiyel hassas boya ile boyama
- DIV 7-8'de, aksonların mikro oluklardan büyüdüğünü ve bir ışık mikroskobunun altındaki aksonal bölmeye uzandığını değerlendirin.
NOT: İstenilen yaşa bağlı olarak farklı DIV aşamaları da mümkündür. - B27-Neurobazal ortamı tüm kuyucuklardan çıkararak ve görüntüleme ortamının yaklaşık 100 μL'sini hem aksonal hem de soma kanallarının (a ve c) üst kuyucuklarına ekleyerek önceden ısıtılmış görüntüleme ortamı (37 ° C) ile iki yıkama gerçekleştirin. Ortamın alt kuyucuklara (h ve i) akmasına izin verin.
- Ortamı alt kuyucuklardan ve üst kuyucuklardaki artık ortamdan çıkarın ve yıkamanın sonunda kuyucukları boş bırakarak taze ortamla tekrarlayın.
NOT: Kanallardaki (d ve f) yüksek kılcal kuvvet nedeniyle, nöronların kurumasını önlemek için kanallarda çıkarılmaması gereken kalan bir yıkama ortamı olacaktır. Herhangi bir fenol kırmızısı içermeyen görüntüleme ortamı burada kullanılabilir, örneğin, Hazırda Bekletme E (bkz. Mikroskop bir CO 2 beslemesi ile kurulmamışsa, görüntüleme ortamının karbonat / CO2'ye (örneğin, HEPES)8'e alternatif bir tamponlama sistemi kullandığından emin olun.
- Ortamı alt kuyucuklardan ve üst kuyucuklardaki artık ortamdan çıkarın ve yıkamanın sonunda kuyucukları boş bırakarak taze ortamla tekrarlayın.
- Görüntüleme ortamında 1 mM tetrametilrodamin etil ester (TMRE, kırmızı, bakınız Malzeme Tablosu) stoğunu 5 nM'ye kadar seyreltin.
NOT: Toksisiteyi önlemek için son seyreltmede %1 DMSO'yu geçmeyin. - Hem somatik hem de aksonal üst kuyucuklara (a ve c) 5 nM TMRE seyreltmenin 100 μL'sini ekleyin ve ortamın tüm kuyucuklarda eşit bir hacim olana kadar hem somatik hem de aksonal bölmelerden akmasına izin verin. TMRE içeren ortamla doldurun.
- Nöronları 25 dakika boyunca kontrollü bir ortam odasına (37 ° C ve% 5 CO2) geri yerleştirin.
- Önceden ısıtılmış görüntüleme ortamı (37 °C) ile daha önce açıklandığı gibi iki yıkama yapın (adım 3.2). Son yıkamada, her bir kuyucukta 100 μL ile doldurun ve somatik kuyucuklarda (a ve c) ortamın bir gerilim kabarcığı oluşturun.
4. Canlı hücre görüntüleme
NOT: Gösterilen durağan görüntüler, dönen disk konfokal mikroskopta, 40x NA 1.25 daldırma hedefi kullanılarak elde edilmiştir (bkz. Kırmızı kanal için 200 ms pozlama süresi ve %10 lazer gücü ve parlak alan için 500 ms pozlama süresi seçildi. Bununla birlikte, TMRE yoğunluğunu incelemek için düzenli konfokal veya geniş alan ters mikroskoplar da kullanılabilir.
- Hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskopla görüntüleyin.
- Mikroskopun, deney boyunca nöronal kültürü 37 ° C'de tutmak için bir sahne inkübatörü ile donatıldığından emin olun.
- Somatik bölmede ilgilendiğiniz bir bölge seçin ve mikro oluklardan aksonal bölmeye kadar takip edin. Görüntülenen mikro olukların somatik ve aksonal bölmelerdekilerle eşleştiğinden emin olun (daha kolay taban çizgisi ve tedavi sonrası karşılaştırma için).
- Kırmızı floresan sinyali için 561 nm'de uyarma ve 625 nm'de emisyon kullanarak floresan görüntüleri yakalayın.
- Görüntüleri edinin.
- Mitokondriyal depolarizasyonu indüklemek için, görüntüleme ortamında aksonal bölmeye 20 μM Antimisin A (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. Soma ve aksonal odalar arasında hacim farkı sağlamak için, somatik tarafta bir gerilim kabarcığının varlığını kontrol edin (hacim >110 μL'ye eşittir).
