Summary
Descriviamo un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule mononucleate del sangue periferico (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B e cellule natural killer). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate e analizzate.
Abstract
La mononucleosi infettiva (IM) è una sindrome acuta per lo più associata all'infezione primaria da virus di Epstein-Barr (EBV). I principali sintomi clinici includono febbre irregolare, linfoadenopatia e linfociti significativamente aumentati nel sangue periferico. Il meccanismo patogenetico della IM non è ancora chiaro; Non esiste un metodo di trattamento efficace per questo, con terapie principalmente sintomatiche disponibili. La domanda principale nell'immunobiologia dell'EBV è perché solo un piccolo sottogruppo di individui infetti mostra gravi sintomi clinici e sviluppa persino tumori maligni associati a EBV, mentre la maggior parte degli individui è asintomatica per tutta la vita con il virus.
Le cellule B sono coinvolte per la prima volta nell'IM perché i recettori EBV sono presentati sulla loro superficie. Le cellule natural killer (NK) sono linfociti innati citotossici che sono importanti per uccidere le cellule infette da EBV. La proporzione di cellule T CD4+ diminuisce mentre quella delle cellule T CD8+ si espande drammaticamente durante l'infezione acuta da EBV e la persistenza delle cellule T CD8+ è importante per il controllo permanente della IM. Queste cellule immunitarie svolgono un ruolo importante nella IM e le loro funzioni devono essere identificate separatamente. A tale scopo, i monociti vengono separati prima dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di individui IM utilizzando microsfere CD14, una colonna e un separatore magnetico.
Le restanti PBMC sono colorate con peridinina-clorofilla-proteina (PerCP)/cianina 5.5 anti-CD3, alloficocianina (APC)/cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, fluoresceina isotiocianato (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e anticorpi APC anti-CD16 per ordinare le cellule T CD4 +, le cellule T CD8 +, le cellule B e le cellule NK utilizzando un citometro a flusso. Inoltre, è stato eseguito il sequenziamento del trascrittoma di cinque sottopopolazioni per esplorare le loro funzioni e meccanismi patogenetici nella IM.
Introduction
Il virus di Epstein-Barr (EBV), un γ-herpesvirus noto anche come herpes virus umano di tipo 4, è onnipresente nella popolazione umana e stabilisce un'infezione latente permanente in oltre il 90% della popolazione adulta1. La maggior parte dell'infezione primaria da EBV si verifica durante l'infanzia e l'adolescenza, con una frazione di pazienti che manifesta mononucleosi infettiva (IM)2, che mostra immunopatologia caratteristica, tra cui una risposta immunitaria attivata con cellule T CD8+ nel sangue e una proliferazione transitoria di cellule B infette da EBV nell'orofaringe3. Il decorso della IM può durare 2-6 settimane e la maggior parte dei pazienti guarisce ben4. Tuttavia, alcuni individui sviluppano sintomi IM-simili persistenti o ricorrenti con elevata morbilità e mortalità, che è classificata come infezione cronica attiva da EBV (CAEBV)5. Inoltre, l'EBV è un importante virus oncogeno, che è strettamente correlato a una varietà di tumori maligni, tra cui tumori maligni epitelioidi e linfoidi come il carcinoma nasofaringeo, il linfoma di Burkitt, il linfoma di Hodgkin (HL) e il linfoma a cellule T / NK6. Sebbene l'EBV sia stato studiato per oltre 50 anni, la sua patogenesi e il meccanismo con cui induce la proliferazione dei linfociti non sono stati completamente chiariti.
