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Developmental Biology

En Face Preparación del cojín endocárdico para el análisis de morfogénesis plana en embriones de ratón

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64207
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Intercellular Signalling in Cardiovascular Development and Disease Laboratory, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Ciber de Enfermedades Cardiovasculares

Summary

Clásicamente, el endocardio del primordio de la válvula embrionaria de ratón se ha analizado utilizando secciones transversales, coronales o sagitales. Nuestro novedoso enfoque para imágenes bidimensionales en la cara del endocardio en regiones valvulogénicas permite el análisis de polaridad plana y reordenamiento celular del endocardio durante el desarrollo de la válvula.

Abstract

El estudio de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al desarrollo del corazón de los mamíferos es esencial para abordar la cardiopatía congénita humana. El desarrollo de las válvulas cardíacas primitivas implica la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células endocárdicas del canal auriculoventricular (AVC) y las regiones del tracto de salida (OFT) del corazón en respuesta a las señales inductivas locales de miocardio y endocardio. Una vez que las células se deslaminan e invaden la matriz extracelular (jalea cardíaca) ubicada entre el endocardio y el miocardio, se forman los cojines endocárdicos primitivos (CE). Este proceso implica que el endocardio tiene que llenar los huecos dejados por las células deslaminadas y tiene que reorganizarse para converger (estrechar) o extenderse (alargarse) a lo largo de un eje. La investigación actual ha implicado la vía de polaridad de células planas (PCP) en la regulación de la localización subcelular de los factores involucrados en este proceso. Clásicamente, las fases iniciales del desarrollo de la válvula cardíaca se han estudiado en secciones transversales de corazones embrionarios o en explantes ex vivo AVC u OFT cultivados en geles de colágeno. Estos enfoques permiten el análisis de la polaridad apico-basal, pero no permiten el análisis del comportamiento celular dentro del plano del epitelio o de los cambios morfológicos de las células migratorias. Aquí, mostramos un enfoque experimental que permite la visualización del endocardio en regiones valvulogénicas como un campo plano de células. Este enfoque experimental brinda la oportunidad de estudiar PCP, topología plana y comunicación intercelular dentro del endocardio de OFT y AVC durante el desarrollo de la válvula. Descifrar nuevos mecanismos celulares implicados en la morfogénesis de la válvula cardíaca puede contribuir a comprender la cardiopatía congénita asociada con defectos del cojín endocárdico.

Introduction

El corazón es el primer órgano funcional de un embrión de mamífero. Alrededor del día embrionario (E) 7.5 en ratones, las células precardíacas bilaterales del mesodermo forman la media luna cardíaca en el lado ventral1. La media luna cardíaca contiene dos poblaciones de células precardíacas que incluyen progenitores del miocardio y el endocardio2. Alrededor de E8.0, los precursores cardíacos se fusionan en la línea media, formando el tubo cardíaco primitivo que consta de dos tejidos epiteliales, el miocardio externo y el endocardio interno, que es un endotelio especializado separado por una matriz extracelular llamada jalea cardíaca. Más tarde, en E8.5, el tubo cardíaco sufre un bucle hacia la derecha. El corazón en bucle tiene diferentes regiones anatómicas con firmas moleculares específicas, como el tracto de salida (OFT), los ventrículos y el canal atrio-ventricular (AVC)3. Aunque inicialmente el tubo cardíaco se expande en su lado de entrada a través de la adición de células4, en E9.5, la proliferación cardíaca intensiva resulta en el globo de las cámaras y el establecimiento de la red trabecular5. La formación de la válvula tiene lugar en la CVA (futuras válvulas mitral y tricúspide) y en la OFT (futuras válvulas aórtica y pulmonar).

El endocardio juega un papel crucial en el desarrollo de la válvula. Las células endocárdicas experimentan transición epitelial-mesenquimal (EMT) en el AVC y OFT para formar los cojines endocárdicos, una estructura que aparece al inicio del desarrollo de la válvula. Diferentes vías de señalización activan este proceso; en E9.5 en ratones, NOTCH activado en el endocardio en respuesta a BMP2 derivado del miocardio promueve la EMT invasiva de las células endocárdicas en las regiones AVC y OFT a través de la activación de TGFβ2 y SNAIL (SNAI1), que reprime directamente la expresión de cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), un componente transmembrana de las uniones adherentes (AJs)6,7,8 . En la OFT, la activación del endocardio para iniciar la EMT está mediada por FGF8 y BMP4, cuya expresión es activada por NOTCH 9,10,11,12.