- Kanal (f) içindeki ortam hariç, aksonal tarafın (i) alt boşluğundan tüm görüntüleme ortamını çıkarın. Üst aksonal kuyucuğa (c) 160 μL 20 μM Antimisin A ekleyin ve her iki aksonal kuyuda eşit bir hacim olana kadar kanaldan akmasına izin verin. Aksonal kuyulardaki hacimler kuyu başına kabaca 80 μL'dir.
NOT: Uygun sıvı basıncını sağlamak için aksonal kuyulardaki hacmin somatik kuyucuklardan daha küçük olduğundan emin olun. En az 10 μL'lik (kuyu hacminin% 10'u) bir fark önerilir, ancak daha yüksek farklılıklar da mümkündür.
- Kanal (f) içindeki ortam hariç, aksonal tarafın (i) alt boşluğundan tüm görüntüleme ortamını çıkarın. Üst aksonal kuyucuğa (c) 160 μL 20 μM Antimisin A ekleyin ve her iki aksonal kuyuda eşit bir hacim olana kadar kanaldan akmasına izin verin. Aksonal kuyulardaki hacimler kuyu başına kabaca 80 μL'dir.
- Nöronları kontrollü çevre odasında (37 ° C) 20-30 dakika boyunca inkübe edin.
- Görüntülemeyi yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın (adım 4.3-4.5). Temel alma sırasında olduğu gibi aynı konumların görüntülendiğinden (mikro oluklar tarafından kolayca tanımlanabildiğinden) emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primer hipokampal nöronlar, mitokondrilerin her iki kanalda da 25 dakika boyunca membrana duyarlı boya (TMRE) ile boyanmasından önce 7-8 gün boyunca mikroakışkan cihazlarda yetiştirildi. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bu, mikroolukların her iki tarafında homojen mitokondri boyanmasına neden oldu, ancak boyamayı mikro olukların ortasına dengelemek için yetersizdi. Aksonal tarafa Antimisin A eklenmesi üzerine, somal mitokondri TMRE sinyalini korudu (Şekil 2B ve Video 1), TMRE floresansı aksonal mitokondriden kayboldu (Şekil 2C ve Video 1). Video, tamamen entegre bir dijital geniş alan mikroskobu kullanılarak yakalanmıştır (bkz.
Şekil 1: Mikroakışkan cihazlar aksonların akışkan izolasyonuna izin verir . (A) Bu çalışmada kullanılan mikroakışkan cihazın şeması. Silikon disk (çap 21 mm) altı delikli bir plakaya kolayca sığar. a) Kuyu soma tarafında, b) Kanalın soma tarafında, c) Akson tarafında kuyu, d) Soma tarafında kanal, e) Mikrooluklar, f) Akson tarafında kanal, g) Kanalın soma tarafında çıkışı, h) Kuyu soma tarafında, i) Akson tarafında iyi. (B) Farklı sıvı seviyelerinin mikrokanallar boyunca nasıl akışkan bir basınç gradyanı oluşturduğunun şematik detaylandırılması. (C) Odanın bir tarafına Tripan mavisi eklenerek akışkan izolasyonun gösterilmesi. Akışkan basınç gradyanı nedeniyle, mavi boyanın mikrokanallar arasında dengelenmediğini unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Aksonların seçici tedavisi aksonal depolarize eder, ancak hücre gövdesi mitokondri değildir. (A) Mikroakışkan cihazlarda TMRE boyamasının etkinliğine genel bir bakış sunan temsili mikrograf. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B-C) Temsili mikrograf, aksonal bölmeye 20 μM Antimisin A (AA) eklenmeden önce ve sonra hücre gövdesinde ve aksonal bölmede aynı alanı gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Antimisin A tedavisinin aksonlar ve hücre cisimlerinde mitokondri üzerine etkisi. Antimisin A eklendikten sonra TMRE floresan kaybının canlı hücre görüntülemesi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol, aksonal mitokondrileri ayrı ayrı tedavi etmek için mikroakışkan bir cihazda ayrışmış hipokampal nöronları tohumlamak ve kültürlemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşımın membrana duyarlı boya TMRE ve kompleks III inhibitörü Antimisin A (daha önce gösterildiği gibi7) ile faydası burada gösterilmiştir, ancak bu yöntem diğer mitokondriyal boyalara veya lokal, mikroskopi tabanlı okumalara izin veren mitokondriyal fonksiyonların genetik olarak kodlanmış sensörlerine kolayca uyarlanabilir9. Diğer nöronal hücre tipleri, birincil kortikal nöronlar10 veya indüklenmiş pluripotent kök hücre (ipSC) kaynaklı motornöronlar11 gibi mikroakışkan odalarda da yetiştirilebilir, bu da bu platformu, ilgilenilen nöronal hücre tipinde nörodejenerasyonda mitokondriyal fonksiyonu incelemek için çok yönlü bir araç haline getirir. Mikroakışkan cihazların montajı, verimli bir sızdırmazlık elde etmek için çok önemlidir ve deneyimli bir araştırmacının montajı gerçekleştirmesini izleyerek en kolay şekilde açıklanmaktadır. Burada açıklanan aşağı akış etiketleme ve arıtma prosedürünün örnek teşkil etmesi amaçlanmıştır ve akışkan basınç gradyanı korunurken ilgili laboratuvarlarda halihazırda oluşturulan protokollere uyacak şekilde ayarlanabilir.