Diversi studi hanno studiato le firme molecolari per l'immunopatologia dell'infezione da EBV mediante sequenziamento del trascrittoma. Zhong et al. hanno analizzato il profilo dell'intero trascrittoma delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di bambini cinesi con IM o CAEBV per scoprire che l'espansione delle cellule T CD8 + è stata trovata prevalentemente nel gruppo IM7, suggerendo che le cellule T CD8 + possono svolgere un ruolo importante nella IM. Allo stesso modo, un altro studio ha rilevato percentuali più basse di cellule T citotossiche e CD19+ B specifiche per EBV e percentuali più elevate di cellule T CD8+ nei pazienti con IM causata da infezione primaria da EBV rispetto ai pazienti con IM causata sia dalla riattivazione dell'EBV che da altri agenti8. Le cellule B sono coinvolte per la prima volta nell'IM perché i recettori EBV sono presentati sulla loro superficie. Al Tabaa et al. hanno scoperto che le cellule B erano attivate policlonalmente e differenziate in plasmablasti (cellule CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmacellule (CD19+, CD27+ e CD20− e CD138+) durante IM9. Inoltre, Zhong et al. hanno scoperto che i marcatori monocitari CD14 e CD64 erano sovraregolati in CAEBV, suggerendo che i monociti possono svolgere un ruolo importante nella risposta immunitaria cellulare di CAEBV attraverso citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) e fagocitosi iperattiva7. Alka et al. hanno caratterizzato il trascrittoma delle cellule NK CD56 CD56 CD16+ selezionate da quattro pazienti di IM o HL e hanno scoperto che le cellule NK di IM e HL avevano una sottoregolazione dell'immunità innata e dei geni di segnalazione delle chemochine, che potrebbero essere responsabili dell'iporeattività delle cellule NK10. Inoltre, Greenough et al. hanno analizzato l'espressione genica delle cellule T CD8 + ordinate da 10 PBMC di individui con IM. Hanno riferito che una grande percentuale di cellule T CD8 + in IM erano specifiche del virus, attivate, divise e innescate per esercitare attività effettrici11. Sia le risposte mediate dalle cellule T, specifiche per l'EBV, sia le risposte non specifiche mediate dalle cellule NK svolgono un ruolo essenziale durante l'infezione primaria da EBV. Tuttavia, questi studi hanno studiato solo i risultati del trascrittoma della diversa miscela di cellule immunitarie o solo una certa sottopopolazione di linfociti, il che non è sufficiente per il confronto completo delle caratteristiche molecolari e delle funzioni di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie nei bambini con IM allo stesso stato di malattia.
Questo articolo descrive un metodo che combina sfere immunomagnetiche e selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) per isolare e analizzare sottopopolazioni definite di cellule immunitarie di PBMC (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B e cellule NK). Utilizzando questo metodo, le cellule magnetiche e fluorescenti possono essere purificate utilizzando un separatore magnetico e FACS o analizzate mediante citometria a flusso. L'RNA può essere estratto dalle cellule purificate per il sequenziamento del trascrittoma. Questo metodo consentirà la caratterizzazione e l'espressione genica di diverse cellule immunitarie negli stessi stati di malattia di individui con IM, che amplierà la nostra comprensione dell'immunopatologia dell'infezione da EBV.
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Protocol
I campioni di sangue sono stati ottenuti da pazienti con IM (n = 3), portatori sani di EBV (n = 3) e bambini non infetti da EBV (n = 3). I volontari sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, dalla Capital Medical University e tutti gli studi sono stati approvati eticamente. L'approvazione etica è stata ottenuta dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: [2021]-E-056-Y). Il consenso informato dei pazienti è stato revocato in quanto lo studio ha utilizzato solo i campioni rimanenti per i test clinici. Tutti i dati sono stati completamente anonimizzati e resi anonimi per proteggere la privacy dei pazienti.
1. Isolamento delle PBMC dal sangue periferico
- Raccogliere sangue periferico fresco (2 ml) da pazienti con IM in provette K3EDTA mediante venipuntura standard.
NOTA: Il processo deve essere rapido per mantenere la vitalità cellulare. - Diluire il sangue periferico a due volumi con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e sovrapporlo al mezzo di separazione dei linfociti umani (densità: 1,077 ± 0,001 g/ml) in una provetta da centrifuga da 15 ml.
