Summary
Den nåværende protokollen bruker en biomolekylær simuleringspakke og beskriver molekylærdynamikken (MD) tilnærming for modellering av villtype caspase og dens mutante former. MD-metoden gjør det mulig å vurdere den dynamiske utviklingen av caspasestrukturen og den potensielle effekten av mutasjoner eller posttranslasjonelle modifikasjoner.
Abstract
Apoptose er en type programmert celledød som eliminerer skadede celler og styrer utviklingen og vevshomeostase av multicellulære organismer. Caspases, en familie av cysteinproteaser, spiller en nøkkelrolle i apoptoseinitiering og utførelse. Modningen av caspases og deres aktivitet er finjustert av posttranslasjonelle modifikasjoner på en svært dynamisk måte. For å vurdere effekten av posttranslasjonelle endringer, blir potensielle steder rutinemessig mutert med rester som er vedvarende for eventuelle modifikasjoner. For eksempel erstattes serinresten med alanin eller asparaginsyre. Slike substitusjoner kan imidlertid endre dannelsen av det aktive kaspasestedet, noe som kan føre til forstyrrelser i katalytisk aktivitet og cellulære funksjoner. Videre kan mutasjoner av andre aminosyrerester lokalisert i kritiske posisjoner også bryte strukturen og funksjonene til caspases og føre til apoptoseforstyrrelse. For å unngå vanskelighetene med å bruke muterte rester, kan molekylære modelleringsmetoder lett brukes til å estimere den potensielle effekten av aminosyresubstitusjoner på kaspasestrukturen. Den nåværende protokollen tillater modellering av både villtype-kaspase og dens mutantformer med biomolekylær simuleringspakke (Amber) og superdatamaskinfasiliteter for å teste effekten av mutasjoner på proteinstrukturen og funksjonen.
Introduction
Apoptose er en av de mest studerte cellulære prosessene som regulerer morfogenese og vevhomeostase av multicellulære organismer. Apoptose kan initieres av et bredt spekter av eksterne eller interne stimuli, for eksempel aktivering av dødsreseptorer, forstyrrelse i cellesyklussignalene, DNA-skade, endoplasmatisk retikulum (ER) stress og ulike bakterielle ogvirusinfeksjoner. Caspases - viktige apoptotiske spillere - er konvensjonelt klassifisert i to grupper: initiatorer (caspase-2, caspase-8, caspase-9 og caspase-10) og effektorer (caspase-3, caspase-6 og caspase-7), avhengig av deres domenestruktur og stedet i caspase-kaskaden 2,3. Ved celledødssignaler interagerer initiatorens caspases med adaptermolekyler som letter nærhetsindusert dimerisering og autoprosessering for å danne et aktivt enzym. Effektoren caspases aktiveres gjennom spaltning av initiator caspases og utfører nedstrøms utførelsestrinn ved å spalte flere cellulære substrater4.
Modningen og funksjonen til initiator- og effektor-caspasene reguleres av et stort antall forskjellige intracellulære mekanismer, blant annet den posttranslasjonelle modifikasjonen spiller en uunnværlig rolle i celledødsmodulasjon5. Tilsetningen av modifiserende grupper (fosforylering, nitrosylering, metylering eller acetylering) eller proteiner (ubiquitination eller SUMOylation) endrer den enzymatiske aktiviteten til caspases eller proteinkonformasjonen og stabiliteten som regulerer apoptose. Site-rettet mutagenese er mye brukt for å undersøke potensielle post-translasjonelle modifikasjonssteder og skille deres rolle. Et antatt modifikasjonssted erstattes vanligvis av en annen aminosyre, som ikke kan modifiseres ytterligere. Dermed blir potensielt fosforylert serin og treonin mutert til alanin, og lysin ubiquitination steder er erstattet med arginin. En annen strategi inkluderer å erstatte en aminosyre som spesielt etterligner posttranslasjonell modifikasjon (f.eks. glutamat og aspartat har blitt brukt til å etterligne fosforylert serin eller treonin)6. Noen av disse substitusjonene som befinner seg i nærheten av et aktivt sted eller i kritiske posisjoner, kan imidlertid endre kaspasestrukturen, forstyrre katalytisk aktivitet og undertrykke apoptotisk celledød7. Lignende effekter kan observeres i tilfeller av tumorassosierte missense-mutasjoner i caspase-gener. For eksempel resulterte den tumorassosierte mutasjonen av caspase-6 - R259H - i konformasjonsendringer av sløyfer i den substratbindende lommen, noe som reduserte den effektive katalytiske omsetningen av substrater8. G325A-aminosyresubstitusjonen i caspase-8 identifisert i hode- og nakkeplateepitelkarsinom kunne hemme caspase-8-aktivitet, noe som førte til modulering av nukleær faktor-kB (NF-kB) signalering og fremmet tumorigenese9.
