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Biology

आणविक मॉडलिंग दृष्टिकोण द्वारा कैसपेज़ म्यूटेशन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की खोज

Published: October 13, 2022 doi: 10.3791/64206
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 2
1Belozersky Institute of Physicochemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Medicine, Lomonosov Moscow State University, 3Division of Toxicology, Institute of Environmental Medicine, Karolinska Institute

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज का उपयोग करता है और जंगली प्रकार के कैस्पेस और इसके उत्परिवर्ती रूपों के मॉडलिंग के लिए आणविक गतिशीलता (एमडी) दृष्टिकोण का वर्णन करता है। एमडी विधि कैसपेस संरचना के गतिशील विकास और उत्परिवर्तन या पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के संभावित प्रभाव का आकलन करने की अनुमति देती है।

Abstract

एपोप्टोसिस एक प्रकार का क्रमादेशित कोशिका मृत्यु है जो क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को समाप्त करता है और बहुकोशिकीय जीवों के विकास और ऊतक होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है। कैसपेस, सिस्टीन प्रोटीज का एक परिवार, एपोप्टोसिस दीक्षा और निष्पादन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। कैसपेस की परिपक्वता और उनकी गतिविधि को अत्यधिक गतिशील तरीके से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा ठीक किया जाता है। पोस्ट-ट्रांसलेशनल परिवर्तनों के प्रभाव का आकलन करने के लिए, संभावित साइटों को नियमित रूप से किसी भी संशोधन के लिए लगातार अवशेषों के साथ उत्परिवर्तित किया जाता है। उदाहरण के लिए, सेरीन अवशेषों को एलानिन या एस्पार्टिक एसिड के साथ बदल दिया जाता है। हालांकि, इस तरह के प्रतिस्थापन कैसपेस सक्रिय साइट की रचना को बदल सकते हैं, जिससे उत्प्रेरक गतिविधि और सेलुलर कार्यों में गड़बड़ी हो सकती है। इसके अलावा, महत्वपूर्ण पदों में स्थित अन्य अमीनो एसिड अवशेषों के उत्परिवर्तन भी कैसपेस की संरचना और कार्यों को तोड़ सकते हैं और एपोप्टोसिस गड़बड़ी का कारण बन सकते हैं। उत्परिवर्तित अवशेषों को नियोजित करने की कठिनाइयों से बचने के लिए, कैसपेस संरचना पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के संभावित प्रभाव का अनुमान लगाने के लिए आणविक मॉडलिंग दृष्टिकोण आसानी से लागू किए जा सकते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल प्रोटीन संरचना और कार्य पर उत्परिवर्तन के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज (एम्बर) और सुपर कंप्यूटर सुविधाओं के साथ जंगली-प्रकार के कैस्पेस और इसके उत्परिवर्ती रूपों दोनों के मॉडलिंग की अनुमति देता है।

Introduction

एपोप्टोसिस सबसे व्यापक रूप से अध्ययन की जाने वाली सेलुलर प्रक्रियाओं में से एक है जो बहुकोशिकीय जीवों के मोर्फोजेनेसिस और ऊतक होमियोस्टैसिस को नियंत्रित करता है। एपोप्टोसिस बाहरी या आंतरिक उत्तेजनाओं की एक विस्तृत श्रृंखला द्वारा शुरू किया जा सकता है, जैसे कि मृत्यु रिसेप्टर्स की सक्रियता, कोशिका चक्र संकेतों में गड़बड़ी, डीएनए क्षति, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) तनाव, और विभिन्न जीवाणु और वायरल संक्रमण1। कैसपेस - प्रमुख एपोप्टोटिक खिलाड़ी - को पारंपरिक रूप से दो समूहों में वर्गीकृत किया जाता है: सर्जक (कैस्पेज़ -2, कैसपेज़ -8, कैसपेज़ -9, और कैसपेज़ -10) और प्रभावक (कैसपेज़ -3, कैसपेज़ -6, और कैसपेज़ -7), उनकी डोमेन संरचना और कैसपेज़ कैस्केड 2,3 में जगह के आधार पर। कोशिका मृत्यु संकेतों पर, आरंभकर्ता कैसपेस एडाप्टर अणुओं के साथ बातचीत करते हैं जो एक सक्रिय एंजाइम बनाने के लिए निकटता-प्रेरित डिमराइजेशन और ऑटोप्रोसेसिंग की सुविधा प्रदान करते हैं। प्रभावक कैसपेस को आरंभकर्ता कैसपेज़ द्वारा दरार के माध्यम से सक्रिय किया जाता है और कई सेलुलर सब्सट्रेट्स को छोड़कर डाउनस्ट्रीम निष्पादनचरणों का प्रदर्शन किया जाता है।

