Summary
Este es un método comúnmente utilizado para la disección de gónadas de C. elegans seguida de grieta por congelación, que produce muestras de línea germinal para inmunofluorescencia a través de tinción de anticuerpos, o para tinción DAPI simple para visualizar el ADN. Este protocolo ha sido exitoso para los estudiantes universitarios en un laboratorio de investigación y en una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos.
Abstract
La línea germinal de C. elegans es un excelente modelo para estudiar la meiosis, en parte debido a la facilidad de realizar análisis citológicos en animales disecados. Las preparaciones de montaje enteras preservan la estructura de los núcleos meióticos y, lo que es más importante, cada brazo de la gónada contiene todas las etapas de la meiosis, organizadas en una progresión temporal-espacial que facilita la identificación de los núcleos en diferentes etapas. Los hermafroditas adultos tienen dos brazos de gónada, cada uno organizado como un tubo cerrado con células madre de línea germinal proliferantes en el extremo cerrado distal y ovocitos celularizados en el extremo abierto proximal, que se unen en el centro en el útero. La disección libera uno o ambos brazos de la gónada de la cavidad corporal, lo que permite visualizar la totalidad de la meiosis. Aquí, se presenta un protocolo común para la inmunofluorescencia contra una proteína de interés, seguido de la tinción DAPI para marcar todos los cromosomas. Los adultos jóvenes son inmovilizados en levamisol y diseccionados rápidamente usando dos agujas de jeringa. Después de la extrusión de la línea germinal, la muestra se fija antes de someterse a una grieta por congelación en nitrógeno líquido, lo que ayuda a permeabilizar la cutícula y otros tejidos. La muestra puede entonces ser deshidratada en etanol, rehidratada e incubada con anticuerpos primarios y secundarios. DAPI se agrega a la muestra en el medio de montaje, lo que permite una visualización confiable del ADN y facilita la búsqueda de animales para obtener imágenes bajo un microscopio fluorescente. Esta técnica es fácilmente adoptada por aquellos familiarizados con el manejo de C. elegans después de unas horas dedicadas a practicar el método de disección en sí. Este protocolo se ha enseñado a estudiantes de secundaria y estudiantes universitarios que trabajan en un laboratorio de investigación y se ha incorporado a una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos en una universidad de artes liberales.
Introduction
La meiosis es la división celular especializada utilizada para crear gametos (óvulos y espermatozoides/polen) en todos los organismos que se reproducen sexualmente 1,2. La recombinación cruzada es el intercambio recíproco de ADN entre cromosomas homólogos; Es esencial para la meiosis, ya que proporciona una fuente importante de diversidad genética y promueve la estabilidad del genoma a través de generaciones. Los cromosomas que no logran formar al menos un cruce durante la meiosis se segregarán aleatoriamente, lo que puede resultar en la no disyunción cromosómica, creando gametos con el número incorrecto de cromosomas, una condición que generalmente es fatal para la progenie resultante3. Durante la meiosis, los cruces son inducidos por roturas programadas de ADN de doble cadena4. Un subconjunto de estas roturas se reparará como cruces que proporcionan enlaces físicos de ADN, llamados quiasmas, que ayudan a orientar los cromosomas homólogos en preparación para la división celular5. Las etapas meióticas están altamente conservadas en todos los eucariotas, y su conformación cromosómica permite identificarlas fácilmente.
Como concepto fundamental en biología, la meiosis es un tema que los estudiantes encuentran varias veces en diferentes cursos de biología. A menudo se les presenta la mecánica de la segregación cromosómica meiótica en la escuela secundaria, mientras que los cursos de nivel universitario se centran en la biología celular de la segregación y el impacto genético de la recombinación cruzada. Sin embargo, la meiosis es un concepto notoriamente complicado para muchos estudiantes1. La falta de comprensión de la relación entre genes, ADN, cromosomas y meiosis puede generar conceptos erróneos de los estudiantes y lagunas en la comprensión que impiden una comprensión completa de la herencia genética 6,7. Una forma de mejorar la comprensión de los estudiantes de los temas abstractos es proporcionar actividades concretas y prácticas. Por ejemplo, al enseñar meiosis, los instructores pueden elegir entre actividades que emulan el análisis molecular8, modelos 3D que permiten a los estudiantes manipular moléculas9, o juegos de roles donde los propios estudiantes representan la coreografía molecular1. Incorporar la investigación con resultados desconocidos es una forma particularmente efectiva de mejorar la comprensión de los estudiantes. Esta práctica se conoce como una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos (CURE) y tiene el beneficio adicional de fortalecer las actitudes y la agencia de los estudiantes, especialmente para aquellos que pertenecen a grupos que permanecen subrepresentados en STEM10,11. El gusano nematodo Caenorhabditis elegans es particularmente susceptible para estudios en el aula de comportamiento, fertilidad y cruces genéticos, y es un modelo eficaz para introducir a los estudiantes a la investigación biológica12.
C. elegans es un poderoso organismo modelo para la biología celular al combinar la genética molecular con el análisis citológico simple. También es particularmente adecuado para su uso en un aula de biología 13,14,15. Son fáciles y económicos de mantener en un laboratorio, produciendo cientos de descendientes cada 3 días, tanto a temperatura ambiente estándar como a 20 °C, la temperatura de incubación más común. Es importante destacar que pueden congelarse como existencias de glicerol y mantenerse en un congelador de -80 ° C, lo que significa que cualquier error de manejo cometido por investigadores novatos puede corregirse fácilmente16. Además, su genoma bien anotado permite técnicas genéticas directas e inversas17,18, lo que permite que C. elegans se utilice para abordar cuestiones biológicas que van desde lo molecular hasta lo evolutivo. Finalmente, los investigadores de C. elegans han creado una comunidad de apoyo que a menudo está dispuesta a proporcionar ayuda y asesoramiento a los científicos en ciernes19. Estas ventajas han llevado a que C. elegans se incorpore a una serie de CURE en varios tipos de instituciones 12,19,20,21,22,23.
Además de sus beneficios para la investigación y la enseñanza, C. elegans se ha convertido en un modelo popular para los estudios de la meiosis y el desarrollo de la línea germinal24,25,26. La claridad óptica de estos animales simplifica los enfoques citológicos27, y en los adultos, las gónadas representan casi la mitad del animal, proporcionando cientos de células meióticas para estudiar. En las gónadas, los núcleos de la línea germinal meiótica están dispuestos como una línea de ensamblaje (Figura 1); La replicación mitótica ocurre en la punta distal de la gónada, con núcleos que progresan a través de etapas meióticas a medida que migran hacia el extremo proximal de la gónada, donde los embriones fertilizados emergen de la vulva. Debido a que la organización espacial estereotipada también representa una progresión temporal a través de la meiosis, se pueden identificar fácilmente diferentes etapas en función de su organización cromosómica y ubicación en la gónada. Finalmente, los procesos que interrumpen la meiosis y causan aneuploidía crean fenotipos que son fáciles de caracterizar, incluso para los principiantes: esterilidad, letalidad embrionaria o una alta incidencia de hombres (fenotipo Him)28.
