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Developmental Biology

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

Klassischerweise wurde das Endokard des embryonalen Klappenprimordiums der Maus anhand transversaler, koronaler oder sagittaler Schnitte analysiert. Unser neuartiger Ansatz für die enface, zweidimensionale Bildgebung des Endokards in valvulogenen Regionen ermöglicht eine planare Polaritäts- und Zellumlagerungsanalyse des Endokards während der Klappenentwicklung.

Abstract

Die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Säugetierherzens zugrunde liegen, ist unerlässlich, um angeborene Herzfehler beim Menschen zu behandeln. Die Entwicklung der primitiven Herzklappen beinhaltet den epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) von Endokardzellen aus den Regionen des atrioventrikulären Kanals (AVC) und des Ausflusstrakts (OFT) des Herzens als Reaktion auf lokale induktive myokardiale und endokardiale Signale. Sobald die Zellen delaminieren und in die extrazelluläre Matrix (Herzgelee) eindringen, die sich zwischen dem Endokard und dem Myokard befindet, bilden sich die primitiven endokardialen Kissen (EC). Dieser Prozess impliziert, dass das Endokard die Lücken füllen muss, die von den delaminierten Zellen hinterlassen werden, und sich neu organisieren muss, um entlang einer Achse zu konvergieren (zu verengen) oder sich zu verlängern (zu verlängern). Aktuelle Forschungen haben den planaren Zellpolaritätsweg (PCP) mit der Regulierung der subzellulären Lokalisation der an diesem Prozess beteiligten Faktoren in Verbindung gebracht. Klassischerweise wurden die Anfangsphasen der Herzklappenentwicklung in Querschnitten embryonaler Herzen oder in ex vivo AVC- oder OFT-Explantaten untersucht, die auf Kollagengelen kultiviert wurden. Diese Ansätze erlauben die Analyse der apiko-basalen Polarität, nicht jedoch die Analyse des Zellverhaltens innerhalb der Epithelebene oder der morphologischen Veränderungen wandernder Zellen. Hier zeigen wir einen experimentellen Ansatz, der die Visualisierung des Endokards in valvulogenen Regionen als planares Zellfeld ermöglicht. Dieser experimentelle Ansatz bietet die Möglichkeit, PCP, planare Topologie und interzelluläre Kommunikation innerhalb des Endokards von OFT und AVC während der Klappenentwicklung zu untersuchen. Die Entschlüsselung neuer zellulärer Mechanismen, die an der Morphogenese der Herzklappe beteiligt sind, kann zum Verständnis angeborener Herzfehler beitragen, die mit endokardialen Kissendefekten einhergehen.

Introduction

Das Herz ist das erste funktionsfähige Organ eines Säugetierembryos. Um den embryonalen Tag (E) 7,5 bei Mäusen bilden bilaterale präkardiale Mesodermzellen die Herzsichel in der ventralen Seite1. Die Herzsichel enthält zwei Populationen von Präkardialzellen, die Vorläufer des Myokards und des Endokardsenthalten 2. Um E8.0 verschmelzen die Herzvorläufer in der Mittellinie und bilden die primitive Herzröhre, die aus zwei Epithelgeweben, dem äußeren Myokard und dem inneren Endokard besteht, das ein spezialisiertes Endothel ist, das durch eine extrazelluläre Matrix namens Herzgelee getrennt ist. Später, bei E8,5, erfährt der Herzschlauch eine Rechtsschleife. Das geschlungene Herz hat verschiedene anatomische Regionen mit spezifischen molekularen Signaturen wie den Ausflusstrakt (OFT), die Ventrikel und den atriventrikulären Kanal (AVC)3. Obwohl sich der Herzschlauch zunächst an seiner Zuflussseite durch die Hinzufügung von Zellen4 ausdehnt, führt die intensive Herzproliferation bei E9,5 zu einer Ballonbildung der Kammern und zur Etablierung des trabekulären Netzwerks5. Die Klappenbildung findet in der AVC (zukünftige Mitral- und Trikuspidalklappen) und in der OFT (zukünftige Aorten- und Pulmonalklappen) statt.