For å vurdere den potensielle effekten av aminosyresubstitusjoner på caspase struktur og funksjon, kan molekylær modellering brukes. Den molekylære dynamikken (MD) tilnærmingen er beskrevet i dette arbeidet for modellering av villtype caspase og dens mutante former ved hjelp av biomolekylær simuleringspakke (Amber). MD-metoden gir et syn på den dynamiske utviklingen av proteinstrukturen etter innføring av mutasjoner. Opprinnelig utviklet av Peter Kollmans gruppe, ble Amber-pakken et av de mest populære programvareverktøyene for biomolekylære simuleringer10,11,12,13. Denne programvaren er delt inn i to deler: (1) AmberTools, en samling av programmer som rutinemessig brukes til systemforberedelse (atomtypeoppgave, tilsetning av hydrogener og eksplisitte vannmolekyler, etc.) og baneanalyse; og (2) Amber, som er sentrert rundt pmemd-simuleringsprogrammet. AmberTools er en gratis pakke (og en forutsetning for å installere Amber selv), mens Amber distribueres med en egen lisens- og avgiftsstruktur. Parallelle simuleringer på en superdatamaskin og/eller ved hjelp av grafikkbehandlingsenheter (GPUer) kan forbedre ytelsen betydelig for vitenskapelig forskning av proteinstrukturdynamikk14. De siste tilgjengelige programvareversjonene er AmberTools21 og Amber20, men de beskrevne protokollene kan også brukes med de tidligere versjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av systemet
MERK: De molekylære modellene av de innfødte og mutante proteinformene er bygget basert på en passende krystallstruktur hentet fra Protein Data Bank15,16.
- For å hente den valgte PDB-strukturen, bruk rullegardinlisten Last ned filer og klikk på PDB-format. Fjern merknader og tilkoblingsdata, og sett inn et TER-kort mellom separate proteinkjeder i PDB-filen. Eventuelt angi protoneringstilstanden til histidinrester ved å erstatte restnavnet HIS med HIE, HID eller HIP (tilleggsfil 1).
MERK: Det er rimelig å ikke fjerne krystallografisk oppløste vannmolekyler (hvis de finnes i PDB-filen). - For å forberede startmodellen, start tleap-programmet (AmberTools-pakken) og skriv deretter inn kommandoer som manipulerer tleap-objekter .
- Start programmet: tleap. Last inn ff14SB-kraftfeltet for å beskrive proteinet med molekylær mekanikk: > kilde leaprc.protein.ff14SB.
- Lastkraftfelt for vannmolekyler og atomioner (Na +, Cl-): > kilde leaprc.water.tip3p.
- Last inn PDB-filen og bygg koordinater for hydrogener, og opprett et objekt som heter mol: > mol = loadpdb protein.pdb.
- Se etter interne uoverensstemmelser som kan forårsake problemer: > sjekk mol.
MERK: Disulfidbroer, hvis de finnes, må spesifiseres manuelt. Erstatt navnene på kovalent bundne cysteiner CYS med CYX og skriv inn følgende kommando i tleap for å skape en binding mellom SG-atomer: binding mol.X.SG mol.Y.SG (X og Y er cysteinresttall). - Lag en løsemiddelboks rundt proteinet (TIP3P vann, 12 Å avstand): > solvatebox mol TIP3PBOX 12.0.