आरंभकर्ता और प्रभावक कैसपेस की परिपक्वता और कार्य को बड़ी संख्या में विभिन्न इंट्रासेल्युलर तंत्रों द्वारा विनियमित किया जाता है, जिनमें से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन सेल डेथ मॉड्यूलेशन 5 में एक अनिवार्य भूमिका निभाताहै। संशोधित समूहों (फॉस्फोराइलेशन, नाइट्रोसिलेशन, मिथाइलेशन, या एसिटिलीकरण) या प्रोटीन (सर्वव्यापी या सूमोनाइलेशन) के अलावा कैसपेस की एंजाइमेटिक गतिविधि या प्रोटीन रचना और स्थिरता जो एपोप्टोसिस को नियंत्रित करते हैं। साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस को व्यापक रूप से संभावित पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन साइटों की जांच करने और उनकी भूमिका को समझने के लिए लागू किया जाता है। एक कथित संशोधन साइट को आमतौर पर एक अन्य एमिनो एसिड द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जिसे आगे संशोधित नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, संभावित फॉस्फोराइलेटेड सेरीन और थ्रेओनिन को एलानिन में उत्परिवर्तित किया जाता है, और लाइसिन सर्वव्यापी साइटों को आर्जिनिन के साथ बदल दिया जाता है। एक अन्य रणनीति में एक एमिनो एसिड को प्रतिस्थापित करना शामिल है जो विशेष रूप से पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की नकल करता है (उदाहरण के लिए, ग्लूटामेट और एस्पार्टेट का उपयोग फॉस्फोराइलेटेड सेरीन या थ्रेओनिन की नकल करने के लिए किया गया है) 6। हालांकि, एक सक्रिय साइट के उच्च आसपास के क्षेत्र में या महत्वपूर्ण पदों में स्थित इनमें से कुछ प्रतिस्थापन कैसपेस संरचना को बदल सकते हैं, उत्प्रेरक गतिविधि को परेशान कर सकते हैं, और एपोप्टोटिक सेल मृत्यु को दबासकते हैं। कैसपेज़ जीन में ट्यूमर से जुड़े गलत समझ उत्परिवर्तन के मामलों में इसी तरह के प्रभाव देखे जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, कैसपेज़ -6 - आर 259 एच के ट्यूमर से जुड़े उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप सब्सट्रेट-बाइंडिंग जेब में लूप के विरूपण परिवर्तन हुए, जिससे सब्सट्रेट 8 के कुशल उत्प्रेरक कारोबार को कम कियागया। सिर और गर्दन स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में पहचाने गए कैसपेज़ -8 में जी 325 ए एमिनो एसिड प्रतिस्थापन कैसपेज़ -8 गतिविधि को बाधित कर सकता है, जिसके कारण परमाणु कारक-केबी (एनएफ-केबी) सिग्नलिंग का मॉड्यूलेशन हुआ और ट्यूमरजेनिसिस9 को बढ़ावा मिला।

कैसपेस संरचना और कार्य पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के संभावित प्रभाव का आकलन करने के लिए, आणविक मॉडलिंग लागू की जा सकती है। आणविक गतिशीलता (एमडी) दृष्टिकोण को बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज (एम्बर) का उपयोग करके जंगली-प्रकार के कैसपेज़ और इसके उत्परिवर्ती रूपों के मॉडलिंग के लिए इस काम में वर्णित किया गया है। एमडी विधि उत्परिवर्तन की शुरूआत के बाद प्रोटीन संरचना के गतिशील विकास का एक दृश्य देती है। मूल रूप से पीटर कोलमैन के समूह द्वारा विकसित, एम्बर पैकेज बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन10,11,12,13 के लिए सबसे लोकप्रिय सॉफ्टवेयर टूल में से एक बन गया। इस सॉफ्टवेयर को दो भागों में विभाजित किया गया है: (1) एम्बरटूल्स, सिस्टम तैयारी के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों का एक संग्रह (परमाणु प्रकार असाइनमेंट, हाइड्रोजन और स्पष्ट-पानी के अणुओं को जोड़ना, आदि) और प्रक्षेपवक्र विश्लेषण; और (2) एम्बर, जो पीएमएमडी सिमुलेशन प्रोग्राम के आसपास केंद्रित है। एम्बरटूल्स एक मुफ्त पैकेज है (और एम्बर को स्थापित करने के लिए एक शर्त है), जबकि एम्बर को एक अलग लाइसेंस और शुल्क संरचना के साथ वितरित किया जाता है। सुपर कंप्यूटर पर समानांतर सिमुलेशन और / या ग्राफिक्स प्रोसेसिंग यूनिट (जीपीयू) का उपयोग प्रोटीन संरचना गतिशीलता 14 के वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए प्रदर्शन में काफी सुधार करसकता है। नवीनतम उपलब्ध सॉफ़्टवेयर संस्करण AmberTools21 और Amber20 हैं, लेकिन वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग पूर्व संस्करणों के साथ भी किया जा सकता है।