Das Endokard spielt eine entscheidende Rolle bei der Klappenentwicklung. Endokardzellen durchlaufen einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) im AVC und OFT, um die endokardialen Kissen zu bilden, eine Struktur, die zu Beginn der Klappenentwicklung auftritt. Verschiedene Signalwege aktivieren diesen Prozess; bei E9,5 bei Mäusen fördert NOTCH, das im Endokard als Reaktion auf myokardial abgeleitetes BMP2 aktiviert wird, die invasive EMT von Endokardzellen in den AVC- und OFT-Regionen durch Aktivierung von TGFβ2 und SNAIL (SNAI1), die die Expression von vaskulärem endothelialem Cadherin (VE-Cadherin), einer Transmembrankomponente von Adherens Junctions (AJs), direkt unterdrückt6,7,8 . Im OFT wird die Aktivierung des Endokards zur Initiierung von EMT durch FGF8 und BMP4 vermittelt, deren Expression durch NOTCH 9,10,11,12 aktiviert wird.

Das Fortschreiten von EMT beinhaltet die zelluläre Dynamik, wenn Zellen ihre Form ändern, Verbindungen mit ihren Nachbarn brechen und neu bilden, delaminieren und beginnen zu wandern13. Diese Veränderungen umfassen AJ-Remodellierung und allmähliche Demontage 14,15, planare Zellpolarität (PCP) -Signalisierung, den Verlust der apiko-basalen Polarität (ABP), apikale Konstriktion und zytoskelettale Organisation 16,17. ABP bezieht sich auf die Verteilung von Proteinen entlang der vorder-hinteren Achse einer Zelle. Im sich entwickelnden Herzen ist eine ABP-Regulation in Kardiomyozyten für die ventrikuläre Entwicklung erforderlich18. PCP bezieht sich auf eine polarisierte Verteilung von Proteinen innerhalb von Zellen über die Ebene eines Gewebes und reguliert die zelluläre Verteilung; Epithelien mit einer stabilen Geometrie bestehen aus sechseckigen Zellen, in denen nur drei Zellen an den Eckpunkten 19,20,21,22 zusammenlaufen. Verschiedene zelluläre Prozesse, wie Zellteilung, Nachbaraustausch oder Delaminierung, die während der epithelialen Morphogenese auftreten, führen zu einer Zunahme der Anzahl der Zellen, die auf einem Scheitelpunkt konvergieren, und der Anzahl der benachbarten Zellen, die eine bestimmte Zelle hat22. Diese zellulären Verhaltensweisen im Zusammenhang mit PCP können durch verschiedene Signalwege, Aktindynamik oder intrazellulären Transport reguliert werden23.

Die Daten, die zur Untersuchung der Klappenentwicklung bei Mäusen generiert wurden, stammen aus transversalen, koronalen oder sagittalen Abschnitten von E8,5- und E9,5-embryonalen Herzen, wobei das Endokard als Zelllinie und nicht als Zellfeld dargestellt wird - das Endokard bedeckt die gesamte innere Oberfläche der Herzröhre24. Embryonale Schnitte erlauben keine Analyse von PCP im Endokard von Mausembryonen. Unsere neuartige experimentelle Methode ermöglicht die Analyse der endokardialen Zellverteilung, der AJ-Anisotropie und der Einzelzellformanalyse, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt. Diese Art von Daten ist für die PCP-Analyse erforderlich, zusammen mit der Beschreibung anderer Moleküle, die mit PCP verwandt sind und in diesem Bericht nicht aufgeführt sind. Die vollständige Immunfluoreszenz, die spezifische Probenvorbereitung und der Einsatz gentechnisch veränderter Mäuse ermöglichen eine planare Polaritätsanalyse im Endokard zu Beginn der Klappenentwicklung bei Mäusen.

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Protocol

Die Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) und von der Autonomen Gemeinschaft Madrid genehmigt (siehe PROEX 155.7/20). Alle Tierverfahren entsprechen der EU-Richtlinie 2010/63EU und der Empfehlung 2007/526/EG zum Schutz von Tieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, die im spanischen Recht unter dem Real Decreto 1201/2005 erlassen wurden.

