Summary
हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (मोनोसाइट्स, सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं) की परिभाषित प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक बीड्स और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग के संयोजन की एक विधि का वर्णन करते हैं। इस विधि का उपयोग करके, चुंबकीय और फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को शुद्ध और विश्लेषण किया जा सकता है।
Abstract
संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस (आईएम) एक तीव्र सिंड्रोम है जो ज्यादातर प्राथमिक एपस्टीन-बार वायरस (ईबीवी) संक्रमण से जुड़ा होता है। मुख्य नैदानिक लक्षणों में अनियमित बुखार, लिम्फैडेनोपैथी और परिधीय रक्त में लिम्फोसाइटों में काफी वृद्धि शामिल है। आईएम का रोगजनक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है; इसके लिए कोई प्रभावी उपचार विधि नहीं है, मुख्य रूप से रोगसूचक उपचार उपलब्ध हैं। ईबीवी इम्यूनोबायोलॉजी में मुख्य सवाल यह है कि संक्रमित व्यक्तियों का केवल एक छोटा सा उप-समूह गंभीर नैदानिक लक्षण क्यों दिखाता है और यहां तक कि ईबीवी से जुड़ी विकृतियों को विकसित करता है, जबकि अधिकांश व्यक्ति वायरस के साथ जीवन के लिए स्पर्शोन्मुख होते हैं।
बी कोशिकाएं पहले आईएम में शामिल होती हैं क्योंकि ईबीवी रिसेप्टर्स उनकी सतह पर प्रस्तुत किए जाते हैं। प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाएं साइटोटोक्सिक जन्मजात लिम्फोसाइट्स हैं जो ईबीवी-संक्रमित कोशिकाओं को मारने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सीडी 4 + टी कोशिकाओं का अनुपात कम हो जाता है जबकि सीडी 8 + टी कोशिकाओं का अनुपात तीव्र ईबीवी संक्रमण के दौरान नाटकीय रूप से फैलता है, और सीडी 8 + टी कोशिकाओं की दृढ़ता आईएम के आजीवन नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है। वे प्रतिरक्षा कोशिकाएं आईएम में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, और उनके कार्यों को अलग से पहचानने की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, मोनोसाइट्स को पहले सीडी 14 माइक्रोबीड्स, एक कॉलम और एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके आईएम व्यक्तियों के परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से अलग किया जाता है।
शेष पीबीएमसी को पेरिडिनिन-क्लोरोफिल-प्रोटीन (पेरसीपी)/साइनिन 5.5 एंटी-सीडी 3, एलोफीकोसायनिन (एपीसी)/साइनिन 7 एंटी-सीडी 4, फाइकोएरिथ्रिन (पीई) एंटी-सीडी 8, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) एंटी-सीडी 19, एपीसी एंटी-सीडी 56, और एपीसी एंटी-सीडी 16 एंटीबॉडी से दाग दिया जाता है। इसके अलावा, आईएम में उनके कार्यों और रोगजनक तंत्र का पता लगाने के लिए पांच उप-आबादी के ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण का प्रदर्शन किया गया था।
Introduction
एपस्टीन-बार वायरस (ईबीवी), एक γ-हर्पीसवायरस जिसे मानव हर्पीस वायरस टाइप 4 के रूप में भी जाना जाता है, मानव आबादी में सर्वव्यापी है और वयस्क आबादी के 90% से अधिक में आजीवन अव्यक्त संक्रमण स्थापित करताहै। अधिकांश ईबीवी प्राथमिक संक्रमण बचपन और किशोरावस्था के दौरान होता है, जिसमें संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस (आईएम) 2 के साथ रोगियों का एक अंश प्रकट होता है, जिसमें विशिष्ट इम्यूनोपैथोलॉजी दिखाई देती है, जिसमें रक्त में सीडी 8 + टी कोशिकाओं के साथ सक्रिय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ओरोफैरिंक्स3 में ईबीवी-संक्रमित बी कोशिकाओं का क्षणिक प्रसार शामिल है। आईएम का कोर्स 2-6 सप्ताह तक चल सकता है और अधिकांश रोगी अच्छी तरह से ठीक होजाते हैं। हालांकि, कुछ व्यक्ति उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के साथ लगातार या आवर्तक आईएम जैसे लक्षण विकसित करते हैं, जिसे क्रोनिक सक्रिय ईबीवी संक्रमण (सीएईबीवी) 5 के रूप में वर्गीकृत किया गया है। इसके अलावा, ईबीवी एक महत्वपूर्ण ऑन्कोजेनिक वायरस है, जो विभिन्न प्रकार की विकृतियों से निकटता से संबंधित है, जिसमें एपिथेलॉइड और लिम्फोइड दुर्भावनाएं जैसे कि नासोफैरेनजील कार्सिनोमा, बर्किट का लिम्फोमा, हॉजकिन लिंफोमा (एचएल), और टी / एनके सेल लिम्फोमा6 शामिल हैं। यद्यपि ईबीवी का अध्ययन 50 से अधिक वर्षों से किया गया है, इसके रोगजनन और तंत्र जिसके द्वारा यह लिम्फोसाइटों के प्रसार को प्रेरित करता है, पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है।