- Kontroller totalladningen: > lading mol, og legg til motioner (Na + eller Cl-) for å nøytralisere systemet:
> tillegg mol Na + 0. - Opprett topologi prmtop-filen og koordinatfilen inpcrd (innganger for å kjøre en simulering): > saveamberparm mol protein.prmtop protein.inpcrd. Avslutt tleap-programmet: > sluttet.
MERK: Koordinatfiler i gult format kan enkelt konverteres til PDB-format ved hjelp av ambpdb-verktøyet (se brukerhåndboken, se materialtabell).
2. Energi minimering
MERK: Energiminimering er nødvendig for å fjerne eventuelle dårlige kontakter og overlappinger mellom atomer i startsystemet som fører til ustabilitet når du kjører MD.
- Utfør den første fasen av energiminimeringen (2,500 trinn av den bratteste nedstigningsalgoritmen + 2,500 trinn i konjugatgradientalgoritmen) for å optimalisere posisjonene til tilsatte hydrogenatomer og vannmolekyler mens du holder proteinkoordinatene festet av posisjonsbegrensninger på tunge atomer.
- Kjør pmemd-programmet som følger:
pmemd -O-i min1.in -p protein.prmtop -c protein.inpcrd -o protein_min1.out
-r protein_min1.rst -ref protein.inpcrd. - Følg de nødvendige argumentene: -i FIL-kontrolldata; -p FILE molekylær topologi, kraftfeltparametere, atomnavn; -c FIL innledende koordinater; -o FILE brukerlesbar loggutgang; -r FIL endelige koordinater; -ref FILREFERANSEKOORDINATER for posisjonsbegrensninger.
- Angi alternativer i inndatafilen min1.in:
&cntrl
imin = 1, maxcyc = 5000, ncyc = 2500,
kutt=10,0, ntb=1,
ntc = 1, ntf = 1,
ntpr=10,
NTR = 1,
restraintmask=':1-517 & !@H=',
restraint_wt=2,0
/
MERK: Inndataalternativer: imin = 1 utfører minimering; maxcyc = 5000 maksimalt antall minimeringssykluser; ncyc = 2500 minimeringsmetode byttes fra bratteste nedstigning til konjugatgradient etter ncyc-sykluser ; cut = 10,0 ikke-bundet cutoff (Å); ntb = 1 periodiske grenser pålegges, konstant volum; NTC = 1 Ingen begrensninger gjelder for bindingslengder (for bedre energikonvergens); ntf = 1 alle interaksjoner beregnes; ntpr = 10 energiinformasjon skrives ut til ut-filen hvert ntpr-trinn ; ntr = 1 flagg for å holde spesifiserte atomer ved hjelp av et harmonisk potensial; restraintmask=':1-517 & !@H=' spesifiserer beherskede atomer; restraint_wt=2,0 vekt (kcal/mol∙Å2) for posisjonsstøtter.
- Kjør pmemd-programmet som følger:
- Utfør den andre fasen av energiminimeringen (5,000 bratteste nedstigningstrinn + 5,000 konjugatgradienttrinn) uten begrensninger for å optimalisere hele systemet.
- Bruk min2.in og protein_min1.rst som innganger: pmemd -O-i min2.in -p protein.prmtop
-c protein_min1.rst -o protein_min2.out -r protein_min2.rst. - Angi alternativer i inndatafilen min2.in:
&cntrl
imin = 1, maxcyc = 10000, ncyc = 5000,
kutt=10,0, ntb=1,
ntc = 1, ntf = 1,
ntpr=10
/
- Bruk min2.in og protein_min1.rst som innganger: pmemd -O-i min2.in -p protein.prmtop
3. Oppvarming
MERK: Dette trinnet tar sikte på å varme systemet fra 0 K til 300 K. Innledende hastigheter er tildelt atomer siden startmodellen basert på PDB-filen ikke inneholder hastighetsinformasjon.
- Utfør oppvarmingsprosessen med posisjonsbegrensninger på proteinatomer (50 ps, konstant volum).