Este es un protocolo simple para visualizar cromosomas meióticos en C. elegans. El montaje, la disección, la fijación y la tinción de anticuerpos se realizan en el mismo portaobjetos de microscopio, lo que simplifica el protocolo y permite una recuperación de muestras casi perfecta. Este método funciona para la tinción DAPI simple para visualizar cromosomas y se puede usar para la inmunofluorescencia para visualizar la localización de proteínas en la gónada. Los estudiantes diseccionan gónadas usando microscopios de disección básicos, generan preparaciones de montaje completo para la visualización de ADN o inmunofluorescencia, y las visualizan en un microscopio fluorescente compuesto. Este protocolo ha sido enseñado a estudiantes de secundaria y estudiantes universitarios que trabajan en un laboratorio de investigación de C. elegans e incorporado a un CURE en una universidad de artes liberales12. Aunque el CURE tenía un tamaño de clase relativamente pequeño, este protocolo sería susceptible de clases en una variedad de instituciones debido al costo relativamente bajo de las cepas de gusanos y reactivos. Los instructores solo estarían limitados por el número de microscopios de disección disponibles para su uso. La implementación anterior tenía estudiantes trabajando en grupos de tres para compartir un solo microscopio y tuvo lugar en tres sesiones de 90 minutos: la primera para practicar la disección, la segunda para implementar la disección y la tinción DAPI, y la tercera para obtener imágenes de diapositivas en un microscopio de fluorescencia de campo amplio. La participación en la investigación de pregrado proporciona muchos beneficios para los estudiantes11,29, tanto académicos como personales. La incorporación de la investigación en los cursos a través de CURE permite a los estudiantes participar en la investigación durante el tiempo normal de clase11,30,31, lo que hace que la exposición a estos beneficios sea más accesible y equitativa.
Protocol
1. Cría de C. elegans
NOTA: Ver protocolo de mantenimiento de C. elegans 16 y Elgin et al.32 para más detalles. Las cepas de C. elegans se pueden adquirir fácilmente en el Centro de Genética Caenorhabditis (https://cgc.umn.edu) y se envían por correo regular a cualquier lugar de los Estados Unidos. Cada cepa cuesta $ 10, y cada laboratorio / usuario paga una tarifa anual de $ 30.
- Usando una técnica estéril, prepare placas de agar medio de crecimiento de nematodos de 6 cm (placas de agar NGM).
NOTA: Las placas vertidas se pueden almacenar boca abajo en sus fundas de plástico originales o recipientes herméticos a 4 °C durante varios meses.- Para hacer placas de agar NGM, agregue 3 g de NaCl, 2.5 g de peptona de Bacto, 20 g de agar NGM y ddH2O a 1 L (~ 975 ml). Autoclave del medio mediante un ciclo de líquido que se mantiene a 121 °C durante 20 min. Dejar enfriar a 55 °C, y utilizando la técnica estéril, añadir 1 mL de colesterol, 0,5 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 MMgSO4, y 25 mL de 1 mL de tampón fosfato de potasio (pH 6).
NOTA: Para hacer 1 M tampón fosfato de potasio, mezcle 108.3 g de KH 2 PO 4(monobásico) y 35.6 g de K2HPO4 (dibásico); si es necesario, ajuste el pH a 6 usando KOH. AñadirddH2Ohasta 1 L (normalmente ~900 ml) y autoclave durante 40 min a 121 °C. 1 L de NGM hace aproximadamente 100 placas que contienen 10 ml cada una.
- Para hacer placas de agar NGM, agregue 3 g de NaCl, 2.5 g de peptona de Bacto, 20 g de agar NGM y ddH2O a 1 L (~ 975 ml). Autoclave del medio mediante un ciclo de líquido que se mantiene a 121 °C durante 20 min. Dejar enfriar a 55 °C, y utilizando la técnica estéril, añadir 1 mL de colesterol, 0,5 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 MMgSO4, y 25 mL de 1 mL de tampón fosfato de potasio (pH 6).
- Usando una pipeta serológica o de transferencia, localice las placas con tres gotas de cultivos bacterianos de E. coli OP50 (~ 150 μL). Trate de detectar en el centro de la placa y evite colocar manchas demasiado cerca de los bordes de la placa; Esto desalentará a los animales de arrastrarse por los lados de las placas y desecarse.
- Una vez que el césped bacteriano se seque, guarde las placas manchadas boca abajo a temperatura ambiente (RT) hasta por 2 semanas. Manchar las placas al menos 1-2 días antes de usarlas permitirá que el césped bacteriano crezca más grueso y soporte una mayor densidad de animales.
NOTA: Para preparar cultivos bacterianos OP50, OP50 se puede pedir al Centro de Genética Caenorhabditis. La bacteria OP50 se raya desde una cepa de glicerol en una placa LB para asegurar colonias individuales y se mantiene a 4 ° C durante 4-6 semanas. Los cultivos bacterianos OP50 se cultivan en LB durante la noche a 37 °C desde una sola colonia, sin necesidad de agitación. Para preparar medios LB, añadir 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, 950 mL de ddH2O, ajustar el pH a 7 con 10 N NaOH y ajustar el volumen final a 1 L con ddH2O. Alícuota en cantidades de 100 mL y autoclave durante 20 min a121°C. - Para crear un material de trabajo para cada cepa, elija tres hermafroditas de etapa L4 en una placa NGM manchada. Conservar las placas a 15-25 °C. La condición de cultivo estándar es de 20 °C. Si no se dispone de acceso a incubadoras con temperatura controlada, mantenga los cultivos en la mesa de trabajo en RT.
NOTA: Los hermafroditas en etapa L4 se pueden organizar fácilmente tanto por tamaño (más pequeño que los adultos) como por la presencia de un semicírculo distinto a mitad de camino a través de sus cuerpos (la vulva en desarrollo). A 20 °C, los animales alcanzarán la etapa L4 34-46 h después de la eclosión (que es aproximadamente 40-52 h después de la puesta de los embriones). Ver Corsi et al.14 para más detalles sobre el momento de las etapas de desarrollo.- Cambiar los cultivos a varias temperaturas para controlar la tasa de desarrollo. Los animales crecerán más rápido a temperaturas más altas y más lento a temperaturas más bajas. Comenzarán a volverse estériles a temperaturas superiores a 25 ° C.
NOTA: Algunos genotipos mutantes son sensibles a la temperatura y mostrarán diferentes fenotipos dependiendo de la temperatura de cultivo.
- Cambiar los cultivos a varias temperaturas para controlar la tasa de desarrollo. Los animales crecerán más rápido a temperaturas más altas y más lento a temperaturas más bajas. Comenzarán a volverse estériles a temperaturas superiores a 25 ° C.
- Mantenga las existencias de trabajo recogiendo tres hermafroditas en etapa L4 a una nueva placa NGM manchada cada 4 días. Hacerlo asegurará una población constante y bien alimentada con una amplia gama de etapas de desarrollo.
2. Disección de gónadas
- Recolección de adultos de la misma edad: 12-24 horas antes de la disección, elija hermafroditas en etapa L4 a una nueva placa NGM manchada; estos se convierten en adultos jóvenes al día siguiente, lo cual es ideal para la disección. El número de hermafroditas en estadio L4 dependerá del análisis citológico que se realice; Por lo general, 10-20 hermafroditas se diseccionan por diapositiva, con dos a cuatro diapositivas generadas por condición.