कई अध्ययनों ने ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण द्वारा ईबीवी संक्रमण के इम्यूनोपैथोलॉजी के लिए आणविक हस्ताक्षर की जांच की है। झोंग एट अल ने आईएम या सीएईबीवी वाले चीनी बच्चों से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के पूरे-ट्रांसस्क्रिप्टम प्रोफाइलिंग का विश्लेषण किया ताकि यह पता लगाया जा सके कि सीडी 8 + टी सेल विस्तार मुख्य रूप से आईएम समूह7 में पाया गया था, यह सुझाव देते हुए कि सीडी 8 + टी कोशिकाएं आईएम में एक प्रमुख भूमिका निभा सकती हैं। इसी तरह, एक अन्य अध्ययन में ईबीवी-विशिष्ट साइटोटोक्सिक टी और सीडी 19 + बी कोशिकाओं का कम अनुपात और प्राथमिक ईबीवी संक्रमण के कारण आईएम वाले रोगियों में सीडी 8 + टी कोशिकाओं का उच्च प्रतिशत पायागया, जो ईबीवी पुनर्सक्रियन और अन्य एजेंटों दोनों के कारण आईएम के रोगियों में होता है। बी कोशिकाएं पहले आईएम में शामिल होती हैं क्योंकि ईबीवी रिसेप्टर्स उनकी सतह पर प्रस्तुत किए जाते हैं। अल तबा एट अल ने पाया कि बी कोशिकाओं को पॉलीक्लोनल रूप से सक्रिय किया गया था और आईएम 9 के दौरान प्लास्माब्लास्ट्स (सीडी 19 +, सीडी 27 + और सीडी 20 −, और सीडी 138 − कोशिकाओं) और प्लाज्मा कोशिकाओं (सीडी 19 +, सीडी 27 + और सीडी 20 −, और सीडी 138 +) में विभेदित कियागया था। इसके अलावा, झोंग एट अल ने पाया कि मोनोसाइट मार्कर सीडी 14 और सीडी 64 सीएईबीवी में अनियंत्रित थे, यह सुझाव देते हुए कि मोनोसाइट्स एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिसिटी (एडीसीसी) और हाइपरएक्टिव फागोसाइटोसिस7 के माध्यम से सीएईबीवी की सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। अल्का एट अल ने आईएम या एचएल के चार रोगियों से एमएसीएस क्रमबद्ध सीडी 56मंद सीडी 16 + एनके कोशिकाओं के प्रतिलेख की विशेषता बताई और पाया कि आईएम और एचएल दोनों से एनके कोशिकाओं ने जन्मजात प्रतिरक्षा और केमोकाइन सिग्नलिंग जीन को कम कर दिया था, जो एनके कोशिकाओं10 की हाइपोरिस्पॉन्सिवनेस के लिए जिम्मेदार हो सकता है। इसके अलावा, ग्रीनो एट अल ने आईएम वाले व्यक्तियों के 10 पीबीएमसी से क्रमबद्ध सीडी 8 + टी कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया। उन्होंने बताया कि आईएम में सीडी 8 + टी कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा वायरस-विशिष्ट, सक्रिय, विभाजित और प्रभावकगतिविधियों को लागू करने के लिए प्रमुख था। टी सेल-मध्यस्थता, ईबीवी-विशिष्ट प्रतिक्रियाएं और एनके सेल-मध्यस्थता, गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाएं प्राथमिक ईबीवी संक्रमण के दौरान आवश्यक भूमिका निभाती हैं। हालांकि, इन अध्ययनों ने केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विविध मिश्रण या लिम्फोसाइटों की केवल एक निश्चित उप-जनसंख्या के प्रतिलेख परिणामों की जांच की, जो एक ही रोग स्थिति में आईएम वाले बच्चों में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी की आणविक विशेषताओं और कार्यों की व्यापक तुलना के लिए पर्याप्त नहीं है।
यह पेपर एक विधि का वर्णन करता है जो पीबीएमसी (मोनोसाइट्स, सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं) की परिभाषित प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक बीड्स और फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) को जोड़ती है। इस विधि का उपयोग करके, चुंबकीय और फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं को चुंबकीय विभाजक और एफएसीएस का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है या प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण के लिए शुद्ध कोशिकाओं से आरएनए निकाला जा सकता है। यह विधि आईएम वाले व्यक्तियों की बीमारी की समान अवस्थाओं में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लक्षण वर्णन और जीन अभिव्यक्ति को सक्षम करेगी, जो ईबीवी संक्रमण के इम्यूनोपैथोलॉजी की हमारी समझ का विस्तार करेगी।
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Protocol