- Bruk heat.in og protein_min2.rst som innganger: pmemd -O-i heat.in -p protein.prmtop
-c protein_min2.rst -o protein_heat.out
-r protein_heat.rst -x protein_heat.mdcrd-ref protein_min2.rst - Følg de nødvendige argumentene: -x FILE-koordinatsett lagret over MD-bane.
- Angi alternativer i inndatafilen heat.in:
&cntrl
imin = 0, irest = 0, ntx = 1,
nstlim=25000, dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
kutt=10,0, ntb=1,
ntpr=500, ntwx=500,
ntt=3, gamma_ln=2,0,
tempi = 0,0, temp0 = 300,0,
ntr=1, tilbakeholdenhetsmaske=':1-517',
restraint_wt=1,0,
nmropt=1
/
&wt TYPE = 'TEMP0',
istep1 = 0, istep2 = 25000,
verdi1=0,1, verdi2=300,0 /
&wt TYPE = 'SLUTT' /
MERK: Inndataalternativer: imin = 0 kjør MD; irest = 0 kjøre en ny simulering; ntx = 1 ingen innledende hastigheter leses fra RST-filen ; nstlim = 25000 antall MD-trinn; dt = 0,002 tidstrinn (ps); ntc = 2 bindinger som involverer hydrogen er begrenset ved hjelp av SHAKE-algoritmen; NTF = 2 krefter for de begrensede bindingene beregnes ikke; ntwx = 500 koordinater skrives til mdcrd-filen hvert ntwx-trinn ; ntt=3 Langevin temperaturregulering; gamma_ln=2,0 kollisjonsfrekvens for Langevin-dynamikk (ps−1); tempi = 0,0 starttemperatur; temp0 = 300,0 referanse temperatur; nmropt=1 parametere angitt i en &wt navneliste leses; TYPE = 'TEMP0' varierer måltemperaturen.
- Bruk heat.in og protein_min2.rst som innganger: pmemd -O-i heat.in -p protein.prmtop
4. Likevekt
NOTAT: Dette stadiet er nødvendig for å justere tettheten av vann og oppnå likevektstilstanden til proteinet.
- Utfør likevekten ved 300 K uten begrensninger (500 ps, konstant trykk).
- Bruk equil.in og protein_heat.rst som innganger: pmemd -O-i equil.in -p protein.prmtop
-c protein_heat.rst -o protein_equil.out -r protein_equil.rst -x protein_equil.mdcrd. - Angi alternativer i inndatafilen equil.in:
&cntrl
imin = 0, irest = 1, ntx = 5,
nstlim = 250000,
dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
kutt = 10,0, ntb = 2, ntp = 1, taup = 2,0,
ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
ntt=3, gamma_ln=2,0,
temp0 = 300,0
/
MERK: Inndataalternativer: irest = 1 start simuleringen på nytt; ntx = 5 koordinater og hastigheter leses fra en tidligere generert rst-fil ; ntb = 2 periodiske grenser pålegges, konstant trykk; NTP = 1 isotropisk trykkskalering; TAUP = 2,0 trykkavslappingstid (PS); ntwr = 50000 hver ntwr trinn, er rst filen skrevet, slik at utvinning fra et krasj.
- Bruk equil.in og protein_heat.rst som innganger: pmemd -O-i equil.in -p protein.prmtop
5. Produksjonsdynamikk
- Etter at likevekt er oppnådd, utfør en produksjon MD-simulering (10 ns eller lenger) ved konstant trykk, og generer banefilen for etterfølgende analyse av proteinstrukturen.
- Bruk prod.in og protein_equil.rst som innganger: pmemd -O-i prod.in -p protein.prmtop
-c protein_equil.rst -o protein_prod.out -r protein_prod.rst -x protein_prod.mdcrd. - Angi alternativer i inndatafilen prod.in:
&cntrl
imin = 0, irest = 1, ntx = 5,
nstlim = 5000000,
dt=0,002,
ntc=2, ntf=2,
kutt = 10,0, ntb = 2, ntp = 1, taup = 2,0,
ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=50000,
ntt=3, gamma_ln=2,0,
temp0=300,0, ig=-1
/
MERK: Den parallelle versjonen av pmemd (pmemd. MPI) eller GPU-akselerert versjon (pmemd.cuda) kan brukes på datamaskinklynger og superdatamaskiner. En lang MD-simulering kan brytes inn i flere segmenter og utføres sekvensielt. Det anbefales på det sterkeste å angi ig=-1 (tilfeldig frøalternativ) for hver omstart av simuleringen. Ptraj - eller cppptraj-programmene kan brukes til analyse og behandling av koordinatbaner. Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se brukerhåndboken for programvaren.