NOTA: Las gónadas se extruyen más eficientemente en animales bien alimentados. Asegúrese de recoger hermafroditas L4 de las existencias de trabajo que no están hambrientas (es decir, que todavía tienen un césped bacteriano visible presente en el plato). Los animales hambrientos tienden a someterse a extrusiones de gónadas incompletas, lo que las hace difíciles de visualizar.- Si se evalúan etapas posteriores de la meiosis, como la diacinesis, diseccionar a los adultos mayores (48 h post-L4) porque acumulan más núcleos en etapa de diacinesis, simplificando el análisis. Sin embargo, los investigadores deben tener en cuenta la posibilidad de que algunos efectos puedan ser causados por la edad materna avanzada.
- Prepárese para la disección.
- Preparar M9: Añadir 3 g de KH 2 PO 4 (monobásico), 6 g deNa2HPO4 (dibásico), 5 g de NaCl, y añadir ddH2O a 100 mL. Autoclave la solución durante 20 min a 121 °C, dejar enfriar y, a continuación, añadir 1 mL de 1 MMgSO4 utilizando la técnica estéril.
- Preparar tampón de disección: Mezclar 1 μL de Tween 20% al 10%, 12 μL de levamisol de 100 mM, 10 μL de 10x M9 y 77 μL deddH2O.
NOTA: La interpolación 20 se incluye en el tampón de disección para reducir la tensión superficial y permeabilizar aún más las membranas tisulares. - Prepare la solución fija (PFA al 2% [100 μL]): Mezcle 12.5 μL de paraformaldehído al 16% (PFA), 10 μL de 10x M9 y 77.5 μL deddH2O; asegúrese de usar una ampolla nueva de PFA (abierta por no más de 2 semanas).
PRECAUCIÓN: El PFA es un producto químico peligroso, y la solución de fijación debe prepararse en la campana extractora. - Configure el método de congelación: el nitrógeno líquido es más fácil de manejar, pero si es necesario, se puede usar un bloque de aluminio sobre hielo seco.
- Método de nitrógeno líquido: coloque un vaso de precipitados de plástico o un frasco de plástico Coplin en una caja de poliestireno. Llene el vaso de precipitados con nitrógeno líquido (el desbordamiento en el recipiente de poliestireno está bien). Coloque las pinzas cerca. Idealmente, el vaso de precipitados debe ser lo suficientemente estrecho como para evitar que los portaobjetos del microscopio caigan completamente horizontales; los portaobjetos deben estar inclinados y ser fáciles de agarrar con pinzas.
NOTA: Es importante utilizar recipientes de plástico cuando se trabaja con nitrógeno líquido en lugar de vidrio para evitar romperse debido al enfriamiento rápido. - Método de hielo seco:
- Coloque un bloque plano de aluminio sobre hielo seco en un recipiente de poliestireno o cubitera rectangular. Es más fácil congelar las diapositivas si la parte superior del bloque se encuentra por encima de la parte superior del contenedor.
- Con guantes, presione suavemente el bloque de aluminio para garantizar un buen contacto con el hielo seco y acelerar el proceso de enfriamiento (puede liberar un chirrido a medida que el metal se enfría rápidamente). Coloque una hoja de afeitar cerca.
- Deje el bloque de aluminio en hielo seco durante al menos 30 minutos antes de detener la congelación-grieta para permitir el enfriamiento completo, que es necesario para una congelación rápida.
NOTA: Idealmente, se deben usar bloques sólidos de hielo seco, lo que ayuda a que la superficie permanezca nivelada. Si es necesario, el bloque de aluminio se puede colocar en gránulos de hielo seco, pero se debe tener cuidado para garantizar que la superficie permanezca nivelada. - La superficie del bloque de aluminio acumulará escarcha, lo que puede evitar el contacto cercano entre los portaobjetos y el bloque. Use la hoja de afeitar para raspar la escarcha de la superficie, despejando un área para cada portaobjetos. Cubrir el recipiente de poliestireno con una tapa ayudará a evitar la acumulación excesiva de escarcha.
- Método de nitrógeno líquido: coloque un vaso de precipitados de plástico o un frasco de plástico Coplin en una caja de poliestireno. Llene el vaso de precipitados con nitrógeno líquido (el desbordamiento en el recipiente de poliestireno está bien). Coloque las pinzas cerca. Idealmente, el vaso de precipitados debe ser lo suficientemente estrecho como para evitar que los portaobjetos del microscopio caigan completamente horizontales; los portaobjetos deben estar inclinados y ser fáciles de agarrar con pinzas.
- Llene un frasco de Coplin con ~ 40 ml de etanol al 95%.
- Llene tres frascos de Coplin con ~ 40 ml de PBS-T.
NOTA: Para hacer PBS-T, mezcle 100 ml de PBS 10x, 5 ml de Triton X-100 y 2 ml de EDTA 0.5 M (pH 8). Añadir 873 ml de ddH2O. Agitar vigorosamente para disolver el Triton X-100. Para hacer 10x PBS, mezcle 25.6 g de Na 2 HPO 4·7H 2 O, 80 g de NaCl, 2 g de KCl y 2 g de KH2PO4. Añadir ddH2O para elevar el volumen hasta 1 L. Autoclave durante 40 min a 121°C. El detergente Triton X-100 se incluye en el tampón de lavado PBS-T para reducir la tensión superficial y mejorar la retención de animales montados enteros en el portaobjetos.
- Diseccionar a los animales en un cubreobjetos de vidrio de 18 mm x 18 mm. Este paso es sensible al tiempo debido a la evaporación del búfer de disección. Debería tomar menos de 5 minutos terminar las disecciones.
NOTA: El levamisol se usa para inmovilizar animales para que sean más fáciles de diseccionar, pero dejarlos en levamisol durante demasiado tiempo resultará en una extrusión de gónada deficiente. Es más fácil reducir el número de animales disecados por diapositiva para que quepa dentro del marco de tiempo de 5 minutos.- Coloque un portaobjetos de sujeción en el escenario de un microscopio de disección: el portaobjetos de sujeción se usa para mover el cubreobjetos más fácilmente y se puede reutilizar indefinidamente (Figura 2A, foto izquierda).
- Coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos de sujeción y la pipeta 4 μL de la solución de disección en el centro del cubreobjetos. Mueva la diapositiva de retención a un lado del escenario para liberar la vista.
- Elija 10-20 hermafroditas en la gota de solución de disección. Elija suficientes animales para obtener imágenes de ~ 10 por diapositiva, pero no tantos que no puedan diseccionarse en 5 minutos.
- Diseccionar a los animales usando dos agujas de jeringa, una para cada mano (Figura 2A).
- Cruce las puntas de las agujas para hacer una forma de X y use la parte inferior de la X para sujetar a un adulto a la superficie del cubreobjetos.
NOTA: Puede tomar práctica descubrir la mejor manera de sostener cada aguja en términos de ángulo y rotación. Comience sosteniendo las agujas con sus biseles (borde inclinado) hacia abajo. Vea la discusión para obtener sugerencias sobre cómo aprender primero a diseccionar en un volumen más grande (Figura 2D). - Coloque la forma de X inmediatamente detrás de la faringe, aproximadamente 1/5 de la longitud del cuerpo de un adulto joven, o justo debajo de la parte clara de la cabeza (Figura 2A, diagrama derecho).