रक्त के नमूने आईएम (एन = 3), स्वस्थ ईबीवी वाहक (एन = 3), और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों (एन = 3) के रोगियों से प्राप्त किए गए थे। स्वयंसेवकों को बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी से भर्ती किया गया था, और सभी अध्ययनों को नैतिक रूप से अनुमोदित किया गया था। बीजिंग चिल्ड्रन हॉस्पिटल, कैपिटल मेडिकल यूनिवर्सिटी की आचार समिति द्वारा नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया था (अनुमोदन संख्या: [2021]-ई-056-वाई)। रोगियों की सूचित सहमति माफ कर दी गई थी क्योंकि अध्ययन ने केवल नैदानिक परीक्षण के लिए शेष नमूनों का उपयोग किया था। रोगी की गोपनीयता की रक्षा के लिए सभी डेटा को पूरी तरह से अज्ञात और अनामित किया गया था।
1. परिधीय रक्त से पीबीएमसी का अलगाव
- मानक वेनिपंक्चर द्वारा के3ईडीटीए ट्यूबों में आईएम वाले रोगियों से ताजा परिधीय रक्त (2 एमएल) एकत्र करें।
नोट: सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए प्रक्रिया को तेजी से होना चाहिए। - परिधीय रक्त को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ दो गुना मात्रा में पतला करें और इसे 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मानव लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम (घनत्व: 1.077 ± 0.001 ग्राम / एमएल) के शीर्ष पर परत करें।
नोट: रक्त, पीबीएस और पृथक्करण माध्यम का आयतन अनुपात 1: 1: 1 था। रक्त को धीरे-धीरे पृथक्करण माध्यम में जोड़ें, और रक्त को पृथक्करण माध्यम में बसने से बचने के लिए तुरंत सेंट्रीफ्यूज करें। - कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। मध्य परत (समृद्ध पीबीएमसी) को एक और 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ट्यूब के तल पर एरिथ्रोसाइट्स होते हैं, मध्य परत पृथक्करण माध्यम होती है, शीर्ष परत प्लाज्मा होती है, और प्लाज्मा परत और पृथक्करण तरल परत के बीच पीबीएमसी (लिम्फोसाइट्स और मोनोसाइट्स सहित) थे। - कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 800 × ग्राम पर पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के 10 एमएल पीबीएस और सेंट्रीफ्यूज के साथ पीबीएमसी को धोएं; सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
- धोने और सेंट्रीफ्यूजिंग को दोहराएं (चरण 1.4) 2 x। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 एमएल पीबीएस के साथ पीबीएमसी को फिर से निलंबित करें और ट्रिपैन ब्लू-आधारित, स्वचालित काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
2. सीडी 14 माइक्रोबीड्स का उपयोग करके पीबीएमसी से सीडी 14 + मोनोसाइट्स का अलगाव
- पीबीएस (पीएच 7.2) में 0.5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 2 एमएम ईडीटीए युक्त एक बफर समाधान तैयार करें। बफर ठंडा रखें (2-8 डिग्री सेल्सियस)।
नोट: हवा के बुलबुले के रूप में उपयोग करने से पहले बफर को डिगास कॉलम को अवरुद्ध कर सकता है। कोशिका की सतह और गैर-विशिष्ट सेल लेबलिंग पर एंटीबॉडी की कैपिंग को रोकने के लिए कोशिकाओं को ठंडा रखें। - कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर पीबीएमसी को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानी से छोड़ दें। बफर के 80 μL के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। सेल सस्पेंशन में सीडी 14 माइक्रोबीड्स के 20 μL जोड़ें।
नोट: यदि ≤107 पीबीएमसी हैं, तो ऊपर उल्लिखित मात्रा का उपयोग करें। यदि >107 पीबीएमसी हैं, तो आनुपातिक रूप से सभी अभिकर्मक वॉल्यूम और कुल मात्रा में वृद्धि करें। - सीडी 14 माइक्रोबीड्स और कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अच्छी तरह से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पीबीएमसी को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर 1 एमएल बफर और सेंट्रीफ्यूज के साथ धोएं। सतह पर तैरने वाले को पूरी तरह से त्याग दें। बफर के 500 μL के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
नोट: यदि ≤108 पीबीएमसी हैं, तो ऊपर उल्लिखित मात्रा का उपयोग करें। यदि >108 पीबीएमसी हैं, तो आनुपातिक रूप से बफर वॉल्यूम बढ़ाएं। - स्तंभों के साथ चुंबकीय पृथक्करण:
- स्तंभ को चुंबकीय मोती विभाजक पर रखें, और स्तंभ को 3 एमएल बफर के साथ धो लें। स्तंभ में कक्ष निलंबन (चरण 2.3 से) जोड़ें.
