Summary
Vi beskriver en metode, der kombinerer immunmagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering for at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer af mononukleære celler i perifert blod (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og naturlige dræberceller). Ved hjælp af denne metode kan magnetiske og fluorescerende mærkede celler renses og analyseres.
Abstract
Infektiøs mononukleose (IM) er et akut syndrom, der hovedsagelig er forbundet med primær Epstein-Barr-virus (EBV) infektion. De vigtigste kliniske symptomer omfatter uregelmæssig feber, lymfadenopati og signifikant øgede lymfocytter i perifert blod. Den patogene mekanisme for IM er stadig uklar; Der er ingen effektiv behandlingsmetode til det, hvor hovedsageligt symptomatiske terapier er tilgængelige. Hovedspørgsmålet i EBV-immunbiologi er, hvorfor kun en lille delmængde af inficerede individer viser alvorlige kliniske symptomer og endda udvikler EBV-associerede maligniteter, mens de fleste individer er asymptomatiske for livet med virussen.
B-celler er først involveret i IM, fordi EBV-receptorer præsenteres på deres overflade. Naturlige dræberceller (NK) er cytotoksiske medfødte lymfocytter, der er vigtige for at dræbe EBV-inficerede celler. Andelen af CD4 + T-celler falder, mens CD8 + T-celler udvides dramatisk under akut EBV-infektion, og persistensen af CD8 + T-celler er vigtig for livslang kontrol af IM. Disse immunceller spiller vigtige roller i IM, og deres funktioner skal identificeres separat. Til dette formål adskilles monocytter først fra perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) af IM-individer ved hjælp af CD14-mikroperler, en søjle og en magnetisk separator.
De resterende PBMC'er er farvet med peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceinisothiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 og APC anti-CD16 antistoffer til sortering af CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler og NK-celler ved hjælp af et flowcytometer. Desuden blev transkriptomsekventering af fem subpopulationer udført for at udforske deres funktioner og patogene mekanismer i IM.
Introduction
Epstein-Barr-virus (EBV), et γ-herpesvirus, også kendt som human herpesvirus type 4, er allestedsnærværende i den menneskelige befolkning og etablerer livslang latent infektion hos mere end 90% af den voksne befolkning1. De fleste EBV-primære infektioner forekommer i barndommen og ungdommen, hvor en brøkdel af patienterne manifesterer sig med infektiøs mononukleose (IM)2, der viser karakteristisk immunopatologi, herunder et aktiveret immunrespons med CD8 + T-celler i blod og en forbigående proliferation af EBV-inficerede B-celler i oropharynx3. Forløbet af IM kan vare i 2-6 uger, og størstedelen af patienterne kommer sig godt4. Imidlertid udvikler nogle individer vedvarende eller tilbagevendende IM-lignende symptomer med høj sygelighed og dødelighed, som er klassificeret som kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV)5. Derudover er EBV en vigtig onkogen virus, som er tæt forbundet med en række maligniteter, herunder epithelioid og lymfoid maligniteter såsom asnasopharyngeal carcinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) og T / NK-cellelymfom6. Selvom EBV er blevet undersøgt i over 50 år, er dets patogenese og den mekanisme, hvormed det inducerer spredning af lymfocytter, ikke blevet fuldt belyst.
