Summary
We beschrijven een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van perifere mononucleaire bloedcellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en natural killer-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd en geanalyseerd.
Abstract
Infectieuze mononucleosis (IM) is een acuut syndroom dat meestal wordt geassocieerd met primaire Epstein-Barr-virus (EBV) -infectie. De belangrijkste klinische symptomen zijn onregelmatige koorts, lymfadenopathie en significant verhoogde lymfocyten in perifeer bloed. Het pathogene mechanisme van IM is nog onduidelijk; er is geen effectieve behandelmethode voor, waarbij voornamelijk symptomatische therapieën beschikbaar zijn. De belangrijkste vraag in EBV-immunobiologie is waarom slechts een kleine subgroep van geïnfecteerde personen ernstige klinische symptomen vertoont en zelfs EBV-geassocieerde maligniteiten ontwikkelt, terwijl de meeste personen asymptomatisch zijn voor het leven met het virus.
B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Natural killer (NK) cellen zijn cytotoxische aangeboren lymfocyten die belangrijk zijn voor het doden van EBV-geïnfecteerde cellen. Het aandeel CD4+ T-cellen neemt af, terwijl dat van CD8+ T-cellen dramatisch uitbreidt tijdens acute EBV-infectie, en de persistentie van CD8+ T-cellen is belangrijk voor levenslange controle van IM. Die immuuncellen spelen een belangrijke rol in IM en hun functies moeten afzonderlijk worden geïdentificeerd. Voor dit doel worden monocyten eerst gescheiden van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) van IM-individuen met behulp van CD14-microbeads, een kolom en een magnetische separator.
De resterende PBMC's zijn gekleurd met peridinine-chlorofyl-eiwit (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanine (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 en APC anti-CD16 antilichamen om CD4+ T cellen, CD8+ T cellen, B cellen en NK cellen te sorteren met behulp van een flow cytometer. Bovendien werd transcriptoomsequencing van vijf subpopulaties uitgevoerd om hun functies en pathogene mechanismen in IM te onderzoeken.
Introduction
Epstein-Barr-virus (EBV), een γ-herpesvirus ook bekend als humaan herpesvirus type 4, is alomtegenwoordig in de menselijke bevolking en vestigt levenslange latente infectie bij meer dan 90% van de volwassen bevolking1. De meeste PRIMAIRE EBV-infecties treden op tijdens de kindertijd en adolescentie, waarbij een fractie van de patiënten zich manifesteert met infectieuze mononucleosis (IM)2, met karakteristieke immunopathologie, waaronder een geactiveerde immuunrespons met CD8+ T-cellen in het bloed en een voorbijgaande proliferatie van EBV-geïnfecteerde B-cellen in de orofarynx3. Het verloop van IM kan 2-6 weken duren en de meerderheid van de patiënten herstelt goed4. Sommige personen ontwikkelen echter aanhoudende of terugkerende IM-achtige symptomen met een hoge morbiditeit en mortaliteit, die is geclassificeerd als chronische actieve EBV-infectie (CAEBV)5. Bovendien is EBV een belangrijk oncogene virus, dat nauw verwant is aan een verscheidenheid aan maligniteiten, waaronder epithelioïde en lymfoïde maligniteiten zoalsnasofaryngeaal carcinoom, Burkitt-lymfoom, Hodgkin-lymfoom (HL) en T / NK-cellymfoom6. Hoewel EBV al meer dan 50 jaar wordt bestudeerd, zijn de pathogenese en het mechanisme waarmee het de proliferatie van lymfocyten induceert, niet volledig opgehelderd.