La progresión de la EMT implica la dinámica celular a medida que las células cambian de forma, rompen y rehacen las uniones con sus vecinas, se deslaminan y comienzan a migrar13. Estos cambios incluyen la remodelación de AJ y el desmontaje gradual 14,15, la señalización de polaridad celular plana (PCP), la pérdida de polaridad apicobasal (ABP), la constricción apical y la organización citoesquelética 16,17. ABP se refiere a la distribución de proteínas a lo largo del eje anterior-posterior de una célula. En el corazón en desarrollo, la regulación de la PBA en los cardiomiocitos es necesaria para el desarrollo ventricular18. PCP se refiere a una distribución polarizada de proteínas dentro de las células a través del plano de un tejido y regula la distribución celular; Los epitelios con una geometría estable están formados por células en forma de hexágono, donde solo tres células convergen en los vértices 19,20,21,22. Diferentes procesos celulares, como la división celular, el intercambio de vecinos o la delaminación que ocurre durante la morfogénesis epitelial, producen un aumento en el número de células que convergen en un vértice y el número de células vecinas que tiene una célula dada22. Estos comportamientos celulares relacionados con la PCP pueden ser regulados por diferentes vías de señalización, dinámica de actina o tráfico intracelular23.

Los datos generados estudiando el desarrollo de la válvula en ratones se han obtenido de secciones transversales, coronales o sagitales de corazones embrionarios E8.5 y E9.5, donde el endocardio se muestra como una línea de células en lugar de como un campo de células: el endocardio cubre toda la superficie interna del tubo cardíaco24. Las secciones embrionarias no permiten el análisis de PCP en el endocardio de embriones de ratón. Nuestro novedoso método experimental permite el análisis de la distribución celular endocárdica, la anisotropía AJ y el análisis de la forma de una sola célula, como se muestra en los resultados representativos. Este tipo de datos son necesarios para el análisis de PCP, junto con la descripción de otras moléculas relacionadas con PCP, que no se muestran en este informe. La inmunofluorescencia de montaje completo, la preparación específica de muestras y el uso de ratones modificados genéticamente permiten el análisis de polaridad plana en el endocardio al inicio del desarrollo de la válvula en ratones.

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Protocol

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) y por la Comunidad de Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Todos los procedimientos con animales se ajustan a la Directiva 2010/63UE de la UE y la Recomendación 2007/526/CE relativa a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, promulgada en la legislación española bajo el Real Decreto 1201/2005.

1. Obtención de AVC y/o OFTs (adaptado de Xiao et al. 25)

  1. Establezca cruces por la tarde entre mTmG femenino y masculino VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
  2. A la mañana siguiente, compruebe si hay un tapón vaginal. Si hay un tapón vaginal, cuéntelo como medio día (E0.5). Dependiendo del experimento de interés, cuente 8 días o 9 días.
  3. 24 h antes de la disección, hacer sonda bocada a la hembra embarazada por vía oral con 50 μL de 5 mg/mL de 4-OH-tamoxifeno diluido en aceite de maíz.
    NOTA: Esta dosis inducirá una cantidad limitada de recombinación mediada por CRE revelada por la presencia de clones positivos para GFP. La dosis apropiada tendrá que determinarse con cada nuevo lote de 4-OH-Tamoxifeno.
  4. Sacrificar a la hembra embarazada en E8.5 o E9.5 por luxación cervical.
  5. Abra el abdomen de los ratones preñados usando tijeras y retire el útero que contiene los embriones usando tijeras y pinzas finas.
  6. Coloque el útero en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada 1x con 0.1% de Tween-20 (PBT).
  7. Retire las deciduas individuales del útero bajo un microscopio de disección y usando fórceps finos.
  8. Usando pinzas finas, haga una incisión en la parte blanca de la decidua, que es donde está el embrión, retírelo suavemente, evitando tirar, y transfiera los embriones a una nueva placa de Petri con PBT fresco usando un P1000 con la punta cortada, dejando un diámetro lo suficientemente grande como para que un embrión pase sin romperse.
  9. Para el genotipado, tome un pequeño trozo del saco vitelino (0,5 mm2) o un trozo de la cola (desde el extremo posterior, contando de 5 a 10 somitas hacia la cabeza) y digieralo en 100 μL de tampón apropiado.
  10. Bajo la campana extractora, transfiera los embriones a paraformaldehído al 4% (4% PFA) helado en PBS filtrado estéril en un tubo de microcentrífuga (2 ml) a 4 °C. Fijar los embriones desde 2 h hasta toda la noche (O/N) a 4 °C en un nutator.
  11. Debajo de la campana extractora, retire el fijador de PFA al 4% de los tubos de microcentrífuga sin tocar los embriones. Deseche el PFA en un recipiente apropiado.
  12. Lave los embriones 5 veces en PBT frío durante 10 minutos cada uno a temperatura ambiente (RT).
  13. Con pinzas finas, extraer el corazón y transferirlo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con PBT fresco.