NOTA: Il rapporto volumetrico tra sangue, PBS e mezzo di separazione era 1:1:1. Aggiungere lentamente il sangue al mezzo di separazione e centrifugare immediatamente per evitare che il sangue si depositi nel mezzo di separazione. - Centrifugare a 800 × g per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato intermedio (PBMC arricchiti) in un'altra provetta da centrifuga da 15 ml.
NOTA: Dopo la centrifugazione, nella parte inferiore del tubo ci sono gli eritrociti, lo strato intermedio è il mezzo di separazione, lo strato superiore è il plasma e tra lo strato di plasma e lo strato liquido di separazione c'erano le PBMC (compresi i linfociti e i monociti). - Lavare le PBMC con 10 ml di PBS e centrifugare a 800 × g per 20 minuti a temperatura ambiente; Scartare il surnatante con attenzione.
- Ripetere il lavaggio e la centrifugazione (punto 1.4) 2 x. Risospendere le PBMC con 1 mL di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e contare le celle con un contatore automatico a base di tripano blu.
2. Isolamento di monociti CD14 + da PBMC utilizzando microsfere CD14
- Preparare una soluzione tampone contenente siero bovino fetale allo 0,5% (FBS) e 2 mM di EDTA in PBS (pH 7,2). Mantenere il tampone freddo (2-8 °C).
NOTA: degasare il buffer prima dell'uso poiché le bolle d'aria potrebbero bloccare la colonna. Mantenere le cellule fredde per prevenire la copertura degli anticorpi sulla superficie cellulare e l'etichettatura cellulare non specifica. - Centrifugare le PBMC a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante con attenzione. Risospendere le cellule con 80 μL di tampone. Aggiungere 20 μL di microsfere CD14 alla sospensione cellulare.
NOTA: se sono presenti ≤107 PBMC, utilizzare il volume sopra indicato. Se ci sono >107 PBMC, aumentare proporzionalmente tutti i volumi di reagente e il volume totale. - Mescolare bene le microsfere CD14 e le cellule nel tubo di microcentrifuga da 1,5 mL e incubare per 15 minuti in frigorifero a 4 °C. Lavare le PBMC con 1 mL di tampone e centrifugare a 300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare completamente il surnatante Risospendere le celle con 500 μL di tampone.
NOTA: se sono presenti ≤108 PBMC, utilizzare il volume sopra indicato. Se sono presenti >108 PBMC, aumentare proporzionalmente il volume del buffer. - Separazione magnetica con colonne:
- Posizionare la colonna sul separatore di sfere magnetiche e lavare la colonna con 3 ml di tampone. Aggiungere la sospensione della cella (dal passaggio 2.3) alla colonna.
- Raccogliere le cellule non etichettate che passano attraverso la colonna in una provetta da centrifuga da 15 ml e lavare la colonna con 3 ml di tampone. Lavare la colonna con 3 x 3 ml di tampone. Raccogliere l'effluente totale nella provetta da centrifuga da 15 ml.
- Posizionare la colonna in una nuova provetta da centrifuga da 15 ml. Aggiungere 5 mL di buffer alla colonna. Spingere saldamente lo stantuffo nella colonna per eliminare immediatamente le celle marcate magneticamente nel tubo della centrifuga da 15 ml.
- Centrifugare le cellule marcate magneticamente a 300 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per l'uso nel successivo sequenziamento del trascrittoma.
3. Separazione delle popolazioni di linfociti dalle PBMC mediante colorazione anticorpale marcata con fluorescenza e FACS
- Centrifugare le cellule non marcate (punto 2.4.2) a 300 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 100 μL di PBS in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
- Aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo marcato (CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56) ai 100 μL di sospensione cellulare (i volumi e le informazioni sui fluorofori coniugati degli anticorpi sono mostrati nella Tabella 1), incubare su ghiaccio per 30 minuti e proteggere dalla luce.