1. Obtention von AVC und/oder OFTs (adaptiert von Xiao et al. 25)

  1. Stellen Sie am Nachmittag Kreuzungen zwischen weiblichen mTmG und männlichen VE-Cadherin-Cre-ERT/+ auf.
  2. Am nächsten Morgen suchen Sie nach einem Vaginalpfropfen. Wenn es einen Vaginalpfropfen gibt, zählen Sie ihn als einen halben Tag (E0,5). Zählen Sie je nach interessantem Experiment 8 Tage oder 9 Tage.
  3. 24 h vor der Dissektion die schwangere Frau oral mit 50 μL 5 mg/ml 4-OH-Tamoxifen in Maisöl verdünnt.
    HINWEIS: Diese Dosis induziert eine begrenzte Menge an CRE-vermittelter Rekombination, die durch das Vorhandensein von GFP-positiven Klonen nachgewiesen wird. Die geeignete Dosis muss mit jeder neuen Charge von 4-OH-Tamoxifen bestimmt werden.
  4. Opfern Sie die schwangere Frau bei E8,5 oder E9,5 durch zervikale Dislokation.
  5. Öffnen Sie den Bauch der trächtigen Mäuse mit einer Schere und entfernen Sie die Gebärmutter mit den Embryonen mit einer Schere und einer feinen Pinzette.
  6. Legen Sie die Gebärmutter in eine Petrischale, die eiskalte 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1% Tween-20 (PBT) enthält.
  7. Entfernen Sie die einzelnen Deciduae aus der Gebärmutter unter einem Seziermikroskop und mit einer feinen Pinzette.
  8. Machen Sie mit einer feinen Pinzette einen Schnitt in den weißen Teil der Decidua, in dem sich der Embryo befindet, entfernen Sie ihn vorsichtig, vermeiden Sie das Ziehen, und übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem PBT mit einem P1000 mit abgeschnittener Spitze, so dass ein Durchmesser groß genug ist, damit ein Embryo passieren kann, ohne zu brechen.
  9. Für die Genotypisierung nehmen Sie ein kleines Stück des Dottersacks (0,5 mm2) oder ein Stück des Schwanzes (vom hinteren Ende, 5 bis 10 Somiten in Richtung Kopf) und verdauen es in 100 μL geeignetem Puffer.
  10. Unter dem Abzug werden die Embryonen in eiskaltes 4% Paraformaldehyd (4% PFA) in sterilfiltriertem PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen (2 ml) bei 4 °C überführt. Die Embryonen werden von 2 h bis Nacht (O/N) bei 4 °C auf einem Nutator fixiert.
  11. Entfernen Sie unter dem Abzug das 4% PFA-Fixiermittel aus den Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Embryonen zu berühren. Entsorgen Sie die PFA in einem geeigneten Behälter.
  12. Waschen Sie die Embryonen 5x in kaltem PBT für jeweils 10 min bei Raumtemperatur (RT).
  13. Entfernen Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und übertragen Sie es in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit frischem PBT.

2. Immunfluoreszenz des embryonalen Herzens der Maus

  1. Ersetzen Sie PBT durch PBSTr (0,4% Triton X-100 in PBS) und waschen Sie die Proben jeweils 3x, 5 min, bei RT auf einem Orbitalschüttler.
  2. Ersetzen Sie PBSTr durch eine Blocklösung (PBSTr mit 10% hitzeinaktiviertem Rinderserum). Inkubieren von 2 h bis O/N bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler.
  3. Ersetzen Sie die Blockierlösung durch eine Blocklösung, die einen primären Antikörper in der gewünschten Konzentration enthält (für Anti-GFP- oder Anti-VE-Cadherin-Antikörper verwenden Sie eine Verdünnung von 1:1000). O/N auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C inkubieren.
  4. Nach O/N-Inkubation bei 4 °C 1,5 h bei RT auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
  5. Entfernen und lagern Sie die primäre Antikörperlösung bei 4 °C für bis zu drei zukünftige Experimente (Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% für beste Konservierung).
  6. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBSTr für jeweils 3 Minuten.
  7. Die Embryonen mit PBSTr 3x jeweils 30 min auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C waschen.
  8. Nach dem letzten Waschgang 1 ml Blockierlösung mit 1:1000 fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörpern gegen die primäre Antikörperwirtsspezies hinzufügen. Der Lösung werden auch 1:3000 DAPI hinzugefügt und die Embryonen O/N auf einem Orbitalschüttler bei 4 °C inkubiert.
  9. Nach O/N-Inkubation bei 4 °C 1,5 h bei RT auf einem Orbitalschüttler inkubieren. Dieser Schritt ist sehr wichtig, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
  10. Waschen Sie die Embryonen 3x mit PBSTr für jeweils 3 Minuten.
  11. Waschen Sie die Embryonen mit PBSTr 3x-5x für jeweils 30 min auf einem Orbitalshaker bei RT.