Verschillende studies hebben de moleculaire handtekeningen voor de immunopathologie van EBV-infectie onderzocht door transcriptoomsequencing. Zhong et al. analyseerden volledige transcriptoomprofilering van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) van Chinese kinderen met IM of CAEBV om te ontdekken dat CD8 + T-celexpansie voornamelijk werd gevonden in de IM-groep7, wat suggereert dat CD8 + T-cellen een belangrijke rol kunnen spelen bij IM. Evenzo vond een andere studie lagere percentages EBV-specifieke cytotoxische T- en CD19 + B-cellen en hogere percentages CD8 + T-cellen bij patiënten met IM veroorzaakt door primaire EBV-infectie dan bij patiënten met IM veroorzaakt door zowel EBV-reactivatie als andere middelen8. B-cellen zijn voor het eerst betrokken bij IM omdat EBV-receptoren op hun oppervlak worden gepresenteerd. Al Tabaa et al. vonden dat B-cellen polyclonaal geactiveerd en gedifferentieerd waren inplasmablasten (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138− cellen) en plasmacellen (CD19+, CD27+ en CD20−, en CD138+) tijdens IM9. Bovendien vonden Zhong et al. dat monocytmarkers CD14 en CD64 werden geupreguleerd in CAEBV, wat suggereert dat monocyten een belangrijke rol kunnen spelen in de cellulaire immuunrespons van CAEBV via antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) en hyperactieve fagocytose7. Alka et al. karakteriseerden het transcriptoom van MACS gesorteerde CD56dim CD16+ NK cellen van vier patiënten van IM of HL en vonden dat NK-cellen van zowel IM als HL gedownreguleerde aangeboren immuniteit en chemokine signaleringsgenen hadden, die verantwoordelijk zouden kunnen zijn voor de hyporesponsiviteit van NK-cellen10. Daarnaast analyseerden Greenough et al. genexpressie van gesorteerde CD8 + T-cellen van 10 PBMC's van personen met IM. Ze meldden dat een groot deel van de CD8 + T-cellen in IM virusspecifiek, geactiveerd, delend en klaargestoomd waren om effectoractiviteiten uit te oefenen11. Zowel T-cel-gemedieerde, EBV-specifieke responsen als NK-cel-gemedieerde, niet-specifieke responsen spelen essentiële rollen tijdens primaire EBV-infectie. Deze studies onderzochten echter alleen de transcriptoomresultaten van het diverse mengsel van immuuncellen of alleen een bepaalde subpopulatie van lymfocyten, wat niet voldoende is voor de uitgebreide vergelijking van de moleculaire kenmerken en functies van verschillende immuuncelsubpopulaties bij kinderen met IM in dezelfde ziektetoestand.
Dit artikel beschrijft een methode die immunomagnetische kralen en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties van PBMC's (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en NK-cellen) te isoleren en te analyseren. Met behulp van deze methode kunnen magnetische en fluorescerend gelabelde cellen worden gezuiverd met behulp van een magnetische separator en FACS of worden geanalyseerd door flowcytometrie. RNA kan uit de gezuiverde cellen worden geëxtraheerd voor transcriptoomsequencing. Deze methode zal de karakterisering en genexpressie van verschillende immuuncellen in dezelfde ziektetoestanden van personen met IM mogelijk maken, wat ons begrip van de immunopathologie van EBV-infectie zal vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloedmonsters werden verkregen van patiënten met IM (n = 3), gezonde EBV-dragers (n = 3) en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (n = 3). Vrijwilligers werden gerekruteerd uit het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, en alle studies werden ethisch goedgekeurd. Ethische goedkeuring werd verkregen door de ethische commissie van het Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (goedkeuringsnummer: [2021]-E-056-Y). Er werd afgezien van geïnformeerde toestemming van patiënten, omdat de studie alleen de resterende monsters gebruikte voor klinische tests. Alle gegevens werden volledig gedeïdentificeerd en geanonimiseerd om de privacy van patiënten te beschermen.
1. Isolatie van PBMC's uit perifeer bloed
- Verzamel vers perifeer bloed (2 ml) van patiënten met IM in K3EDTA-buizen door standaard venapunctie.