- स्तंभ से गुजरने वाली बिना लेबल वाली कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें और कॉलम को 3 एमएल बफर के साथ धोएं। कॉलम को 3 x 3 एमएल बफर के साथ धोएं। 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में कुल बहिःस्राव एकत्र करें।
- कॉलम को एक नए 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें। कॉलम में 5 एमएल बफर जोड़ें। चुंबकीय रूप से लेबल कोशिकाओं को तुरंत 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बाहर निकालने के लिए प्लंजर को कॉलम में मजबूती से धक्का दें।
- चुंबकीय रूप से लेबल की गई कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। बाद में ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण में उपयोग के लिए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया गया।
3. फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी स्टेनिंग और एफएसीएस द्वारा पीबीएमसी से लिम्फोसाइट आबादी का पृथक्करण
- 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर अनलेबल कोशिकाओं (चरण 2.4.2) को सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को हटा दें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के 100 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।
- सेल सस्पेंशन के 100 μL में प्रत्येक लेबल एंटीबॉडी (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) का 2 μL जोड़ें (एंटीबॉडी की मात्रा और संयुग्मित फ्लोरोफोर जानकारी तालिका 1 में दिखाई गई है), 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें, और प्रकाश से बचाएं।
- कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस जोड़कर 2 x धोएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजिंग करें। 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीबीएस के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया। फ्लो सेल सॉर्टर साइटोमीटर पर डेटा प्राप्त करने से पहले धीरे-धीरे सेल निलंबन।
4. फ्लो साइटोमेट्री पैरामीटर सेटिंग
- आवश्यकतानुसार 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में सेल सस्पेंशन (अनुभाग 1 देखें) का 100 μL लें, और एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना, एक CD3 एकल-धुंधला नमूना, एक CD4 एकल-धुंधला नमूना, एक CD8 एकल-धुंधला नमूना, एक CD19 एकल-धुंधला नमूना, और एक CD56/CD16 धुंधला नमूना सेट करें।
- सेल निलंबन और भंवर के प्रति 100 μL संबंधित फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के 2 μL जोड़ें। अंधेरे में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर और सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। पीबीएस और भंवर के 500 μL के साथ छर्रों को फिर से निलंबित करें।
- सॉर्टिंग स्ट्रीम को चालू करें और फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग करके बूंदों में देरी करें:
- सेल सॉर्टिंग सिस्टम खोलें, पावर-ऑन प्रोग्राम चलाएं, 85 μm नोजल स्थापित करें, और सॉर्टिंग स्ट्रीम खोलें। सॉर्टिंग वोल्टेज को 4,500 वी पर सेट करें, और फ्रेक को 47 पर सेट करें।
- मुख्य रूप से मुख्य प्रवाह ड्रॉपलेट ब्रेकपॉइंट और निर्माता के निर्देशोंके अनुसार ड्रॉपलेट देरी को समायोजित करके मापदंडों को समायोजित करें। ब्रेकऑफ विंडो में पहली ड्रॉपलेट ब्रेकपॉइंट स्थिति (ड्रॉप 1) को 275 पर और गैप को 8 पर सेट करें। स्ट्रीम को स्थिर करने के लिए साइटोमेट्री को स्वचालित रूप से ड्रॉपलेट आयाम मान निर्धारित करने की अनुमति देने के लिए स्वीट स्पॉट स्वचालित सॉर्टिंग मोड चालू करें।
- फ्लोरोसेंट मोतियों को लोड करके साइड स्ट्रीम विंडो में ड्रॉपलेट देरी को 30.31 तक समायोजित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि मोती प्रारंभिक या ठीक ट्यून मोड में >99% का साइड फ्लो विक्षेपण प्राप्त करते हैं।
- निम्नानुसार गेटिंग करने के लिए चित्र 1 में दिखाई गई गेटिंग रणनीति देखें:
- फॉरवर्ड स्कैटर-एरिया (एफएससी-ए)/साइड स्कैटर-एरिया (एसएससी-ए) डॉट प्लॉट का उपयोग करके, बरकरार लिम्फोसाइट आबादी की पहचान करने के लिए बहुभुज गेट (पी 1) खींचें।
- एफएससी-ए/एफएससी-ऊंचाई (एफएससी-एच) डॉट प्लॉट का उपयोग करके, एकल कोशिकाओं की पहचान करने और डबल्स को बाहर करने के लिए बहुभुज गेट (पी 2) खींचें (चित्रा 1 ए)।
- CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A डॉट प्लॉट का उपयोग करके, CD3+ T कोशिकाओं और CD19+ B कोशिकाओं (चित्रा 1A, B) का चयन करने के लिए आयताकार गेट (P3) खींचें।
- सीडी 4 एपीसी-साइ 7-ए / सीडी 8 पीई-ए डॉट प्लॉट का उपयोग करके, सीडी 4 + टी कोशिकाओं और सीडी 8 + टी कोशिकाओं (क्रमशः इन मार्करों के लिए उच्च प्रतिदीप्ति वाली कोशिकाओं) का चयन करने के लिए एक आयताकार द्वार खींचें।
- CD56/CD16 APC-A/SSC-A डॉट प्लॉट का उपयोग करके, CD56+/CD16+ NK कोशिकाओं (चित्रा 1C) का चयन करने के लिए एक आयताकार द्वार खींचें।
- नकारात्मक नियंत्रण नमूने का उपयोग करके वाद्य पैरामीटर समायोजित करें:
- लोडिंग पोर्ट पर नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब स्थापित करें और अधिग्रहण डैशबोर्ड में लोड क्लिक करें। सॉफ़्टवेयर में साइटोमीटर सेटिंग्स का चयन करें।
- इंस्पेक्टर विंडो में, पैरामीटर टैब पर क्लिक करें, और एफएससी, एसएससी और विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के वोल्टेज को समायोजित करें; एफएससी: 231, एसएससी: 512, पीई: 549, एपीसी: 615, एपीसी-साइनिन 7: 824, एफआईटीसी: 555, परसीपी-साइनिन 5.5: 663।
- एकल दाग वाले नमूने13 का उपयोग करके मुआवजा समायोजित करें।
- एकल दाग वाले ट्यूबों को साइटोमेट्री पर क्रमिक रूप से लोड करें और सॉफ्टवेयर में साइटोमीटर सेटिंग्स का चयन करें। मुआवजा समायोजित करने के लिए मुआवजा टैब क्लिक करें.