3. Montage der embryonalen AVC oder OFTs der Maus

  1. Legen Sie die Herzen auf eine Petrischale (35 mm), die PBS enthält.
  2. Isolieren Sie den AVC oder den OFT mit einem Wolframdraht und einer feinen Pinzette und schneiden Sie sie längs26.
  3. Bereiten Sie Deckgläser (22 mm x 22 mm), Objektträger (60 mm x 24 mm), Pinzetten, eine P200-Pipette mit den entsprechenden Spitzen, ein Papiertuch und alle wässrigen Montagemedien auf Glycerinbasis für die Fluoreszenz ohne DAPI vor.
  4. Mit einem ähnlichen Ansatz wie in Xiao, C. et al.25, kleben Sie zwei Streifen Klebeband auf einen Objektträger, getrennt durch 0,3-0,6 cm, um einen 3D-Raumraum zu schaffen, der es den Proben ermöglicht, ihre ursprüngliche Form zu erhalten, ohne sie zu zerquetschen.
  5. Lassen Sie die Proben vorsichtig und mit dem minimalen Puffervolumen mit einer geschnittenen P200-Pipette auf den Objektträger zwischen den Bandstreifen fallen. Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um die Genauigkeit zu erhöhen.
  6. Legen Sie die Proben mit einer feinen Pinzette mit dem Endokard nach oben (Myokard nach unten auf dem Objektträger).
  7. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Papiertuch (vermeiden Sie es, die Probe zu berühren), und trocknen Sie dann die Proben für 1-2 Minuten bei RT, damit die Proben am Objektträger haften.
  8. Fügen Sie 40 μL wässrige Montagemedien auf das Gewebe auf.
  9. Legen Sie das Deckglas über die beiden Klebebandstücke und senken Sie es langsam mit einer Nadel oder Pinzette auf das Gewebe. Vermeiden Sie es, Luftblasen zu erzeugen.
  10. Versiegeln Sie das Deckglas mit einem Tropfen Nagellack auf jedem Scheitelpunkt des Deckglases.
  11. Sobald der Nagellack trocken ist, reinigen Sie die überschüssigen Montagemedien von den Seiten des Deckglases mit einem saugfähigen Papiertuch. Vermeiden Sie es, das Deckglas zu bewegen.
  12. Fügen Sie Nagellack entlang der Deckglaskanten hinzu, um sie vollständig abzudichten und die Verdunstung der Montagemedien zu verhindern.
  13. Nehmen Sie mit einem aufrechten oder einem inversen konfokalen Mikroskop Bilder mit 10x für die Gesamtansicht und mit 63x mit 3x Zoom für detaillierte Bilder auf.

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Representative Results

Die mit diesem Protokoll generierten Daten zeigen, dass es möglich ist, eine Gesichtsbildgebung des Endokards des AVC durchzuführen. Das erste Ziel war es, die Zellform des Endokards während der Bildung der Klappen mit zellulärer Auflösung zu analysieren (Abbildung 1). Um einzelne Endokardzellen bei E9.5 hervorzuheben, verwendeten wir zwei transgene Mausstämme. (1) ROSAmT/mG ist ein zweifarbiges fluoreszierendes Cre-Reporter-Allel (tdTomato/mT und EGFP/mG), dessen Fluoreszenz an der Zellmembran detektiert wird. Ohne Cre-vermittelte Aktivierung exprimiert das Transgen tdTomato (mT). Bei Cre-vermittelter Aktivierung wird die tdTomato-Expression durch EGFP-Fluoreszenzexpression (mG) in spezifischen Zellen und klonalen Derivaten ersetzt27. (2) Die Cdh5CreERT2/+ Mauslinie exprimiert Tamoxifen-induzierbare CRE-Rekombinase (CreERT2) unter der Regulation des vaskulären endothelialen Cadherin-Promotors (Cdh5), der im vaskulären Endothel und Endokard in den embryonalen Stadienexprimiert wird 28. Wir kreuzten ein Männchen und ein Weibchen jedes Genotyps, um Embryonen zu erhalten, die die beiden Transgene tragen, um die Expression von GFP in einzelnen Zellen des Endokards zu aktivieren. Um dies zu erreichen, impften wir niedrige Dosierungen von Tamoxifen, um die CRE-Expression in einer reduzierten Anzahl von Zellen zu aktivieren. Infolgedessen exprimierten einzelne Zellen oder Klone weniger Zellen GFP im Endokard (Abbildung 1A). Die GFP-Expression (Abbildung 1A,B) in Kombination mit der subzellulären VE-Cadherin-Lokalisation (Abbildung 1C) ist ein effektiver Ansatz, um die Beziehung zwischen AJ-Dynamik und Filopodienbildung in prä-EMT-Zellen zu untersuchen, da diese Zellen Membranvorsprünge entwickeln, wenn sich AJs auflösen29. PCP-Signale können den AJs eine anisotrope Kontraktilität verleihen und zelluläre Kräfte erzeugen, die die polarisierte Morphogenese in den Epithelien30 fördern. Wir fanden Unterschiede in der Intensität der VE-Cadherin-Färbung im Endokard (Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass wir die anisotrope Kontraktilität im embryonalen Endokard von AVC in prävalvulären Stadien nicht verwerfen können.