Flere undersøgelser har undersøgt de molekylære signaturer for immunpatologien af EBV-infektion ved transkriptomsekventering. Zhong et al. analyserede heltranskriptomprofilering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) fra kinesiske børn med IM eller CAEBV for at finde ud af, at CD8 + T-celleudvidelse overvejende blev fundet i IM-gruppe7, hvilket tyder på, at CD8 + T-celler kan spille en vigtig rolle i IM. Tilsvarende fandt en anden undersøgelse lavere andele af EBV-specifikke cytotoksiske T- og CD19+ B-celler og højere procentdele af CD8+ T-celler hos patienter med IM forårsaget af primær EBV-infektion end hos patienter med IM forårsaget både af EBV-reaktivering og andre midler8. B-celler er først involveret i IM, fordi EBV-receptorer præsenteres på deres overflade. Al Tabaa et al. fandt, at B-celler var polyklonalt aktiverede og differentierede intoplasmablaster (CD19+, CD27+ og CD20− og CD138− celler) og plasmaceller (CD19+, CD27+ og CD20− og CD138+) under IM9. Desuden fandt Zhong et al., at monocytmarkører CD14 og CD64 blev opreguleret i CAEBV, hvilket tyder på, at monocytter kan spille en vigtig rolle i CAEBV's cellulære immunrespons gennem antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) og hyperaktiv fagocytose7. Alka et al. karakteriserede transkriptomet af MACS sorterede CD56dim CD16+ NK-celler fra fire patienter med IM eller HL og fandt ud af, at NK-celler fra både IM og HL havde nedreguleret medfødt immunitet og kemokinsignaleringsgener, som kunne være ansvarlige for hyporesponsen af NK-celler10. Derudover analyserede Greenough et al. genekspression af sorterede CD8 + T-celler fra 10 PBMC'er af personer med IM. De rapporterede, at en stor del af CD8 + T-celler i IM var virusspecifikke, aktiverede, delte og primerede til at udøve effektoraktiviteter11. Både T-cellemedierede, EBV-specifikke reaktioner og NK-cellemedierede, uspecifikke reaktioner spiller væsentlige roller under primær EBV-infektion. Disse undersøgelser undersøgte imidlertid kun transkriptomresultaterne af den forskelligartede blanding af immunceller eller kun en bestemt subpopulation af lymfocytter, hvilket ikke er tilstrækkeligt til en omfattende sammenligning af de molekylære egenskaber og funktioner hos forskellige immuncelleunderpopulationer hos børn med IM i samme sygdomstilstand.
Dette papir beskriver en metode, der kombinerer immunomagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer af PBMC'er (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler). Ved hjælp af denne metode kan magnetiske og fluorescerende mærkede celler renses ved hjælp af en magnetisk separator og FACS eller analyseres ved flowcytometri. RNA kan ekstraheres fra de oprensede celler til transkriptomsekventering. Denne metode vil muliggøre karakterisering og genekspression af forskellige immunceller i samme sygdomstilstande hos personer med IM, hvilket vil udvide vores forståelse af immunpatologien af EBV-infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodprøver blev taget fra patienter med IM (n = 3), raske EBV-bærere (n = 3) og EBV-uinficerede børn (n = 3). Frivillige blev rekrutteret fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, og alle undersøgelser blev etisk godkendt. Etisk godkendelse blev opnået af den etiske komité for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: [2021]-E-056-Y). Informeret samtykke fra patienter blev frafaldet, da undersøgelsen kun brugte de resterende prøver til klinisk test. Alle data blev fuldt afidentificeret og anonymiseret for at beskytte patientens privatliv.
1. Isolering af PBMC'er fra perifert blod
- Indsaml frisk perifert blod (2 ml) fra patienter med IM i K3EDTA-rør ved standard venipunktur.
BEMÆRK: Processen skal være hurtig for at opretholde cellens levedygtighed. - Fortynd perifert blod til dobbelt volumen med fosfatbufferet saltvand (PBS) og læg det oven på humant lymfocytseparationsmedium (densitet: 1,077 ± 0,001 g / ml) i et 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Volumenforholdet mellem blod, PBS og separationsmedium var 1: 1: 1. Tilsæt blodet langsomt til separationsmediet, og centrifuge straks for at undgå, at blod sætter sig i separationsmediet. - Centrifuge ved 800 × g i 20 min ved stuetemperatur. Overfør mellemlaget (berigede PBMC'er) til et andet 15 ml centrifugerør.
BEMÆRK: Efter centrifugering er der i bunden af røret erythrocytter, mellemlaget er separationsmediet, det øverste lag er plasma, og mellem plasmalaget og separationslaget var PBMC'erne (inklusive lymfocytter og monocytter). - PBMC'erne vaskes med 10 ml PBS, og centrifuge ved 800 × g i 20 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten omhyggeligt.