नोट: प्रवाह साइटोमेट्री का मुआवजा संदर्भ तालिका 2 में दिखाया गया है।
- एकल दाग वाले ट्यूबों को साइटोमेट्री पर क्रमिक रूप से लोड करें और सॉफ्टवेयर में साइटोमीटर सेटिंग्स का चयन करें। मुआवजा समायोजित करने के लिए मुआवजा टैब क्लिक करें.
5. सेल सॉर्टिंग और फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से डेटा एकत्र करना
- कोशिका निलंबन (खंड 1-3 के अनुसार पीबीएमसी को अलग करना) संक्षेप में साइटोमीटर में ट्यूब लोड करने से पहले कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए। शेष ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
- ट्यूब की दीवार पर क्रमबद्ध कोशिकाओं के चिपकने से बचने के लिए चार संग्रह प्रवाह ट्यूबों में 200 μL FBS जोड़ें और उन्हें साइटोमीटर संग्रह कक्ष में रखें।
- चार प्रवाह ट्यूबों में आईएम वाले रोगी के नमूने से सीडी 3 + सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं, सीडी 3 - सीडी 19 + बी कोशिकाओं और सीडी 3 − सीडी 56 + / सीडी 16 + एनके कोशिकाओं को अलग से एकत्र करें (चित्रा 2 ए)।
- 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर अलग कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को हटा दें। ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण के लिए कोशिकाओं में आरएनए अलगाव अभिकर्मक के 200 μL जोड़ें।
- उपरोक्त चरणों के अनुसार स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के नमूनों की प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को अलग करें (चित्रा 2 बी, सी)।
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Representative Results
गेटिंग रणनीति का संदर्भ
चार लिम्फोसाइट उप-आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति को चित्रा 1 में दिखाया गया है। संक्षेप में, लिम्फोसाइटों को एक डॉट प्लॉट पर चुना जाता है (पी 1) ग्रैनुलोसिटी (एसएससी-ए) बनाम आकार (एफएससी-ए) दिखाते हुए। फिर, एकल कोशिकाओं को एक डॉट प्लॉट पर चुना जाता है (पी 2) आकार (एफएससी-ए) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी-एच) दिखाता है, जबकि डबल कोशिकाओं को बाहर रखा जाता है। CD3+ T कोशिकाओं (P3) और CD19+ B कोशिकाओं (चित्रा 1B) को एक डॉट प्लॉट पर अलग से चुना जाता है जो CD3 PerCP-Cy5.5-A बनाम CD19 FITC-A को दर्शाता है। सीडी 8 + टी कोशिकाओं और सीडी 4 + टी कोशिकाओं को एक डॉट प्लॉट पर अलग से चुना जाता है जो पी 3 से सीडी 8 पीई-ए बनाम सीडी 4 एपीसी-साइ 7-ए दिखाते हैं। CD16+/CD56+ NK कोशिकाओं को एक डॉट प्लॉट पर चुना जाता है जो P4 (चित्रा 1C) से CD56/CD16 APC-A बनाम SSC-A दिखाता है।
वर्णित विधि द्वारा आईएम के साथ रोगियों के नमूनों से क्रमबद्ध चार सेल उप-आबादी के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 ए में दिखाए गए हैं। हमने इस प्रयोग की व्यवहार्यता की पुष्टि करने के लिए नियंत्रण समूहों के रूप में स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के नमूनों पर सेल सॉर्टिंग भी की। एक स्वस्थ ईबीवी वाहक के नमूने से अलग सेल उप-आबादी के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 बी में दिखाए गए हैं। ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के नमूने से क्रमबद्ध सेल उप-आबादी का प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 सी में दिखाया गया है। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, पी 1 को लिम्फोसाइटों की पहचान करने के लिए गेट किया गया था और पी 2 के माध्यम से डबल कोशिकाओं को बाहर रखा गया था; पी 3 को सीडी 3 + टी कोशिकाओं का चयन करने के लिए गेट किया गया था और पी 5 को सीडी 19 + बी कोशिकाओं का चयन करने के लिए गेट किया गया था; सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं (पी 6) और सीडी 3 + सीडी 4 + टी कोशिकाओं (पी 7) को पी 3 से अलग चुना गया था; CD16+/CD56+ NK कोशिकाओं (P8) को P4 से चुना गया था। इन उप-आबादी में से प्रत्येक को व्यक्तिगत रूप से क्रमबद्ध किया जा सकता है और डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए एकत्र किया जा सकता है। इस प्रणाली का उपयोग आरएनए निष्कर्षण और ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया गया था।
