Summary
وصفنا طريقة تجمع بين الخرز المغنطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالتألق لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية للخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية وتحليلها.
Abstract
عدد كريات الدم البيضاء المعدية (IM) هو متلازمة حادة ترتبط في الغالب بعدوى فيروس إبشتاين بار الأولية (EBV). تشمل الأعراض السريرية الرئيسية الحمى غير المنتظمة ، واعتلال العقد اللمفية ، وزيادة الخلايا الليمفاوية بشكل ملحوظ في الدم المحيطي. لا تزال الآلية المسببة للأمراض في IM غير واضحة. لا توجد طريقة علاج فعالة لذلك ، مع توفر علاجات الأعراض بشكل أساسي. السؤال الرئيسي في علم الأحياء المناعي EBV هو لماذا تظهر مجموعة فرعية صغيرة فقط من الأفراد المصابين أعراضا سريرية حادة وحتى يصابون بأورام خبيثة مرتبطة ب EBV ، في حين أن معظم الأفراد لا تظهر عليهم أعراض مدى الحياة مع الفيروس.
تشارك الخلايا البائية أولا في العضلي؛ لأن مستقبلات EBV تظهر على سطحها. الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي خلايا ليمفاوية فطرية سامة للخلايا مهمة لقتل الخلايا المصابة بفيروس EBV. تنخفض نسبة الخلايا التائية CD4 + بينما تتوسع نسبة الخلايا التائية CD8 + بشكل كبير أثناء عدوى EBV الحادة ، واستمرار الخلايا التائية CD8 + مهم للسيطرة على العضلي مدى الحياة. تلعب هذه الخلايا المناعية أدوارا مهمة في العضل العضلي، ويجب تحديد وظائفها بشكل منفصل. لهذا الغرض ، يتم فصل الخلايا الوحيدة أولا عن خلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) لأفراد IM باستخدام ميكروبيدات CD14 وعمود وفاصل مغناطيسي.
يتم تلطيخ PBMCs المتبقية ببروتين بيريدين كلوروفيل (PerCP) / سيانين 5.5 مضاد CD3 ، ألوفيكوسيانين (APC) / سيانين 7 مضاد CD4 ، فيكوريثرين (PE) مضاد CD8 ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) مضاد CD19 ، APC مضاد CD56 ، و APC مضاد ل CD16 لفرز خلايا CD4 + T وخلايا CD8 + T والخلايا البائية وخلايا NK باستخدام مقياس التدفق الخلوي. علاوة على ذلك ، تم إجراء تسلسل النسخ لخمس مجموعات سكانية فرعية لاستكشاف وظائفها وآلياتها المسببة للأمراض في IM.
Introduction
فيروس إبشتاين بار (EBV) ، وهو فيروس الهربس γ المعروف أيضا باسم فيروس الهربس البشري من النوع 4 ، موجود في كل مكان في البشر ويؤسس عدوى كامنة مدى الحياة في أكثر من 90٪ من السكان البالغين1. تحدث معظم العدوى الأولية EBV خلال مرحلة الطفولة والمراهقة ، مع ظهور جزء صغير من المرضى مع عدد كريات الدم البيضاء المعدية (IM) 2 ، مما يدل على علم الأمراض المناعية المميزة ، بما في ذلك الاستجابة المناعية النشطة مع خلايا CD8 + T في الدم وانتشار عابر للخلايا البائية المصابة بفيروس EBV في البلعومالفموي 3. قد تستمر دورة الحقن العضلي لمدة 2-6 أسابيع ويتعافى غالبية المرضى بشكل جيد4. ومع ذلك ، يصاب بعض الأفراد بأعراض مستمرة أو متكررة تشبه IM مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات ، والتي تصنف على أنها عدوى EBV المزمنة النشطة (CAEBV)5. بالإضافة إلى ذلك ، يعد EBV فيروسا مهما للأورام ، يرتبط ارتباطا وثيقا بمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة ، بما في ذلك الأورام الخبيثة الظهارية واللمفاوية مثل سرطان البلعوم البلعومي ، وسرطان الغدد الليمفاوية بوركيت ، وسرطان الغدد الليمفاوية هودجكين (HL) ، وسرطان الغدد الليمفاوية لخلايا T / NK6. على الرغم من دراسة EBV لأكثر من 50 عاما ، إلا أن التسبب في المرض والآلية التي يحفز بها تكاثر الخلايا الليمفاوية لم يتم توضيحها بالكامل.