OPMERKING: Het proces moet snel zijn om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. - Verdun perifeer bloed tot een tweevoudig volume met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en leg het bovenop het menselijke lymfocytenscheidingsmedium (dichtheid: 1,077 ± 0,001 g / ml) in een centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: De volumeverhouding van bloed, PBS en scheidingsmedium was 1:1:1. Voeg het bloed langzaam toe aan het scheidingsmedium en centrifugeer onmiddellijk om te voorkomen dat bloed in het scheidingsmedium bezinkt. - Centrifugeer bij 800 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Breng de middelste laag (verrijkte PBMC's) over naar een andere centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: Na centrifugatie bevinden zich aan de onderkant van de buis erytrocyten, de middelste laag is het scheidingsmedium, de bovenste laag is plasma en tussen de plasmalaag en de scheidingsvloeistoflaag bevonden zich de PBMC's (inclusief lymfocyten en monocyten). - Was de PBMC's met 10 ml PBS en centrifugeer op 800 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur; gooi het supernatant voorzichtig weg.
- Herhaal het wassen en centrifugeren (stap 1.4) 2 x. Resuspendeer de PBMC's met 1 ml PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en tel de cellen met een op trypan blue gebaseerde, geautomatiseerde teller.
2. Isolatie van CD14 + monocyten van PBMC's met behulp van CD14 microbeads
- Bereid een bufferoplossing met 0,5% foetaal runderserum (FBS) en 2 mM EDTA in PBS (pH 7,2). Houd de buffer koud (2−8 °C).
OPMERKING: Ontgas de buffer voor gebruik, omdat luchtbellen de kolom kunnen blokkeren. Houd de cellen koud om te voorkomen dat de antilichamen op het celoppervlak worden afgedekt en niet-specifieke celetikettering. - Centrifugeer de PBMC's op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant voorzichtig weg. Resuspendeer de cellen met 80 μL van de buffer. Voeg 20 μL CD14 microbeads toe aan de celsuspensie.
OPMERKING: Als er ≤ 107 PBMC's zijn, gebruik dan het hierboven aangegeven volume. Als er > 107 PBMC's zijn, verhoog dan proportioneel alle reagensvolumes en het totale volume. - Meng de CD14 microbeads en de cellen goed in de 1,5 ml microcentrifugebuis en incubeer gedurende 15 minuten in een koelkast van 4 °C. Was de PBMC's met 1 ml buffer en centrifugeer op 300 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant volledig weg. Resuspendeer de cellen met 500 μL van de buffer.
OPMERKING: Als er ≤ 108 PBMC's zijn, gebruik dan het hierboven aangegeven volume. Als er > 108 PBMC's zijn, verhoog dan proportioneel het buffervolume. - Magnetische scheiding met kolommen:
- Plaats de kolom op de magnetische kraalscheider en was de kolom met 3 ml buffer. Voeg de celsuspensie (uit stap 2.3) toe aan de kolom.
- Verzamel de niet-gelabelde cellen die door de kolom gaan in een centrifugebuis van 15 ml en was de kolom met 3 ml buffer. Was de kolom met 3 x 3 ml buffer. Verzamel het totale effluent in de centrifugebuis van 15 ml.
- Plaats de kolom in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Voeg 5 ml buffer toe aan de kolom. Duw de zuiger stevig in de kolom om de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk in de centrifugebuis van 15 ml te spoelen.
- Centrifugeer de magnetisch gelabelde cellen op 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspensie van de cellen in 500 μL PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor gebruik in de daaropvolgende transcriptoomsequencing.
3. Scheiding van lymfocytenpopulaties van PBMC's door fluorescerend gelabelde antilichaamkleuring en FACS
- Centrifugeer de niet-gelabelde cellen (stap 2.4.2) bij 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Resuspensieer de cellen in 100 μL PBS in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 2 μL van elk gelabeld antilichaam (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) toe aan de 100 μL celsuspensie (de volumes en geconjugeerde fluorofoorinformatie van antilichamen worden weergegeven in tabel 1), incubeer op ijs gedurende 30 minuten en bescherm tegen licht.