- Decapitar al animal con un movimiento de tijera (como cortar comida con un cuchillo y un tenedor). Una buena extrusión dará como resultado que un brazo de la gónada (o a veces ambos brazos) se libere completamente de la cavidad corporal, junto con una o ambas mitades del intestino (Figura 2B, imagen izquierda). El intestino aparecerá más oscuro y de anchura uniforme, mientras que la gónada aparecerá clara con una punta cónica distal.
- Cada animal solo debe cortarse una vez; Si la gónada no se extruye después de hacer el corte, simplemente pase al siguiente animal. El primer corte reduce significativamente la presión hidrostática en el cuerpo, lo que hace que cualquier corte adicional sea poco probable que resulte en una mejor extrusión. Las extrusiones incompletas o deficientes son fácilmente visibles durante la obtención de imágenes y pueden ignorarse (Figura 2B, imagen derecha).
NOTA: No intente separar la gónada de la carcasa, ya que generalmente desgarrará el tejido y limitará el número de etapas meióticas que se pueden analizar.
- Cada animal solo debe cortarse una vez; Si la gónada no se extruye después de hacer el corte, simplemente pase al siguiente animal. El primer corte reduce significativamente la presión hidrostática en el cuerpo, lo que hace que cualquier corte adicional sea poco probable que resulte en una mejor extrusión. Las extrusiones incompletas o deficientes son fácilmente visibles durante la obtención de imágenes y pueden ignorarse (Figura 2B, imagen derecha).
- Repita la disección para los animales restantes en la hoja de cobertura.
- Cruce las puntas de las agujas para hacer una forma de X y use la parte inferior de la X para sujetar a un adulto a la superficie del cubreobjetos.
- Arregle la muestra con formaldehído.
- Trabajando suavemente, pipete 4 μL de la solución fija en el cubreobjetos muy cerca de la gota con animales. Idealmente, las gotas están lo suficientemente cerca como para fusionarse; Evite el pipeteo directamente en la gota de disección y el desplazamiento de las canales disecadas.
- Fije el cubreobjetos a la corredera de sujeción con un dedo. Con la otra mano, mueva suavemente el cubreobjetos varias veces para mezclar las gotas. La concentración fija final es de 0,8% PFA.
- Sosteniendo una corredera cargada positivamente de frente hacia abajo, úsela para recoger el cubreobjetos en el centro de la diapositiva. Toque suavemente la gota de muestra, y la tensión superficial de la gota recogerá el cubreobjetos.
NOTA: Los portaobjetos cargados positivamente tienen un recubrimiento electrostático que ayuda a los tejidos a adherirse a la superficie para evitar la pérdida de muestras.- Si lo desea, coloque el cubreobjetos en diagonal, de modo que una esquina cuelgue del borde superior o inferior de la corredera 1 mm. Dejar un voladizo hará que sea más fácil romper el cubreobjetos después de la congelación (Figura 2C).
- Coloque el tobogán en el banco y fíjelo durante exactamente 5 minutos en RT. Durante este tiempo, etiquete la diapositiva con un lápiz.
NOTA: Es común sobrefijar las muestras, lo que puede detectarse mediante una exclusión de anticuerpos de los núcleos o incluso de todos los tejidos. Además, algunos anticuerpos son particularmente sensibles al formaldehído. En estos casos, reducir el tiempo de fijación, o disminuir la concentración final de formaldehído utilizado.
- Congelación-grieta
- Inmediatamente después de la corrección, congele las diapositivas.
- Si usa nitrógeno líquido: Sostenga el borde etiquetado del portaobjetos con pinzas y bájelo suavemente en nitrógeno líquido. Suelte la corredera de tal manera que se apoye contra el costado del vaso de precipitados, con el lado de la cubierta hacia arriba. Los portaobjetos se congelan dentro de 10 s (una vez que el líquido deja de hervir).
- Si usa hielo seco: raspe la escarcha de la superficie del bloque de aluminio con una navaja de afeitar. Sostenga firmemente el borde etiquetado de la corredera y colóquelo en la superficie despejada, aplicando algo de presión hacia abajo para garantizar el contacto total con el bloque. El cubreobjetos debe estar completamente en la superficie del bloque. La congelación ocurre dentro de los 10 s y se puede confirmar visualmente a medida que la muestra debajo del cubreobjetos se convierte en hielo.
- Para ambos métodos, deje las diapositivas durante al menos 5 minutos para que se congelen completamente.
NOTA: Una vez congelados, los portaobjetos se pueden dejar en nitrógeno líquido o en el bloque durante 15-20 minutos, siempre y cuando permanezcan congelados. Esto permite que se recojan varias diapositivas en esta etapa antes de continuar con el paso de agrietamiento.
- Trabajando rápidamente, rompa el cubreobjetos de la muestra. Este paso es sensible al tiempo. Retire el cubreobjetos y sumerja el portaobjetos en etanol antes de que la muestra comience a descongelarse.
- Retire el portaobjetos congelado (usando pinzas para nitrógeno líquido).
- Agarre firmemente el borde corto etiquetado de la corredera y apoye un borde largo contra el banco.
- Con la otra mano, agarre firmemente una navaja de afeitar y deslice el borde de la navaja hacia abajo por la diapositiva para mover el cubreobjetos y alejarlo de la muestra. Este paso es ligeramente más fácil si el cubreobjetos se coloca con un voladizo de esquina (Figura 2C).
- Inmediatamente después de la corrección, congele las diapositivas.
- Coloque inmediatamente el portaobjetos en un frasco de Coplin que contenga 95% de etanol en RT. Deje los portaobjetos en etanol durante al menos 5 minutos.
NOTA: Los portaobjetos se pueden dejar en etanol durante un tiempo, lo que permite que se recojan varios portaobjetos en este paso antes de proceder a los lavados. Las diapositivas también se pueden almacenar en este paso durante varios días. Si está almacenado, mueva el frasco de portaobjetos Coplin en etanol a -20 °C. - Lave los portaobjetos en PBS-T tres veces durante 5 minutos cada una en RT. Use PBS-T fresco para cada lavado.
- Si se tinciona con anticuerpos, continúe con el paso 3 (tinción de anticuerpos). Si solo se tiñe con DAPI para visualizar los cromosomas, continúe con el paso 4 (montaje e imagen).
3. Tinción de anticuerpos
- Incubación de anticuerpos primarios
NOTA: Al determinar las condiciones apropiadas para nuevos anticuerpos, es importante incluir los siguientes controles negativos para verificar la especificidad de la señal fluorescente: 1) Un portaobjetos que carece de un anticuerpo primario y tiene un anticuerpo secundario solamente; 2) un portaobjetos con un anticuerpo primario solamente que carece de un anticuerpo secundario. Cada uno de estos controles negativos debe producir una falta total de señal. Si se identifica fluorescencia en el portaobjetos secundario de anticuerpos solos, se debe aumentar la dilución de anticuerpos secundarios o se debe usar un secundario diferente. Si se identifica fluorescencia en el portaobjetos primario de anticuerpos solos, es probable que se deba a la autofluorescencia u otros contaminantes potenciales.- Diluir el anticuerpo primario en tampón de dilución de anticuerpos (50 mg de BSA + 50 μL de azida de sodio al 10% + 10 ml de PBS-T): prepare suficiente dilución de anticuerpos para usar 20-30 μL por portaobjetos.