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Protocol

1. सिस्टम की तैयारी

नोट: देशी और उत्परिवर्ती प्रोटीन रूपों के आणविक मॉडल प्रोटीन डेटा बैंक15,16 से प्राप्त एक उपयुक्त क्रिस्टल संरचना के आधार पर बनाए गए हैं।

  1. चयनित PDB संरचना को पुनर्प्राप्त करने के लिए, डाउनलोड फ़ाइल ड्रॉप-डाउन सूची का उपयोग करें और PDB स्वरूप पर क्लिक करें. टिप्पणियों और कनेक्टिविटी डेटा को निकालें, और पीडीबी फ़ाइल में अलग-अलग प्रोटीन श्रृंखलाओं के बीच एक टीईआर कार्ड डालें। वैकल्पिक रूप से, अवशेष नाम एचआईएस को HIE, HID, या HIP (पूरक फ़ाइल 1) के साथ बदलकर हिस्टिडाइन अवशेषों की प्रोटॉन स्थिति सेट करें।
    नोट: क्रिस्टलोग्राफिक रूप से हल किए गए पानी के अणुओं (यदि पीडीबी फ़ाइल में मौजूद है) को नहीं हटाना उचित है।
  2. प्रारंभिक मॉडल तैयार करने के लिए, tleap प्रोग्राम (AmberTools पैकेज) लॉन्च करें और फिर उन आदेशों को दर्ज करें जो tleap ऑब्जेक्ट्स में हेरफेर करते हैं।
    1. कार्यक्रम शुरू करें: tleap. आणविक यांत्रिकी के साथ प्रोटीन का वर्णन करने के लिए एफएफ 14एसबी बल क्षेत्र लोड करें: > स्रोत leaprc.protein.ff14SB।
    2. पानी के अणुओं और परमाणु आयनों (Na+, Cl-): > स्रोत leaprc.water.tip3p के लिए लोड बल क्षेत्र।
    3. पीडीबी फ़ाइल लोड करें और हाइड्रोजन के लिए निर्देशांक बनाएं, मोल नामक एक वस्तु बनाएं: > मोल = लोडपीडीबी प्रोटीन.pdb।
    4. आंतरिक विसंगतियों की जांच करें जो समस्याएं पैदा कर सकती हैं: > की जांच करें।
      नोट: डाइसल्फ़ाइड पुल, यदि मौजूद हैं, तो मैन्युअल रूप से निर्दिष्ट किया जाना चाहिए। सहसंयोजक रूप से बंधे सिस्टीन के नामों को CYX के साथ बदलें और SG परमाणुओं के बीच एक बंधन बनाने के लिए tleap में निम्नलिखित कमांड टाइप करें: बॉन्ड mol.X.SG mol.Y.SG (X और Y सिस्टीन अवशेष संख्याएं हैं)।
    5. प्रोटीन के चारों ओर एक विलायक बॉक्स बनाएं (टीआईपी 3 पी पानी, 12 ए दूरी): सॉल्वेटबॉक्स मोल टीआईपी 3 पीबॉक्स 12.0 >।
    6. कुल चार्ज की जांच करें: > चार्ज मोल, और सिस्टम को बेअसर करने के लिए काउंटरियन (Na + या Cl-) जोड़ें:
      > जोड़ों में एनए + 0 है।
    7. टोपोलॉजी prmtop फ़ाइल और समन्वय inpcrd फ़ाइल (सिमुलेशन चलाने के लिए इनपुट): saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd >। tleap प्रोग्राम छोड़ दें: > छोड़ दिया।
      नोट: एम्बर-प्रारूप समन्वय फ़ाइलों को आसानी से एएमपीपीडीबी उपकरण का उपयोग करके पीडीबी प्रारूप में परिवर्तित किया जा सकता है (उपयोगकर्ता मैनुअल देखें, सामग्री की तालिका देखें)।

2. ऊर्जा न्यूनीकरण

नोट: शुरुआती प्रणाली में परमाणुओं के बीच किसी भी खराब संपर्क और ओवरलैप को हटाने के लिए ऊर्जा न्यूनीकरण आवश्यक है जो एमडी चलाते समय अस्थिरता का कारण बनता है।