2. Inmunofluorescencia de montaje completo del corazón embrionario del ratón

  1. Reemplace PBT con PBSTr (0.4% Triton X-100 en PBS) y lave las muestras 3x, 5 min cada una, en RT en un agitador orbital.
  2. Reemplace PBSTr con solución de bloqueo (PBSTr con suero bovino inactivado por calor al 10%). Incubar de 2 h a O/N a 4 °C en un agitador orbital.
  3. Reemplace la solución de bloqueo con una solución de bloqueo que contenga anticuerpos primarios a la concentración deseada (para anticuerpos anti-GFP o anti-VE-Cadherin, use dilución 1:1000). Incubar O/N en un agitador orbital a 4 °C.
  4. Después de la incubación O/N a 4 °C, incubar durante 1,5 h a RT en un agitador orbital. Este paso es muy importante para aumentar la relación señal-ruido.
  5. Retirar y mantener a 4 °C la solución de anticuerpos primarios para un máximo de tres experimentos futuros (añadir azida de sodio a una concentración final del 0,02% para una mejor conservación).
  6. Lave los embriones 3 veces con PBSTr durante 3 minutos cada uno.
  7. Lavar los embriones con PBSTr 3x durante 30 min cada uno en un agitador orbital a 4 °C.
  8. Después del último lavado, añadir 1 ml de solución bloqueante que contenga 1:1000 de anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia contra la especie huésped de anticuerpos primarios. Añadir también 1:3000 DAPI a la solución e incubar los embriones O/N en un agitador orbital a 4 °C.
  9. Después de la incubación O/N a 4 °C, incubar durante 1,5 h a RT en un agitador orbital. Este paso es muy importante para aumentar la relación señal-ruido.
  10. Lave los embriones 3 veces con PBSTr durante 3 minutos cada uno.
  11. Lave los embriones con PBSTr 3x-5x durante 30 minutos cada uno en un agitador orbital en RT.

3. Montaje del AVC embrionario de ratón o OFTs

  1. Coloque los corazones en una placa de Petri (35 mm) que contenga PBS.
  2. Usando un alambre de tungsteno y pinzas finas, aísle el AVC o el OFT, y córtelos longitudinalmente26.
  3. Prepare cubreobjetos (22 mm x 22 mm), portaobjetos (60 mm x 24 mm), pinzas, una pipeta P200 con las puntas adecuadas, toalla de papel y cualquier medio de montaje acuoso a base de glicerol para fluorescencia, sin DAPI.
  4. Utilizando un enfoque similar al de Xiao, C. et al.25, pegue dos tiras de cinta adhesiva en una diapositiva, separadas por 0,3-0,6 cm para crear un espacio de sala 3D que permita a las muestras conservar su forma original sin aplastarlas.
  5. Con cuidado, y utilizando el volumen mínimo de tampón, coloque las muestras en el portaobjetos entre las bandas de cinta con una pipeta de punta P200 cortada. Use un microscopio de disección para aumentar la precisión.
  6. Con pinzas finas, coloque las muestras con el endocardio hacia arriba (miocardio hacia abajo en el portaobjetos).
  7. Retire el exceso de PBS con una toalla de papel (evite tocar la muestra) y luego seque las muestras durante 1-2 minutos en RT para que las muestras se peguen al portaobjetos.
  8. Añadir 40 μL de medios de montaje acuosos sobre el tejido.
  9. Coloque el cubreobjetos sobre los dos trozos de cinta y bájelo lentamente sobre el tejido con una aguja o fórceps. Evite crear burbujas de aire.
  10. Selle el cubreobjetos con una gota de esmalte de uñas en cada vértice del cubreobjetos.
  11. Una vez que el esmalte de uñas esté seco, limpie el exceso de medios de montaje de los lados del cubreobjetos usando una toalla de papel absorbente. Evite mover el cubreobjetos.
  12. Agregue esmalte de uñas a lo largo de los bordes del cubreobjetos para sellarlo completamente, evitando la evaporación del medio de montaje.
  13. Usando un microscopio vertical o confocal invertido, tome imágenes a 10x para una vista general y a 63x con zoom de 3x para imágenes detalladas.