जैसा कि तालिका 3 में बताया गया है, स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों (46.5 ± 4.0 बनाम 27.0 ± 0.1 और 46.5 ± 4.0 बनाम 24.7 ± 2.9, % सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं प्रति कुल लिम्फोसाइटों की तुलना में आईएम वाले रोगियों में सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं में वृद्धि देखी गई थी); स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों की तुलना में आईएम वाले रोगियों में सीडी 3 + सीडी 4 + टी कोशिकाओं और सीडी 19 + बी कोशिकाओं ± के अनुपात में कमी देखी गई (1.5 और 13.4 ± 1.5 बनाम 13.4 ± 1.5 बनाम 23.6 ± 3.2, % सीडी 3 + सीडी 4 + टी कोशिकाएं प्रति कुल लिम्फोसाइट्स; 1.4 ± ± 0.3 ± 0.5 और 13.4 ± 0.3 बनाम 9.0 ± 1.5+ टी कोशिकाएं; 1.4 ± 0.3 और 1.4 ± 0.3 और 0.4 ± 0.7 और 13.4 ± 13.4) ईबीवी-असंक्रमित बच्चों की तुलना में आईएम वाले रोगियों में सीडी 16 + / सीडी 56 + एनके कोशिकाओं के अनुपात में कमी देखी गई (7.5 ± 0.5 बनाम 10.7 ± 0.4, % सीडी 16 + / सीडी 56 + एनके कोशिकाएं प्रति कुल लिम्फोसाइट्स)। इन परिणामों ने इस सॉर्टिंग प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को मान्य किया और प्रदर्शित किया कि आईएम और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के रोगियों में लिम्फोसाइट उपसमुच्चय के अनुपात अलग-अलग हैं।
चित्रा 1: पीबीएमसी से प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली समग्र गेटिंग रणनीति (ए) सीडी 3 + टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए परसीपी-साइ 5.5 फिल्टर का उपयोग किया गया था। सीडी 8 + टी कोशिकाओं और सीडी 4 + टी कोशिकाओं को एक डॉट प्लॉट पर अलग से चुना गया था, जिसमें पी 3 से सीडी 8 पीई-ए बनाम सीडी 4 एपीसी-साइ 7-ए दिखाया गया था। (बी) एफआईटीसी फिल्टर का उपयोग सीडी 19 + बी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए किया गया था। (C) APC फ़िल्टर का उपयोग CD16+/CD56+ NK कोशिकाओं को P4 से अलग करने के लिए किया गया था। संक्षेप: पीबीएमसी = परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं; एफएससी-ए = आगे प्रकीर्णन-क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटरिंग-एरिया; एफएससी-एच = आगे प्रकीर्णन-ऊंचाई; परसीपी = पेरिडिनिन-क्रोमोफिल-प्रोटीन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: वर्णित विधि द्वारा सफलतापूर्वक अलग किए गए चार सेल उप-आबादी के प्रतिनिधि परिणाम। (ए) आईएम के साथ रोगी के परिधीय रक्त नमूने से प्रतिनिधि सेल सॉर्टिंग आंकड़े। (बी) स्वस्थ ईबीवी वाहक के परिधीय रक्त नमूने से प्रतिनिधि सेल सॉर्टिंग आंकड़े। (सी) ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के परिधीय रक्त नमूने से प्रतिनिधि सेल सॉर्टिंग आंकड़े। लिम्फोसाइटों की पहचान करने के लिए पी 1, डॉट प्लॉट गेट; पी 2, एकल कोशिकाओं का चयन करने के लिए डॉट प्लॉट गेट; सीडी 3 + टी कोशिकाओं का चयन करने के लिए पी 3, डॉट प्लॉट गेट; पी 4, सीडी 3- सीडी 19- लिम्फोसाइटों की पहचान करने के लिए डॉट प्लॉट गेट; सीडी 19 + बी कोशिकाओं का चयन करने के लिए पी 5, डॉट प्लॉट गेट; पी 3 से सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं का चयन करने के लिए पी 6, डॉट प्लॉट गेट; पी 7, पी 3 से सीडी 3 + सीडी 4 + टी कोशिकाओं का चयन करने के लिए डॉट प्लॉट गेट; P8, P4 से CD16+/CD56+ NK कोशिकाओं का चयन करने के लिए डॉट प्लॉट गेट. संक्षिप्तीकरण: ईबीवी = एपस्टीन-बार वायरस; आईएम = संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस; एफएससी-ए = आगे प्रकीर्णन-क्षेत्र; एसएससी-ए = साइड स्कैटरिंग-एरिया; एफएससी-एच = आगे प्रकीर्णन-ऊंचाई; परसीपी = पेरिडिनिन-क्रोमोफिल-प्रोटीन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| एंटीबॉडी लक्ष्य | संयुग्मित फ्लोरोफोरे | खुराक | क्लोन | आइसोटाइप |
| CD3 | PerCP/Cyanine5.5 | 2 μL | SK7 | माउस IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cyanine7 | 2 μL | SK3 | माउस IgG1, κ |
| CD8 | पीई | 2 μL | SK1 | माउस IgG1, κ |
| CD19 | एफआईटीसी | 2 μL | HIB19 | माउस IgG1, κ |
| CD56 | एपीसी | 2 μL | 5.1H11 | माउस IgG1, κ |
| CD16 | एपीसी | 2 μL | 3G8 | माउस IgG1, κ |
तालिका 1: फ्लो साइटोमेट्री के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी। संक्षेप: PERCP = पेरिडिनिन-क्रोमोफिल-प्रोटीन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट।