  1. ऊर्जा न्यूनीकरण के पहले चरण (सबसे तेज वंश एल्गोरिथ्म के 2,500 चरण + संयुग्म ढाल एल्गोरिथ्म के 2,500 चरण) को पूरा करें ताकि भारी परमाणुओं पर स्थितिगत अवरोधों द्वारा प्रोटीन निर्देशांक तय करते हुए अतिरिक्त हाइड्रोजन परमाणुओं और पानी के अणुओं की स्थिति को अनुकूलित किया जा सके।
    1. PMEMD प्रोग्राम निम्नानुसार चलाएँ:
      pmemd-O-i min1.in-p protein.prmtop-c protein.inpcrd-o protein_min1.out
      -आर protein_min1.rst-ref protein.inpcrd      .
    2. आवश्यक तर्कों का पालन करें: -i FILE नियंत्रण डेटा; -पी फाइल आणविक टोपोलॉजी, बल क्षेत्र पैरामीटर, परमाणु नाम; -सी फ़ाइल प्रारंभिक निर्देशांक; -ओ फ़ाइल उपयोगकर्ता-पठनीय लॉग आउटपुट; -आर फाइल अंतिम निर्देशांक; -स्थिति संयम के लिए रेफरी फ़ाइल संदर्भ निर्देशांक।
    3. इनपुट फ़ाइल min1.in में विकल्प निर्दिष्ट करें:
      &cntrl
      imin = 1, maxcyc = 5000, ncyc = 2500,
      कट = 10.0, एनटीबी = 1,
      ntc = 1, ntf = 1,
      ntpr = 10,
      ntr = 1,
      संयम मास्क =':1-517 और !@H=',
      restraint_wt = 2.0
      /
      नोट: इनपुट विकल्प: imin = 1 न्यूनतम प्रदर्शन; अधिकतम चक्र = 5000 न्यूनतम चक्रों की अधिकतम संख्या; ncyc = 2500 न्यूनीकरण विधि को ncyc चक्रों के बाद सबसे तेज वंश से संयुग्म ढाल में बदल दिया जाता है; कट = 10.0 गैर-बंधुआ कटऑफ (ओ); एनटीबी = 1 आवधिक सीमाएं लगाई जाती हैं, स्थिर मात्रा; एनटीसी = 1 बॉन्ड लंबाई (बेहतर ऊर्जा अभिसरण के लिए) पर कोई बाधा लागू नहीं की जाती है; एनटीएफ = 1 सभी इंटरैक्शन की गणना की जाती है; ntpr = 10 ऊर्जा जानकारी हर ntpr चरणों में आउट फ़ाइल में मुद्रित की जाती है; हार्मोनिक क्षमता का उपयोग करके निर्दिष्ट परमाणुओं को रोकने के लिए एनटीआर = 1 ध्वज; संयम मास्क =':1-517 और !@H=' संयमित परमाणुओं को निर्दिष्ट करता है; स्थितिगत अवरोधों के लिए restraint_wt = 2.0 वजन (kcal/ mol=A2)।
  2. पूरे सिस्टम को अनुकूलित करने के लिए प्रतिबंध के बिना ऊर्जा न्यूनीकरण के दूसरे चरण (5,000 सबसे तेज अवतरण चरण + 5,000 संयुग्म ढाल चरण) को पूरा करें।
    1. इनपुट के रूप में min2.in और protein_min1.rst का उपयोग करें: pmemd-O-i min2.in-p protein.prmtop
      -सी protein_min1.आर.आर.protein_min2.आउट-आर protein_min2.आर      .
    2. इनपुट फ़ाइल min2.in में विकल्प निर्दिष्ट करें:
      &cntrl
      imin = 1, maxcyc = 10000, ncyc = 5000,
      कट = 10.0, एनटीबी = 1,
      ntc = 1, ntf = 1,
      ntpr = 10
      /

3. हीटिंग

नोट: इस चरण का उद्देश्य सिस्टम को 0 K से 300 K तक गर्म करना है। प्रारंभिक वेग परमाणुओं को सौंपे जाते हैं क्योंकि PDB फ़ाइल पर आधारित प्रारंभिक मॉडल में वेग जानकारी नहीं होती है।