- Lavare le celle 2 volte aggiungendo 1 mL di PBS e centrifugando a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS nella provetta da 1,5 mL di microcentrifuga. Vortice la sospensione cellulare delicatamente prima di acquisire i dati su un citometro a smistamento di cellule a flusso.
4. Impostazione dei parametri di citometria a flusso
- Prelevare 100 μL della sospensione cellulare (vedere paragrafo 1) in provette da microcentrifuga da 1,5 mL come richiesto e impostare un campione di controllo negativo, un campione di colorazione singola CD3, un campione di colorazione singola CD4, un campione di colorazione singola CD8, un campione di colorazione singola CD19 e un campione di colorazione CD56/CD16.
- Aggiungere 2 μL del corrispondente anticorpo marcato con fluorescenza per 100 μL della sospensione cellulare e del vortice. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Centrifugare per 5 min a 300 × g e aspirare il surnatante. Risospendere i pellet con 500 μL di PBS e vortice.
- Commissionare il flusso di selezione e ritardare le goccioline utilizzando le sfere fluorescenti come segue:
- Aprire il sistema di smistamento delle celle, eseguire il programma di accensione, installare l'ugello da 85 μm e aprire il flusso di smistamento. Impostare la tensione di ordinamento su 4.500 V e la frequenza su 47.
- Regolare i parametri principalmente regolando il punto di rottura della goccia del flusso principale e il ritardo della goccia secondo le istruzioni del produttore12. Impostate la prima posizione del punto di interruzione della goccia (Drop1) su 275 e la posizione dello spazio su 8 nella finestra di interruzione . Attivare la modalità di ordinamento automatico Sweet Spot per consentire alla citometria di determinare automaticamente il valore di ampiezza delle goccioline per stabilizzare il flusso.
- Regolate il ritardo delle gocce a 30,31 nella finestra Flusso laterale caricando le sfere fluorescenti, assicurandovi che le perle raggiungano una deflessione del flusso laterale del >99% in modalità iniziale o fine.
- Fare riferimento alla strategia di gating illustrata nella Figura 1 per eseguire il gating come segue:
- Utilizzando un dot plot forward scatter-area (FSC-A)/area di dispersione laterale (SSC-A), disegnare il gate poligonale (P1) per identificare la popolazione di linfociti intatta .
- Utilizzando un dot plot FSC-A/FSC-height (FSC-H), disegnare la porta poligonale (P2) per identificare le singole celle ed escludere doppietti (Figura 1A).
- Utilizzando un diagramma a punti CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A, disegnare il gate rettangolare (P3) per selezionare le cellule T CD3+ e le cellule B CD19+ (Figura 1A,B).
- Utilizzando un diagramma a punti CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A, disegnare un gate rettangolare per selezionare le cellule T CD4+ e le cellule T CD8+ (cellule con un'alta fluorescenza per questi marcatori, rispettivamente).
- Utilizzando un grafico a punti APC-A/SSC-A CD56/CD16, disegnare un gate rettangolare per selezionare le celle NK CD56+/CD16+ (Figura 1C).
- Regolare i parametri strumentali utilizzando il campione di controllo negativo:
- Installare il tubo di controllo negativo sulla porta di carico e fare clic su Carica nel dashboard di acquisizione. Selezionare le impostazioni del citometro nel software.
- Nella finestra Impostazioni, fare clic sulla scheda Parametri e regolare le tensioni di FSC, SSC e diversi coloranti fluorescenti; FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-cianina 7: 824, FITC: 555, PerCP-cianina 5.5: 663.
- Regolare la compensazione utilizzando i campioni monocolore13.
- Caricare i tubi monocolorati sulla citometria in sequenza e selezionare Impostazioni citometro nel software. Fai clic sulla scheda Retribuzione per modificare la retribuzione .
NOTA: Il riferimento di compensazione della citometria a flusso è mostrato nella Tabella 2.