Burada açıklanan tohumlama tekniği, yayınlanmış protokollerden ve üreticinin açıklamasından farklıdır, çünkü monte edilmiş cihazın önerilen yıkamalarını atlarız ve bunun yerine ayrışmış nöronları doğrudan kuru odaya tohumlarız (bölüm 2). Bunun, kanal (e) içindeki nöronların yoğunluğunu arttırdığı ve nöronların mikrokanallardan uzaktaki kuyucuklara yayılmasını sınırladığı için ihtiyaç duyulan nöron sayısını azalttığı gözlenmiştir. Kuru tohumlama, plakanın tabanına dokunarak (adım 2.5), cihazı monte ederken daha önce uygulanan kuvvete bağlı olarak gerekli olabilir veya olmayabilir.
Ancak, bu yordamda bazı sınırlamalar vardır. Montaj sırasında uygulanan kuvvetteki farklılıklar nedeniyle contanın sızdırmazlığında, mikro oluklar boyunca sınırlı büyümeye yol açabilecek bazı değişkenlikler vardır. Ayrıca, kalan nem conta oluşumunu bozabilir ve cihazın altında aksonal büyümeye ve hatta hücre göçüne izin verebilir. Her iki problem de lekelenmeden önce kolayca tespit edilebilir ve bu da hatalı odaların deneyden çıkarılmasına neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (HA 7728/2-1 ve EXC2145 Proje Kimliği 390857198) ve Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well Glass bottom plate | Cellvis | P06.1.5H-N | Silicone device |
| Antimycin A | Sigma | A8674 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| EVOS M5000 widefield microscope | Thermofischer Scientific | EVOS M5000 | fully integrated digital widefield microscope |
| Hibernate E | BrainBits | HE500 | |
| Inverted spinning disk confocal | Nikon | TI2-E + CSU-W1 | With incubator chamber |
| Laminin | Invitrogen | L2020 | |
| Microfluidic devices | XONA microfluidics | RD450 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P2636 | |
| TMRE | Sigma | 87917 |
References
- Murali Mahadevan, H., Hashemiaghdam, A., Ashrafi, G., Harbauer, A. B. Mitochondria in neuronal health: from energy metabolism to Parkinson's disease. Advanced Biology. 5 (9), 2100663 (2021).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39 (6), 889-909 (2003).
- Moratalla, R., et al. Differential vulnerability of primate caudate-putamen and striosome-matrix dopamine systems to the neurotoxic effects of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (9), 3859-3863 (1992).
- Cheng, H. -C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical progression in Parkinson disease and the neurobiology of axons. Annals of Neurology. 67 (6), 715-725 (2010).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Harbauer, A. B., et al. Neuronal mitochondria transport Pink1 mRNA via synaptojanin 2 to support local mitophagy. Neuron. 110 (9), 1516-1531 (2022).
- Ashrafi, G., Schlehe, J. S., LaVoie, M. J., Schwarz, T. L. Mitophagy of damaged mitochondria occurs locally in distal neuronal axons and requires PINK1 and Parkin. Journal of Cell Biology. 206 (5), 655-670 (2014).
- Shipman, C. Evaluation of 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineëthanesulfonic acid (HEPES) as a tissue culture buffer. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 130 (1), 305-310 (1969).
- Harbauer, A. B., Schneider, A., Wohlleber, D. Analysis of mitochondria by single-organelle resolution. Annual Review of Analytical Chemistry. 15, 1-16 (2022).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Altman, T., et al. Axonal TDP-43 condensates drive neuromuscular junction disruption through inhibition of local synthesis of nuclear encoded mitochondrial proteins. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