- Gentag vask og centrifugering (trin 1.4) 2 x. Resuspend PBMC'erne med 1 ml PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og tæl cellerne med en trypan blåbaseret, automatiseret tæller.
2. Isolering af CD14 + monocytter fra PBMC'er ved hjælp af CD14 mikroperler
- Der fremstilles en bufferopløsning indeholdende 0,5% føtalt bovint serum (FBS) og 2 mM EDTA i PBS (pH 7,2). Hold bufferen kold (2-8 °C).
BEMÆRK: Afgas bufferen før brug, da luftbobler kan blokere søjlen. Hold cellerne kolde for at forhindre afdækning af antistofferne på celleoverfladen og ikke-specifik cellemærkning. - Centrifuge PBMC'erne ved 300 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten omhyggeligt. Resuspender cellerne med 80 μL af bufferen. Tilsæt 20 μL CD14 mikroperler til cellesuspensionen.
BEMÆRK: Hvis der er ≤107 PBMC'er, skal du bruge det volumen, der er angivet ovenfor. Hvis der er >107 PBMC'er, skal du proportionalt øge alle reagensvolumener og det samlede volumen. - Bland CD14-mikroperlerne og cellerne godt i 1,5 ml mikrocentrifugerøret og inkuber i 15 minutter i et 4 °C køleskab. PBMC'erne vaskes med 1 ml buffer og centrifuge ved 300 × g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten helt. Resuspender cellerne med 500 μL af bufferen.
BEMÆRK: Hvis der er ≤108 PBMC'er, skal du bruge det volumen, der er angivet ovenfor. Hvis der er >108 PBMC'er, skal du øge buffervolumenet proportionalt. - Magnetisk adskillelse med søjler:
- Sæt søjlen på magnetperleseparatoren, og vask søjlen med 3 ml buffer. Føj cellesuspensionen (fra trin 2.3) til kolonnen.
- Saml de umærkede celler, der passerer gennem søjlen i et 15 ml centrifugerør, og vask søjlen med 3 ml buffer. Vask søjlen med 3 x 3 ml buffer. Det samlede spildevand opsamles i centrifugerøret på 15 ml.
- Placer søjlen i et nyt 15 ml centrifugerør. Tilsæt 5 ml buffer til kolonnen. Skub stemplet godt ind i søjlen for straks at skylle de magnetisk mærkede celler ud i 15 ml centrifugerøret.
- Centrifuger de magnetisk mærkede celler ved 300 × g i 5 minutter og fjern supernatanten. Resuspenderer cellerne i 500 μL PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør til brug i efterfølgende transkriptomsekventering.
3. Adskillelse af lymfocytpopulationer fra PBMC'er ved fluorescerende mærket antistoffarvning og FACS
- De umærkede celler centrifugeres (trin 2.4.2) ved 300 × g i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Resuspender cellerne i 100 μL PBS i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilsæt 2 μL af hvert mærket antistof (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) til 100 μL cellesuspension (volumener og konjugerede fluorophoroplysninger om antistoffer er vist i tabel 1), inkuberes på is i 30 min, og beskyt mod lys.
- Cellerne vaskes 2 x ved tilsætning af 1 ml PBS og centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter ved stuetemperatur. Resuspender cellerne i 500 μL PBS i 1,5 ml mikrocentrifugerøret. Hvirvel cellesuspensionen forsigtigt, før du får data på et flowcellesortercytometer.
4. Indstilling af flowcytometriparameter
- Tag 100 μL af cellesuspensionen (se punkt 1) i 1,5 ml mikrocentrifugerør efter behov, og opsæt en negativ kontrolprøve, en CD3-enkeltfarvningsprøve, en CD4-enkeltfarvningsprøve, en CD8-enkeltfarvningsprøve, en CD19-enkeltfarvningsprøve og en CD56/CD16-farvningsprøve.