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Representative Results

Los datos generados utilizando este protocolo muestran que es posible realizar imágenes en la cara del endocardio del AVC. El primer objetivo fue analizar la forma celular del endocardio durante la formación de las válvulas a una resolución celular (Figura 1). Para resaltar las células endocárdicas individuales en E9.5, utilizamos dos cepas de ratones transgénicos. (1) ROSAmT/mG es un alelo reportero Cre fluorescente de dos colores (tdTomato/mT y EGFP/mG) cuya fluorescencia se detecta en la membrana celular. Sin activación mediada por Cre, el transgén expresa tdTomato (mT). Tras la activación mediada por Cre, la expresión de tdTomate es reemplazada por expresión de fluorescencia EGFP (mG) en células específicas y derivados clonales27. (2) La línea de ratón Cdh5CreERT2/+ expresa CRE recombinasa inducible por tamoxifeno (CreERT2) bajo la regulación del promotor de cadherina endotelial vascular (Cdh5), que se expresa en el endotelio vascular y el endocardio en las etapas embrionarias28. Cruzamos un macho y una hembra de cada genotipo para obtener embriones portadores de los dos transgenes con el fin de activar la expresión de GFP en células individuales del endocardio. Para lograr esto, inoculamos dosis bajas de tamoxifeno para activar la expresión de CRE en un número reducido de células. Como resultado, células individuales, o clones de pocas células, expresaron GFP en el endocardio (Figura 1A). La expresión de GFP (Figura 1A,B) en combinación con la localización subcelular VE-Cadherina (Figura 1C) es un enfoque eficaz para estudiar la relación entre la dinámica de AJ y la formación de filopodios en células pre-EMT, ya que estas células desarrollan protuberancias de membrana a medida que las AJs se disuelven29. Las señales de PCP pueden conferir contractilidad anisotrópica a los AJs, produciendo fuerzas celulares que promueven la morfogénesis polarizada en el epitelio30. Encontramos diferencias en la intensidad de la tinción VE-Cadherina en el endocardio (Figura 2), lo que indica que no podemos descartar la contractilidad anisotrópica en el endocardio embrionario de AVC en estadios prevalvulares.

El segundo objetivo fue analizar la topología plana del endocardio durante el desarrollo de la válvula (Figura 2). Para definir el número de células que convergen en un solo vértice, teñimos todo el corazón con el anticuerpo VE-Cadherin en E8.5 y E9.5 (Figura 2A, B). Otras moléculas localizadas en los contactos célula-célula de la célula endocárdica también serían útiles para ese propósito (por ejemplo, β-Catenina). En E8.5, el endocardio de la CVA tiende a tener una organización epitelial estable, y no pudimos detectar vértices formados por más de cuatro células (Figura 2A,C). Más tarde, en E9.5, encontramos vértices formados por hasta seis células que forman estructuras en forma de roseta (Figura 2B, D), similar a la organización celular previamente descrita en epitelios sometidos a reordenamientos celulares activos31, lo que sugiere que el endocardio AVC está experimentando un reordenamiento celular activo durante el desarrollo de la válvula.

Figure 1
Figura 1: Análisis de la forma unicelular en endocardio prevalvular. (A) AVC de embrión de ratón E9.5 abierto longitudinalmente mostrando células GFP positivas dispersas. (B) La expresión de GFP en células individuales define la forma celular a resolución celular. (C) La tinción de montaje completo de VE-Cadherin resalta los AJ. Los filopodios se generan en dominios de la célula que no localizan VE-Cadherina (flechas púrpuras), y viceversa, VE-Cadherina se localiza en dominios de la célula que son lisos y no forman filopodios (puntas de flecha azules). V: ventral; D: dorsal. La barra de escala en A es de 100 μm; en B y C es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La topología plana y la anisotropía de proteínas localizadas planas se pueden definir en imágenes frontales del endocardio en el canal AV. VE-Cadherin se localiza en los contactos célula-célula del endocardio. (A) E8.5 y (B) E9.5 AVC de embriones se abrieron longitudinalmente. Los aumentos en (C) y (D) nos permitieron observar el número de celdas que convergen en un vértice. Además, podemos distinguir diferentes intensidades en la tinción VE-Cadherina, indicando que su localización en el AVC es anisotrópica. La barra de escala en A y B es de 100 μm; en C y D es de 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El endocardio es una monocapa epitelial que cubre toda la superficie interna del tubo cardíaco embrionario. Durante el desarrollo de la válvula, las células endocárdicas en las regiones valvulares prospectivas se someten a EMT, por lo que las células endocárdicas transforman y reorganizan su citoesqueleto para deslaminarse desde el endocardio hacia la jalea cardíaca. Nosotros y otros hemos obtenido datos relevantes sobre el desarrollo valvular en embriones de ratón mediante el análisis de secciones transversales de corazones embrionarios E8.5 y E9.5, donde el endocardio se muestra como una fila de células 6,8,24,32. Este enfoque permitió el análisis de la expresión de las vías de señalización y otras moléculas involucradas en el desarrollo de la válvula, pero no fue posible analizar los aspectos espaciales del endocardio prevalvular.