- Caricare i tubi monocolorati sulla citometria in sequenza e selezionare Impostazioni citometro nel software. Fai clic sulla scheda Retribuzione per modificare la retribuzione .
5. Selezione cellulare e raccolta di dati tramite citometria a flusso
- Vortice la sospensione cellulare (PBMC separati secondo le sezioni 1-3) brevemente per risospendere le cellule prima di caricare il tubo nel citometro. Mantenere i tubi rimanenti sul ghiaccio.
- Aggiungere 200 μL di FBS a quattro tubi di flusso di raccolta per evitare che le cellule selezionate si attacchino alla parete del tubo e posizionarle nella camera di raccolta del citometro.
- Raccogliere le cellule T CD3+CD4+, le cellule T CD3+CD8+, le cellule B CD3−CD19+ e le cellule NK CD3− CD56+/CD16+ separatamente dal campione di un paziente con IM nelle quattro provette a flusso (Figura 2A).
- Centrifugare le cellule separate a 300 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μL di reagente di isolamento dell'RNA alle cellule per il sequenziamento del trascrittoma.
- Separare le sottopopolazioni di cellule immunitarie dei campioni dai portatori sani di EBV e dai bambini non infetti da EBV secondo i passaggi precedenti (Figura 2B, C).
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Representative Results
Riferimento della strategia di gating
La strategia di gating utilizzata per ordinare le quattro sottopopolazioni di linfociti è mostrata nella Figura 1. In breve, i linfociti sono selezionati (P1) su un dot plot che mostra la granulosità (SSC-A) rispetto alle dimensioni (FSC-A). Quindi, le singole celle vengono selezionate (P2) su un dot plot che mostra la dimensione (FSC-A) rispetto alla dispersione diretta (FSC-H), mentre le celle doppiette sono escluse. Le cellule T CD3+ (P3) e le cellule B CD19+ (Figura 1B) sono selezionate separatamente su un dot plot che mostra il CD3 PerCP-Cy5.5-A rispetto al CD19 FITC-A. Le cellule T CD8+ e le cellule T CD4+ sono selezionate separatamente su un dot plot che mostra CD8 PE-A rispetto a CD4 APC-Cy7-A da P3. Le celle NK CD16+/CD56+ sono selezionate su un dot plot che mostra CD56/CD16 APC-A rispetto a SSC-A da P4 (Figura 1C).
I risultati rappresentativi di quattro sottopopolazioni cellulari ordinati dai campioni di pazienti con IM con il metodo descritto sono mostrati nella Figura 2A. Abbiamo anche eseguito la selezione cellulare su campioni di portatori sani di EBV e bambini non infetti da EBV come gruppi di controllo per confermare la fattibilità di questo esperimento. I risultati rappresentativi delle sottopopolazioni cellulari separate dal campione di un portatore sano di EBV sono mostrati nella Figura 2B. Il risultato rappresentativo delle sottopopolazioni cellulari selezionate dal campione di bambini non infetti da EBV è mostrato nella Figura 2C. Come mostrato in Figura 2, P1 è stato controllato per identificare i linfociti e le cellule doppiette sono state escluse attraverso P2; P3 è stato controllato per selezionare le cellule T CD3 + e P5 è stato controllato per selezionare le cellule B CD19 +; Le cellule T CD3+ CD8+ (P6) e CD3+ CD4+ (P7) sono state selezionate separatamente da P3; Le cellule NK CD16+/CD56+ (P8) sono state selezionate da P4. Ognuna di queste sottopopolazioni può essere ordinata individualmente e raccolta per esperimenti a valle. Questo sistema è stato utilizzato per analizzare l'espressione genica attraverso l'estrazione dell'RNA e il sequenziamento del trascrittoma.