  1. प्रोटीन परमाणुओं (50 पीएस, निरंतर मात्रा) पर स्थितिगत संयम के साथ हीटिंग प्रक्रिया को पूरा करें।
    1. इनपुट के रूप में heat.in और protein_min2.rst का उपयोग करें: pmemd-O-i heat.in-p protein.prmtop
      -c protein_min2.rst-o protein_heat.out
      -r protein_heat.rst-x protein_heat.mdcrd -ref protein_min2.rst
    2. आवश्यक तर्कों का पालन करें: -x FILE निर्देशांक सेट MD प्रक्षेपवक्र पर सहेजे गए।
    3. इनपुट फ़ाइल heat.in में विकल्प निर्दिष्ट करें:
      &cntrl
      imin = 0, irest = 0, ntx = 1,
      nstlim = 25000, dt = 0.002,
      ntc = 2, ntf = 2,
      कट = 10.0, एनटीबी = 1,
      ntpr = 500, ntwx = 500,
      ntt = 3, gamma_ln = 2.0,
      tempi = 0.0, temp0 = 300.0,
      ntr = 1, संयम मास्क =':1-517',
      restraint_wt = 1.0,
      nmropt = 1
      /
      &wt TYPE='TEMP0',
      istep1=0, istep2=25000,
      मान 1 = 0.1, मान 2 = 300.0 /
      &wt प्रकार='अंत' /
      नोट: इनपुट विकल्प: imin = 0 रन MD; irest = 0 एक नया सिमुलेशन चलाएं; ntx = 1 पहली फ़ाइल से कोई प्रारंभिक वेग नहीं पढ़ा जाता है; nstlim = 25000 MD चरणों की संख्या; dt = 0.002 समय चरण (ps); हाइड्रोजन से जुड़े एनटीसी = 2 बॉन्ड शेक एल्गोरिदम का उपयोग करके बाधित होते हैं; विवश बांड के लिए एनटीएफ = 2 बलों की गणना नहीं की जाती है; ntwx = 500 निर्देशांक प्रत्येक ntwx चरणों में mdcrd फ़ाइल में लिखे जाते हैं; ntt = 3 लैंगविन तापमान विनियमन; लैंगविन गतिशीलता (पीएस -1) के लिए gamma_ln = 2.0 टकराव आवृत्ति; टेम्पी = 0.0 प्रारंभिक तापमान; temp0 = 300.0 संदर्भ तापमान; nmropt = 1 पैरामीटर एक &wt नाम सूची में निर्दिष्ट किए गए हैं; TYPE='TEMP0' लक्ष्य तापमान को बदलता है।

4. संतुलन

नोट: यह चरण पानी के घनत्व को समायोजित करने और प्रोटीन की संतुलन स्थिति प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

  1. बिना किसी अवरोध (500 पीएस, निरंतर दबाव) के 300 K पर संतुलन करें।
    1. इनपुट के रूप में equil.in और protein_heat.rst का उपयोग करें: pmemd-O-i equil.in-p protein.prmtop
      -सी protein_heat.rst-o protein_equil.out-r protein_equil.rst-x protein_equil.mdcrd      .
    2. इनपुट फ़ाइल equil.in में विकल्प निर्दिष्ट करें:
      &cntrl
      imin = 0, irest = 1, ntx = 5,
      nstlim = 250000,
      dt = 0.002,
      ntc = 2, ntf = 2,
      कट = 10.0, एनटीबी = 2, एनटीपी = 1, टॉप = 2.0,
      ntpr = 1000, ntwx = 1000, ntwr = 50000,
      ntt = 3, gamma_ln = 2.0,
      temp0=300.0
      /
      नोट: इनपुट विकल्प: irest = 1 सिमुलेशन को पुनरारंभ करें; ntx = 5 निर्देशांक और वेग पहले से उत्पन्न पहली फ़ाइल से पढ़े जाते हैं; ntb = 2 आवधिक सीमाएं लगाई जाती हैं, निरंतर दबाव; एनटीपी = 1 आइसोट्रोपिक दबाव स्केलिंग; टॉप = 2.0 दबाव विश्राम समय (पीएस); ntwr = 50000 हर ntwr चरण, पहली फ़ाइल लिखी जाती है, जिससे दुर्घटना से वसूली सुनिश्चित होती है।