بحثت العديد من الدراسات في التوقيعات الجزيئية لعلم الأمراض المناعي لعدوى EBV عن طريق تسلسل النسخ. قام Zhong et al. بتحليل التنميط الكامل للنسخ لخلايا الدم أحادية النواة المحيطية (PBMCs) من الأطفال الصينيين المصابين ب IM أو CAEBV ليجد أن توسع الخلايا التائية CD8 + تم العثور عليه في الغالب في مجموعة IM7 ، مما يشير إلى أن خلايا CD8 + T قد تلعب دورا رئيسيا في IM. وبالمثل ، وجدت دراسة أخرى نسبا أقل من الخلايا التائية السامة للخلايا وخلايا CD19 + B السامة للخلايا ونسب أعلى من خلايا CD8 + T في المرضى الذين يعانون من IM الناجم عن عدوى EBV الأولية مقارنة بالمرضى الذين يعانون من IM الناجم عن إعادة تنشيط EBV وعوامل أخرى8. تشارك الخلايا البائية أولا في العضلي؛ لأن مستقبلات EBV تظهر على سطحها. وجد الطباع وآخرون أن الخلايا البائية تم تنشيطها متعددة النسيلة وخلايا البلازما المتمايزة (خلايا CD19 + و CD27 + و CD20− و CD138−) وخلايا البلازما (CD19 + و CD27 + و CD20− و CD138 +) خلال IM9. علاوة على ذلك ، وجد Zhong et al. أن علامات الخلايا الوحيدة CD14 و CD64 تم تنظيمها في CAEBV ، مما يشير إلى أن الخلايا الوحيدة قد تلعب دورا مهما في الاستجابة المناعية الخلوية ل CAEBV من خلال السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) والبلعمة المفرطة النشاط7. Alka et al. ميز نسخ خلايا CD56 CD16 + NKالخافتة من أربعة مرضى من IM أو HL ووجد أن الخلايا القاتلة الطبيعية من كل من IM و HL قد خفضت المناعة الفطرية وجينات إشارات chemokine ، والتي يمكن أن تكون مسؤولة عن عدم استجابة الخلايا القاتلة الطبيعية10. بالإضافة إلى ذلك ، قام Greenough et al. بتحليل التعبير الجيني لخلايا CD8 + T المصنفة من 10 PBMCs للأفراد المصابين ب IM. وأفادوا أن نسبة كبيرة من الخلايا التائية CD8 + في IM كانت خاصة بالفيروسات ، وتم تنشيطها ، وتقسيمها ، واستعدادها لممارسة أنشطة المستجيب11. تلعب كل من الاستجابات بوساطة الخلايا التائية ، والاستجابات الخاصة ب EBV ، والاستجابات غير المحددة بوساطة الخلايا القاتلة الطبيعية ، أدوارا أساسية أثناء عدوى EBV الأولية. ومع ذلك ، فإن هذه الدراسات بحثت فقط في نتائج النسخ للخليط المتنوع من الخلايا المناعية أو مجموعة فرعية معينة فقط من الخلايا الليمفاوية ، وهو ما لا يكفي للمقارنة الشاملة للخصائص الجزيئية ووظائف مجموعات الخلايا المناعية المختلفة في الأطفال المصابين ب IM في نفس حالة المرض.
تصف هذه الورقة طريقة تجمع بين الخرز المغناطيسي المناعي وفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية من PBMCs (الخلايا الوحيدة ، خلايا CD4 + T ، خلايا CD8 + T ، الخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية). باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تنقية الخلايا المغناطيسية والفلورية باستخدام فاصل مغناطيسي و FACS أو تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا المنقاة لتسلسل النسخ. ستمكن هذه الطريقة من توصيف الخلايا المناعية المختلفة والتعبير الجيني عنها في نفس حالات المرض للأفراد المصابين بالحقن العضلي ، مما سيوسع فهمنا لعلم الأمراض المناعي لعدوى EBV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات دم من المرضى الذين يعانون من IM (ن = 3) ، وحاملات EBV الأصحاء (ن = 3) ، والأطفال غير المصابين بفيروس EBV (ن = 3). تم تجنيد متطوعين من مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية ، وتمت الموافقة على جميع الدراسات أخلاقيا. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين للأطفال ، جامعة العاصمة الطبية (رقم الموافقة: [2021] -E-056-Y). تم التنازل عن الموافقة المستنيرة للمرضى لأن الدراسة استخدمت فقط العينات المتبقية للاختبار السريري. تم تحديد جميع البيانات بالكامل وإخفاء هويتها لحماية خصوصية المريض.