- Der tilsættes 2 μL fluorescerende mærket antistof pr. 100 μL af cellesuspensionen og hvirvelstrømmen. Inkuber på is i 30 minutter i mørke. Centrifuge i 5 min ved 300 × g og opsug supernatanten. Resuspender pellets med 500 μL PBS og hvirvel.
- Idriftsættelse af sorteringsstrømmen og forsinkelse af dråberne ved hjælp af fluorescerende perler som følger:
- Åbn cellesorteringssystemet, kør tændingsprogrammet, installer 85 μm dysen, og åbn sorteringsstrømmen. Indstil sorteringsspændingen til 4.500 V og Freq til 47.
- Juster parametrene hovedsageligt ved at justere hovedstrømsdråbebrudpunktet og dråbeforsinkelsen i henhold til producentens anvisninger12. Indstil den første slipsepunktposition (Drop1) til 275 og Gap til 8 i vinduet Breakoff . Tænd for Sweet Spot automatisk sorteringstilstand for at tillade cytometri automatisk at bestemme dråbeamplitudeværdien for at stabilisere strømmen.
- Juster dråbeforsinkelsen til 30,31 i sidestrømsvinduet ved at lægge de fluorescerende perler, hvilket sikrer, at perlerne opnår en sidestrømsafbøjning på >99% i enten indledende eller finjusteringstilstand.
- Se gating-strategien vist i figur 1 for at udføre gating som følger:
- Brug et fremadgående spredningsområde (FSC-A) / sidespredningsområde (SSC-A) prikplot til at tegne polygonporten (P1) for at identificere den intakte lymfocytpopulation .
- Brug et FSC-A/FSC-højde (FSC-H) prikplot til at tegne polygonporten (P2) for at identificere de enkelte celler og udelukke dubletter (figur 1A).
- Brug et CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A prikplot til at tegne den rektangulære port (P3) for at vælge CD3+ T-celler og CD19+ B-celler (figur 1A,B).
- Brug et CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A prikplot til at tegne en rektangulær port for at vælge CD4+ T-celler og CD8+ T-celler (celler med høj fluorescens for disse markører).
- Brug et cd56/CD16 APC-A/SSC-A-punktdiagram til at tegne en rektangulær port for at vælge CD56+/CD16+ NK-celler (figur 1C).
- Juster instrumentelle parametre ved hjælp af den negative kontrolprøve:
- Installer det negative kontrolrør på lasteporten, og klik på Indlæs i Acquisition Dashboard. Vælg cytometerindstillingerne i softwaren.
- I vinduet Inspektør skal du klikke på fanen Parametre og justere spændingerne for FSC, SSC og forskellige fluorescerende farvestoffer; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- Juster kompensationen ved hjælp af enkeltfarvede prøver13.
- Læg de enkeltfarvede rør på cytometrien sekventielt, og vælg Cytometerindstillinger i softwaren. Klik på fanen Kompensation for at justere kompensationen.
BEMÆRK: Kompensationsreferencen for flowcytometri er vist i tabel 2.
- Læg de enkeltfarvede rør på cytometrien sekventielt, og vælg Cytometerindstillinger i softwaren. Klik på fanen Kompensation for at justere kompensationen.
5. Cellesortering og indsamling af data via flowcytometri
- Hvirvel cellesuspensionen (adskilte PBMC'er i henhold til punkt 1-3) kort for at resuspendere cellerne, før røret lægges i cytometeret. Hold de resterende rør på is.
- Tilsæt 200 μL FBS til fire opsamlingsstrømningsrør for at undgå at klæbe de sorterede celler til rørvæggen og læg dem i cytometeropsamlingskammeret.
- Der indsamles CD3+CD4+ T-celler, CD3+CD8+ T-celler, CD3−CD19+ B-celler og CD3− CD56+/CD16+ NK-celler separat fra prøven af en patient med IM i de fire flowrør (figur 2A).
- Centrifuge de adskilte celler ved 300 × g i 5 minutter og fjern supernatanten. Tilsæt 200 μL RNA-isolationsreagens til cellerne til transkriptomsekventering.