Come riportato nella Tabella 3, è stato osservato un aumento delle cellule T CD3+ CD8+ nei pazienti con IM rispetto sia ai portatori sani di EBV che ai bambini non infetti da EBV (46,5 ± 4,0 vs. 27,0 ± 0,1 e 46,5 ± 4,0 vs. 24,7 ± 2,9, % cellule T CD3+ CD8+ per linfociti totali); Percentuali ridotte di cellule T CD3+ CD4+ e cellule B CD19+ sono state osservate in pazienti con IM rispetto a portatori sani di EBV e bambini non infetti da EBV (13,4 ± 1,5 vs 19,3 ± 1,5 e 13,4 ± 1,5 vs. 23,6 ± 3,2, % cellule T CD3+ CD4+ per linfociti totali; 1,4 ± 0,3 vs 7,6 ± 0,7 e 1,4 ± 0,3 vs 9,0 ± 1,5, % cellule B CD19+ per linfociti totali). Percentuali ridotte di cellule NK CD16+/CD56+ sono state osservate nei pazienti con IM rispetto ai bambini non infetti da EBV (7,5 ± 0,5 vs 10,7 ± 0,4, % cellule NK CD16+/CD56+ per linfociti totali). Questi risultati hanno convalidato l'efficacia di questo protocollo di selezione e hanno dimostrato che le proporzioni dei sottogruppi di linfociti sono diverse nei pazienti con bambini IM e non infetti da EBV.
Figura 1: Strategia di gating complessiva utilizzata per ordinare le sottopopolazioni di cellule immunitarie dalle PBMC. (A) Il filtro PerCP-Cy5.5 è stato utilizzato per separare le cellule T CD3+. Le cellule T CD8+ e le cellule T CD4+ sono state selezionate separatamente su un dot plot che mostra CD8 PE-A rispetto a CD4 APC-Cy7-A da P3. (B) Il filtro FITC è stato utilizzato per identificare le cellule B CD19+. (C) Il filtro APC è stato utilizzato per separare le cellule NK CD16+/CD56+ da P4. Abbreviazioni: PBMCs= cellule mononucleate del sangue periferico; FSC-A = area di diffusione diretta; SSC-A = area di diffusione laterale; FSC-H = altezza di dispersione in avanti; PerCP = peridinina-crofilla-proteina; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati rappresentativi di quattro sottopopolazioni cellulari isolate con successo con il metodo descritto. (A) Dati rappresentativi di selezione cellulare dal campione di sangue periferico del paziente con IM. (B) Dati rappresentativi di selezione cellulare dal campione di sangue periferico di portatori sani di EBV. (C) Dati rappresentativi di selezione cellulare dal campione di sangue periferico di bambini non infetti da EBV. P1, dot plot gate per identificare i linfociti; P2, dot plot gate per selezionare singole celle; P3, dot plot gate per selezionare le cellule T CD3+; P4, dot plot gate per identificare i linfociti CD3-CD19-; P5, dot plot gate per selezionare le cellule B CD19+; P6, dot plot gate per selezionare le cellule T CD3+ CD8+ da P3; P7, dot plot gate per selezionare le cellule T CD3+ CD4+ da P3; P8, dot plot gate per selezionare le celle NK CD16+/CD56+ da P4. Abbreviazioni: EBV = virus di Epstein-Barr; IM = mononucleosi infettiva; FSC-A = area di diffusione diretta; SSC-A = area di diffusione laterale; FSC-H = altezza di dispersione in avanti; PerCP = peridinina-crofilla-proteina; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Bersaglio anticorpale | Fluoroforo coniugato | Dosaggio | Clone | Isotype |
| CD3 | PerCP/Cianina5.5 | 2 μL | SK7 | Mouse IgG1, κ |
| CD4 | APC/Cianina7 | 2 μL | SK3 | Mouse IgG1, κ |
| CD8 | PE | 2 μL | SK1 | Mouse IgG1, κ |
| CD19 | FITC | 2 μL | HIB19 | Mouse IgG1, κ |
| CD56 | APC | 2 μL | 5.1H11 | Mouse IgG1, κ |
| CD16 | APC | 2 μL | 3G8 | Mouse IgG1, κ |
Tabella 1: Anticorpi usati per la citometria a flusso. Abbreviazioni: PerCP = peridinina-crofilla-proteina; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina.