1. عزل PBMCs من الدم المحيطي
- اجمع الدم المحيطي الطازج (2 مل) من المرضى الذين يعانون من IM في أنابيب K3EDTA عن طريق بزل الوريد القياسي.
ملاحظة: يجب أن تكون العملية سريعة للحفاظ على صلاحية الخلية. - قم بتخفيف الدم المحيطي إلى حجم مزدوج باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وقم بوضعه فوق وسط فصل الخلايا الليمفاوية البشرية (الكثافة: 1.077 ± 0.001 جم / مل) في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
ملاحظة: كانت نسبة حجم الدم و PBS ووسط الفصل 1: 1: 1. أضف الدم ببطء إلى وسط الفصل ، وأجهزة الطرد المركزي على الفور لتجنب استقرار الدم في وسط الفصل. - جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. انقل الطبقة الوسطى (PBMCs المخصبة) إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 15 مل.
ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، توجد في الجزء السفلي من الأنبوب كريات الدم الحمراء ، والطبقة الوسطى هي وسط الفصل ، والطبقة العليا هي البلازما ، وبين طبقة البلازما والطبقة السائلة المنفصلة كانت PBMCs (بما في ذلك الخلايا الليمفاوية والوحيدات). - اغسل PBMCs ب 10 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ؛ تخلص من المادة الطافية بعناية.
- كرر الغسيل والطرد المركزي (الخطوة 1.4) 2 x. أعد تعليق PBMCs مع 1 مل من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وعد الخلايا باستخدام عداد آلي قائم على التريبان الأزرق.
2. عزل CD14 + monocytes من PBMCs باستخدام ميكروبيدات CD14
- تحضير محلول عازل يحتوي على 0.5٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 2 mM EDTA في PBS (درجة الحموضة 7.2). حافظ على المخزن المؤقت باردا (2-8 درجة مئوية).
ملاحظة: قم بإزالة المخزن المؤقت قبل استخدامه لأن فقاعات الهواء يمكن أن تسد العمود. حافظ على برودة الخلايا لمنع تغطية الأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع العلامات على الخلايا غير المحددة. - أجهزة الطرد المركزي PBMCs على 300 × غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الخلايا ب 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت. أضف 20 ميكرولتر من ميكروبيدات CD14 إلى معلق الخلية.
ملاحظة: إذا كان هناك ≤107 PBMCs ، استخدم وحدة التخزين المشار إليها أعلاه. إذا كان هناك >107 PBMCs ، فقم بزيادة جميع أحجام الكاشف والحجم الإجمالي بشكل متناسب. - امزج الميكروبيدات CD14 والخلايا جيدا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل واحتضانها لمدة 15 دقيقة في ثلاجة 4 درجات مئوية. اغسل PBMCs ب 1 مل من المخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية تماما. أعد تعليق الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
ملاحظة: إذا كان هناك ≤108 PBMCs ، استخدم وحدة التخزين المشار إليها أعلاه. إذا كان هناك >108 PBMCs ، فقم بزيادة حجم المخزن المؤقت بشكل متناسب. - الفصل المغناطيسي مع الأعمدة:
- ضع العمود على فاصل الخرزة المغناطيسية ، واغسل العمود ب 3 مل من المخزن المؤقت. أضف تعليق الخلية (من الخطوة 2.3) إلى العمود.
- اجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل واغسل العمود ب 3 مل من المخزن المؤقت. اغسل العمود ب 3 × 3 مل من المخزن المؤقت. اجمع إجمالي النفايات السائلة في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل.
- ضع العمود في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل. أضف 5 مل من المخزن المؤقت إلى العمود. ادفع المكبس بقوة في العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا على الفور في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل.
- قم بالطرد المركزي للخلايا المصنفة مغناطيسيا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل لاستخدامه في تسلسل النسخ اللاحق.
3. فصل مجموعات الخلايا الليمفاوية عن PBMCs عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة المسمى بالفلورسنت و FACS
- قم بالطرد المركزي للخلايا غير المسماة (الخطوة 2.4.2) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
- أضف 2 ميكرولتر من كل جسم مضاد مسمى (CD3 ، CD4 ، CD8 ، CD16 ، CD19 ، CD56) إلى 100 ميكرولتر من معلق الخلية (تظهر الأحجام ومعلومات الفلوروفور المترافقة للأجسام المضادة في الجدول 1) ، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة ، والحماية من الضوء.