- Prepare una cámara húmeda: Forre el fondo de un recipiente de plástico con una tapa hermética con toallas de papel húmedas. Coloque una sola capa de pipetas de vidrio Pasteur sobre las toallas de papel. Estas pipetas crean una superficie que permite que los toboganes permanezcan nivelados y los mantiene elevados fuera de las toallas de papel.
NOTA: Para cámaras húmedas, es mejor usar recipientes de plástico para almacenar alimentos con tapas a presión, lo que facilita abrir y cerrar el recipiente sin interrumpir los toboganes en su interior. Busque uno que sea lo suficientemente largo para las pipetas Pasteur, pero que también tenga un fondo relativamente plano sin hendiduras para permitir que las diapositivas descansen completamente horizontales. - Retire la corredera del lavado final de PBS-T. Trabaje rápidamente a partir de este paso adelante para mantener la muestra húmeda en todo momento y evitar la evaporación. Si la muestra se seca, la tinción de anticuerpos se verá afectada negativamente.
- Seque toda la superficie del portaobjetos con un pañuelo de papel doblado en un rectángulo compacto. Limpie la parte delantera y trasera de la diapositiva, pero deje mucho espacio alrededor de la muestra. Tenga especial cuidado al secar la superficie cerca de la muestra, evite acercarse demasiado a la muestra, lo que deja un área del tamaño del cubreobjetos sin secar. Sin embargo, asegúrese de que el perímetro de la muestra esté seco para el siguiente paso.
- Dibuje un círculo alrededor de la muestra con una pluma de PAP hidrófoba. Tenga cuidado de encerrar toda el área de la muestra, pero evite interrumpir los cadáveres de animales visibles en la superficie del portaobjetos. Espere ~5 s para permitir que la barrera se seque completamente.
NOTA: Se necesita una barrera hidrofóbica para contener la solución de anticuerpos primarios porque la superficie del portaobjetos ha sido recubierta con PBS-T, que contiene un detergente. La pluma PAP funciona mejor en una superficie de diapositiva seca, por lo que es importante crear un perímetro seco alrededor de la muestra. Dejar el área más cercana a la muestra sin secar protege la muestra durante este paso. - Trabajando rápidamente, use la esquina o el borde del pañuelo de limpieza doblado para absorber el líquido de la muestra dentro de la barrera hidrofóbica. Tenga cuidado de evitar interrumpir los cadáveres de animales.
- Pipetear inmediatamente 20 μL de la solución de anticuerpos primarios en el anillo creado por la barrera hidrofóbica. Tenga cuidado de pipetear suavemente y en ángulo para evitar que se interrumpan las canales. Evite el pipeteo directamente sobre cualquier canal.
- Incline el portaobjetos suavemente para asegurarse de que toda la superficie dentro de la barrera hidrófoba esté cubierta por la solución.
NOTA: Es mejor si las barreras hidrofóbicas tienen una circunferencia interior de 1-1.5 cm, que está completamente cubierta por 20 μL de la solución de anticuerpos. El ancho de la circunferencia dependerá de cómo se distribuyan las canales durante la etapa de congelación-grieta. Las barreras más amplias pueden requerir un mayor volumen de solución de anticuerpos. Si lo desea, se pueden colocar suavemente pequeños cuadrados de parafilm (cortados al tamaño del cubreobjetos de 18 mm x 18 mm) sobre la muestra. Los cuadrados de parafilm asegurarán que la solución de anticuerpos cubra toda la muestra y también ayudarán a prevenir la evaporación. - Repita los pasos 3.1.3-3.1.8 para el resto de las diapositivas.
- Transfiera cuidadosamente los portaobjetos a la cámara húmeda, asegurándose de que la solución permanezca contenida dentro de la barrera hidrófoba y que los portaobjetos descansen completamente nivelados.
- Incubar los portaobjetos durante la noche en RT. Dependiendo del anticuerpo, este paso podría acortarse a 6 h o realizarse durante la noche a 4 °C manteniendo la cámara húmeda en una cámara frigorífica o en un refrigerador.
NOTA: El uso de una cámara húmeda y barreras hidrofóbicas suele ser suficiente para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos, incluso para incubaciones largas durante la noche. Sin embargo, si la evaporación resulta ser un problema, se pueden colocar pequeños cuadrados de parafilm suavemente sobre cada muestra, lo que ayudará a prevenir la evaporación. Estos se pueden quitar en el primer paso de lavado: sumerja cada portaobjetos en un frasco de Coplin lleno de PBS-T (que no contenga otros portaobjetos) y permita que la película flote lejos de la muestra. Retire el parafilm del frasco de Coplin antes de usar el mismo frasco para quitar el parafilm de la siguiente diapositiva.
- Lave los portaobjetos en frascos Coplin que contengan ~40 ml de PBS-T tres veces durante 5 minutos cada una en RT. Use PBS-T fresco para cada lavado.
- Durante estos lavados, diluya el anticuerpo secundario en tampón de dilución de anticuerpos. Prepare suficiente dilución de anticuerpos para usar 20-30 μL por portaobjetos. Es común usar anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor diluidos a 1:200.
- Incubación secundaria de anticuerpos
- Retire la corredera del lavado final de PBS-T. Trabaje rápidamente a partir de este paso adelante para mantener la muestra húmeda en todo momento y evitar la evaporación.
- Seque el portaobjetos con un pañuelo de papel doblado. Evite secar el área contenida por la barrera hidrófoba.
- Trabajando rápidamente, use la esquina o el borde del pañuelo de limpieza doblado para absorber el líquido de la muestra dentro de la barrera hidrofóbica. Tenga cuidado de evitar interrumpir los cadáveres de los animales.
- Pipetear inmediatamente 20 μL de la solución de anticuerpos secundarios en el anillo creado por la barrera hidrofóbica. Tenga cuidado de pipetear suavemente y en ángulo para evitar interrumpir las canales.
- Evite el pipeteo directamente sobre cualquier canal. Asegúrese de que toda la superficie dentro de la barrera hidrofóbica esté cubierta por la solución. Las circunferencias de barrera más anchas pueden requerir un mayor volumen de solución de anticuerpos. Si lo desea, cubra la muestra con un pequeño cuadrado de parafilm (véase la nota a continuación paso 3.1.8).
- Transfiera cuidadosamente el portaobjetos a la cámara húmeda, asegurándose de que la solución permanezca contenida dentro de la barrera hidrofóbica y que el portaobjetos descanse completamente nivelado. Vuelva a colocar la tapa de la cámara húmeda para mantener la corredera en la oscuridad.
- Repita los pasos 3.3.1-3.3.6 para el resto de las diapositivas.
- Incubar en la oscuridad durante 4 h en RT.
NOTA: Dependiendo del anticuerpo, este paso puede acortarse a 2 h o extenderse a 6 h. Si la cámara húmeda no está oscura, colóquela en un cajón o cúbrala con una caja de cartón. Alternativamente, la cámara húmeda se puede envolver en papel de aluminio para mantener las diapositivas en la oscuridad.
- Lave los portaobjetos en frascos Coplin que contengan ~40 ml de PBS-T tres veces durante 5 minutos cada una en RT. Use PBS-T fresco para cada lavado.
4. Montaje e imágenes
- Prepárese para montar la muestra teniendo a su alcance un medio de montaje + DAPI (2 μg/mL), cubreobjetos de vidrio de 18 mm x 18 mm y esmalte de uñas.