5. उत्पादन गतिशीलता

  1. संतुलन सफलतापूर्वक प्राप्त होने के बाद, निरंतर दबाव पर एक उत्पादन एमडी सिमुलेशन (10 एनएस या उससे अधिक) करें, और प्रोटीन संरचना के बाद के विश्लेषण के लिए प्रक्षेपवक्र फ़ाइल उत्पन्न करें।
    1. इनपुट के रूप में prod.in और protein_equil.rst का उपयोग करें: pmemd-O-i prod.in-p protein.prmtop
      -सी protein_equil.आर.आर.protein_prod.आउट-आर protein_prod.rst-x protein_prod.mdcrd      .
    2. इनपुट फ़ाइल prod.in में विकल्प निर्दिष्ट करें:
      &cntrl
      imin = 0, irest = 1, ntx = 5,
      nstlim = 5000000,
      dt = 0.002,
      ntc = 2, ntf = 2,
      कट = 10.0, एनटीबी = 2, एनटीपी = 1, टॉप = 2.0,
      ntpr = 1000, ntwx = 1000, ntwr = 50000,
      ntt = 3, gamma_ln = 2.0,
      temp0=300.0, ig=-1
      /
      नोट: pmemd (pmemd ) का समानांतर संस्करण। एमपीआई) या जीपीयू-त्वरित संस्करण (pmemd.cuda) का उपयोग कंप्यूटर क्लस्टर और सुपर कंप्यूटर पर किया जा सकता है। एक लंबे एमडी सिमुलेशन को कई खंडों में विभाजित किया जा सकता है और क्रमिक रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है। प्रत्येक सिमुलेशन पुनरारंभ के लिए आईजी = -1 (यादृच्छिक बीज विकल्प) सेट करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। समन्वय प्रक्षेपपथ के विश्लेषण और प्रसंस्करण के लिए प्टराज या सीपीपीपीट्राज कार्यक्रमों का उपयोग किया जा सकता है। अधिक जानकारी के लिए, सॉफ़्टवेयर उपयोगकर्ता मैनुअल देखें।

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Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल को कैस्पेस या रोगजनक उत्परिवर्तन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन के अध्ययन में आसानी से लागू किया जा सकता है। इस खंड में, एमडी मॉडलिंग वर्कफ़्लो को चित्रित किया गया है (चित्रा 1), जिसका सफलतापूर्वक कैसपेज़ -2 7 के अध्ययन में उपयोग किया गयाहै। संभावित फॉस्फोराइलेशन साइटों (सेर / टीएचआर से अला) और जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के इन विट्रो साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस का उपयोग करते हुए, यह प्रदर्शित किया गया था कि सेर 384 एएलए उत्परिवर्तन ने कैसपेज़ -2 प्रसंस्करण को रोका और एंजाइमेटिक गतिविधि और एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु के प्रेरण को अवरुद्ध किया (पूरक चित्रा 1)। हालांकि, न तो मास-स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण और न ही फॉस-टैग तकनीक ने पुष्टि की कि Ser384 फॉस्फोराइलेशन 7 से गुजरताहै। यह समझने के लिए कि Ser384 कैसपेज़ -2 गतिविधि को कैसे नियंत्रित करता है, त्रि-आयामी प्रोटीन संरचना का एमडी मॉडलिंग किया गया था (चित्रा 1)।

कैसपेज़ -2 के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती रूपों के आणविक मॉडल का निर्माण 1प्यो क्रिस्टल संरचना का उपयोग करके किया गया था (उपलब्ध कैसपेज़ -2 संरचनाएं पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं)। Ser384Ala उत्परिवर्ती Ser384 अवशेषों में Oγ परमाणु को हटाकर बनाया गया था (PDB में, Ser और Ala अवशेषों को Oγ परमाणु होने से अलग किया जाता है)। हाइड्रोजन निर्देशांक आमतौर पर क्रिस्टल संरचनाओं में अनुपस्थित होते हैं। इसलिए, हाइड्रोजन परमाणुओं को प्रोटीन संरचना में जोड़ा गया था, और फिर इसे आगे स्पष्ट-विलायक सिमुलेशन को सक्षम करने के लिए टीआईपी 3 पी पानी की 12 ए मोटी परत द्वारा सॉल्व किया गया था। सिस्टम को बेअसर करने के लिए सोडियम आयनों को जोड़ा गया था। कैसपेज़ -2 के प्राप्त शुरुआती मॉडल को एमडी मॉडलिंग प्रोटोकॉल के अनुसार ऊर्जा न्यूनीकरण, संतुलन और बाद में 10 एनएस एमडी सिमुलेशन के अधीन किया गया था, जिसमें min1.in, min2.in, heat.in, equil.in और prod.in नियंत्रण डेटा फ़ाइलों का उपयोग किया गया था।