- Adskil immuncelleunderpopulationerne af prøver fra raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn i henhold til ovenstående trin (figur 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Henvisning til gating-strategien
Gating-strategien, der blev brugt til at sortere de fire lymfocytunderpopulationer, er vist i figur 1. Kort fortalt vælges lymfocytter (P1) på et prikplot, der viser granulositeten (SSC-A) versus størrelse (FSC-A). Derefter vælges enkeltceller (P2) på et prikplot, der viser størrelsen (FSC-A) versus fremadgående spredning (FSC-H), mens dubletceller er udelukket. CD3+ T-celler (P3) og CD19+ B-celler (figur 1B) vælges separat på et prikdiagram, der viser CD3 PerCP-Cy5.5-A versus CD19 FITC-A. CD8+ T-celler og CD4+ T-celler vælges separat på et prikplot, der viser CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A fra P3. CD16+/CD56+ NK-celler vælges på et prikdiagram, der viser CD56/CD16 APC-A versus SSC-A fra P4 (figur 1C).
De repræsentative resultater af fire cellesubpopulationer sorteret fra prøverne af patienter med IM ved den beskrevne metode er vist i figur 2A. Vi udførte også cellesortering på prøver fra raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn som kontrolgrupper for at bekræfte gennemførligheden af dette eksperiment. De repræsentative resultater af celleunderpopulationer adskilt fra en rask EBV-bærers prøve er vist i figur 2B. Det repræsentative resultat af celleunderpopulationer sorteret fra stikprøven af EBV-uinficerede børn er vist i figur 2C. Som vist i figur 2 blev P1 gated for at identificere lymfocytter, og dubletceller blev udelukket gennem P2; P3 blev gated for at vælge CD3 + T-celler, og P5 blev gated for at vælge CD19 + B-celler; CD3+ CD8+ T-celler (P6) og CD3+ CD4+ T-celler (P7) blev valgt separat fra P3; CD16+/CD56+ NK-celler (P8) blev valgt fra P4. Hver af disse underpopulationer kan sorteres individuelt og indsamles til downstream-eksperimenter. Dette system blev brugt til at analysere genekspression gennem RNA-ekstraktion og transkriptomsekventering.
Som rapporteret i tabel 3 blev der observeret en stigning i CD3+ CD8+ T-celler hos patienter med IM sammenlignet med både raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 og 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % CD3+ CD8+ T-celler pr. total lymfocytter); Faldende andele af CD3+ CD4+ T-celler og CD19+ B-celler blev observeret hos patienter med IM sammenlignet med raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn (13,4 ± 1,5 vs. 19,3 ± 1,5 og 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % CD3+ CD4+ T-celler pr. total lymfocytter; 1,4 ± 0,3 vs. 7,6 ± 0,7 og 1,4 ± 0,3 vs. 9,0 ± 1,5, % CD19+ B-celler pr. total lymfocytter). Faldende andele af CD16+/CD56+ NK-celler blev observeret hos patienter med IM sammenlignet med EBV-uinficerede børn (7,5 ± 0,5 vs. 10,7 ± 0,4, % CD16+/CD56+ NK-celler pr. total lymfocytter). Disse resultater validerede effektiviteten af denne sorteringsprotokol og viste, at andelen af lymfocytundergrupper er forskellig hos patienter med IM- og EBV-uinficerede børn.