- اغسل الخلايا 2 × بإضافة 1 مل من PBS والطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من PBS في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل. دوامة تعليق الخلية بلطف قبل الحصول على البيانات على مقياس خلوي فارز خلية التدفق.
4. إعداد معلمة قياس التدفق الخلوي
- خذ 100 ميكرولتر من معلق الخلية (انظر القسم 1) في أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل حسب الحاجة ، وقم بإعداد عينة تحكم سلبية ، وعينة تلطيخ مفردة CD3 ، وعينة تلطيخ مفردة CD4 ، وعينة تلطيخ مفردة CD8 ، وعينة تلطيخ مفردة CD19 ، وعينة تلطيخ CD56 / CD16.
- أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد المقابل المسمى بالفلورسنت لكل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية والدوامة. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم وشفط المادة الطافية. أعد تعليق الكريات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS والدوامة.
- قم بتكليف تيار الفرز وتأخير القطرات باستخدام حبات الفلورسنت على النحو التالي:
- افتح نظام فرز الخلايا ، وقم بتشغيل برنامج التشغيل ، وقم بتثبيت فوهة 85 ميكرومتر ، وافتح تيار الفرز. اضبط جهد الفرز على 4500 فولت ، والتكرار على 47.
- اضبط المعلمات بشكل أساسي عن طريق ضبط نقطة توقف قطرة التدفق الرئيسية وتأخير القطرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة12. قم بإعداد موضع نقطة توقف القطرات الأولى (Drop1) إلى 275 ، والفجوة إلى 8 في نافذة الفاصل . قم بتشغيل وضع الفرز التلقائي Sweet Spot للسماح للقياس الخلوي بتحديد قيمة سعة القطرة تلقائيا لتثبيت الدفق.
- اضبط تأخير القطرة إلى 30.31 في نافذة Side Stream عن طريق تحميل حبات الفلورسنت ، مما يضمن أن الخرز يحقق انحرافا جانبيا للتدفق بنسبة >99٪ في وضع الضبط الأولي أو الدقيق.
- راجع استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 1 لأداء البوابات على النحو التالي:
- باستخدام مخطط نقطي لمنطقة التشتت الأمامية (FSC-A) / منطقة التشتت الجانبية (SSC-A) ، ارسم بوابة المضلع (P1) لتحديد مجموعة الخلايا الليمفاوية السليمة .
- باستخدام مخطط نقطي FSC-A / FSC-HEIGHT (FSC-H) ، ارسم بوابة المضلع (P2) لتحديد الخلايا المفردة واستبعاد الثنائيات (الشكل 1 أ).
- باستخدام مخطط نقطي CD19 FITC-A / CD3 PerCP-Cy5.5-A ، ارسم البوابة المستطيلة (P3) لتحديد خلايا CD3 + T وخلايا CD19 + B (الشكل 1 أ ، ب).
- باستخدام مخطط نقطي CD4 APC-Cy7-A / CD8 PE-A ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد خلايا CD4 + T وخلايا CD8 + T (الخلايا ذات التألق العالي لهذه العلامات ، على التوالي).
- باستخدام مخطط نقطي CD56 / CD16 APC-A / SSC-A ، ارسم بوابة مستطيلة لتحديد خلايا CD56 + / CD16 + NK (الشكل 1C).
- اضبط المعلمات الآلية باستخدام عينة التحكم السلبية:
- قم بتثبيت أنبوب التحكم السلبي على منفذ التحميل وانقر فوق تحميل في لوحة معلومات الاستحواذ. حدد إعدادات مقياس الخلايا في البرنامج.
- في نافذة المفتش ، انقر فوق علامة التبويب المعلمات ، واضبط الفولتية ل FSC و SSC وأصباغ الفلورسنت المختلفة ؛ FSC: 231 ، SSC: 512 ، PE: 549 ، APC: 615 ، APC-Cyanine 7: 824 ، FITC: 555 ، PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- اضبط التعويض باستخدام العينات ذات اللون الواحد13.
- قم بتحميل الأنابيب ذات اللون الواحد على قياس الخلايا بالتتابع وحدد إعدادات مقياس الخلايا في البرنامج. انقر فوق علامة التبويب التعويض لضبط التعويض.
ملاحظة: يظهر مرجع التعويض لقياس التدفق الخلوي في الجدول 2.
- قم بتحميل الأنابيب ذات اللون الواحد على قياس الخلايا بالتتابع وحدد إعدادات مقياس الخلايا في البرنامج. انقر فوق علامة التبويب التعويض لضبط التعويض.