- Was de cellen 2 x door 1 ml PBS toe te voegen en te centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspensieer de cellen in 500 μL PBS in de 1,5 ml microcentrifugebuis. Vortex de celsuspensie voorzichtig voordat gegevens worden verkregen op een flow cell sorter cytometer.
4. Instelling van de flowcytometrieparameter
- Neem indien nodig 100 μL van de celsuspensie (zie rubriek 1) in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en stel een negatief controlemonster, een CD3-monster met één kleuring, een CD4-monster met één kleuring, een CD8-monster met één kleuring, een CD19-monster met één kleuring en een CD56/CD16-kleuringsmonster in.
- Voeg 2 μL van het overeenkomstige fluorescerend gelabelde antilichaam toe per 100 μL van de celsuspensie en vortex. Broed op ijs gedurende 30 minuten in het donker. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g en adem het supernatant aan. Resuspendeer de pellets met 500 μL PBS en vortex.
- Zet de sorteerstroom in en vertraag de druppels met behulp van de fluorescerende kralen als volgt:
- Open het celsorteersysteem, voer het inschakelprogramma uit, installeer het mondstuk van 85 μm en open de sorteerstroom. Stel de sorteerspanning in op 4.500 V en de Freq op 47.
- Pas de parameters voornamelijk aan door het hoofdstroomdruppelbreekpunt en de druppelvertraging aan te passen volgens de instructies van de fabrikant12. Stel de eerste druppelbreekpuntpositie (Drop1) in op 275 en de gap op 8 in het breakoff-venster . Schakel de sweet spot automatische sorteermodus in zodat de cytometrie automatisch de amplitudewaarde van de druppel kan bepalen om de stroom te stabiliseren.
- Pas de druppelvertraging aan op 30,31 in het side stream-venster door de fluorescerende kralen te laden, zodat de kralen een zijstroomafbuiging van > 99% bereiken in de initiële of fijnafstellingsmodus.
- Raadpleeg de gatingstrategie in figuur 1 om gating als volgt uit te voeren:
- Teken met behulp van een forward scatter-area (FSC-A)/side scatter-area (SSC-A) dot plot de polygoonpoort (P1) om de intacte lymfocytenpopulatie te identificeren.
- Gebruik een FSC-A/FSC-hoogte (FSC-H) dot plot, teken de polygoon poort (P2) om de enkele cellen te identificeren en doubletten uit te sluiten (figuur 1A).
- Teken met behulp van een CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A dot plot de rechthoekige poort (P3) om CD3+ T-cellen en CD19+ B-cellen te selecteren (figuur 1A,B).
- Teken met behulp van een CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A dot plot een rechthoekige poort om CD4+ T-cellen en CD8+ T-cellen te selecteren (cellen met een hoge fluorescentie voor deze markers, respectievelijk).
- Teken met behulp van een CD56/CD16 APC-A/SSC-A dot plot een rechthoekige poort om CD56+/CD16+ NK-cellen te selecteren (figuur 1C).
- Pas instrumentele parameters aan met behulp van het negatieve controlemonster:
- Installeer de negatieve bedieningsbuis op de laadpoort en klik op Laden in het Acquisitiedashboard. Selecteer de cytometerinstellingen in de software.
- Klik in het venster Infovenster op het tabblad Parameters en pas de spanningen van FSC, SSC en verschillende fluorescerende kleurstoffen aan; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-Cyanine 7: 824, FITC: 555, PerCP-Cyanine 5.5: 663.
- Pas de compensatie aan met behulp van de enkelgekleurde monsters13.
- Laad de enkelvlekbuizen sequentieel op de cytometrie en selecteer Cytometerinstellingen in de software. Klik op het tabblad Compensatie om de compensatie aan te passen.