- Retire el portaobjetos del lavado final y séquelo con un pañuelo de papel doblado. Evite secar el área contenida por la barrera hidrófoba.
- Usando la esquina del pañuelo de papel doblado, absorba cuidadosamente el líquido de la muestra dentro de la barrera. Retire la mayor parte del líquido en este paso, pero sin dejar que las canales se sequen por completo.
- Trabajando rápidamente, agregue 8 μL del medio de montaje a la muestra. Pipeta suavemente y en ángulo para evitar que se interrumpan las canales. Evite el pipeteo directamente sobre las canales.
- Aún trabajando rápidamente, baje con cuidado un cubreobjetos de vidrio sobre la muestra.
- Las burbujas de aire pueden alterar las imágenes y provocar la degradación de la muestra. Para minimizar las burbujas de aire, apoye un borde del cubreobjetos en el portaobjetos junto a la muestra, de modo que se mantenga en diagonal sobre la muestra. Puede ayudar apoyar el borde superior del cubreobjetos sobre un lápiz o pinzas. Luego, baje lentamente el borde superior del cubreobjetos, este movimiento permite que el medio de montaje cree un sello líquido que progresa desde un borde hasta el borde opuesto.
- Repita los pasos 4.2-4.5 para el resto de las diapositivas.
- Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas. Tenga cuidado de evitar presionar hacia abajo sobre el cubreobjetos (que aplastará la muestra) o desalojar el cubreobjetos horizontalmente (lo que manchará la muestra).
- Agregue un pequeño punto de esmalte de uñas a cada esquina de un cubreobjetos (~ 1 mm de ancho). Estos ayudarán a mantener el cubreobjetos en su lugar. Deje que los puntos se sequen completamente.
- Cuando las esquinas estén completamente secas, selle los bordes con esmalte de uñas. Asegúrese de que el pulido llene completamente el espacio entre el cubreobjetos y la corredera, pero evite cubrir demasiado la muestra. Es mejor mantener una superposición de 1 mm en el cubreobjetos. Solo use tanto esmalte de uñas como sea necesario. Evite usar demasiado o tener exceso de pulido, que puede tardar mucho tiempo en secarse y corre el riesgo de dañar el objetivo del microscopio.
NOTA: Es preferible usar esmalte de uñas de color en lugar de transparente, lo que facilita ver el límite del sello y ayuda a evitar imágenes de animales que se encuentran debajo del límite del esmalte de uñas. - Deje que el esmalte de uñas se seque completamente antes de la imagen. Este paso es importante, ya que el esmalte de uñas húmedo puede dañar gravemente los objetivos del microscopio.
NOTA: Las diapositivas deben mantenerse en la oscuridad tanto como sea posible de aquí en adelante. Use una caja de cartón plana para cubrirlos mientras se secan en el banco.
- Guarde los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C durante 1-2 semanas antes de la obtención de imágenes. Si es necesario, guarde los portaobjetos a -20 °C durante más tiempo.
- Imagen utilizando microscopía de luz compuesta de fluorescencia estándar.
- Para cada diapositiva, primero, examine toda la muestra a 10x en el canal DAPI para identificar gónadas bien extruidas y anotar su ubicación. Para la mayoría de las aplicaciones, evite obtener imágenes de gónadas cortadas, incompletas o parcialmente cubiertas por otra parte del animal. Para la mayoría de los animales, solo un brazo de gónada estará completamente extruido y visible.
NOTA: Puede ser útil tomar una imagen de menor aumento a 10x de toda la gónada en el canal DAPI para usarla para orientación posterior o identificar la ubicación de núcleos específicos. - Dependiendo de la aplicación, las imágenes se pueden tomar a 40x, 63x o 100x. Si se va a capturar toda la gónada, cree un montaje con límites superpuestos. Al obtener imágenes, recuerde que la gónada es un tubo hueco, con los núcleos más densos en la parte superior e inferior.
- Para cada diapositiva, primero, examine toda la muestra a 10x en el canal DAPI para identificar gónadas bien extruidas y anotar su ubicación. Para la mayoría de las aplicaciones, evite obtener imágenes de gónadas cortadas, incompletas o parcialmente cubiertas por otra parte del animal. Para la mayoría de los animales, solo un brazo de gónada estará completamente extruido y visible.
Representative Results
DAPI se une fuertemente al ADN, y su tinción es robusta incluso en una amplia variedad de condiciones (Figura 3A, B). Debe estar presente en todos los núcleos y, por lo tanto, hace un control positivo efectivo para la presencia de cualquier tejido de gusano en el portaobjetos y la capacidad de detectar fluorescencia en el microscopio. La tinción es efectiva cuando el anticuerpo está presente dentro de los núcleos meióticos (Figura 3A, B). Por ejemplo, la Figura 3A,B muestra núcleos de paquiteno medio teñidos con DAPI y un anticuerpo dirigido a RAD-51, un marcador de roturas de doble cadena. KLE-2 es un componente de la condensina, un complejo proteico altamente conservado que estructura los cromosomas en preparación para la mitosis y la meiosis. Los mutantes kle-2/+ tienen defectos menores en la estructura cromosómica, como lo demuestra la tinción DAPI ligeramente desordenada y un aumento en el número de roturas de doble cadena reflejado en el mayor número de focos de RAD-51 (Figura 3B). Un error común para la inmunofluorescencia es dejar la muestra en la solución fija durante demasiado tiempo. La fijación excesiva puede conducir a una tinción infructuosa porque generalmente evita que los anticuerpos se difundan en los núcleos. Este error se puede identificar cuando el anticuerpo se difunde en las regiones citoplasmáticas de la gónada, pero parece estar excluido de los núcleos.
En la línea germinal (Figura 1), los núcleos proliferan mitóticamente en la punta distal, entran en meiosis durante la zona de transición y progresan a través del paquiteno (que a menudo se divide en tres etapas iguales por varias filas de núcleos) antes de entrar en diploteno y finalmente diacinesis. Los ovocitos en diacinesis se numeran en función de su proximidad a la espermateca, siendo el ovocito -1 el más proximal a la espermateca, el ovocito -2 el siguiente distal, y así sucesivamente. C. elegans tiene seis cromosomas, que se manifiestan como óvalos compactos en los núcleos de diacinesis. Cada uno de estos representa un par homólogo de dos cromátidas hermanas unidas por un quiasma, también llamado bivalente (Figura 3C). Los mutantes, como spo-11, que interrumpen la formación de cruces no formarán quiasmata; por lo tanto, los núcleos de diacinesis tendrán 12 cuerpos DAPI separados (también llamados univalents), uno para cada cromátida hermana (Figura 3D).