5. فرز الخلايا وجمع البيانات عبر قياس التدفق الخلوي
- دوامة تعليق الخلية (فصل PBMCs وفقا للأقسام 1-3) لفترة وجيزة لإعادة تعليق الخلايا قبل تحميل الأنبوب في مقياس الخلايا. الحفاظ على الأنابيب المتبقية على الجليد.
- أضف 200 ميكرولتر من FBS إلى أربعة أنابيب تدفق تجميع لتجنب التصاق الخلايا المصنفة بجدار الأنبوب ووضعها في غرفة تجميع مقياس الخلايا.
- اجمع خلايا CD3 + CD4 + T ، وخلايا CD3 + CD8 + T ، وخلايا CD3−CD19 + B ، وخلايا CD3− CD56 + / CD16 + NK بشكل منفصل عن عينة مريض مصاب ب IM في أنابيب التدفق الأربعة (الشكل 2 أ).
- جهاز طرد مركزي للخلايا المنفصلة عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي الريبي إلى الخلايا لتسلسل النسخ.
- افصل مجموعات الخلايا المناعية الفرعية للعينات عن حاملات EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV وفقا للخطوات المذكورة أعلاه (الشكل 2B ، C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مرجع استراتيجية البوابات
يوضح الشكل 1 استراتيجية البوابة المستخدمة لفرز المجموعات الفرعية الأربعة للخلايا الليمفاوية. باختصار ، يتم اختيار الخلايا الليمفاوية (P1) على مخطط نقطي يوضح التحبب (SSC-A) مقابل الحجم (FSC-A). بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا المفردة (P2) على مخطط نقطي يوضح الحجم (FSC-A) مقابل التشتت الأمامي (FSC-H) ، بينما يتم استبعاد الخلايا المزدوجة. يتم تحديد خلايا CD3 + T (P3) وخلايا CD19 + B (الشكل 1B) بشكل منفصل على مخطط نقطي يوضح CD3 PerCP-Cy5.5-A مقابل CD19 FITC-A. يتم تحديد خلايا CD8 + T وخلايا CD4 + T بشكل منفصل على مخطط نقطي يوضح CD8 PE-A مقابل CD4 APC-Cy7-A من P3. يتم تحديد خلايا CD16 + / CD56 + NK على مخطط نقطي يوضح CD56 / CD16 APC-A مقابل SSC-A من P4 (الشكل 1C).
يوضح الشكل 2 أ النتائج التمثيلية لأربع مجموعات فرعية من الخلايا تم فرزها من عينات المرضى الذين يعانون من الحقن العضلي بالطريقة الموصوفة. أجرينا أيضا فرز الخلايا على عينات من حاملات EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV كمجموعات تحكم لتأكيد جدوى هذه التجربة. تظهر النتائج التمثيلية لمجموعات الخلايا الفرعية المنفصلة عن عينة حامل EBV السليم في الشكل 2B. يوضح الشكل 2 ج النتيجة التمثيلية لمجموعات الخلايا الفرعية التي تم فرزها من عينة الأطفال غير المصابين بفيروس EBV. كما هو موضح في الشكل 2 ، تم إغلاق P1 لتحديد الخلايا الليمفاوية وتم استبعاد الخلايا المزدوجة من خلال P2 ؛ تم بوابات P3 لتحديد خلايا CD3 + T وتم بوابات P5 لتحديد خلايا CD19 + B ؛ تم اختيار خلايا CD3 + CD8 + T (P6) وخلايا CD3 + CD4 + T (P7) بشكل منفصل عن P3 ؛ تم اختيار خلايا CD16 + / CD56 + NK (P8) من P4. يمكن فرز كل من هذه المجموعات السكانية الفرعية بشكل فردي وجمعها لإجراء تجارب المصب. تم استخدام هذا النظام لتحليل التعبير الجيني من خلال استخراج الحمض النووي الريبي وتسلسل النسخ.