OPMERKING: De compensatiereferentie van flowcytometrie is weergegeven in tabel 2.
- Laad de enkelvlekbuizen sequentieel op de cytometrie en selecteer Cytometerinstellingen in de software. Klik op het tabblad Compensatie om de compensatie aan te passen.
5. Celsortering en het verzamelen van gegevens via flowcytometrie
- Vortex de celsuspensie (gescheiden PBMC's volgens secties 1-3) kort om de cellen te resuspenderen voordat de buis in de cytometer wordt geladen. Houd de resterende buizen op ijs.
- Voeg 200 μL FBS toe aan vier verzamelstroombuizen om te voorkomen dat de gesorteerde cellen aan de buiswand blijven plakken en plaats ze in de verzamelkamer van de cytometer.
- Verzamel CD3+CD4+ T-cellen, CD3+CD8+ T-cellen, CD3−CD19+ B-cellen en CD3− CD56+/CD16+ NK-cellen afzonderlijk van het monster van een patiënt met IM in de vier stroombuizen (figuur 2A).
- Centrifugeer de gescheiden cellen op 300 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 200 μL RNA-isolatiereagens toe aan de cellen voor transcriptoomsequencing.
- Scheid de immuuncelsubpopulaties van monsters van gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen volgens de bovenstaande stappen (figuur 2B, C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Referentie van de gatingstrategie
De gatingstrategie die wordt gebruikt om de vier lymfocytensubpopulaties te sorteren, is weergegeven in figuur 1. Kortom, lymfocyten worden geselecteerd (P1) op een dot plot die de granulositeit (SSC-A) versus grootte (FSC-A) weergeeft. Vervolgens worden afzonderlijke cellen geselecteerd (P2) op een dot plot met de grootte (FSC-A) versus forward scatter (FSC-H), terwijl doubletcellen worden uitgesloten. CD3+ T-cellen (P3) en CD19+ B-cellen (figuur 1B) worden afzonderlijk geselecteerd op een dot plot met de CD3 PerCP-Cy5.5-A versus CD19 FITC-A. CD8+ T-cellen en CD4+ T-cellen worden afzonderlijk geselecteerd op een dot plot met CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A van P3. CD16+/CD56+ NK-cellen worden geselecteerd op een dot plot met CD56/CD16 APC-A versus SSC-A van P4 (figuur 1C).
De representatieve resultaten van vier celsubpopulaties gesorteerd uit de monsters van patiënten met IM volgens de beschreven methode zijn weergegeven in figuur 2A. We hebben ook celsortering uitgevoerd op monsters van gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen als controlegroepen om de haalbaarheid van dit experiment te bevestigen. De representatieve resultaten van celsubpopulaties gescheiden van het monster van een gezonde EBV-drager zijn weergegeven in figuur 2B. Het representatieve resultaat van celsubpopulaties gesorteerd uit de steekproef van EBV-niet-geïnfecteerde kinderen is weergegeven in figuur 2C. Zoals te zien is in figuur 2, was P1 gated om lymfocyten te identificeren en werden doubletcellen uitgesloten via P2; P3 was gated om CD3 + T-cellen te selecteren en P5 was gated om CD19 + B-cellen te selecteren; CD3+ CD8+ T-cellen (P6) en CD3+ CD4+ T-cellen (P7) werden afzonderlijk van P3 geselecteerd; CD16+/CD56+ NK-cellen (P8) werden geselecteerd uit P4. Elk van deze subpopulaties kan individueel worden gesorteerd en verzameld voor downstream-experimenten. Dit systeem werd gebruikt om genexpressie te analyseren door middel van RNA-extractie en transcriptoomsequencing.