| Riferimento di compensazione della citometria a flusso (%) | |||||
| PE | APC | APC-Cy7 | FITC | PerCP-Cy5.5 | |
| PE | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| APC | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| PerCP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
Tabella 2: Riferimento di compensazione della citometria a flusso. Abbreviazioni: PerCP = peridinina-crofilla-proteina; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina; FITC = isotiocianato di fluoresceina.
| Percentuale di linfociti di diverse sottopopolazioni nel totale dei linfociti ordinati (%) | |||
| sottopopolazione di linfociti | IM | portatori di EBV sani | Bambini non infetti da EBV |
| Cellule T CD3+ | 80,5 ± 1,8 | 70,2 ± 2,3 | 66,1 ± 2,1 |
| Cellule T CD3+ CD8+ | 46,5 ± 4,0 | 27,0 ± 0,1 | 24,7 ± 2,9 |
| Cellule T CD3+ CD4+ | 13,4 ± 1,5 | 19,3 ± 1,5 | 23,6 ± 3,2 |
| Cellule NK CD16+/CD56+ | 7,5 ± 0,5 | 2,2 ± 0,1 | 10,7 ± 0,4 |
| Cellule B CD3- CD19+ | 1,4 ± 0,3 | 7,6 ± 0,7 | 9,0 ± 1,5 |
Tabella 3: La proporzione di linfociti ordinati di diversi gruppi. Abbreviazioni: EBV = virus di Epstein-Barr; IM = mononucleosi infettiva; NK = natural killer.
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Discussion
Questo protocollo rappresenta un modo efficace per ordinare le sottopopolazioni di cellule immunitarie del sangue periferico. In questo studio, campioni di sangue venoso di pazienti con IM, portatori sani di EBV e bambini non infetti da EBV sono stati selezionati come obiettivo della ricerca. Questo lavoro che utilizza il sangue periferico di pazienti di IM si concentra principalmente sull'analisi e la determinazione delle proporzioni di diversi sottogruppi cellulari attraverso la citometria a flusso multicolore. Il sequenziamento del trascrittoma viene utilizzato principalmente per l'individuazione e l'analisi di una certa sottopopolazione di linfociti che era insufficiente per il confronto completo e specifico delle caratteristiche molecolari e delle funzioni di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie in bambini con IM allo stesso stato di malattia. Pertanto, selezionare diversi tipi di cellule dal sangue periferico ed eseguire il sequenziamento del trascrittoma per confrontare le differenze nei geni di espressione e nelle funzioni di queste cellule immunitarie potrebbe fornire dati significativi per lo studio della patogenesi della IM.
La cernita FACS ha l'ulteriore vantaggio di poter trattare cellule vive frazionate per ulteriori esperimenti in vitro o in vivo 14. Mantenere la vitalità cellulare è vitale per gli esperimenti successivi. Abbiamo ottimizzato la fase di selezione per migliorare la vitalità cellulare in questo protocollo: le manipolazioni sperimentali sono state eseguite su ghiaccio o in un frigorifero a 4 °C. Anche la velocità e il tempo di centrifugazione adeguati sono fondamentali per l'isolamento cellulare. La resa delle celle ordinate è anche il vincolo principale in questo metodo e l'uso di tubi rivestiti FBS durante la selezione può ridurre notevolmente la perdita di cellule che aderiscono ai tubi. Fornire le impostazioni corrette per lo smistatore FACS può migliorare l'efficienza complessiva della selezione evitando il blocco delle celle o la contaminazione incrociata nel tubo di raccolta. Attraverso l'ottimizzazione di passaggi e impostazioni sperimentali, questo protocollo può essere estrapolato alla selezione di altre cellule immunitarie sostituendo etichette magnetiche o fluorescenti. Tuttavia, a causa della specificità dei campioni dei bambini (basso volume di raccolta del sangue), abbiamo studiato solo le principali popolazioni di cellule immunitarie (monociti, cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B e cellule NK) senza procedere a ordinare le sottopopolazioni a causa della restrizione del canale di selezione del flusso. Questo studio ha dimostrato che campioni di sangue periferico di bambini immunocompetenti e campioni di IM potrebbero risolvere con successo questi cinque gruppi di cellule immunitarie; tuttavia, i campioni di sangue di pazienti con neoplasie ematologiche (ad es. leucemia, linfoma), disturbi linfoproliferativi (ad es. disordini linfoproliferativi post-trapianto, CAEBV) o immunodeficienza primaria/sindrome da immunodeficienza acquisita potrebbero non essere ordinati con successo secondo questo protocollo.