Figura 1: Los núcleos de la línea germinal están dispuestos de una manera espacio-temporal que representa su progresión a través de la meiosis . (A) Hermafrodita adulto joven de montaje entero teñido con DAPI. Se delinean las etapas gónada y meiótica, desde la punta distal (asterisco) hasta la región proximal (el ovocito -1, indicado con una flecha), que contiene la espermateca (triángulo). La barra de escala representa 100 μm. (B) Imagen de fluorescencia proyectada de una gónada hermafrodita diseccionada teñida con DAPI. Las etapas meióticas se denotan, con núcleos representativos que se muestran en recuadros (todos los inserciones se muestran a escala entre sí). Los núcleos se pueden estadificar fácilmente en función de su ubicación en la línea germinal y la morfología cromosómica característica, progresando desde la zona mitótica en la punta distal (asterisco), hasta la zona de transición, a través de paquiteno, diploteno y diacinesis. La espermateca está marcada por un triángulo. Esta figura ha sido adaptada de Hillers et al. bajo licencia CC BY 3.028. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Demostración de la configuración de la disección. (A) Etapa del microscopio durante la disección. Los animales se diseccionan en 4 μL de solución de disección en un cubreobjetos colocado en el portaobjetos de sujeción, que se utiliza para mover el cubreobjetos a la vista. El diagrama muestra la colocación ideal de la aguja. Las agujas se sostienen con un borde biselado hacia abajo, cruzado sobre la región faríngea. Las flechas rosadas demuestran un movimiento similar a una tijera para las agujas. La línea discontinua rosa muestra la ubicación ideal del corte. (B) Imágenes de animales disecados, con un ejemplo de una extrusión completa y una extrusión incompleta. Las secciones de gónadas y tripas extruidas están etiquetadas. (C) Imagen que demuestra el paso de congelación-grieta. La corredera debe sostenerse firmemente en una mano, con el lado del cubreobjetos hacia el otro lado del cuerpo. El borde opuesto está apoyado contra el banco. La maquinilla de afeitar debe sostenerse en la otra mano. La flecha rosa indica la dirección del movimiento de la maquinilla de afeitar para mover el cubreobjetos de la corredera, con un ligero giro tal que el cubreobjetos se aleja del cuerpo. Tenga en cuenta que el cubreobjetos se ha colocado de tal manera que una esquina cuelga sobre el borde largo de la corredera. (D) Imagen de la configuración para la práctica de disección en un plato de tinción de embriones de vidrio. Los animales se colocan en 50-200 μL de solución de disección, lo que niega el problema de la evaporación y extiende el tiempo de disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de fluorescencia de núcleos de línea germinal. (A,B) Proyecciones de pila Z de núcleos de paquiteno tardío teñidos con anticuerpos RAD-51 (verde) y DAPI (rojo) en (A) heterocigotos de tipo salvaje y (B) kle-2/+. (C,D) Proyecciones Z-stack de un solo núcleo de diacinesis teñido con DAPI en (C) tipo salvaje (con seis cuerpos de tinción DAPI) y (D) mutantes spo-11 (con 12 cuerpos de tinción DAPI). Las barras de escala representan 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La reproducción sexual requiere la creación de gametos haploides, que se producen a través de la división celular especializada de la meiosis. C. elegans se ha convertido en un modelo popular para el estudio citológico de la meiosis debido a su transparencia óptica, anatomía conveniente de la línea germinal y poderosa genética28. Los experimentos microbianos simples que evalúan la fertilidad y la letalidad embrionaria se pueden combinar con la genética molecular para abordar muchas preguntas en el laboratorio o en el aula. Por ejemplo, debido a que los cruces son esenciales para la segregación cromosómica adecuada, los procesos que interrumpen su formación o resolución generarán gametos aneuploides. A su vez, la aneuploidía conduce a una progenie inviable, que puede evaluarse fácilmente contando la progenie, o mediante el método ligeramente más complicado de determinar la letalidad embrionaria. Citológicamente, la falta de cruces afectará el número de cuerpos de tinción DAPI observados durante la diacinesis. La robustez de la tinción DAPI y la facilidad de puntuación hacen de este un experimento ideal para enseñar técnicas citológicas. La disposición temporal-espacial de los núcleos en la línea germinal hermafrodita proporciona una instantánea de cada etapa de la meiosis en un solo momento en el tiempo. Los núcleos tardan aproximadamente 54 horas en proceder desde el extremo mitótico distal de la línea germinal hasta el extremo proximal (para ejemplos, ver Jaramillo-Lambert et al.33, Stamper et al.34 y Libuda et al.35). Este momento bien establecido del progreso meiótico permite el etiquetado de pulsos o experimentos que dañan el ADN.
Debido a que la tinción DAPI casi siempre funciona, sirve como un control técnico útil para la microscopía de fluorescencia (y puede proporcionar satisfacción para los microscopistas en formación). La tinción de anticuerpos puede ser más variable y es una buena medida de reproducibilidad entre réplicas. Las gónadas de C.elegans pueden ser difíciles de arreglar de manera consistente, ya que este paso requiere un equilibrio entre preservar la estructura cromosómica y al mismo tiempo permitir una difusión suficiente de anticuerpos. La fijación con formaldehído preserva mejor la morfología cromosómica, y la preparación de formaldehído fresco de ampollas de paraformaldehído ha proporcionado los resultados más reproducibles. También es posible utilizar formaldehído preparado a partir de formalina (37% de formaldehído acuoso y metanol). Es posible que sea necesario determinar empíricamente la fuerza de fijación y el momento de cada anticuerpo. Los métodos alternativos implican omitir la fijación de formaldehído en el paso 2.4 y, después de la congelación-crack, la inmersión en etanol al 100% a -20 °C, o la inmersión en metanol al 100% durante 10 minutos seguida de la inmersión en acetona al 100% durante 10 min a -20 °C. Estas condiciones fijas permiten una mejor penetración de anticuerpos, pero afectarán negativamente la morfología del tejido (los cromosomas se verán quemados y más sofocantes).
El tiempo es muy importante para los pasos de disección y corrección descritos en el paso 2. Debido a que el volumen de la solución de disección es tan pequeño, la evaporación puede afectar la concentración de fijación final, lo que causará tinción variable de anticuerpos. Un manejador experimentado de C. elegans puede preparar una diapositiva en menos de 2 minutos desde el principio (paso 2.3) para arreglarla (paso 2.4). El principal obstáculo técnico es la capacidad de recoger animales en la gota de la solución de disección y diseccionarlos rápidamente. Puede ser más fácil aprender a diseccionar en volúmenes más grandes. Los nuevos aprendices comienzan recogiendo animales en 50-200 μL de solución de disección en un plato de tinción de embriones de vidrio (Figura 2D); La superficie más ancha proporciona más espacio para maniobrar al identificar una posición de aguja ideal para buenas extrusiones de gónadas, mientras que el mayor volumen de líquido hace que la evaporación sea un problema menor. Una vez que se sienten cómodos con los movimientos de disección, los aprendices comienzan a diseccionar usando solo 50 μL en el plato, luego cambian a la disección en 20 μL en un portaobjetos. Una vez que diseccionan en portaobjetos, los aprendices pueden comenzar rápidamente a reducir la cantidad de solución hasta que sean lo suficientemente rápidos para trabajar en 4 μL para que la evaporación sea insignificante.
Si el momento de la disección sigue siendo un problema, los alumnos pueden diseccionar 8 μL de la solución de disección durante el paso 2.3. Luego, durante el paso 2.4, pueden agregar 8 μL de la solución fija, pipeteando suavemente para mezclar bien (observando de cerca para asegurarse de que las canales no se interrumpan o pipeteen) y retirando 8 μL de la solución mezclada. Este enfoque alternativo dará como resultado el mismo volumen final de 8 μL y la misma concentración fija final; Este volumen es importante para garantizar que las carcasas entren en contacto tanto con el cubreobjetos como con la superficie de la corredera durante la grieta por congelación en el paso 2.5. Si el momento de preparación de cada portaobjetos sigue siendo un problema incluso en volúmenes de disección más grandes, Gervaise y Arur26 describen un método de suspensión para el protocolo de inmunofluorescencia de la línea germinal.