Figur 1: Samlet gating-strategi, der bruges til at sortere immuncelleunderpopulationer fra PBMC'er . (A) PerCP-Cy5.5-filteret blev brugt til at adskille CD3 + T-celler. CD8+ T-celler og CD4+ T-celler blev valgt separat på et prikplot, der viser CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A fra P3. (B) FITC-filteret blev brugt til at identificere CD19+ B-celler. (C) APC-filteret blev brugt til at adskille CD16+/CD56+ NK-celler fra P4. Forkortelser: PBMC'er = mononukleære celler i perifert blod; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; SSC-A = side spredningsområde; FSC-H = fremadgående spredningshøjde; PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative resultater af fire celleunderpopulationer, der med succes er isoleret ved den beskrevne metode. (A) Repræsentative cellesorteringstal fra den perifere blodprøve fra patient med IM. (B) Repræsentative cellesorteringstal fra den perifere blodprøve fra sund EBV-bærer. (C) Repræsentative cellesorteringstal fra den perifere blodprøve af EBV-uinficerede børn. P1, dot plot gate for at identificere lymfocytter; P2, dot plot gate for at vælge enkeltceller; P3, dot plot gate for at vælge CD3 + T-celler; P4, dot plot gate til identifikation af CD3- CD19- lymfocytter; P5, dot plot gate for at vælge CD19 + B-celler; P6, dot plot gate for at vælge CD3 + CD8 + T-celler fra P3; P7, dot plot gate for at vælge CD3 + CD4 + T-celler fra P3; P8, dot plot gate for at vælge CD16 + / CD56 + NK celler fra P4. Forkortelser: EBV = Epstein–Barr virus; IM = infektiøs mononukleose; FSC-A = fremadrettet spredningsområde; SSC-A = side spredningsområde; FSC-H = fremadgående spredningshøjde; PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Antistof mål | Konjugeret fluorophore | Dosering | Klon | Isotype |
| C3 | PerCP/Cyanine5.5 | 2 μL | SK7 | Mus IgG1, κ |
| Cd4 | APC/Cyanine7 | 2 μL | SK3 | Mus IgG1, κ |
| Cd8 | PE | 2 μL | SK1 | Mus IgG1, κ |
| Cd19 | Faktaboks | 2 μL | HIB19 | Mus IgG1, κ |
| Cd56 | APC | 2 μL | 5,1H11 | Mus IgG1, κ |
| Cd16 | APC | 2 μL | 3G8 | Mus IgG1, κ |
Tabel 1: Antistoffer anvendt til flowcytometri. Forkortelser: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat.
| Kompensationsreference for flowcytometri (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 | Faktaboks | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| Faktaboks | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabel 2: Kompensationsreference for flowcytometri. Forkortelser: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanin; FITC = fluoresceinisothiocyanat.
| Andel af lymfocytter fra forskellige delpopulationer i samlede sorterede lymfocytter (%) | |||
| Lymfocytter subpopulation | IM | sunde EBV-luftfartsselskaber | EBV-uinficerede børn |
| CD3+ T-celler | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| CD3+ CD8+ T-celler | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| CD3+ CD4+ T-celler | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| CD16+/CD56+ NK-celler | 7,5 ± 0,5 | 2.2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- CD19+ B-celler | 1.4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9.0 ± 1.5 |
Tabel 3: Andelen af sorterede lymfocytter fra forskellige grupper. Forkortelser: EBV = Epstein–Barr virus; IM = infektiøs mononukleose; NK = naturlig dræber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol repræsenterer en effektiv måde at sortere perifere blodimmuncelleunderpopulationer på. I denne undersøgelse blev venøse blodprøver fra patienter med IM, raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn valgt som forskningsmål. Dette arbejde ved hjælp af perifert blod fra patienter i IM fokuserer primært på at analysere og bestemme proportionerne af forskellige celleundergrupper gennem flerfarvet flowcytometri. Transkriptomsekventering anvendes hovedsageligt til påvisning og analyse af en bestemt subpopulation af lymfocytter, der var utilstrækkelig til de omfattende og specifikke sammenligninger af de molekylære egenskaber og funktioner hos forskellige immuncelleunderpopulationer hos børn med IM i samme sygdomstilstand. Derfor kan sortering af flere typer celler fra det perifere blod og udførelse af transkriptomsekventering for at sammenligne forskellene i ekspressionsgener og funktioner i disse immunceller give betydelige data til undersøgelsen af patogenesen af IM.