Das zweite Ziel war die Analyse der planaren Topologie des Endokards während der Klappenentwicklung (Abbildung 2). Um die Anzahl der Zellen zu definieren, die in einem einzigen Scheitelpunkt konvergieren, färbten wir das ganze Herz mit VE-Cadherin-Antikörpern bei E8,5 und E9,5 (Abbildung 2A,B). Andere Moleküle, die an Zell-Zell-Kontakten der Endokardzelle lokalisiert sind, wären für diesen Zweck ebenfalls nützlich (z. B. β-Catenin). Bei E8.5 neigt das Endokard des AVC dazu, eine stabile Epithelorganisation zu haben, und wir konnten keine Eckpunkte erkennen, die von mehr als vier Zellen gebildet wurden (Abbildung 2A,C). Später bei E9.5 fanden wir Eckpunkte, die aus bis zu sechs Zellen bestehen, die rosettenartige Strukturen bilden (Abbildung 2B, D), ähnlich der zellulären Organisation, die zuvor in Epithelien beschrieben wurde, die aktive Zellumlagerungen durchlaufen31, was darauf hindeutet, dass das AVC-Endokard während der Klappenentwicklung eine aktive zelluläre Umlagerung durchläuft.

Figure 1
Abbildung 1: Einzelzellformanalyse im prävalvulären Endokard. (A) AVC aus einem E9.5-Mausembryo öffnete sich longitudinal und zeigte verstreute GFP-positive Zellen. (B) Die GFP-Expression in einzelnen Zellen definiert die Zellform bei zellulärer Auflösung. (C) Die gesamte Färbung von VE-Cadherin hebt AJs hervor. Filopodien werden in Domänen der Zelle erzeugt, die VE-Cadherin nicht lokalisieren (violette Pfeile), und umgekehrt lokalisiert sich VE-Cadherin in Domänen der Zelle, die glatt sind und keine Filopodien bilden (blaue Pfeilspitzen). v, ventral; d, dorsal. Der Maßstabsbalken in A beträgt 100 μm; in B und C beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Planare Topologie und Anisotropie planar lokalisierter Proteine können in En-Face-Bildern von Endokard am AV-Kanal definiert werden. VE-Cadherin ist an den Zell-Zell-Kontakten des Endokards lokalisiert. (A) E8.5 und (B) E9.5 AVC aus Embryonen wurden längs geöffnet. Vergrößerungen in (C) und (D) ermöglichten es uns, die Anzahl der Zellen zu beobachten, die in einem Scheitelpunkt konvergieren. Darüber hinaus können wir verschiedene Intensitäten in der VE-Cadherin-Färbung unterscheiden, was darauf hinweist, dass ihre Position im AVC anisotrop ist. Der Maßstabsbalken in A und B beträgt 100 μm; in C und D beträgt 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Das Endokard ist eine epitheliale Monoschicht, die die gesamte innere Oberfläche des embryonalen Herzschlauchs bedeckt. Während der Klappenentwicklung werden endokardiale Zellen in den prospektiven Klappenregionen EMT unterzogen, so dass endokardiale Zellen ihr Zytoskelett transformieren und neu anordnen, um vom Endokard in Richtung Herzgelee zu delaminatieren. Wir und andere haben relevante Daten über die Klappenentwicklung in Mausembryonen erhalten, indem wir transversale Abschnitte von E8.5 und E9.5 embryonalen Herzen analysiert haben, wo das Endokard als eine Reihe von Zellen 6,8,24,32 dargestellt wird. Dieser Ansatz ermöglichte die Analyse der Expression von Signalwegen und anderen Molekülen, die an der Klappenentwicklung beteiligt sind, aber es war nicht möglich, räumliche Aspekte des prävalvulären Endokards zu analysieren.