Los explantes AVC u OFT se utilizaron principalmente para estudiar la transformación de EC en un gel de colágeno 3D. Los explantes son útiles para la cuantificación de EMT, el análisis de la capacidad de transformación o el ensayo de fármacos después de pocos días en cultivo 6,7,11,33. Estos experimentos ex vivo también permiten la expansión del endocardio sobre el gel de colágeno como una monocapa, pero las condiciones ambientales en las que se cultivan los explantes cardíacos ex vivo difieren de las condiciones intrauterinas. Por ejemplo, el flujo sanguíneo unidireccional es esencial para el correcto desarrollo de la válvula34,35 y sólo se logra en explantes in utero, no ex vivo.

Este nuevo enfoque nos permite observar el endocardio valvular intacto en la cara durante el inicio del desarrollo de la válvula sin ninguna manipulación ambiental. Permite el análisis de la distribución celular del endocardio valvular, así como el análisis de la forma de una sola célula antes y durante la EMT en condiciones intrauterinas . También podemos observar y analizar la intensidad y organización de los contactos célula-célula y la distribución subcelular de moléculas relevantes durante la EMT. Esta técnica también ofrece la posibilidad de analizar las estructuras subcelulares del endocardio, la activación de las vías de señalización mediante el uso de genes reporteros, el efecto que la inactivación de genes puede tener en el comportamiento celular y cómo puede afectar a las células vecinas de tipo salvaje.

Para obtener muestras de alta calidad, es importante tener mucho cuidado al manipularlas, ya que las impurezas (por ejemplo, microfibras) que se adhieren al tejido pueden dar lugar a artefactos durante la captura de imágenes. Además, al tratarse de muestras muy pequeñas, el riesgo de rotura es alto, por lo que hay que lavar el tejido (paso 1. y paso 2.) en agitadores lentos. Durante el cambio de medio con pipetas, recomendamos cortar la punta para evitar que el tejido se colapse a su paso por la punta en caso de que se absorba accidentalmente. Para convertirse en un experto en esta técnica, es necesaria una curva de aprendizaje, que será más larga o más corta dependiendo de la experiencia previa del investigador en micromanipulación.

Elegir el fijador adecuado y el momento de fijación puede ser importante en el caso del uso de transgenes que expresan proteínas fluorescentes. La estructura anatómica no se ve afectada por diferentes fijadores como etanol 70%, metanol, PFA 4% o formalina 10%.

Para la contratinción de núcleos, recomendamos la incubación de muestras con DAPI porque la penetración es mucho más eficiente que usar medios de montaje con DAPI.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por las subvenciones PID2019-104776RB-I00 y CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. fue financiado por el Programa de Atracción de Talento de la Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. fue financiado por Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos a la Unidad de Microscopía e Imagen Dinámica del CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). También agradecemos a A. Galicia y L. Méndez por la cría de ratones. El coste de esta publicación fue financiado en parte por fondos del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. El CNIC cuenta con el apoyo del ISCIII, el MCIN y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (subvención CEX2020-001041-S) financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OH-Tamoxifen Sigma Aldrich H-6278
16 % Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 157-10 Dilute to 4% in water
anti-GFP Aves Labs FGP-1010
anti-VECadherin BD Biosciences 555289
Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11039
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 115-605-174
DAPI AppliChem A4099,0005
Slides Superfrost PLUS VWR 631-0108 25 mm x 75 mm x 1.0 mm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
Tween 20 A4974,0500 AppliChem
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10

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Biología del desarrollo Número 185
<em>En Face</em> Preparación del cojín endocárdico para el análisis de morfogénesis plana en embriones de ratón
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Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J.… More

Gonzalez-Costa, T., de la Pompa, J. L., Grego-Bessa, J. En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (185), e64207, doi:10.3791/64207 (2022).

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