- Bruk prod.in og protein_equil.rst som innganger: pmemd -O-i prod.in -p protein.prmtop
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen kan lett anvendes i studier av posttranslasjonell modifisering av caspases eller patogene mutasjoner. I denne delen er MD-modelleringsarbeidsflyten illustrert (figur 1), som har blitt brukt med hell i studiet av caspase-27. Ved bruk av in vitro stedsrettet mutagenese av potensielle fosforyleringssteder (Ser/Thr til Ala) og biokjemiske tilnærminger ble det vist at Ser384Ala-mutasjonen forhindret caspase-2-prosessering og blokkerte enzymatisk aktivitet og induksjon av apoptotisk celledød (supplerende figur 1). Imidlertid bekreftet verken massespektrometrianalyse eller Phos-Tag-teknologi at Ser384 gjennomgår fosforylering7. For å forstå hvordan Ser384 regulerer caspase-2-aktivitet, ble MD-modellering av den tredimensjonale proteinstrukturen utført (figur 1).
De molekylære modellene av villtype og mutante former av caspase-2 ble konstruert ved hjelp av 1pyo krystallstrukturen (tilgjengelige caspase-2-strukturer er oppført i tilleggstabell 1). Ser384Ala-mutanten ble opprettet ved å fjerneO-γ-atomet i Ser384-resten (i PDB, Ser og Ala-rester utmerker seg ved å haO-γ-atomet ). Hydrogenkoordinater er vanligvis fraværende i krystallstrukturer. Derfor ble hydrogenatomer tilsatt til proteinstrukturen, og deretter ble det oppløst av 12 Å tykt lag med TIP3P-vann for å muliggjøre ytterligere eksplisitte løsningsmiddelsimuleringer. Natriumioner ble tilsatt for å nøytralisere systemet. De oppnådde startmodellene av caspase-2 ble utsatt for energiminimering, likevekt og påfølgende 10 ns MD-simulering i henhold til MD-modelleringsprotokollen, ved bruk av min1.in-, min2.in-, heat.in-, equil.in- og prod.in kontrolldatafiler.
I krystallstrukturen til caspase-2 er Ser384, sammen med Arg219 og Arg378, involvert i å danne hulrommets overflate på det aktive stedet. Arg219 og Arg378 danner hydrogenbindinger med substratets karboksylgruppe, mens Ser384 ikke griper inn i direkte interaksjoner med substratet. MD-simuleringer bekreftet at Ser384Ala-substitusjonen ikke påvirket de katalytiske restene Cys320 (nukleofil) og His277 (generell base), men induserte en stor konformasjonsendring i Arg378. Dens guanidiniumgruppe vendte seg mot bulkløsningsmidlet slik at Nε-atomet ikke kunne danne en essensiell hydrogenbinding med substratets karboksylgruppe (figur 1). I det opprinnelige enzymet oppstår en elektrostatisk interaksjon mellom Oγ atom av Ser384 (delvis negativ ladning) og Arg378 guanidiniumgruppen (positiv ladning). Imidlertid forstyrrer serinsubstitusjonen tilsynelatende denne interaksjonen. Det ble således vist at Ser384Ala-substitusjonen påvirket substratgjenkjenningen av argininrester i det aktive stedet caspase-2, noe som svekket enzymatisk aktivitet og evnen til å utløse apoptotisk celledød. Den oppdagede mekanismen virker evolusjonært bevart og vanlig for andre caspase familiemedlemmer. Dermed tillot implementeringen av MD-simuleringer å bekrefte de biokjemiske resultatene og få ny innsikt i molekylstrukturen til det aktive sentrum av caspases.