Zoals gerapporteerd in tabel 3, werd een toename van CD3+ CD8+ T-cellen waargenomen bij patiënten met IM in vergelijking met zowel gezonde EBV-dragers als EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 en 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % CD3+ CD8+ T-cellen per totaal lymfocyten); Verlaagde proporties van CD3+ CD4+ T-cellen en CD19+ B-cellen werden waargenomen bij patiënten met IM in vergelijking met gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (13,4 ± 1,5 vs. 19,3 ± 1,5 en 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % CD3+ CD4+ T-cellen per totaal lymfocyten; 1,4 ± 0,3 vs. 7,6 ± 0,7 en 1,4 ± 0,3 vs. 9,0 ± 1,5, % CD19+ B-cellen per totaal lymfocyten). Verlaagde proporties van CD16+/CD56+ NK-cellen werden waargenomen bij patiënten met IM in vergelijking met EBV-niet-geïnfecteerde kinderen (7,5 ± 0,5 vs. 10,7 ± 0,4, % CD16+/CD56+ NK-cellen per totaal lymfocyten). Deze resultaten valideerden de effectiviteit van dit sorteerprotocol en toonden aan dat de proporties van lymfocytensubsets verschillend zijn bij patiënten met IM- en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen.
Figuur 1: Algemene gatingstrategie die wordt gebruikt om immuuncelsubpopulaties van PBMC's te sorteren. (A) Het PerCP-Cy5.5-filter werd gebruikt om CD3 + T-cellen te scheiden. CD8+ T-cellen en CD4+ T-cellen werden afzonderlijk geselecteerd op een dot plot met CD8 PE-A versus CD4 APC-Cy7-A van P3. (B) Het FITC-filter werd gebruikt om CD19+ B-cellen te identificeren. (C) Het APC-filter werd gebruikt om CD16+/CD56+ NK-cellen van P4 te scheiden. Afkortingen: PBMC's= perifere bloed mononucleaire cellen; FSC-A = voorwaarts verstrooiingsgebied; SSC-A = zijverstrooiingsgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiingshoogte; PerCP = peridinine-chrorofyl-eiwit; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten van vier celsubpopulaties die met succes zijn geïsoleerd volgens de beschreven methode. (A) Representatieve celsorteercijfers van het perifere bloedmonster van een patiënt met IM. B) Representatieve celsorteercijfers van het perifere bloedmonster van een gezonde EBV-drager. C) Representatieve celsorteercijfers van het perifere bloedmonster van EBV-niet-geïnfecteerde kinderen. P1, dot plot gate om lymfocyten te identificeren; P2, dot plot gate om enkele cellen te selecteren; P3, dot plot gate om CD3 + T-cellen te selecteren; P4, dot plot gate om CD3- CD19- lymfocyten te identificeren; P5, dot plot gate om CD19 + B-cellen te selecteren; P6, dot plot gate om CD3 + CD8 + T-cellen van P3 te selecteren; P7, dot plot gate om CD3 + CD4 + T-cellen van P3 te selecteren; P8, dot plot gate om CD16+/CD56+ NK cellen van P4 te selecteren. Afkortingen: EBV = Epstein-Barr virus; IM = infectieuze mononucleosis; FSC-A = voorwaarts verstrooiingsgebied; SSC-A = zijverstrooiingsgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiingshoogte; PerCP = peridinine-chrorofyl-eiwit; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam Target | Geconjugeerde fluorofoor | Dosering | Kloon | Isotype |
| Cd3 | PerCP/Cyanine5,5 | 2 μL | Sk7 | Muis IgG1, κ |
| Cd4 | APC/Cyanine7 | 2 μL | Sk3 | Muis IgG1, κ |
| cd8 | PE | 2 μL | Sk1 | Muis IgG1, κ |
| cd19 | Fitc | 2 μL | HIB19 | Muis IgG1, κ |
| cd56 | APC | 2 μL | 5,1H11 | Muis IgG1, κ |
| cd16 | APC | 2 μL | 3G8 | Muis IgG1, κ |
Tabel 1: Antilichamen die worden gebruikt voor flowcytometrie. Afkortingen: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat.