कैसपेज़ -2 की क्रिस्टल संरचना में, Ser384, Arg219 और Arg378 के साथ, सक्रिय साइट में गुहा की सतह बनाने में शामिल हैं। Arg219 और Arg378 सब्सट्रेट के कार्बोक्सिल समूह के साथ हाइड्रोजन बांड बनाते हैं, जबकि Ser384 सब्सट्रेट के साथ सीधे बातचीत में हस्तक्षेप नहीं करता है। एमडी सिमुलेशन ने पुष्टि की कि Ser384Ala प्रतिस्थापन ने उत्प्रेरक अवशेष Cys320 (न्यूक्लियोफाइल) और His277 (सामान्य आधार) को प्रभावित नहीं किया, लेकिन Arg378 में एक प्रमुख संवहन परिवर्तन को प्रेरित किया। इसका गुआनिडिनियम समूह थोक विलायक की ओर मुड़ गया ताकि एनε परमाणु सब्सट्रेट के कार्बोक्सिल समूह (चित्रा 1) के साथ एक आवश्यक हाइड्रोजन बंधन नहीं बना सके। देशी एंजाइम में, सेर 384 (आंशिक नकारात्मक चार्ज)के ओ γ परमाणु और एआरजी 378 गुआनिडिनियम समूह (सकारात्मक चार्ज) के बीच एक इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन होता है। हालांकि, सेरीन प्रतिस्थापन स्पष्ट रूप से इस बातचीत को बाधित करता है। इस प्रकार, यह दिखाया गया कि Ser384Ala प्रतिस्थापन ने कैस्पेज़ -2 सक्रिय साइट में आर्गिनिन अवशेषों द्वारा सब्सट्रेट मान्यता को प्रभावित किया, जिससे एंजाइमेटिक गतिविधि और एपोप्टोटिक सेल मृत्यु को ट्रिगर करने की क्षमता कम हो गई। खोजा गया तंत्र अन्य कैसपेज़ परिवार के सदस्यों के लिए क्रमिक रूप से संरक्षित और आम लगता है। इस प्रकार, एमडी सिमुलेशन के कार्यान्वयन ने जैव रासायनिक परिणामों की पुष्टि करने और कैसपेस के सक्रिय केंद्र की आणविक संरचना में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति दी।

Figure 1
चित्रा 1: एमडी मॉडलिंग वर्कफ़्लो का उपयोग कैसपेज़ संरचना का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। प्रोटोकॉल अनुभाग में निर्देशों के बाद जंगली प्रकार के कैसपेज़ -2 और इसके Ser384Ala उत्परिवर्ती की जांच की गई। यह पता चला कि Ser384Ala प्रतिस्थापन सक्रिय साइट अवशेष Arg378 में एक महत्वपूर्ण संवहन परिवर्तन को प्रेरित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्र 1: कोशिका मृत्यु में कैसपेज़ -2 का कार्य। बाह्य और आंतरिक उत्तेजनाओं के जवाब में, जंगली प्रकार के कैसपेज़ -2 को एक ऑटोप्रोटियोलिटिक तंत्र द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। सक्रिय कैसपेज़ -2 क्लीवर बिड को छोड़ देता है, जो बदले में, माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली परमेबिलाइजेशन और एपोप्टोटिक कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देता है। Ser384Ala उत्परिवर्तन कैसपेज़ -2 सक्रियण और कोशिका मृत्यु के प्रेरण को रोकता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: प्रोटीन डेटा बैंक में उपलब्ध कैसपेज़ -2 संरचनाएं। संरचनाओं को रिलीज की तारीख से क्रमबद्ध किया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: PDB फ़ाइल संपादित करने में विभिन्न चरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्णित एमडी दृष्टिकोण बायोमोलेक्यूलर सिमुलेशन पैकेज का उपयोग करके कैसपेज़ के जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती दोनों रूपों को मॉडलिंग करने की अनुमति देता है। कार्यप्रणाली के कई महत्वपूर्ण मुद्दों पर यहां चर्चा की गई है। सबसे पहले, प्रोटीन डेटा बैंक से कैसपेज़ की एक प्रतिनिधि क्रिस्टल संरचना का चयन करने की आवश्यकता है। महत्वपूर्ण रूप से, कैसपेज़ के मोनोमेरिक और डिमेरिक दोनों रूप स्वीकार्य हैं। लापता अवशेषों की न्यूनतम संख्या के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं का चयन करना एक अच्छा विचार है। कुछ अवशेषों की प्रोटॉन स्थिति को इनपुट पीडीबी फ़ाइल में मैन्युअल रूप से सेट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्र 1 में, एक हाइड्रोजन परमाणु उत्प्रेरक अवशेषHis277 के N2 परमाणु (HIE रूप) से जुड़ा हुआ था। दूसरा, आगे स्पष्ट-विलायक सिमुलेशन के लिए प्रोटीन के चारों ओर एक विलायक बॉक्स बनाया जाना चाहिए। अतिरिक्त हाइड्रोजन परमाणुओं और पानी के अणुओं के निर्देशांक को अनुकूलित करने के लिए ऊर्जा न्यूनीकरण की आवश्यकता होती है। तीसरा, उत्पादन गतिशीलता सिमुलेशन से पहले हीटिंग और संतुलन किया जाना चाहिए। हीटिंग चरण में, किसी को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि प्रोटीन की सतह पर गुहाओं और बाध्यकारी जेब पानी के अणुओं से भर जाते हैं (यदि आवश्यक हो, तो कोई एमडी चरणों की संख्या बढ़ा सकता है)। संतुलन चरण में, प्रोटीन के संतुलन रचना के अधिग्रहण को प्रारंभिक स्थिति12 से इसकी रीढ़ की हड्डी के परमाणुओं के जड़-माध्य-वर्ग विचलन का विश्लेषण करके पुष्टि करने की आवश्यकता है। चौथा, उत्पादन गतिशीलता सिमुलेशन के दौरान प्रोटीन संरचना के संवहन परिवर्तनों की निगरानी की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, रीढ़ की हड्डी के परमाणुओं को फिट करके शुरुआती संरचना पर प्रक्षेपवक्र फ्रेम को सुपरइम्पोज करना चाहिए और फिर आणविक विज़ुअलाइज़ेशन टूल (वीएमडी, PyMOL, आदि) का उपयोग करके विरूपण परिवर्तनों का विश्लेषण करना चाहिए। 17. यदि आवश्यक हो, तो कोई एमडी चरणों की संख्या बढ़ा सकता है और / या सिमुलेशन को क्रमिक रूप से किए गए कई खंडों में तोड़ सकता है। पांचवां, एमडी सिमुलेशन प्रोग्राम (pmemd.cuda) के जीपीयू-त्वरित संस्करण का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसका प्रदर्शन पारंपरिक सीपीयू कार्यान्वयन14,18 द्वारा प्राप्त करने योग्य से काफी अधिक है।