Figur 1: MD-modelleringsarbeidsflyt som brukes til å studere caspasestrukturen. Wild-type caspase-2 og dens Ser384Ala mutant ble undersøkt etter instruksjonene i protokollseksjonen. Det ble avslørt at Ser384Ala-substitusjonen induserer en viktig konformasjonsendring i rester av det aktive stedet Arg378. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Funksjon av caspase-2 ved celledød. Som svar på ekstrinsiske og inneboende stimuli kan villtype caspase-2 aktiveres av en autoproteolytisk mekanisme. Aktiv caspase-2 klipper Bid, som igjen fremmer mitokondriell ytre membranpermeabilisering og apoptotisk celledød. Ser384Ala-mutasjonen forhindrer caspase-2-aktivering og induksjon av celledød. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Caspase-2 strukturer tilgjengelig i Protein Data Bank. Strukturene er sortert etter utgivelsesdato. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Ulike trinn i redigering av en PDB-fil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne MD-tilnærmingen gjør det mulig å modellere både villtype og mutante former for caspase ved hjelp av biomolekylære simuleringspakker. Flere viktige spørsmål ved metodikken diskuteres her. Først må en representativ krystallstruktur av caspase velges fra Protein Data Bank. Det er viktig at både monomere og dimeriske former for caspase er akseptable. Å velge høyoppløselige strukturer med et minimum antall manglende rester er en god idé. Protoneringstilstanden til noen rester kan stilles inn manuelt i PDB-filen for inngang. For eksempel, i figur 1, ble et hydrogenatom festet til Nε2-atomet (HIE-form) av den katalytiske resten His277. For det andre må det opprettes en løsningsmiddelboks rundt proteinet for ytterligere eksplisitte løsningsmiddelsimuleringer. Energiminimering er nødvendig for å optimalisere koordinatene til tilsatte hydrogenatomer og vannmolekyler. For det tredje må oppvarming og likevekt utføres før simuleringen av produksjonsdynamikken. På oppvarmingstrinnet bør man sørge for at hulrommene og bindingslommene på proteinoverflaten fylles opp med vannmolekyler (om nødvendig kan man øke antall MD-trinn). På likevektsstadiet må oppkjøpet av likevektskonformasjonen av proteinet bekreftes ved å analysere rot-middelkvadratavviket fra ryggradsatomene fra de opprinnelige posisjonene12. For det fjerde er det nødvendig å overvåke konformasjonsendringene i proteinstrukturen under produksjonsdynamikksimuleringen. For dette formålet bør man legge banerammer på startstrukturen ved å montere ryggradsatomene og deretter analysere konformasjonsendringene ved hjelp av et molekylært visualiseringsverktøy (VMD, PyMOL, etc.) 17. Om nødvendig kan man øke antall MD-trinn og/eller bryte opp simuleringen i flere segmenter utført sekvensielt. For det femte anbefales det å bruke den GPU-akselererte versjonen av MD-simuleringsprogrammet (pmemd.cuda), hvis ytelse betydelig overstiger det som kan oppnås ved den tradisjonelle CPU-implementeringen14,18.
En mulig begrensning av den beskrevne metoden er tilgjengeligheten av visse caspasestrukturer i Protein Data Bank. Imidlertid er mer enn 900 PDB-oppføringer funnet under "caspase" -forespørselen, noe som indikerer at caspasestrukturer har blitt undersøkt i detalj. Noen vanskeligheter kan oppstå når en krystallstruktur oppnås ved lav oppløsning (dvs. på et grovt detaljnivå) eller mangler noen fragmenter som er viktige for caspasefunksjonen.