كما ورد في الجدول 3 ، لوحظت زيادة في خلايا CD3 + CD8 + T في المرضى الذين يعانون من الحقن العضلي مقارنة بكل من حاملي EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV (46.5 ± 4.0 مقابل 27.0 ± 0.1 و 46.5 ± 4.0 مقابل 24.7 ± 2.9 ، ٪ CD3 + CD8 + T الخلايا لكل مجموع الخلايا الليمفاوية) ؛ لوحظ انخفاض نسب خلايا CD3 + CD4 + T وخلايا CD19 + B في المرضى الذين يعانون من IM مقارنة بحاملي EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV (13.4 ± 1.5 مقابل 19.3 ± 1.5 و 13.4 ± 1.5 مقابل 23.6 ± 3.2،٪ CD3 + CD4 + T الخلايا لكل مجموع الخلايا الليمفاوية ؛ 1.4 ± 0.3 مقابل 7.6 ± 0.7 و 1.4 ± 0.3 مقابل 9.0 ± 1.5،٪ CD19 + B الخلايا لكل مجموع الخلايا الليمفاوية). لوحظ انخفاض نسب خلايا CD16 + / CD56 + NK في المرضى الذين يعانون من الحقن العضلي مقارنة بالأطفال غير المصابين بفيروس EBV (7.5 ± 0.5 مقابل 10.7 ± 0.4 ، ٪ CD16 + / CD56 + خلايا NK لكل إجمالي الخلايا الليمفاوية). أثبتت هذه النتائج فعالية بروتوكول الفرز هذا وأظهرت أن نسب المجموعات الفرعية للخلايا الليمفاوية تختلف في المرضى الذين يعانون من الأطفال غير المصابين ب IM و EBV.
الشكل 1: استراتيجية البوابات الشاملة المستخدمة لفرز مجموعات الخلايا المناعية الفرعية من PBMCs. (أ) تم استخدام مرشح PerCP-Cy5.5 لفصل خلايا CD3+ T. تم اختيار خلايا CD8 + T وخلايا CD4 + T بشكل منفصل على مخطط نقطي يوضح CD8 PE-A مقابل CD4 APC-Cy7-A من P3. (ب) استخدم مرشح FITC لتحديد خلايا CD19+ B. (ج) تم استخدام مرشح APC لفصل خلايا CD16 + / CD56 + NK عن P4. الاختصارات: PBMCs = خلايا الدم أحادية النواة المحيطية ؛ FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع التشتت الأمامي ؛ PerCP = بروتين بيريدينين كروروفيل ؛ PE = فيكوريثرين ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: النتائج التمثيلية لأربع مجموعات فرعية من الخلايا تم عزلها بنجاح بالطريقة الموصوفة. (أ) أرقام فرز الخلايا التمثيلية من عينة الدم المحيطية للمريض المصاب بالحقن العضلي. (ب) أرقام فرز الخلايا التمثيلية من عينة الدم المحيطية لحامل EBV السليم. (ج) أرقام فرز الخلايا التمثيلية من عينة الدم المحيطية للأطفال غير المصابين بفيروس EBV. P1 ، بوابة مؤامرة نقطة لتحديد الخلايا الليمفاوية ؛ P2 ، بوابة رسم نقطية لتحديد خلايا مفردة ؛ P3 ، بوابة مخطط نقطي لتحديد خلايا CD3 + T ؛ P4 ، بوابة مؤامرة نقطية لتحديد الخلايا الليمفاوية CD3- CD19 ؛ P5 ، بوابة مخطط نقطي لتحديد خلايا CD19 + B ؛ P6 ، بوابة مخطط نقطي لتحديد خلايا CD3 + CD8 + T من P3 ؛ P7 ، بوابة مخطط نقطي لتحديد خلايا CD3 + CD4 + T من P3 ؛ P8 ، بوابة رسم نقطية لتحديد خلايا CD16 + / CD56 + NK من P4. الاختصارات: EBV = فيروس إبشتاين بار ؛ IM = عدد كريات الدم البيضاء المعدية. FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ SSC-A = منطقة التشتت الجانبية ؛ FSC-H = ارتفاع التشتت الأمامي ؛ PerCP = بروتين بيريدينين كروروفيل ؛ PE = فيكوريثرين ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| هدف الأجسام المضادة | الفلوروفور المترافق | جرعة | استنساخ | إيزوتايب |
| سي دي 3 | بير سي بي/سيانين5.5 | 2 ميكرولتر | SK7 | الماوس IgG1, κ |
| سي دي 4 | APC / السيانين 7 | 2 ميكرولتر | SK3 | الماوس IgG1, κ |
| سي دي 8 | بيه | 2 ميكرولتر | SK1 | الماوس IgG1, κ |
| سي دي 19 | فيتسي | 2 ميكرولتر | HIB19 | الماوس IgG1, κ |
| سي دي 56 | ايه بي سي | 2 ميكرولتر | 5.1ح11 | الماوس IgG1, κ |
| سي دي 16 | ايه بي سي | 2 ميكرولتر | 3G8 | الماوس IgG1, κ |
الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة لقياس التدفق الخلوي. الاختصارات: PerCP = بروتين بيريدينين كروفيل. PE = فيكوريثرين ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات.