AVC- oder OFT-Explantate wurden hauptsächlich verwendet, um die Transformation von EC auf einem 3D-Kollagengel zu untersuchen. Explantate sind nützlich für die EMT-Quantifizierung, die Analyse der Transformationskapazität oder das Testen von Medikamenten nach wenigen Tagen in Kultur 6,7,11,33. Diese Ex-vivo-Experimente erlauben auch die Expansion des Endokards auf dem Kollagengel als Monoschicht, aber die Umweltbedingungen, unter denen ex vivo Herzexplantate angebaut werden, unterscheiden sich von in utero. Zum Beispiel ist der unidirektionale Blutfluss essentiell für die richtige Klappenentwicklung34,35 und wird nur in utero, nicht in ex vivo, Explantaten erreicht.

Dieser neuartige Ansatz ermöglicht es uns, das intakte Klappenendokard während des Beginns der Klappenentwicklung ohne Umweltmanipulation zu beobachten. Es ermöglicht die Analyse der zellulären Verteilung des Klappenendokards sowie die Analyse der Einzelzellform vor und während EMT unter In-utero-Bedingungen . Wir können auch die Intensität und Organisation der Zell-Zell-Kontakte und die subzelluläre Verteilung relevanter Moleküle während der EMT beobachten und analysieren. Diese Technik bietet auch die Möglichkeit, subzelluläre Strukturen des Endokards zu analysieren, die Aktivierung von Signalwegen durch die Verwendung von Reportergenen, die Auswirkungen, die die Geninaktivierung auf das zelluläre Verhalten haben kann, und wie sie benachbarte Wildtyp-Zellen beeinflussen kann.

Um qualitativ hochwertige Proben zu erhalten, ist es wichtig, beim Umgang mit ihnen sehr vorsichtig zu sein, da Verunreinigungen (z. B. Mikrofasern), die am Gewebe haften, bei der Aufnahme von Bildern zu Artefakten führen können. Da es sich um sehr kleine Proben handelt, ist das Risiko des Brechens hoch, so dass man das Gewebe (Schritt 1. und Schritt 2.) in langsamen Schüttlern waschen muss. Während des Medienwechsels mit Pipetten empfehlen wir, die Spitze abzuschneiden, um zu verhindern, dass das Gewebe beim Durchgang durch die Spitze kollabiert, falls es versehentlich absorbiert wird. Um ein Experte in dieser Technik zu werden, ist eine Lernkurve notwendig, die je nach vorheriger Erfahrung des Forschers in der Mikromanipulation länger oder kürzer sein wird.

Die Wahl des richtigen Fixiermittels und des Zeitpunkts der Fixierung kann bei der Verwendung von Transgenen, die fluoreszierende Proteine exprimieren, wichtig sein. Die anatomische Struktur wird durch verschiedene Fixikatien wie Ethanol 70%, Methanol, PFA 4% oder Formalin 10% nicht beeinflusst.

Für die Gegenfärbung von Kernen empfehlen wir die Inkubation von Proben mit DAPI, da die Penetration viel effizienter ist als die Verwendung von Montagemedien mit DAPI.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgments

Diese Studie wurde durch die Zuschüsse PID2019-104776RB-I00 und CB16/11/00399 (CIBER CV) von MCIN/AEI/10.13039/501100011033 an J. L. P. J.G.-B. unterstützt. wurde vom Programa de Atracción de Talento der Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729) finanziert. T.G.-C. wurde gefördert von Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Wir danken der CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, kofinanziert von MCIN/AEI /10.13039/501100011033 und FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Wir danken auch A. Galicia und L. Méndez für die Mäusehaltung. Die Kosten für diese Veröffentlichung wurden teilweise aus Mitteln des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung getragen. Das CNIC wird vom ISCIII, dem MCIN und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (Stipendium CEX2020-001041-S), finanziert von MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 185
<em>En Gesicht</em> Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen
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Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

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