L'IM è considerata una malattia autolimitante e le cellule immunitarie come le cellule T γδ, le cellule NKT e le cellule NK svolgono un ruolo significativo nella risposta immunitaria antivirale15. Le cellule T CD8+ specifiche per EBV sono ampiamente differenziate verso un fenotipo effettore 10,16 e vi è una contrazione della memoria effettrice tardiva e delle cellule effettrici dall'IM alla convalescenza 17. Nel frattempo, le cellule NK nella IM sembrano essere funzionalmente difettose, compresa la mancanza di attivazione cellulare10, la perdita della segnalazione del recettore attivante e la degranulazione18. Alcuni studi hanno scoperto che le cellule T CD4+ possono non solo aiutare le cellule T CD8+ a uccidere ed eliminare le cellule B infette da EBV, ma anche inibire la proliferazione delle cellule B secernendo citochine e persino svolgere direttamente un ruolo di uccisione durante l'infezione da EBV19,20. Come dimostrato in questo studio, è stata osservata una percentuale aumentata di cellule T CD3+ CD8+ nei pazienti con IM rispetto sia ai portatori sani di EBV che ai bambini non infetti da EBV. Al contrario, sono state osservate percentuali ridotte di cellule T CD3+ CD4+, cellule B CD19+ e cellule NK CD16+/CD56+ nei pazienti con IM rispetto ai bambini non infetti da EBV. Tuttavia, la funzione e l'espressione genica di questi diversi sottotipi di cellule immunitarie nello stesso stato di malattia della IM rimangono poco chiare. Un'ulteriore analisi dei profili di espressione genica di specifici sottogruppi di cellule immunitarie nella IM può aiutare a ottenere informazioni sul meccanismo patogenetico della IM.
Forniamo una strategia che combina la selezione delle sfere immunomagnetiche e FACS per isolare e analizzare sottopopolazioni di cellule immunitarie definite nelle PBMC. I monociti vengono separati prima utilizzando microsfere CD14 e le restanti PBMC vengono colorate con corrispondenti anticorpi marcati con fluorescenza per ordinare le cellule T CD4 +, le cellule T CD8 +, le cellule B e le cellule NK attraverso FACS. Abbiamo inoltre utilizzato queste cellule selezionate per l'estrazione dell'RNA e il sequenziamento del trascrittoma per caratterizzare la funzione e l'espressione genica di diverse cellule immunitarie nell'immunopatologia dell'IM. La purezza e la resa delle cellule selezionate erano generalmente sufficienti per condurre studi di espressione genica (dati non mostrati). Pertanto, il metodo di selezione di sottopopolazioni separate di cellule immunitarie può essere utilizzato per esplorare ulteriormente i disordini linfoproliferativi associati a EBV come CAEBV, il disturbo linfoproliferativo post-trapianto per rilevare geni patogeni, proteine patogene e potenziali bersagli terapeutici.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82002130), dalla Beijing Natural Science Foundation (7222059) e dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
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