| مرجع التعويض لقياس التدفق الخلوي (٪) | |||||
| بيه | ايه بي سي | APC-Cy7 | فيتسي | بير سي بي-سي 5.5 | |
| بيه | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| ايه بي سي | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| فيتسي | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| بير سي بي-سي 5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
الجدول 2: مرجع التعويض لقياس التدفق الخلوي. الاختصارات: PerCP = بروتين بيريدينين كروفيل. PE = فيكوريثرين ؛ APC = الوفيكوسيانين ؛ FITC = فلوريسئين إيزوثيوسيانات.
| نسبة الخلايا الليمفاوية من مجموعات سكانية فرعية مختلفة في إجمالي الخلايا الليمفاوية المصنفة (٪) | |||
| السكان اللمفاوي | الدردشه | ناقلات EBV صحية | الأطفال غير المصابين بفيروس EBV |
| خلايا CD3+ التائية | 80.5 ± 1.8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| خلايا CD3 + CD8 + T | 46.5 ± 4.0 | 27.0 ± 0.1 | 24.7 ± 2.9 |
| خلايا CD3 + CD4 + T | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| خلايا CD16+/CD56+ NK | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| خلايا CD3- CD19 + B | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
الجدول 3: نسبة الخلايا الليمفاوية المصنفة من مجموعات مختلفة. الاختصارات: EBV = فيروس إبشتاين بار ؛ IM = عدد كريات الدم البيضاء المعدية. NK = القاتل الطبيعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمثل هذا البروتوكول طريقة فعالة لفرز المجموعات الفرعية للخلايا المناعية للدم المحيطي. في هذه الدراسة ، تم اختيار عينات الدم الوريدي من المرضى الذين يعانون من IM ، وناقلات EBV الأصحاء ، والأطفال غير المصابين بفيروس EBV كهدف بحثي. يركز هذا العمل باستخدام الدم المحيطي لمرضى IM بشكل أساسي على تحليل وتحديد نسب مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا من خلال قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان. يستخدم تسلسل Transcriptome بشكل أساسي للكشف عن مجموعة فرعية معينة من الخلايا الليمفاوية وتحليلها والتي لم تكن كافية لإجراء مقارنات شاملة ومحددة للخصائص الجزيئية ووظائف مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا المناعية لدى الأطفال المصابين ب IM في نفس حالة المرض. لذلك ، فإن فرز عدة أنواع من الخلايا من الدم المحيطي وإجراء تسلسل النسخ لمقارنة الاختلافات في جينات التعبير ووظائف هذه الخلايا المناعية يمكن أن يوفر بيانات مهمة لدراسة التسبب في العضلي.
يتميز فرز FACS بفائدة إضافية تتمثل في القدرة على معالجة الخلايا الحية المجزأة لمزيد من التجارب في المختبر أو في الجسم الحي 14. الحفاظ على صلاحية الخلية أمر حيوي للتجارب اللاحقة. لقد قمنا بتحسين خطوة الفرز لتحسين صلاحية الخلية في هذا البروتوكول - تم إجراء عمليات التلاعب التجريبية على الجليد أو في ثلاجة 4 درجات مئوية. سرعة الطرد المركزي المناسبة والوقت أمران حاسمان أيضا لعزل الخلية. إن إنتاج الخلايا المصنفة هو أيضا القيد الرئيسي في هذه الطريقة ، ويمكن أن يؤدي استخدام الأنابيب المطلية ب FBS أثناء الفرز إلى تقليل فقد الخلايا التي تلتصق بالأنابيب بشكل كبير. يمكن أن يؤدي توفير الإعدادات المناسبة لفارز FACS إلى تحسين الكفاءة الكلية للفرز عن طريق تجنب انسداد الخلايا أو التلوث المتبادل في أنبوب التجميع. من خلال تحسين الخطوات والإعدادات التجريبية ، يمكن استقراء هذا البروتوكول لفرز الخلايا المناعية الأخرى عن طريق استبدال الملصقات المغناطيسية أو الفلورية. ومع ذلك ، نظرا لخصوصية عينات الأطفال (انخفاض حجم جمع الدم) ، قمنا فقط بالتحقيق في المجموعات الرئيسية للخلايا المناعية (الخلايا الوحيدة ، والخلايا التائية CD4 + ، والخلايا التائية CD8 + ، والخلايا البائية ، والخلايا القاتلة الطبيعية) دون الشروع في فرز المجموعات السكانية الفرعية بسبب تقييد قناة فرز التدفق. أظهرت هذه الدراسة أن عينات الدم المحيطية من الأطفال ذوي الكفاءة المناعية والعينات من الحقن العضلي يمكن أن تفرز بنجاح هذه المجموعات الخمس من الخلايا المناعية. ومع ذلك ، قد لا يتم فرز عينات الدم للمرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الدموية (مثل سرطان الدم ، سرطان الغدد الليمفاوية) ، واضطرابات التكاثر اللمفاوي (على سبيل المثال ، اضطرابات التكاثر اللمفاوي بعد الزرع ، CAEBV) ، أو نقص المناعة الأولية / متلازمة نقص المناعة المكتسب بنجاح وفقا لهذا البروتوكول.