वर्णित विधि की एक संभावित सीमा प्रोटीन डेटा बैंक में कुछ कैसपेस संरचनाओं की उपलब्धता है। हालांकि, "कैसपेज़" अनुरोध के तहत 900 से अधिक पीडीबी प्रविष्टियां पाई जाती हैं, यह दर्शाता है कि कैसपेज़ संरचनाओं की विस्तार से जांच की गई है। कुछ कठिनाइयां उत्पन्न हो सकती हैं जब एक क्रिस्टल संरचना कम रिज़ॉल्यूशन (यानी, विवरण के मोटे स्तर पर) पर प्राप्त की जाती है या कैसपेज़ फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण कुछ टुकड़ों का अभाव होता है।

सारांश में, एमडी मॉडलिंग दृष्टिकोण उनके जीन, संशोधनों या इंटरमॉलिक्युलर इंटरैक्शन के उत्परिवर्तन के बाद प्रोटीन के संरचनात्मक परिवर्तनों की भविष्यवाणी करने में प्रभावी साबित हुए हैं। कोशिका मृत्यु के क्षेत्र में एमडी सिमुलेशन का अनुप्रयोग पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा कैसपेज़ विनियमन के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए महान अवसर खोलता है। इस संबंध में, दीर्घकालिक एमडी सिमुलेशन कार्यात्मक क्षेत्रों के गतिशील व्यवहार और उत्परिवर्तित या संशोधित कैसपेज़ -2 के साथ-साथ अन्य कैसपेस से जुड़े आणविक कारणों को स्पष्ट करने के लिए अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के संभावित प्रभाव का आकलन कर सकता है। उदाहरण के लिए, सर्जक कैसपेज़ जीन (कैसपेज़ -2 / कैसपेज़ -8 / कैसपेज़ -9 / कैसपेज़ -10) के गलत उत्परिवर्तन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर और केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र19 के ट्यूमर में पाए गए थे। साथ में, कैसपेस का एमडी मॉडलिंग प्रोग्राम्ड सेल डेथ और संबंधित विकारों को विनियमित करने वाले तंत्र को समझने और नए प्रभावी उपचार विकसित करने के लिए सिलिको दृष्टिकोण में एक शक्तिशाली है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को रूसी विज्ञान फाउंडेशन (17-75-20102, प्रोटोकॉल विकास) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग (फॉस्फोराइलेशन का विश्लेषण) में वर्णित प्रयोगों को स्टॉकहोम (181301) और स्वीडिश (190345) कैंसर सोसाइटी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amber20 University of California, San Francisco Software for molecular dynamics simulation
http://ambermd.org
AmberTools21 University of California, San Francisco Software for molecular modeling and analysis
http://ambermd.org

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References

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जीव विज्ञान अंक 188
आणविक मॉडलिंग दृष्टिकोण द्वारा कैसपेज़ म्यूटेशन और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन की खोज
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Nilov, D. K., Zamaraev, A. V.,… More

Nilov, D. K., Zamaraev, A. V., Zhivotovsky, B., Kopeina, G. S. Exploring Caspase Mutations and Post-Translational Modification by Molecular Modeling Approaches. J. Vis. Exp. (188), e64206, doi:10.3791/64206 (2022).

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