| Compensatiereferentie van flowcytometrie (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 | Fitc | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| Fitc | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabel 2: Compensatiereferentie van flowcytometrie. Afkortingen: PerCP = peridinin-chrorophyll-protein; PE = phycoerythrin; APC = allofycocyanine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat.
| Aandeel lymfocyten van verschillende subpopulaties in totaal gesorteerde lymfocyten (%) | |||
| subpopulatie van lymfocyten | IM | gezonde EBV-dragers | EBV-niet-geïnfecteerde kinderen |
| CD3+ T-cellen | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| CD3+ CD8+ T cellen | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| CD3+ CD4+ T cellen | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| CD16+/CD56+ NK cellen | 7,5 ± 0,5 | 2,2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| CD3- CD19+ B cellen | 1,4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tabel 3: Het aandeel gesorteerde lymfocyten van verschillende groepen. Afkortingen: EBV = Epstein-Barr virus; IM = infectieuze mononucleosis; NK = natuurlijke killer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol is een efficiënte manier om subpopulaties van perifere immuuncellen in het bloed te sorteren. In deze studie werden veneuze bloedmonsters van patiënten met IM, gezonde EBV-dragers en EBV-niet-geïnfecteerde kinderen geselecteerd als onderzoeksdoelstelling. Dit werk met behulp van het perifere bloed van patiënten met IM richt zich voornamelijk op het analyseren en bepalen van de verhoudingen van verschillende celsubsets door middel van meerkleurige flowcytometrie. Transcriptoomsequencing wordt voornamelijk gebruikt voor de detectie en analyse van een bepaalde subpopulatie van lymfocyten die onvoldoende was voor de uitgebreide en specifieke vergelijkingen van de moleculaire kenmerken en functies van verschillende immuuncelsubpopulaties bij kinderen met IM in dezelfde ziektetoestand. Daarom zou het sorteren van verschillende soorten cellen uit het perifere bloed en het uitvoeren van transcriptoomsequencing om de verschillen in de expressiegenen en functies van deze immuuncellen te vergelijken, significante gegevens kunnen opleveren voor de studie van de pathogenese van IM.
FACS-sortering heeft als bijkomend voordeel dat levende, gefractioneerde cellen kunnen worden verwerkt voor verdere in vitro of in vivo experimenten14. Het behoud van de levensvatbaarheid van de cel is van vitaal belang voor latere experimenten. We hebben de sorteerstap geoptimaliseerd om de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren in dit protocol - experimentele manipulaties zijn uitgevoerd op ijs of in een koelkast van 4 °C. Een goede centrifugatiesnelheid en -tijd zijn ook van cruciaal belang voor celisolatie. De opbrengst van gesorteerde cellen is ook de belangrijkste beperking in deze methode, en het gebruik van FBS-gecoate buizen tijdens het sorteren kan het verlies van cellen die zich aan de buizen hechten aanzienlijk verminderen. Het bieden van de juiste instellingen voor de FACS-sorteerder kan de algehele efficiëntie van de sortering verbeteren door celverstopping of kruisbesmetting in de opvangbuis te voorkomen. Door de optimalisatie van experimentele stappen en instellingen kan dit protocol worden geëxtrapoleerd naar het sorteren van andere immuuncellen door magnetische of fluorescerende labels te vervangen. Vanwege de specificiteit van de monsters van de kinderen (laag bloedafnamevolume), onderzochten we echter alleen de belangrijkste populaties van immuuncellen (monocyten, CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en NK-cellen) zonder verder te gaan met het sorteren van subpopulaties vanwege de beperking van het stroomsorteerkanaal. Deze studie toonde aan dat perifere bloedmonsters van immunocompetente kinderen en monsters van IM deze vijf groepen immuuncellen met succes konden sorteren; de bloedmonsters van patiënten met hematologische maligniteiten (bijv. leukemie, lymfoom), lymfoproliferatieve aandoeningen (bijv. Posttransplante lymfoproliferatieve stoornissen, CAEBV) of primair immunodeficiëntie/verworven immuundeficiëntiesyndroom kunnen echter niet met succes worden gesorteerd volgens dit protocol.