| प्रवाह साइटोमेट्री का मुआवजा संदर्भ (%) | |||||
| पीई | एपीसी | APC-Cy7 | एफआईटीसी | PerCP-Cy5.5 | |
| पीई | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| एपीसी | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| एफआईटीसी | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
तालिका 2: प्रवाह साइटोमेट्री का मुआवजा संदर्भ। संक्षेप: PERCP = पेरिडिनिन-क्रोमोफिल-प्रोटीन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट।
| कुल क्रमबद्ध लिम्फोसाइटों में विभिन्न उप-आबादी के लिम्फोसाइटों का अनुपात (%) | |||
| लिम्फोसाइट्स उप-जनसंख्या | आईएम | स्वस्थ ईबीवी वाहक | ईबीवी-असंक्रमित बच्चे |
| CD3+ T कोशिकाएँ | 80.5 ± 1.8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3+ CD8+ T कोशिकाएँ | 46.5 ± 4.0 | 27.0 ± 0.1 | 24.7 ± 2.9 |
| CD3+ CD4+ T कोशिकाएँ | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ NK कोशिकाएँ | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3- CD19+ B कोशिकाएँ | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
तालिका 3: विभिन्न समूहों के क्रमबद्ध लिम्फोसाइटों का अनुपात। संक्षिप्तीकरण: ईबीवी = एपस्टीन-बार वायरस; आईएम = संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस; एनके = प्राकृतिक हत्यारा।
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Discussion
यह प्रोटोकॉल परिधीय रक्त प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी को क्रमबद्ध करने का एक कुशल तरीका दर्शाता है। इस अध्ययन में, आईएम, स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों के रोगियों के शिरापरक रक्त के नमूनों को अनुसंधान उद्देश्य के रूप में चुना गया था। आईएम के रोगियों के परिधीय रक्त का उपयोग करने वाला यह काम मुख्य रूप से बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से विभिन्न सेल उपसमुच्चय के अनुपात का विश्लेषण और निर्धारण करने पर केंद्रित है। ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण मुख्य रूप से लिम्फोसाइटों की एक निश्चित उप-जनसंख्या का पता लगाने और विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है जो एक ही रोग स्थिति में आईएम वाले बच्चों में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी की आणविक विशेषताओं और कार्यों की व्यापक और विशिष्ट तुलना के लिए अपर्याप्त था। इसलिए, परिधीय रक्त से कई प्रकार की कोशिकाओं को छांटना और इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अभिव्यक्ति जीन और कार्यों में अंतर की तुलना करने के लिए ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण करना आईएम के रोगजनन के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण डेटा प्रदान कर सकता है।
एफएसीएस सॉर्टिंग में आगे इन विट्रो या विवो प्रयोगों14 में जीवित, अंशित कोशिकाओं को संसाधित करने में सक्षम होने का अतिरिक्त लाभ है। बाद के प्रयोगों के लिए सेल व्यवहार्यता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। हमने इस प्रोटोकॉल में सेल व्यवहार्यता में सुधार के लिए सॉर्टिंग चरण को अनुकूलित किया है- प्रयोगात्मक जोड़तोड़ बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में किए गए हैं। सेल अलगाव के लिए उचित सेंट्रीफ्यूजेशन गति और समय भी महत्वपूर्ण हैं। क्रमबद्ध कोशिकाओं की उपज भी इस विधि में मुख्य बाधा है, और छंटाई के दौरान एफबीएस-लेपित ट्यूबों का उपयोग ट्यूबों का पालन करने वाली कोशिकाओं के नुकसान को बहुत कम कर सकता है। एफएसीएस सॉर्टर के लिए उचित सेटिंग्स प्रदान करने से संग्रह ट्यूब में सेल रुकावट या क्रॉस-संदूषण से बचकर सॉर्टिंग की समग्र दक्षता में सुधार हो सकता है। प्रयोगात्मक चरणों और सेटिंग्स के अनुकूलन के माध्यम से, इस प्रोटोकॉल को चुंबकीय या फ्लोरोसेंट लेबल को बदलकर अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की छंटाई के लिए विस्तारित किया जा सकता है। हालांकि, बच्चों के नमूनों (कम रक्त संग्रह मात्रा) की विशिष्टता के कारण, हमने प्रवाह सॉर्टिंग चैनल के प्रतिबंध के कारण उप-आबादी को क्रमबद्ध करने के लिए आगे बढ़े बिना केवल प्रतिरक्षा कोशिकाओं (मोनोसाइट्स, सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं) की प्रमुख आबादी की जांच की। इस अध्ययन से पता चला है कि इम्यूनोसक्षम बच्चों के परिधीय रक्त के नमूने और आईएम के नमूने प्रतिरक्षा कोशिकाओं के इन पांच समूहों को सफलतापूर्वक हल कर सकते हैं; हालांकि, हेमेटोलॉजिकल विकृतियों (जैसे, ल्यूकेमिया, लिम्फोमा), लिम्फोप्रोलिफेरेटिव विकारों (जैसे, पोस्टट्रांसप्लांट लिम्फोप्रोलिफेरेटिव विकार, सीएईबीवी), या प्राथमिक इम्यूनोडेफिशिएंसी / अधिग्रहित प्रतिरक्षा कमी सिंड्रोम वाले रोगियों के रक्त के नमूने इस प्रोटोकॉल के अनुसार सफलतापूर्वक क्रमबद्ध नहीं किए जा सकते हैं।
आईएम को एक आत्म-सीमित बीमारी माना जाता है, और प्रतिरक्षा कोशिकाएं जैसे कि टी कोशिकाएं, एनकेटी कोशिकाएं और एनके कोशिकाएं एंटीवायरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया15 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। ईबीवी-विशिष्ट सीडी 8 + टी कोशिकाओं को काफी हद तक एक प्रभावकारक फेनोटाइप10,16 की ओर विभेदित किया जाता है, और आईएम से स्वास्थ्य17 तक देर से प्रभावक स्मृति और प्रभावक कोशिकाओं का संकुचन होता है। इस बीच, आईएम में एनके कोशिकाएं कार्यात्मक रूप से दोषपूर्ण प्रतीत होती हैं, जिसमें सेल सक्रियण10 की कमी, रिसेप्टर सिग्नलिंग को सक्रिय करने का नुकसान और अपघटन18 शामिल हैं। कुछ अध्ययनों में पाया गया है कि सीडी 4 + टी कोशिकाएं न केवल सीडी 8 + टी कोशिकाओं को ईबीवी-संक्रमित बी कोशिकाओं को मारने और खत्म करने में सहायता कर सकती हैं, बल्कि साइटोकिन्स को स्रावित करके बी कोशिकाओं के प्रसार को भी रोक सकती हैं और यहां तक कि ईबीवी संक्रमण19,20 के दौरान सीधे हत्या की भूमिका निभाती हैं। जैसा कि इस अध्ययन में दिखाया गया है, स्वस्थ ईबीवी वाहक और ईबीवी-असंक्रमित बच्चों दोनों की तुलना में आईएम वाले रोगियों में सीडी 3 + सीडी 8 + टी कोशिकाओं का एक बढ़ा हुआ अनुपात देखा गया था। इसके विपरीत, ईबीवी-असंक्रमित बच्चों की तुलना में आईएम वाले रोगियों में सीडी 3 + सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 1 9 + बी कोशिकाओं और सीडी 16 + / सीडी 56 + एनके कोशिकाओं के अनुपात में कमी देखी गई। हालांकि, आईएम की एक ही बीमारी की स्थिति में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के इन विभिन्न उपप्रकारों का कार्य और जीन अभिव्यक्ति स्पष्ट नहीं है। आईएम में विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका उपसमुच्चय के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का आगे विश्लेषण आईएम के रोगजनक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में मदद कर सकता है।
हम एक रणनीति प्रदान करते हैं जो पीबीएमसी में परिभाषित प्रतिरक्षा सेल उप-आबादी को अलग करने और विश्लेषण करने के लिए इम्यूनोमैग्नेटिक बीड सॉर्टिंग और एफएसीएस को जोड़ती है। मोनोसाइट्स को पहले सीडी 14 माइक्रोबीड्स का उपयोग करके अलग किया जाता है, और शेष पीबीएमसी को एफएसीएस के माध्यम से सीडी 4 + टी कोशिकाओं, सीडी 8 + टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए संबंधित फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जाता है। हमने आईएम के इम्यूनोपैथोलॉजी में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कार्य और जीन अभिव्यक्ति को चिह्नित करने के लिए आरएनए निष्कर्षण और ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण के लिए इन क्रमबद्ध कोशिकाओं का उपयोग किया। क्रमबद्ध कोशिकाओं की शुद्धता और उपज आम तौर पर जीन अभिव्यक्ति अध्ययन (डेटा नहीं दिखाया गया) का संचालन करने के लिए पर्याप्त थी। इसलिए, रोगजनक जीन, रोगजनक प्रोटीन और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों का पता लगाने के लिए अलग-अलग प्रतिरक्षा कोशिका उप-आबादी की छंटाई विधि का उपयोग ईबीवी से जुड़े लिम्फोप्रोलिफेरेटिव विकारों जैसे सीएईबीवी, पोस्ट-ट्रांसप्लांट लिम्फोप्रोलिफेरेटिव विकार का पता लगाने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82002130), बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (7222059) और चिकित्सा विज्ञान के लिए सीएएमएस इनोवेशन फंड (2019-आई 2 एम-5-026) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
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