يعتبر IM مرضا محدودا ذاتيا ، وتلعب الخلايا المناعية مثل الخلايا التائية γδ وخلايا NKT والخلايا القاتلة الطبيعية دورا مهما في الاستجابة المناعية المضادة للفيروسات15. يتم تمييز خلايا CD8 + T الخاصة ب EBV إلى حد كبير نحو النمط الظاهري المستجيب 10،16 ، وهناك تقلص في ذاكرة المستجيب المتأخر وخلاياالمستجيب من IM إلى النقاهة 17. وفي الوقت نفسه ، يبدو أن الخلايا القاتلة الطبيعية في IM معيبة وظيفيا ، بما في ذلك نقص تنشيط الخلية10 ، وفقدان تنشيط إشارات المستقبلات ، و degranulation18. وجدت بعض الدراسات أن الخلايا التائية CD4 + لا يمكنها فقط مساعدة الخلايا التائية CD8 + على قتل الخلايا البائية المصابة بفيروس EBV والقضاء عليها ولكن أيضا تمنع تكاثر الخلايا البائية عن طريق إفراز السيتوكينات وحتى تلعب دورا قاتلا بشكل مباشر أثناء عدوى EBV19,20. كما هو موضح في هذه الدراسة ، لوحظت نسبة متزايدة من خلايا CD3 + CD8 + T في المرضى الذين يعانون من IM مقارنة بكل من حاملي EBV الأصحاء والأطفال غير المصابين بفيروس EBV. في المقابل ، لوحظ انخفاض نسب خلايا CD3 + CD4 + T وخلايا CD19 + B وخلايا CD16 + / CD56 + NK في المرضى الذين يعانون من IM مقارنة بالأطفال غير المصابين بفيروس EBV. ومع ذلك ، فإن الوظيفة والتعبير الجيني لهذه الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المناعية في نفس حالة مرض IM لا تزال غير واضحة. يمكن أن يساعد التحليل الإضافي لملفات تعريف التعبير الجيني لمجموعات فرعية معينة من الخلايا المناعية في IM في اكتساب نظرة ثاقبة للآلية المسببة للأمراض في IM.
نحن نقدم استراتيجية تجمع بين فرز الخرز المغنطيسي المناعي و FACS لعزل وتحليل مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية في PBMCs. يتم فصل الخلايا الوحيدة أولا باستخدام ميكروبيدات CD14 ، ويتم تلطيخ PBMCs المتبقية بأجسام مضادة ذات علامات فلورية مقابلة لفرز خلايا CD4 + T وخلايا CD8 + T والخلايا البائية والخلايا القاتلة الطبيعية من خلال FACS. استخدمنا أيضا هذه الخلايا المصنفة لاستخراج الحمض النووي الريبي وتسلسل النسخ لتوصيف الوظيفة والتعبير الجيني للخلايا المناعية المختلفة في علم الأمراض المناعي للعضلي. كان نقاء وإنتاجية الخلايا المصنفة كافيا بشكل عام لإجراء دراسات التعبير الجيني (البيانات غير معروضة). لذلك ، يمكن استخدام طريقة الفرز لمجموعات فرعية منفصلة من الخلايا المناعية لمواصلة استكشاف الاضطرابات التكاثرية اللمفاوية المرتبطة بفيروس EBV مثل CAEBV ، واضطراب التكاثر اللمفاوي بعد الزرع للكشف عن الجينات المسببة للأمراض والبروتينات المسببة للأمراض والأهداف العلاجية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82002130) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7222059) وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