La principal limitación del uso de la inmunofluorescencia para visualizar proteínas in situ es la disponibilidad de anticuerpos primarios dirigidos a una proteína particular de interés. Sin embargo, si se ha diseñado una versión marcada de la proteína, este protocolo se puede adaptar para visualizar la etiqueta de proteína. Los anticuerpos dirigidos a etiquetas comunes, como FLAG, HA o GFP, están comúnmente disponibles. Las etiquetas fluorescentes como GFP a menudo se pueden apagar mediante pasos de fijación, por lo que se recomienda usar un anticuerpo primario dirigido a GFP, en lugar de confiar en la señal de fluorescencia nativa en sí. Otra limitación de este protocolo es que captura la línea germinal dentro de un solo marco de tiempo (aunque todas las etapas de la ovogénesis estarán representadas dentro de la línea germinal). Por lo tanto, esta técnica puede pasar por alto los cambios dinámicos que pueden ocurrir a medida que un ovocito progresa a través de la ovogénesis. Sin embargo, el momento de la gametogénesis ha sido bien estudiado en C. elegans; En un adulto joven de tipo salvaje, un ovocito tarda aproximadamente 60 h en progresar desde la punta distal de la línea germinal (la zona mitótica) hasta la diacinesia33. Por lo tanto, una persecución de pulso o una intervención específica como la irradiación seguida de un curso temporal permitiría la observación de los efectos en diferentes etapas de la meiosis.
En conclusión, este protocolo describe la disección de gónadas de C. elegans seguida de DAPI y tinción de anticuerpos para microscopía de fluorescencia. La disección y fijación (paso 2) toma 60-90 minutos, dependiendo del número de diapositivas generadas. La tinción de anticuerpos (paso 3) es en su mayoría de manos libres y puede variar de 7 h como mínimo a 1,5 días, dependiendo de los tiempos de incubación de anticuerpos. El montaje (pasos 4.1-4.7) dura unos 15 minutos. Este enfoque general para visualizar los cromosomas de la línea germinal y la gónada se puede utilizar para estudios citológicos de cualquier proteína si existe un anticuerpo o reactivo de etiqueta fluorescente. En su forma más simple, la tinción DAPI de los núcleos de diacinesis se puede utilizar para detectar factores que afectan la recombinación meiótica. Cuando se combina con análisis de organismos del número de descendientes, la incidencia de machos (fenotipo Him) y la letalidad embrionaria, este enfoque citológico proporciona un contrapunto unicelular a los análisis basados en la población.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar. El contenido de este manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores. No representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud o la Fundación Nacional de Ciencias.
Acknowledgments
El trabajo en el laboratorio Lee fue apoyado por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo el número de premio 1R15GM144861 y el Instituto Nacional para el Desarrollo Infantil y Humano bajo el número de premio 1R15HD104115, ambos de los Institutos Nacionales de Salud. DA fue apoyado por el programa UML Kennedy College of Sciences Science Scholars. NW fue apoyado por una beca UML Honors College y una beca UMLSAMP (financiada por la National Science Foundation bajo el número de subvención HRD-1712771). Agradecemos a A. Gartner por el anticuerpo RAD-51. Todas las cepas de C. elegans fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis , que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de adjudicación P40 OD010440.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | Molecular Probes | 711-545-152 | |
| Aluminum heating/cooling block | Millipore Sigma | Z743497 | |
| Bacto Peptone | Gibco | DF0118 17 0 | |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets, Disposable, 5.75 inches | Fisherbrand | 13 678 20B | Used to make worm picks |
| BSA, Bovine Serum Albumin | VWR | 97061 420 | |
| C. elegans wild type (ancestral) | Caenorhabditis Genetics Center | N2 (ancestral) | |
| C. elegans kle-2 (ok1151) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | VC768 | The full genotype of this strain is: kle-2(ok1151) III/hT2 [bli-4(e937) let-?(q782) qIs48] (I;III). It has kle-2 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous kle-2 mutants. |
| C. elegans spo-11 (me44) mutants | Caenorhabditis Genetics Center | TY4342 | The full genotype of this strains is: spo-11(me44) IV / nT1[qIs51] (IV:V). It has spo-11 balanced with a balancer chromosome marked with pharangeal GFP. Pick non-green animals to identify homozygous spo-11 mutants. |
| Calcium Chloride Anhydrous | VWR | 97062 590 | |
| Cholesterol | Sigma Aldrich | 501848300 | |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |
| EDTA, Disodium Dihydrate Salt | Apex Bioresearch Products | 20 147 | |
| Embryo Dish, glass, 30mm cavity | Electron Microscopy Services | 100492-980 | Used to practice dissecting; glass is preferred because dissected animals can stick to plastic |
| Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| Food storage container, plastic | various | n/a | Plastic containers with (1) relatively flat bottoms, to allow slides to rest level; (2) lids that are air-tight, but can still be easily removed without disturbing contents of container, and (3) are about 9 inches long by 6 inches wide are preferred |
| Glass Coplin Jar | DWK Life Sciences Wheaton | 08-813E | |
| Hydrophobic Barrier PAP Pen | ImmEdge | NC9545623 | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 06 666A | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma Aldrich | L0380000 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous | Fisher Chemical | M65 500 | |
| Needles, Single-use, 25 G | BD PrecisionGlide | 14 821 13D | blue, 1 inch |
| NGM Agar, Granulated | Apex Bioresearch Products | 20 249NGM | |
| Parafilm | Bemis | 16 101 | |
| Paraformaldehyde (16% w/v) Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 50 980 487 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline (10x Solution) | Fisher BioReagents | BP399500 | |
| Petri Dishes, 60-mm | Tritech Research | NC9321999 | Non-vented, sharp edge |
| Platinum wire (90% platinum, 10% iridium) | Tritech Research | PT 9010 | Used to make worm picks |
| Potassium Chloride | Fisher | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR BDH Chemicals | BDH9266 500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR BDH Chemicals | BDH9268 500G | |
| Premium Cover Glasses 18 mm x 18 mm | Fisherbrand | 12-548-AP | 0.13–0.17 mm thickness |
| Razor Blades, Single Edge | VWR | 55411 055 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Molecular Probes | S36937 | Alternatives: VectaShield Antifade Mounting Medium (Vector Laboratories, H-1000-10) or ProLong Diamond Antifade (Thermo Fisher Scientific, P36970). If using ProLong Diamond, no nail polish is required for sealing, but slides must cure for 24 hours before imaging. |
| Sodium Azide | Fisher BioReagents | BP922I 500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Sigma Aldrich | 7558 79 4 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate | Sigma Aldrich | S9390 | |
| Styrofoam box | various | n/a | Approximate dimensions of interior: 12 inches long, 9 inches wide, 8 inches deep |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 22 037 246 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 500 | |
| Tryptone | Apex Bioresearch Products | 20 251 | |
| Tween 20 | Fisher Chemical | BP337 500 | |
| Yeast Extract | Apex Bioresearch Products | 20 254 |
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