IM wordt beschouwd als een zelfbeperkende ziekte en immuuncellen zoals γδ T-cellen, NKT-cellen en NK-cellen spelen een belangrijke rol in de antivirale immuunrespons15. EBV-specifieke CD8+ T-cellen zijn grotendeels gedifferentieerd naar een effectorfenotype10,16, en er is contractie van late effectorgeheugen en effectorcellen van IM naar herstel17. Ondertussen lijken NK-cellen in IM functioneel defect te zijn, waaronder gebrek aan celactivering10, verlies van activerende receptorsignalering en degranulatie18. Sommige studies hebben aangetoond dat CD4 + T-cellen niet alleen CD8 + T-cellen kunnen helpen om EBV-geïnfecteerde B-cellen te doden en te elimineren, maar ook de proliferatie van B-cellen remmen door cytokines af te scheiden en zelfs direct een dodelijke rol spelen tijdens EBV-infectie19,20. Zoals aangetoond in deze studie, werd een verhoogd aandeel CD3+ CD8+ T-cellen waargenomen bij patiënten met IM in vergelijking met zowel gezonde EBV-dragers als EBV-niet-geïnfecteerde kinderen. Daarentegen werden verminderde verhoudingen van CD3+ CD4+ T-cellen, CD19+ B-cellen en CD16+/CD56+ NK-cellen waargenomen bij patiënten met IM in vergelijking met EBV-niet-geïnfecteerde kinderen. De functie en genexpressie van deze verschillende subtypen van immuuncellen in dezelfde ziektetoestand van IM blijven echter onduidelijk. Verdere analyse van de genexpressieprofielen van specifieke immuuncelsubsets in IM kan helpen om inzicht te krijgen in het pathogene mechanisme van IM.
We bieden een strategie die immunomagnetische kralensortering en FACS combineert om gedefinieerde immuuncelsubpopulaties in PBMC's te isoleren en te analyseren. Monocyten worden eerst gescheiden met behulp van CD14-microbeads en de resterende PBMC's worden gekleurd met overeenkomstig fluorescerend gelabelde antilichamen om CD4 + T-cellen, CD8 + T-cellen, B-cellen en NK-cellen via FACS te sorteren. We gebruikten deze gesorteerde cellen verder voor RNA-extractie en transcriptoomsequencing om de functie en genexpressie van verschillende immuuncellen in de immunopathologie van IM te karakteriseren. De zuiverheid en opbrengst van de gesorteerde cellen was over het algemeen voldoende om genexpressiestudies uit te voeren (gegevens niet aangetoond). Daarom kan de sorteermethode van afzonderlijke immuuncelsubpopulaties worden gebruikt om EBV-geassocieerde lymfoproliferatieve aandoeningen zoals CAEBV, post-transplantatie lymfoproliferatieve stoornis verder te onderzoeken om pathogene genen, pathogene eiwitten en potentiële therapeutische doelen te detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) en het CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
- Kwok, H., Chiang, A. K. From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes. Viruses. 8 (3), 60 (2016).
- Bu, W., et al. Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells. Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).
- Balfour, H. H., et al. Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students. Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).
- Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. Infectious mononucleosis. New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).
- Fujiwara, S., et al. Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan. Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).
- Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).
- Zhong, H., et al. Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).
- Fedyanina, O. S., et al. The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children. Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).
- Al Tabaa, Y., et al. B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis. Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).
- M, A., et al. Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation. Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).
- Greenough, T. C., et al. A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection. Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).
- Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry. Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Djaoud, Z., et al. Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).
- Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders. Cancers. 13 (8), 1836 (2021).
- Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection. PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).
- Zamai, L., et al. Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy. Cells. 9 (3), 753 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).
- Choi, I. K., et al. Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).