Oppsummert har MD-modelleringsmetoder vist seg å være effektive for å forutsi strukturelle endringer av proteiner etter mutasjoner av deres gener, modifikasjoner eller intermolekylære interaksjoner. Anvendelsen av MD-simulering innen celledød åpner store muligheter for å studere de molekylære mekanismene for caspaseregulering ved posttranslasjonelle modifikasjoner. I denne forbindelse kan langsiktig MD-simulering vurdere den dynamiske oppførselen til funksjonelle regioner og den potensielle effekten av aminosyresubstitusjoner for å belyse de molekylære årsakene forbundet med mutert eller modifisert caspase-2, så vel som andre caspaser. For eksempel ble missensemutasjoner av initiator caspase gener (caspase-2/caspase-8/caspase-9/caspase-10) påvist i gastrointestinale kreftformer og i svulster i det sentrale og perifere nervesystemet19. Sammen er MD-modellering av caspases en kraftig silico-tilnærming for å forstå mekanismene som regulerer programmert celledød og tilhørende lidelser og for å utvikle nye effektive terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et tilskudd fra Russian Science Foundation (17-75-20102, protokollutviklingen). Eksperimenter beskrevet i den representative resultatdelen (analyse av fosforylering) ble støttet av Stockholm (181301) og svenske (190345) kreftforeninger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amber20 | University of California, San Francisco | Software for molecular dynamics simulation http://ambermd.org |
|
| AmberTools21 | University of California, San Francisco | Software for molecular modeling and analysis http://ambermd.org |
References
- Olsson, M., Zhivotovsky, B. Caspases and cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1441-1449 (2011).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspase: Pharmacological manipulation of cell death. Journal of Clinical Investigation. 115 (10), 2665-2672 (2005).
- Degterev, A., Boyce, M., Yuan, J. A decade of caspases. Oncogene. 22 (53), 8543-8567 (2003).
- Pop, C., Salvesen, G. S. Human caspases: Activation, specificity, and regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (33), 21777-21781 (2009).
- Zamaraev, A. V., Kopeina, G. S., Prokhorova, E. A., Zhivotovsky, B., Lavrik, I. N. Post-translational modification of caspases: The other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology. 27 (5), 322-339 (2017).
- Pearlman, S. M., Serber, Z., Ferrell, J. E. A mechanism for the evolution of phosphorylation sites. Cell. 147 (4), 934-946 (2011).
- Zamaraev, A. V., et al. Requirement for Serine-384 in Caspase-2 processing and activity. Cell Death and Disease. 11 (10), 825 (2020).
- Dagbay, K. B., Hill, M. E., Barrett, E., Hardy, J. A. Tumor-associated mutations in caspase-6 negatively impact catalytic efficiency. Biochemistry. 56 (34), 4568-4577 (2017).
- Ando, M., et al. Cancer-associated missense mutations of caspase-8 activate nuclear factor-κB signaling. Cancer Science. 104 (8), 1002-1008 (2013).
- Case, D. A., et al. AMBER 2020. , University of California, San Francisco. (2020).
- Salomon-Ferrer, R., Case, D. A., Walker, R. C. An overview of the Amber biomolecular simulation package. WIREs Computational Molecular Science. 3 (2), 198-210 (2013).
- Roe, D. R., Cheatham, T. E. PTRAJ and CPPTRAJ: Software for processing and analysis of molecular dynamics trajectory data. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (7), 3084-3095 (2013).
- Maier, J. A., et al. ff14SB: Improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB. Journal of Chemical Theory and Computation. 11 (8), 3696-3713 (2015).
- Salomon-Ferrer, R., Götz, A. W., Poole, D., Le Grand, S., Walker, R. C. Routine microsecond molecular dynamics simulations with AMBER on GPUs. 2. Explicit solvent particle mesh ewald. Journal of Chemical Theory and Computation. 9 (9), 3878-3888 (2013).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Burley, S. K., et al. RCSB Protein Data Bank: Powerful new tools for exploring 3D structures of biological macromolecules for basic and applied research and education in fundamental biology, biomedicine, biotechnology, bioengineering and energy sciences. Nucleic Acids Research. 49, 437-451 (2021).
- Martinez, X., et al. Molecular graphics: Bridging structural biologists and computer scientists. Structure. 27 (11), 1617-1623 (2019).
- Lee, T. S., et al. GPU-accelerated molecular dynamics and free energy methods in Amber18: Performance enhancements and new features. Journal of Chemical Information and Modeling. 58 (10), 2043-2050 (2018).
- Jäger, R., Zwacka, R. M. The enigmatic roles of caspases in tumor development. Cancers. 2 (4), 1952-1979 (2010).