FACS-sortering har den yderligere fordel, at den kan behandle levende, fraktionerede celler til yderligere in vitro- eller in vivo-eksperimenter 14. Opretholdelse af cellens levedygtighed er afgørende for efterfølgende eksperimenter. Vi har optimeret sorteringstrinnet for at forbedre cellelevedygtigheden i denne protokol-eksperimentelle manipulationer er blevet udført på is eller i et 4 °C køleskab. Korrekt centrifugeringshastighed og tid er også afgørende for celleisolering. Udbyttet af sorterede celler er også den største begrænsning i denne metode, og brugen af FBS-belagte rør under sortering kan i høj grad reducere tabet af celler, der klæber til rørene. Tilvejebringelse af de korrekte indstillinger for FACS-sorteringen kan forbedre sorteringens samlede effektivitet ved at undgå celleblokering eller krydskontaminering i opsamlingsrøret. Gennem optimering af eksperimentelle trin og indstillinger kan denne protokol ekstrapoleres til sortering af andre immunceller ved at erstatte magnetiske eller fluorescerende etiketter. På grund af specificiteten af børnenes prøver (lav blodindsamlingsvolumen) undersøgte vi imidlertid kun de største populationer af immunceller (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler) uden at fortsætte med at sortere underpopulationer på grund af begrænsningen af flowsorteringskanalen. Denne undersøgelse viste, at perifere blodprøver fra immunkompetente børn og prøver fra IM med succes kunne sortere disse fem grupper af immunceller; blodprøver fra patienter med hæmatologiske maligniteter (f.eks. leukæmi, lymfom), lymfoproliferative lidelser (f.eks. posttransplanterede lymfoproliferative lidelser, CAEBV) eller primært immundefekt/erhvervet immundefektsyndrom sorteres muligvis ikke korrekt i henhold til denne protokol.
IM betragtes som en selvbegrænsende sygdom, og immunceller såsom γδ T-celler, NKT-celler og NK-celler spiller en væsentlig rolle i det antivirale immunrespons15. EBV-specifikke CD8+ T-celler er stort set differentieret mod en effektorfænotype10,16, og der er sammentrækning af seneffektorhukommelse og effektorceller fra IM til rekonvalescens 17. I mellemtiden synes NK-celler i IM at være funktionelt defekte, herunder mangel på celleaktivering10, tab af aktiverende receptorsignalering og degranulering18. Nogle undersøgelser har vist, at CD4 + T-celler ikke kun kan hjælpe CD8 + T-celler med at dræbe og eliminere EBV-inficerede B-celler, men også hæmme spredningen af B-celler ved at udskille cytokiner og endda direkte spille en dræbende rolle under EBV-infektion 19,20. Som vist i denne undersøgelse blev der observeret en øget andel af CD3+ CD8+ T-celler hos patienter med IM sammenlignet med både raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn. I modsætning hertil blev der observeret faldende andele af CD3+ CD4+ T-celler, CD19+ B-celler og CD16+/CD56+ NK-celler hos patienter med IM sammenlignet med EBV-uinficerede børn. Imidlertid forbliver funktionen og genekspressionen af disse forskellige undertyper af immunceller i samme sygdomstilstand af IM uklare. Yderligere analyse af genekspressionsprofilerne for specifikke immuncelleundergrupper i IM kan bidrage til at få indsigt i den patogene mekanisme af IM.
Vi leverer en strategi, der kombinerer immunmagnetisk perlesortering og FACS til at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer i PBMC'er. Monocytter adskilles først ved hjælp af CD14-mikroperler, og de resterende PBMC'er farves med tilsvarende fluorescerende mærkede antistoffer til sortering af CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler gennem FACS. Vi brugte yderligere disse sorterede celler til RNA-ekstraktion og transkriptomsekventering til at karakterisere funktionen og genekspressionen af forskellige immunceller i immunpatologien af IM. Renheden og udbyttet af de sorterede celler var generelt tilstrækkeligt til at gennemføre genekspressionsundersøgelser (data ikke vist). Derfor kan sorteringsmetoden for separate immuncelleunderpopulationer bruges til yderligere at udforske EBV-associerede lymfoproliferative lidelser såsom CAEBV, posttransplanteret lymfoproliferativ lidelse for at detektere patogene gener, patogene proteiner og potentielle terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
